KR102659191B1 - Biomarker composition and kit for diagnosing prostate cancer specifically binding to lysine-succinilated ldha and screening method for treating prostate cancer using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전립선암 진행을 진단하는 바이오마커 조성물 및 키트로서, 탈숙시닐효소로서 SIRT5의 기질이 되는 타깃 단백질인 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, LDHA)를 이용하여 전립선암 진행을 진단하고, 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명은 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA)에 특이적으로 결합하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트이다. 또한, 본 발명은 a) 피검자로부터 분리된 생물학적 시료에서 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 측정된 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. The present invention is a biomarker composition and kit for diagnosing prostate cancer progression, using lactate dehydrogenase A (LDHA), a target protein that is a desuccinyl enzyme and a substrate for SIRT5, to diagnose prostate cancer progression. , which concerns methods of providing information for prostate cancer diagnosis.
The present invention is characterized in that lysine specifically binds to succinylated lactate dehydrogenase A (LDHA). In addition, the present invention is a prostate cancer diagnostic kit comprising a prostate cancer diagnostic biomarker composition that specifically binds to lactate dehydrogenase A (LDHA) in which lysine is succinylated. In addition, the present invention includes the steps of a) measuring the expression level of lactate dehydrogenase A in which lysine is succinylated in a biological sample isolated from a subject; and b) comparing the measured expression level of lactate dehydrogenase A, in which lysine is succinylated, with a normal control group.
Description
본 발명은 전립선암 진행을 진단하는 바이오마커 조성물 및 키트로서, 탈숙시닐효소로서 SIRT5의 기질이 되는 타깃 단백질인 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, LDHA)를 이용하여 전립선암 진행을 진단하고, 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. The present invention is a biomarker composition and kit for diagnosing prostate cancer progression, using lactate dehydrogenase A (LDHA), a target protein that is a desuccinyl enzyme and a substrate for SIRT5, to diagnose prostate cancer progression. , which concerns methods of providing information for prostate cancer diagnosis.
전립선암은 국내에서 남성암 중 발생률이 가장 빠르게 증가되고 있는 암이지만, 현재 효과적인 치료법이 개발되어 5년 생존률이 90.2 %로 매우 높은 치료 효율을 가지고 있다. 하지만 전이성 전립선암의 평균 생존기간은 2년 반으로 급격히 저하되며, 말기 전이성 전립선암의 환자는 평균 10.9개월 생존하는 것으로 알려져 있는데, 특히 한국 남성들에게서 발생하는 전립선암의 약 76%가 다른 부위로 전이될 가능성이 큰 ‘조직의 분화도가 나쁜 암’으로 알려져 있다. 전이 가능성이 높은 고위험군 환자의 경우 국내(25%)가 미국 (10~15%)보다 높은 빈도를 나타내며, 전립선암 환자 25%가 수술 후 재발되고, 이중 1/3이 말기암으로 진행한다. 전립선암의 전이 가능성을 진단 초기 또는 수술 후 분자생화학적 기술에 근거하여 예측하는 바이오마커 탐색 및 진단법의 개발 요구된다. Prostate cancer is the cancer with the fastest increasing incidence among male cancers in Korea, but effective treatments have now been developed and the 5-year survival rate is 90.2%, resulting in very high treatment efficiency. However, the average survival period for metastatic prostate cancer rapidly decreases to 2 and a half years, and patients with late-stage metastatic prostate cancer are known to survive on average for 10.9 months. In particular, about 76% of prostate cancers occurring in Korean men are transferred to other parts of the body. It is known as a ‘cancer with poor tissue differentiation’ that has a high possibility of metastasis. In the case of high-risk patients with a high possibility of metastasis, the frequency is higher in Korea (25%) than in the United States (10-15%). 25% of prostate cancer patients recur after surgery, and one-third of them progress to terminal cancer. There is a need to develop biomarkers and diagnostic methods that predict the possibility of prostate cancer metastasis based on molecular biochemical techniques at the beginning of diagnosis or after surgery.
선행연구(특허 대한민국 제10-2229255호)에서는 전립선암 환자 조직의 단백체 분석 결과 sirtuin 5 (이하, SIRT5)가 전립선암 진행단계에 따라 유의적으로 감소됨을 규정하여 진단마커로 제안하였다. 추가적으로 본 발명에서는 SIRT5가 단백질의 숙시닐(succinyl)기를 제거하는 효소로서 대표적인 탈숙시닐효소(desuccinylase)이므로, SIRT5(효소)의 기질이 되는 타깃 단백질을 동정하여 전립선암 진행을 조절하는 기전을 규명하여, 전립선암 진행을 진단할 수 있는 선택적 분자 마커를 제안하고, 이를 인지하는 선택적 항체를 생산하고자 한다. In a previous study (Korea Patent No. 10-2229255), as a result of proteomic analysis of prostate cancer patient tissue, sirtuin 5 (hereinafter referred to as SIRT5) was found to be significantly decreased depending on the stage of prostate cancer progression, and was proposed as a diagnostic marker. Additionally, in the present invention, since SIRT5 is a representative desuccinylase enzyme that removes the succinyl group of proteins, the mechanism that regulates prostate cancer progression is identified by identifying the target protein that is a substrate for SIRT5 (enzyme). Therefore, we propose a selective molecular marker that can diagnose prostate cancer progression and produce a selective antibody that recognizes it.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 SIRT5 단백질의 기질이 되는 타깃 단백질인 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, LDHA)를 동정하여 전립선 암 예후 예측용 바이오마커를 제공하는 것이다. The present invention was devised to solve the above problems, and the purpose of the present invention is to identify lactate dehydrogenase A (LDHA), a target protein that is a substrate of SIRT5 protein, to identify a biomarker for predicting prostate cancer prognosis. is to provide.
또한, 본 발명의 목적은 SIRT5 단백질의 기질이 되는 타깃 단백질인 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, LDHA) 또는 상기 타깃 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 전립선 암 예후 예측용 조성물, 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. In addition, the object of the present invention is to provide prognosis for prostate cancer, including an agent for measuring the mRNA expression level of lactate dehydrogenase A (LDHA), a target protein that is a substrate of the SIRT5 protein, or the mRNA expression level of the gene encoding the target protein. To provide a prediction composition or a kit containing the composition.
또한, 본 발명의 목적은 SIRT5 단백질의 기질이 되는 타깃 단백질인 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, LDHA)를 동정하여 전립선암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Additionally, the purpose of the present invention is to provide a method for providing information necessary for predicting the prognosis of prostate cancer by identifying lactate dehydrogenase A (LDHA), a target protein that is a substrate of the SIRT5 protein.
또한, 본 발명의 목적은 SIRT5 단백질의 기질이 되는 타깃 단백질인 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, LDHA)를 동정하여 전립선암의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. Additionally, the purpose of the present invention is to provide a method for screening substances for the prevention or treatment of prostate cancer by identifying lactate dehydrogenase A (LDHA), a target protein that is a substrate for the SIRT5 protein.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems to be solved by the invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below. You will be able to.
<전립선암 진단용 바이오마커 조성물><Biomarker composition for diagnosis of prostate cancer>
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A (Lactate dehydrogenase A, 이하 LDHA)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.According to one embodiment of the present invention, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing prostate cancer, comprising an antibody that specifically binds to lactate dehydrogenase A (LDHA) in which lysine is succinylated. provides.
상기 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A는 아미노산 서열에서 118번째 리신 잔기가 숙시닐화 된 것을 특징으로 한다. The lysine-succinylated lactate dehydrogenase A is characterized in that the 118th lysine residue in the amino acid sequence is succinylated.
SIRT5(Sirtuin 5) 단백질은 상기 락테이트 탈수소 효소 A에서 리신의 숙시닐화를 조절하는 것을 특징으로 한다. SIRT5 (Sirtuin 5) protein is characterized by regulating succinylation of lysine in lactate dehydrogenase A.
상기 조성물은 아미노산 서열에서 118번째 리신 잔기가 숙시닐화 된 LDHA에 특이적으로 결합하여 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것으로, 항체, 앱타머, DNA 등일 수 있다. 이때, LDHA에 특이적으로 결합하는 항체는 단백질의 숙시닐화와 관계없이 LDHA 전체 또는 단편을 인식하거나, 또는 LDHA의 리신 숙시닐화 부위를 인식하는 항체인 것이 바람직하다. 상기 항체는 아미노산 서열에 포함된 리신 잔기들 중 숙시닐화가 일어난 부위라면 제한 없이 인식할 수 있으며, 특히 118번째 리신 잔기의 숙시닐화 부위를 특이적으로 인식할 수 있다.The composition is capable of measuring the expression level of LDHA in which lysine is succinylated by specifically binding to LDHA in which the 118th lysine residue in the amino acid sequence is succinylated, and may be an antibody, aptamer, DNA, etc. At this time, the antibody that specifically binds to LDHA is preferably an antibody that recognizes the entire LDHA or fragments regardless of succinylation of the protein, or recognizes the lysine succinylation site of LDHA. The antibody can recognize without limitation any succinylation site among lysine residues included in the amino acid sequence, and in particular, can specifically recognize the succinylation site of the 118th lysine residue.
여기서, "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.Here, “specifically binding” means that the binding ability to the target substance is superior to that of other substances to the extent that the presence or absence of the target substance can be detected by binding.
본 발명의 "항체"는 항원 또는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자, 또는 그의 단편으로부터 유래되거나 이를 본떠서 만든 실질적으로 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태이거나, 또는 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다. 이때, 항체는 단클론성 항체(monoclonal antibody) 또는 다중클론성 항체(polyclonal antibody)일 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있으며, 일례로 융합 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지 항체 라이브러리 방법 등에 의해 제조될 수 있다.“Antibody” of the present invention refers to a peptide or polypeptide substantially encoded by an immunoglobulin gene capable of specifically binding to an antigen or epitope, or derived from or modeled after a fragment thereof. These antibodies are either intact, with two full-length light chains and two full-length heavy chains, or include functional fragments of the antibody molecule. The functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function and may be Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, etc. At this time, the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Such antibodies can be produced by conventional methods known in the art, for example, by fusion methods, recombinant DNA methods, phage antibody library methods, etc.
본 발명의 전립선암 진단용 바이오마커 조성물을 이용한 키트 조성물을 제조할 수 있다. 여기서, "진단용 키트"는 암 의심 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 정상인으로부터 채취한 생물학적 시료와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 전립선암 진단용 키트는 시료 내 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 존재를 측정하기 위한 것으로, LDHA에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 변형된 단백질의 양을 확인할 수 있다. 상기 키트는 면역분석(immunoassay)에 기초한 단백질 확인 방법이 적용된 것일 수 있으며, 일례로 리신이 숙시닐화 된 LDHA에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation; IP), 방사능면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays; ELISA), 면역염색법(immunohistochemistry, IHC), 유세포 분석법(flow cytometry analysis, FACS) 등의 방법이 적용될 수 있다. 이러한 키트에는 항체를 이용하여 각종 면역화학적 반응을 수행하기에 적합한 물질들이 포함될 수 있으며, 일례로 동결건조 형태의 항체, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 이때, 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화 될 수 있다.A kit composition can be prepared using the biomarker composition for diagnosing prostate cancer of the present invention. Here, “diagnostic kit” refers to a substance that can diagnose a biological sample collected from a patient suspected of having cancer by distinguishing it from a biological sample collected from a normal person. This prostate cancer diagnostic kit is designed to measure the presence of LDHA in which lysine is succinylated in a sample, and the amount of modified protein can be confirmed using an antibody that specifically binds to LDHA. The kit may be a protein identification method based on immunoassay, for example, Western blot using an antibody that specifically binds to lysine-succinylated LDHA, and immunoprecipitation (IP). ), radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunoabsorbent assays (ELISA), immunohistochemistry (IHC), and flow cytometry analysis (FACS) can be applied. . These kits may contain materials suitable for performing various immunochemical reactions using antibodies, and may include, for example, lyophilized antibodies, buffers, stabilizers, inactive proteins, etc. At this time, the antibody may be labeled with radionuclides, fluoresces, enzymes, etc.
이러한 키트를 사용하여 전립선암을 진단할 경우에는 암 의심 환자에서 채취된 시료를 키트에 포함된 리신이 숙시닐화 된 LDHA에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시킬 수 있다. 이때, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있고, 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형상에 고정될 수 있다. 상기 고형상은 유리 또는 플라스틱이며, 일례로 미세역가 플레이트(microtiter plate), 막대, 비드(bead), 미세비드(microbead) 등일 수 있다. 또한, 상기 항체는 프로브 기질이나 단백질칩에 결합될 수 있다. 이와 같이 시료 및 항체를 준비하여 시료를 항체와 정온배치한 후 세척하여 형성된 항체-마커 복합체를 측정할 수 있다. 이는 세척된 혼합물을 2차 시약, 바람직하게는 2차 항체와 정온배치하여 수행된다. 항체-마커 복합체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다. 상기 방법 외에도 시료 내의 마커는 간접적인 분석방법 예를 들어, 마커의 다른 에피토프에 결합하는 단클론성 항체와 경쟁 또는 억제 반응 분석을 실시하여 검출할 수 있다.When diagnosing prostate cancer using such a kit, a sample collected from a patient suspected of having cancer can be contacted with an antibody that specifically binds to LDHA in which lysine is succinylated contained in the kit. At this time, the sample may be diluted to an appropriate degree before contact with the antibody, and the antibody may be immobilized on a solid phase to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex. The solid form is glass or plastic, and may be, for example, a microtiter plate, rod, bead, or microbead. Additionally, the antibody may be bound to a probe substrate or protein chip. By preparing a sample and an antibody in this way, the sample is placed at a constant temperature with the antibody, and then washed to measure the antibody-marker complex formed. This is accomplished by placing the washed mixture at constant temperature with a secondary reagent, preferably a secondary antibody. Measuring the amount or detecting the presence of an antibody-marker complex can be accomplished through fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflection, or transmission. In addition to the above method, the marker in the sample can be detected by an indirect analysis method, for example, competition or inhibition reaction analysis with a monoclonal antibody that binds to another epitope of the marker.
상기 SIRT5는 다양한 암의 주요 조절인자로 가정되나, 다른 SIRT와 비교하여 암에서 SIRT5의 역할은 연구가 부족한 실정이었다. 선행연구에서 전이성 전립선암(PCa) 세포주에서 SIRT5의 유의적 감소를 확인하고, SIRT5의 역할을 규명하기 위해 SIRT5 KD 세포주를 만들어 SIRT5만 선택적으로 감소함을 확인하고, SIRT5 KD 세포주의 높은 이동(migration) 및 침윤(invasion)을 가짐을 확인하였다.SIRT5 is assumed to be a key regulator of various cancers, but compared to other SIRTs, the role of SIRT5 in cancer has been understudied. In a previous study, we confirmed a significant decrease in SIRT5 in metastatic prostate cancer (PCa) cell lines, and to identify the role of SIRT5, we created a SIRT5 KD cell line and confirmed that only SIRT5 was selectively decreased, and the high migration rate of the SIRT5 KD cell line was confirmed. ) and invasion were confirmed.
이에, 본 발명에서는 SIRT5는 탈숙시닐효소로서, SIRT5가 감소되면 단백질 숙시닐(succinyl)이 증가됨을 in vitro 및 환자시료에서 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실제 전립선암 조직의 진행에 따라 SIRT5는 감소하고, 단백질 숙시닐(succinyl)은 증가함을 확인할 수 있다. Accordingly, in the present invention, SIRT5 is a desuccinyl enzyme, and it was confirmed in vitro and in patient samples that when SIRT5 is reduced, protein succinyl increases. As shown in Figure 3, it can be seen that SIRT5 decreases and protein succinyl increases as the prostate cancer tissue progresses.
따라서, 전립선암의 진행에 영향을 미치는 SIRT5(효소)의 기질을 찾기 위한 단백체 실험을 수행하였다(도 4). 분석결과, 도 5에 나타난 바와 같이, LHDA 효소의 K118번 위치의 숙시닐화(succinylation)가 SIRT5와 관련됨을 규명하였고, 도 7에 나타난 바와 같이, LDHA의 118번 라이신 잔기의 숙시닐화(succinylation)가 LDHA의 활성을 증가시켜, 전립선암 세포의 침략(invasion)을 증가시킴을 규명하였다. Therefore, a proteomic experiment was performed to find the substrate of SIRT5 (an enzyme) that affects the progression of prostate cancer (Figure 4). As a result of the analysis, as shown in Figure 5, it was confirmed that succinylation of the K118 position of the LHDA enzyme is related to SIRT5, and as shown in Figure 7, succinylation of the lysine residue at position 118 of LDHA was confirmed. It was found that increasing the activity of LDHA increases the invasion of prostate cancer cells.
SIRT5에 의한 전립선암 세포주의 이동(migration) 및 침윤(invasion)을 평가하였을 때, 도 6(A)에 나타난 바와 같이, SIRT5 KO 세포주에서 증가된 이동(migration)을 확인할 수 있고, 도 6(B)에 나타난 바와 같이, SIRT5 선택적 억제제(inhibitor)에 의해 증가된 이동(migration)을 확인할 수 있다. When evaluating the migration and invasion of prostate cancer cell lines by SIRT5, increased migration was confirmed in the SIRT5 KO cell line, as shown in Figure 6 (A), and Figure 6 (B) ), increased migration can be confirmed by the SIRT5 selective inhibitor.
도 8(A) 및 (B)는 LDHA의 118번 리신 잔기의 숙시닐화(succinylation)를 선택적으로 인지하는 항체(anti-LDHAK118su)를 생산하여 전립선암 진행과 LDHA의 118번 숙시닐화(succinylation)를 증명하였다. 또한, 도 8(C)에 나타난 바와 같이, SIRT5와 숙시닐화(Succinylation)의 상관성을 증명하였다. Figures 8 (A) and (B) show the production of an antibody (anti-LDHAK118su) that selectively recognizes succinylation of lysine residue 118 of LDHA, thereby inhibiting prostate cancer progression and succinylation of 118 lysine residue of LDHA. It has been proven. Additionally, as shown in Figure 8(C), the correlation between SIRT5 and succinylation was demonstrated.
도 9는 항체(anti-LDHAK118su)를 생산이 용이하여 전립선암 진행에 따라 발현이 증가됨을 증명하였다. SIRT5 감소(선행연구)와 LDHA의 숙시닐화(succinylation)의 증가는 전립선암의 진행을 진단하는 바이오마커로 활용 가능성을 나타낸다. Figure 9 demonstrates that the antibody (anti-LDHAK118su) is easy to produce and its expression increases as prostate cancer progresses. A decrease in SIRT5 (previous study) and an increase in succinylation of LDHA indicate the possibility of use as a biomarker for diagnosing the progression of prostate cancer.
도 10은 최종적인 SIRT5와 LDHA의 전립선암 진행과 관련된 기전에 관한 모식도를 나타내었다. Figure 10 shows a schematic diagram of the final SIRT5 and LDHA mechanisms related to prostate cancer progression.
여기서, 본 발명의 "바이오마커"는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 분자 또는 화합물로서, 생체의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 말한다.Here, the “biomarker” of the present invention is generally a molecule or compound detectable in a biological sample and refers to an indicator that can detect changes in the living body.
본 발명의 "바이오마커 조성물"은 바이오마커에 특이적으로 결합하여 그의 발현 수준을 측정할 수 있는 물질로서, 항체, 앱타머(aptamer), PNA(peptide nucleic acid) 등일 수 있다.The “biomarker composition” of the present invention is a substance that can specifically bind to a biomarker and measure its expression level, and may be an antibody, aptamer, PNA (peptide nucleic acid), etc.
<전립선암 예후 예측용 조성물><Composition for predicting prostate cancer prognosis>
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 전립선암 예후 예측용 조성물을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, the present invention is a prostate comprising an agent for measuring the mRNA expression level of a lysine-succinylated lactate dehydrogenase A (LDHA) protein or a gene encoding the protein. A composition for predicting cancer prognosis is provided.
본 발명자들은 전립선암의 예후를 신속 및 정확하게 분석할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전립선암 조직 또는 세포에서 발현된 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA)의 발현수준과 전립선암 의 예후 사이에 유의적인 상관관계가 있어, 상기 마커를 통하여 전립선암의 예후 판정이 가능함을 확인하였다.The present inventors made extensive research efforts to discover new biomarkers that can quickly and accurately analyze the prognosis of prostate cancer. As a result, there was a significant correlation between the expression level of lactate dehydrogenase A (LDHA), in which lysine expressed in prostate cancer tissues or cells is succinylated, and the prognosis of prostate cancer, and the prostate cancer was diagnosed through this marker. It was confirmed that it was possible to determine the prognosis of cancer.
따라서, 본 발명의 바이오마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료(전립선암 조직 또는 세포)로부터 전립선암의 예후를 신속하고 정확하게 분석(예측)할 수 있다. Therefore, by using the biomarker of the present invention, the prognosis of prostate cancer can be quickly and accurately analyzed (predicted) from a sample (prostate cancer tissue or cells) collected from an individual.
본 발명에서 사용되는 용어,"예후"는 전립선암의 진행 가능성 및 진행 과정을 말하며, 전립선 암의 차도 및 전립선 암의 재발/전이에 대한 예측을 포함한다.The term “prognosis” used in the present invention refers to the possibility and progression of prostate cancer, and includes prediction of remission of prostate cancer and recurrence/metastasis of prostate cancer.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, an agent for measuring the expression level of the protein may include an antibody specific for the protein.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, an agent for measuring the expression level of the mRNA may include a primer pair, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the mRNA.
본 발명의 일 구체예에 따른 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제는 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA) 단백질에 특이적인 항체를 포함한다. 따라서, 전립선 암 환자 유래 시료로부터 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA) 단백질을 정량할 수 있으므로, 전립선 암 환자의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.The agent for measuring the expression level of the biomarker of the present invention according to one embodiment of the present invention includes an antibody specific for the lactate dehydrogenase A (LDHA) protein in which lysine is succinylated. Therefore, since lysine-succinylated lactate dehydrogenase A (LDHA) protein can be quantified from samples derived from prostate cancer patients, it can be used to predict the prognosis of prostate cancer patients.
본 발명의 키트에서 이용되는 프라이머 또는 프로브는 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA) 단백질을 암호화하는 유전 자의 mRNA 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다The primer or probe used in the kit of the present invention may have a sequence complementary to the mRNA sequence of the gene encoding the lactate dehydrogenase A (LDHA) protein in which lysine is succinylated.
본 발명에서 사용되는 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA) 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 서열에 선택적으로 혼성화될 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "상보적"은 용어 "완전 상보적"(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A(Lactate dehydrogenase A, LDHA) 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다As used in the present invention, "complementary" refers to a selective mRNA sequence of a gene encoding a lactate dehydrogenase A (LDHA) protein in which lysine is succinylated under certain hybridization or annealing conditions. This means having a level of complementarity that allows hybridization. Therefore, the term "complementary" has a different meaning from the term "perfectly complementary", and the primer or probe of the present invention is a lysine succinylated Lactate dehydrogenase A (LDHA) protein. If it can selectively hybridize to the mRNA sequence of the gene encoding, it may have one or more mismatch base sequences.
본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 하에서 주형- 지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 말한다. PCR 조건 및 프라이머 쌍의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.As used herein, the term “primer” refers to a single-stranded oligonucleotide that can serve as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions in a suitable buffer at a suitable temperature. PCR conditions and primer pair lengths can be appropriately selected according to techniques known in the art.
본 명세서에서 사용되는 용어, "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 표적 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다.As used herein, the term "probe" refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and capable of specifically hybridizing to a target nucleotide sequence; It may exist naturally or may be artificially synthesized.
프로브의 표지에 의하여 혼성화 여부를 검출케 하는 신호의 제공이 가능하며, 표지는 올리고뉴클레오타이드에 연결되는 것일 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예를 들어, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), Cy3 및 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예를 들어, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있다.It is possible to provide a signal for detecting hybridization by labeling the probe, and the label may be linked to an oligonucleotide. Suitable labels include fluorophores (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, Cy3, and Cy5 (Pharmacia)), chromophores, chemiluminophores, magnetic particles, and radioactivity. Isotopes (P 32 and S 35 ), mass labels, electron dense particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (e.g. gold) and antibodies; It includes, but is not limited to, haptens with specific binding partners such as streptavidin, biotin, digoxigenin, and chelating groups. Labeling can be performed using various methods commonly practiced in the art, such as the nick translation method, the random priming method (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham" (1989)), and the kination method (Maxam & Gilbert, Methods). in Enzymology, 65:499 (1986)). Labels can provide signals that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetry, gravimetry, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, radiofrequency hybridization, or nanocrystals.
<전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법><How to provide information for prostate cancer diagnosis>
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 전립선암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 a) 피검자로부터 분리된 생물학적 시료에서 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 측정된 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함한다.According to another embodiment of the present invention, the present invention provides a method of providing information for diagnosing prostate cancer. Specifically, the method includes a) measuring the expression level of LDHA in which lysine is succinylated in a biological sample isolated from a subject; and b) comparing the measured expression level of lysine-succinylated LDHA with the normal control group.
상기 a) 단계는 전립선암을 진단하기 위해 암 의심 환자(피검자)의 생물학적 시료에서 바이오마커인 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 존재 여부 및 발현 수준을 확인하는 과정이다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 대장 세포 및 대장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 피검자로부터 수득이 용이한 혈액, 혈장 또는 혈청인 것이 바람직하다. 이때, 리신이 숙시닐화 된 LDHA에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 반응 방법으로 단백질의 양을 측정할 수 있다. 상기 항원-항체 반응은 웨스턴 블롯, 면역침강법(IP), 방사능 면역 분석법(RIA), 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 면역염색법(IHC), 유세포 분석법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, 단백질칩 등의 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 전술한 전립선암 진단용 키트를 사용하여 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 발현 수준을 측정할 수 있다.Step a) is a process of confirming the presence and expression level of LDHA, a biomarker in which lysine is succinylated, in a biological sample from a patient (subject) suspected of having cancer in order to diagnose prostate cancer. The biological sample may be selected from the group consisting of blood, plasma, serum, colon cells, and colon tissue, and is preferably blood, plasma, or serum that can be easily obtained from the subject. At this time, the amount of protein can be measured using an antigen-antibody reaction method using an antibody that specifically binds to lysine-succinylated LDHA. The antigen-antibody reaction includes Western blot, immunoprecipitation (IP), radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunostaining (IHC), flow cytometry (FACS), enzyme matrix colorimetric assay, and antigen-antibody reaction. -It may be performed using methods such as antibody agglutination or protein chips. For example, the expression level of LDHA in which lysine is succinylated can be measured using the aforementioned prostate cancer diagnostic kit.
상기 b) 단계는 암 의심 환자에서 측정된 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 발현 수준을 정상인과 비교하는 과정이다. 이때, 측정된 리신이 숙시닐화 된 LDHA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우, 전립선암으로 진단할 수 있다.Step b) is a process of comparing the expression level of lysine-succinylated LDHA measured in patients suspected of having cancer with that of normal people. At this time, if the measured expression level of LDHA, in which lysine is succinylated, is higher than that of the normal control group, prostate cancer can be diagnosed.
본 발명의 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것) 등을 포함한다.“Diagnosis” in the present invention means confirming the presence or characteristics of a pathological condition, determining the susceptibility of an individual to a specific disease or disorder, and whether an individual currently has a specific disease or condition. determining the prognosis of an individual with a specific disease or condition, therametrics (e.g., monitoring the condition of an object to provide information about the efficacy of treatment), etc. Includes.
<전립선암의 예후 예측에 필요한 정보 제공 방법><Method of providing information needed to predict prognosis of prostate cancer>
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명은 전립선암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 A) 피검자로부터 분리된 생물학적 시료에서 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 B) 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함한다.According to another embodiment of the present invention, the present invention provides a method of providing information necessary for predicting the prognosis of prostate cancer. Specifically, the method includes the steps of A) measuring the mRNA expression level of the gene encoding lactate dehydrogenase A protein in which lysine is succinylated in a biological sample isolated from a subject; and B) comparing the mRNA expression level of the gene or the expression level of the protein with a control sample.
본 발명의 바이오마커인 신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것은 전립선암의 예후를 예측하기 위하여 전립선 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 바이오마커를 암호화하는 유전자의 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로써, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Measuring the mRNA level of the gene encoding the succinylated lactate dehydrogenase A protein, the biomarker of the present invention, is a gene encoding the biomarker in biological samples isolated from prostate cancer patients to predict the prognosis of prostate cancer. As a process to confirm the presence and expression level of mRNA, reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (competitive RT-PCR), real time quantitative RT- It may be performed by PCR), RNase protection method, Northern blotting, or DNA chip technology, but is not limited thereto.
본 발명의 바이오마커인 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A 단백질의 수준을 측정하는 것은 전립선암의 예후를 예측하기 위하여 전립선 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 바이오마커의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로써, 웨스턴블롯(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmuno assay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석 법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Measuring the level of lactate dehydrogenase A protein in which lysine is succinylated, which is the biomarker of the present invention, confirms the presence and expression level of the biomarker in biological samples isolated from prostate cancer patients in order to predict the prognosis of prostate cancer. As a process, western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmuno assay (RIA), radial immunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunization. Rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography, FACS analysis. It may be performed using (fluorescence activated cell sorter analysis) or protein chip technology, but is not limited thereto.
본 발명의 바이오마커인 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A는 예후가 나쁜 전립선 암 환자에서 발현이 증가하므로, 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우, 전립선암 예후가 나쁠 것으로 판단한다. Since the expression of lactate dehydrogenase A with succinylated lysine, which is the biomarker of the present invention, increases in prostate cancer patients with poor prognosis, when the expression level of lactate dehydrogenase A with succinylated lysine is higher than that in the normal control group, The prognosis for prostate cancer is judged to be poor.
본 발명인 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A에 특이적으로 결합하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물과 키트 및 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 따르면, 전립선암 진행을 진단하여 적절한 치료방향을 결정할 수 있어, 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하므로, 불량한 예후의 전립선 암 환자의 전립 선 암 재발 및 사망률을 감소시킬 수 있으므로, 전립선 암 환자의 효과적인 치료에 유용하게 활용할 수 있다.According to the present invention, a biomarker composition and kit for diagnosing prostate cancer in which lysine specifically binds to succinylated lactate dehydrogenase A, and a method for providing information for diagnosing prostate cancer, it is possible to diagnose the progression of prostate cancer and determine an appropriate treatment direction. Therefore, it is possible to provide a treatment method tailored to each patient, thereby reducing the recurrence and mortality rate of prostate cancer in prostate cancer patients with poor prognosis, and thus can be useful in the effective treatment of prostate cancer patients.
도 1은 선행 연구에서 실시한 전이성 전립선암 세포주에서 SIRT5의 유의적 감소를 나타낸 것으로, SIRT5의 역할을 규명하기 위해 SIRT5 KO 세포주를 만들어서 SIRT5만 선택적으로 감소를 확인 함
도 2는 선행 연구에서 실시한 SIRT5 KO 세포주의 높은 이동(migration)과 침윤(invasion)을 가짐을 확인한 그래프
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 SIRT5는 탈숙시닐 효소로서 SIRT5가 감소되면 단백질 숙시닐(succinyl)이 증가됨을 in vitro 및 환자시료에서 확인한 그래프로, 실제 전립선암 조직의 진행에 따라 SIRT5는 감소, 단백질 숙시닐은 증가함
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 전립선암의 진행에 영향을 미치는 SIRT5(효소)의 기질을 찾기 위한 단백체 실험 모식도
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 LDHA효소의 K118번 위치의 숙시닐 화가 SIRT5와 관련됨을 규명 한 아미노산 서열
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 SIRT5에 의한 전립선암 세포주의 이동(migration) 및 침윤(invasion)을 평가한 그래프로, (A) SIRT5 KO 세포주에서 증가된 이동(migration), (B) SIRT5 선택적 저해제(inhibitor)에 의해 증가된 이동(migration)을 나타냄
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 LDHA의 118번 리신 잔기의 숙시닐화가 LDHA의 활성을 증가시켜, 전립선암 세포의 침략(invasion)을 증가시킴을 나타낸 그래프
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라, A 및 B는 LDHA의 118번 라이신 잔기의 숙시닐화를 선택적으로 인지하는 항체(anti-LDHAK118su)를 생산하여 전립선암 진행과 LDHA의 118번 숙시닐화을 증명한 그래프, C는 SIRT5와 숙시닐화의 상관성을 증명한 그래프
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 항체(anti-LDHAK118su)를 생산이 용이하여 전립선암 진행에 따라 발현이 증가됨을 증명한 그래프
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 최종적인 SIRT5와 LDHA의 전립선암 진행에 관련된 기전에 관한 모식도
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 SIRT5-KO에서 LDHA의 숙시닐기화 증가를 나타낸 웨스턴 블롯(western blot) 결과
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 항체(anti-LDHAK118su) 생성을 확인한 결과이다. Figure 1 shows a significant decrease in SIRT5 in a metastatic prostate cancer cell line conducted in a previous study. To investigate the role of SIRT5, a SIRT5 KO cell line was created and a selective decrease in SIRT5 was confirmed.
Figure 2 is a graph confirming that the SIRT5 KO cell line conducted in a previous study had high migration and invasion.
Figure 3 is a graph confirming in vitro and patient samples that SIRT5 is a desuccinyl enzyme and that when SIRT5 is reduced, protein succinyl increases, according to an embodiment of the present invention. SIRT5 actually decreases with the progression of prostate cancer tissue. decreases, protein succinyl increases
Figure 4 is a schematic diagram of a proteomic experiment to find a substrate of SIRT5 (enzyme) that affects the progression of prostate cancer according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 is an amino acid sequence demonstrating that succinylation at position K118 of the LDHA enzyme is related to SIRT5 according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 is a graph evaluating migration and invasion of prostate cancer cell lines by SIRT5 according to an embodiment of the present invention, (A) increased migration in SIRT5 KO cell line, (B) Shows increased migration by SIRT5 selective inhibitor
Figure 7 is a graph showing that succinylation of lysine residue 118 of LDHA increases the activity of LDHA and increases invasion of prostate cancer cells according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows that, according to one embodiment of the present invention, A and B produce an antibody (anti-LDHAK118su) that selectively recognizes succinylation of lysine residue 118 of LDHA, thereby preventing prostate cancer progression and succinylation of 118 lysine residue of LDHA. Proven graph, C is a graph that proves the correlation between SIRT5 and succinylation
Figure 9 is a graph demonstrating that the antibody (anti-LDHAK118su) is easily produced according to an embodiment of the present invention and its expression increases as prostate cancer progresses.
Figure 10 is a schematic diagram of the final mechanism of SIRT5 and LDHA related to prostate cancer progression according to an embodiment of the present invention.
Figure 11 is a Western blot result showing an increase in succinyl gyration of LDHA in SIRT5-KO according to an embodiment of the present invention.
Figure 12 shows the results of confirming the production of antibody (anti-LDHAK118su) according to an embodiment of the present invention.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.The terms used in this specification will be briefly explained, and the present invention will be described in detail.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.The terms used in the present invention are general terms that are currently widely used as much as possible while considering the functions in the present invention, but this may vary depending on the intention or precedent of a person working in the art, the emergence of new technology, etc. Therefore, the terms used in the present invention should be defined based on the meaning of the term and the overall content of the present invention, rather than simply the name of the term.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.When it is said that a part “includes” a certain element throughout the specification, this means that it does not exclude other elements, but may further include other elements, unless specifically stated to the contrary.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Below, with reference to the attached drawings, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art can easily implement the present invention. However, the present invention may be implemented in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.Specific details, including the problem to be solved by the present invention, the means for solving the problem, and the effect of the invention, are included in the examples and drawings described below. The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the attached drawings.
실시예 1. 전립선암 예후 예측을 위한 바이오마커 선택 및 분석 방법 Example 1. Biomarker selection and analysis method for predicting prostate cancer prognosis
1-1. 전립선 조직 임상 샘플1-1. Prostate tissue clinical samples
전립선암(이하, PCa)에서 리신 아실화의 스크리닝을 위해, pan 항-숙시닐-리신 항체(PTM-401; PTM Biolabs), pan 항-아세틸-리신 항체(PTM-101; PTM Biolabs), pan 항-말로닐-리신에 특이적인 1차 항체(PTM-901; PTM Biolabs), pan 항글루타릴-리신 항체(PTM-1151; PTM Biolabs) 및 pan 항-3-하이드록시-부티릴-리신 항체(PTM-1201; PTM Biolabs)를 구입하였다. HRP 연결 마우스 및 토끼 2차 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 입수했다.For screening of lysine acylation in prostate cancer (PCa), pan anti-succinyl-lysine antibody (PTM-401; PTM Biolabs), pan anti-acetyl-lysine antibody (PTM-101; PTM Biolabs), pan Primary antibodies specific for anti-malonyl-lysine (PTM-901; PTM Biolabs), pan anti-glutaryl-lysine antibody (PTM-1151; PTM Biolabs), and pan anti-3-hydroxy-butyryl-lysine antibody. (PTM-1201; PTM Biolabs) was purchased. HRP-linked mouse and rabbit secondary antibodies were obtained from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
1-2. PCa 세포주 배양1-2. PCa cell line culture
LNCaP, LNCaP-LN3, PC-3 및 PC-3M을 포함한 PCa 세포주는 KCLB에서 구입했다. 정상 전립선 세포주인 RWPE1은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 입수했다. 암 세포주는 가습 인큐베이터에서 5 % CO2 분위기의 37 °C에서 10 % FBS 및 1 % 페니실린 G 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 정상 전립선 세포주는 인간 재조합 표피 성장 인자 및 소 뇌하수체 추출물을 포함하는 인간 각질세포 성장 보충 키트(Gibco, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 각질세포 SFM(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)에서 성장했다.PCa cell lines, including LNCaP, LNCaP-LN3, PC-3, and PC-3M, were purchased from KCLB. RWPE1, a normal prostate cell line, was obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cancer cell lines were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin G and streptomycin at 37 °C in a 5% CO 2 atmosphere in a humidified incubator. Normal prostate cell lines were grown in keratinocyte SFM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) using the human keratinocyte growth supplementation kit (Gibco, Thermo Fisher Scientific) containing human recombinant epidermal growth factor and bovine pituitary extract.
1-3. Sandwich ELISA1-3. Sandwich ELISA
전립선 조직에서 SIRT5 및 숙시닐-리신(이하, Ksu)의 수준을 측정하기 위해 SIRT5에 대한 마우스 단일클론 항체 50mL/well 및 0.2 M 중탄산나트륨(2 mg/mL)으로 희석된 Ksu를 사용하여 멸균된 96well 폴리스티렌 플레이트(Corning)를 2시간 동안 코팅했다. 다음으로, 플레이트를 TBS-T로 3회 세척하고 TBS-T 중 3% BSA와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. RIPA 완충액으로 용해된 정상 전립선 조직 및 PCa 조직을 실온(RT)에서 5시간 동안 인큐베이션한 후 다시 세척하였다. 그 다음, 50 mL/well 검출 항체(3% BSA로 희석된 SIRT5 토끼 다클론성 항체)를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하기 위해 첨가하였다. 플레이트를 3회 세척한 후 2차 항체(HRP-conjugated rabbit antibody)를 2시간 동안 첨가한 후 5회 세척하였다. 마지막으로 TMB 기질(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 각 well에 첨가하여 적절한 색상을 시각화했다. 정확한 측정을 위해 색 변화를 멈추기 위해 stop solution(Thermo Fisher Scientific)을 사용했다. 플레이트는 450 nm에서 광학 밀도에 대해 측정되었다.To measure the levels of SIRT5 and succinyl-lysine (hereafter, Ksu) in prostate tissue, 50 mL/well of mouse monoclonal antibody against SIRT5 and Ksu diluted in 0.2 M sodium bicarbonate (2 mg/mL) were used in sterilized cells. A 96-well polystyrene plate (Corning) was coated for 2 hours. Next, the plate was washed three times with TBS-T and incubated overnight at 4°C with 3% BSA in TBS-T. Normal prostate tissue and PCa tissue dissolved in RIPA buffer were incubated at room temperature (RT) for 5 hours and then washed again. Then, 50 mL/well detection antibody (SIRT5 rabbit polyclonal antibody diluted in 3% BSA) was added for overnight incubation at 4 °C. After washing the plate three times, secondary antibody (HRP-conjugated rabbit antibody) was added for 2 hours and washed five times. Finally, TMB substrate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) was added to each well to visualize the appropriate color. For accurate measurement, a stop solution (Thermo Fisher Scientific) was used to stop the color change. Plates were measured for optical density at 450 nm.
1-4. 면역형광 염색1-4. Immunofluorescence staining
세포를 실온에서 30분 동안 3.2 % 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)로 고정시켰다. 세포를 PBS(PBST) 중 0.1% Triton X-100으로 투과화한 다음 PBST 중 10 % 정상 염소 혈청(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)으로 37 ℃에서 1시간 동안 차단했다. 세포를 SIRT5(Abcam) 및 COX IV(Abcam)에 대한 1차 항체와 함께 2 % 정상 염소 혈청을 함유하는 PBST에 희석하여 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후 10분 동안 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 실온에서 3시간 동안 Alexa 488- 또는 568-접합된 이차 항체와 함께 배양한 다음 실온에서 8분 동안 4',6-디아미디노 2-페닐인돌(4′,6-diamidino 2-phenylindole)로 염색하였다. 샘플을 Vectashield 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 장착하고 이미징을 위해 600X 대물렌즈를 사용하여 공초점 현미경(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA)을 사용하여 이미지를 생성했다.Cells were fixed with 3.2% paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) for 30 minutes at room temperature. Cells were permeabilized with 0.1% Triton Cells were incubated overnight at 4°C with primary antibodies against SIRT5 (Abcam) and COX IV (Abcam) diluted in PBST containing 2% normal goat serum and then washed three times for 10 min. Cells were then incubated with Alexa 488- or 568-conjugated secondary antibodies for 3 h at room temperature and then incubated with 4′,6-diamidino 2-phenylindole for 8 min at room temperature. stained with phenylindole). Samples were mounted on slides using Vectashield mounting medium and imaged using a confocal microscope (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA) using a 600X objective for imaging.
1-5. 세포 배양에서 아미노산에 의한 안정 동위원소 표지(SILAC)1-5. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)
SILAC 실험을 위해 PC-3 및 PC-3M 세포는 7번의 성장 계대에 걸쳐 SILAC RPMI 1640 배지에서 경질 또는 중질 아미노산으로 표지되었다. SILAC RPMI 1640 배지는 48 mg/L 리신 및 200 mg/L 아르기닌(SILAC "경량") 또는 13C615N2-리신 및 13C615N4-아르기닌(SILAC "중")으로 보충되었다. 생물학적 복제물은 동일한 세포 배양에서 2주 간격으로 수확되었다. SILAC 표지 효율이 >98 % 임을 확인한 후, 세포를 RIPA 완충액으로 용해하고, BCA 분석에 의해 용해물을 정량하였다. 우리는 두 세포주를 동등하게 혼합하고(각각 300mg) 15mM DTT 및 60mM IAA를 사용하여 환원 및 알킬화를 수행했다. 37 °C에서 밤새 트립신 소화를 사용하여 단백질을 펩티드로 소화했다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 고 pH 역상 분획 및 오프 겔 분획을 수행했다. PC-3 및 PC-3M 세포주는 각각 경량(K0R0) 및 중량(K8R10) SILAC 배지로 표지되었다. For SILAC experiments, PC-3 and PC-3M cells were labeled with light or heavy amino acids in SILAC RPMI 1640 medium over seven growth passages. SILAC RPMI 1640 medium was supplemented with 48 mg/L lysine and 200 mg/L arginine (SILAC “light”) or 13C615N2-lysine and 13C615N4-arginine (SILAC “heavy”). Biological replicates were harvested 2 weeks apart from the same cell culture. After confirming that the SILAC labeling efficiency was >98%, cells were lysed with RIPA buffer, and the lysates were quantified by BCA analysis. We mixed the two cell lines equally (300 mg each) and performed reduction and alkylation using 15mM DTT and 60mM IAA. Proteins were digested into peptides using trypsin digestion overnight at 37 °C. High pH reversed-phase fractionation and off-gel fractionation were then performed according to the manufacturer's protocol. PC-3 and PC-3M cell lines were labeled with light (K0R0) and heavy (K8R10) SILAC media, respectively.
실시예 2. proteomic 분석Example 2. Proteomic analysis
2-1. 샘플 준비 및 용액 내 트립신 분해2-1. Sample preparation and trypsin digestion in solution
SILAC으로 표지된 암세포의 접시를 얼음 위의 PBS로 두 번 세척한 다음 정지 프로테아제 억제제 칵테일, 4M 부티르산 나트륨(sodium butyrate) 및 HDAC 억제제로서 2M 니코틴아미드(nicotinamide)가 포함된 4 % SDS 용해 완충액으로 긁었다. 완전한 단백질 추출을 보장하기 위해 세포 용해물을 4 °C에서 1분 동안 초음파 처리하여 파괴하고 98 °C에서 5분 동안 가열했다. 파손되지 않은 세포는 4 °C에서 10분 동안 16,000 g에서 원심분리하여 제거하고 상층액을 저단백질 결합 E-튜브로 옮겼다. PC-3 및 PC-3M 세포의 단백질은 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정되었다. PC-3 및 PC-3M 세포의 동일한 양의 단백질을 SILAC 기반 정량적 프로테오믹스를 위해 조심스럽게 혼합했다. 결합된 단백질을 순차적으로 환원시키고 56 ℃에서 30분 동안 15mM DTT로 알킬화하고 RT에서 30분 동안 60mM IAA로 암실에서 알킬화시켰다. 단백질 혼합물에 존재하는 세제 및 화학 시약은 4 °C에서 4시간 동안 10 % 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 단백질 침전 후 제거되었다. 4 °C에서 10분 동안 12,000 g에서 원심분리한 후, 단백질 펠렛을 20 °C 아세톤으로 두 번 세척한 다음 얼음 위에서 5분 동안 초음파 처리를 사용하여 50mM ABC 완충액에 재현탁했다. 펩티드를 생성하기 위해 SILAC 단백질을 회전 장치에서 밤새 37 °C에서 트립신으로 소화시켰다. TFA의 10 % 용액을 펩타이드에 최종 농도가 1 %가 되도록 첨가하여 트립신 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물을 16,000g에서 5분 동안 원심분리하여 효소와 소화되지 않은 단백질을 제거했다. 리신 숙시닐화를 평가하기 위한 면역침전 전에, 제조사의 지침에 따라 C18 Sep-Pak을 사용하여 펩티드를 세척하였다. C18 3cc Sep-Pak을 3 mL의 100 % ACN과 2 mL의 50 % ACN으로 적셨다. 평형을 위해 Sep-Pak을 0.1 % TFA를 포함하는 2 mL의 물을 첨가하여 3회 세척했다. 펩타이드를 카트리지에 천천히 로드한 다음 0.1% TFA를 포함하는 2 mL 물을 사용하여 3회 탈염했다. 샘플은 다음을 포함하는 75% ACN 1mL로 두 번 용출되었다. 0.1 % TFA를 매번 및 세 번째로 사용하여 펩타이드 회수를 극대화하였다. 정제된 샘플은 속도-진공 시스템을 사용하여 건조되었다. 정량적 비색 펩티드 분석을 사용하여 샘플에서 펩티드의 양을 측정하였다.Dish of SILAC-labeled cancer cells were washed twice with PBS on ice and then scraped with 4% SDS lysis buffer containing quiescent protease inhibitor cocktail, 4 M sodium butyrate, and 2 M nicotinamide as HDAC inhibitor. It was. To ensure complete protein extraction, cell lysates were disrupted by sonication for 1 min at 4 °C and heated at 98 °C for 5 min. Unbroken cells were removed by centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4 °C, and the supernatant was transferred to low-protein binding E-tubes. Proteins in PC-3 and PC-3M cells were measured using the BCA protein assay kit. Equal amounts of proteins from PC-3 and PC-3M cells were carefully mixed for SILAC-based quantitative proteomics. Bound proteins were sequentially reduced and alkylated with 15mM DTT for 30 min at 56°C and with 60mM IAA for 30 min at RT in the dark. Detergents and chemical reagents present in the protein mixture were removed after protein precipitation with 10% trichloroacetic acid for 4 hours at 4 °C. After centrifugation at 12,000 g for 10 min at 4 °C, the protein pellet was washed twice with acetone at 20 °C and then resuspended in 50 mM ABC buffer using sonication for 5 min on ice. To generate peptides, SILAC proteins were digested with trypsin at 37 °C overnight on a rotator. The trypsin reaction was stopped by adding a 10% solution of TFA to the peptides to a final concentration of 1%. The reaction mixture was centrifuged at 16,000 g for 5 minutes to remove enzymes and undigested proteins. Before immunoprecipitation to assess lysine succinylation, peptides were washed using C18 Sep-Pak according to the manufacturer's instructions. Wet a C18 3cc Sep-Pak with 3 mL of 100% ACN and 2 mL of 50% ACN. For equilibration, the Sep-Pak was washed three times by adding 2 mL of water containing 0.1% TFA. Peptides were slowly loaded into the cartridge and then desalted three times using 2 mL water containing 0.1% TFA. Samples were eluted twice with 1 mL of 75% ACN containing: Peptide recovery was maximized by using 0.1% TFA every time and every third time. Purified samples were dried using a speed-vacuum system. Quantitative colorimetric peptide analysis was used to determine the amount of peptide in the sample.
2-2. LC-MS/MS 분석2-2. LC-MS/MS analysis
심층 정량적 단백질체학을 위한 펩티드 분획 단백질 식별을 개선하기 위해 SILAC 펩타이드는 두 가지 다른 프로세스, 즉 고 pH 역상 분획 및 3100 OFFGEL 분획으로 분리되었다. 펩타이드의 분획은 제조사의 절차에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 펩티드(100μg)는 ACN에서 0.1% TEA로 만들어졌고 8개의 다른 용리 완충액(5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 0.1% TFA에서 20% 및 50% ACN)을 사용하는 고 pH 역상 분획 키트를 사용하여 분리되었다. 8개의 샘플을 4개의 샘플(예: 분획 1 및 5, 2 및 6 등)로 결합했다. 고해상도 24웰 프레임 IPG 스트립(pH 3-10)을 사용하여 OFFGEL 분획으로 펩티드(200μg)를 분리했다. 이들은 또한 24개 분획에서 파생된 12개 샘플로 결합되었다. 모든 분획화 된 샘플은 C18 zip 팁을 사용하여 탈염되었고 추가 분석 전에 속도-진공 시스템을 사용하여 완전히 건조되었다.Peptide fractionation for in-depth quantitative proteomics To improve protein identification, SILAC peptides were separated by two different processes: high pH reversed-phase fractionation and 3100 OFFGEL fractionation. Fractionation of peptides was performed according to the manufacturer's procedures. Briefly, peptides (100 μg) were made in 0.1% TEA in ACN and incubated in eight different elution buffers (5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20% and 50% ACN in 0.1% TFA). ) was separated using a high pH reversed phase fractionation kit. Eight samples were combined into four samples (e.g. fractions 1 and 5, 2 and 6, etc.). Peptides (200 μg) were separated into OFFGEL fractions using high-resolution 24-well frame IPG strips (pH 3–10). These were also combined into 12 samples derived from 24 fractions. All fractionated samples were desalted using C18 zip tips and thoroughly dried using a speed-vacuum system before further analysis.
모든 샘플을 용매 A(0.1% FA 중 98% 물)에 용해시켰다. 특히, IP 샘플을 16,000g에서 5분 동안 원심분리하여 남아 있는 비드를 제거했다. 샘플은 Mass Spectrometry Convergence Research Center의 Eksigent nanoLC 시스템에 연결된 고해상도의 정확한 MS를 사용하여 분석되었다. 펩티드 분리는 95분 동안 0-23% 용매 B(0.1% FA의 100% ACN), 9분 동안 23-90% 용매 B의 선형 구배가 있는 직접 만든 C12 역상 분석 컬럼을 사용하여 수행되었다. 300nL/min의 지속 유속으로 6분 동안 90% 용매 B. LTQ-velos Orbitrap은 상위 20개 DDA(데이터 종속 수집) 모드에서 작동되었다. MS 데이터는 다음 설정을 사용하여 수집되었다. 전자분무 소스 전압 1.8 kV 및 300 °C 모세관 온도; FTMS 300-1800 m/z 범위, 60,000 분해능(m/z 400), 28 % NCE 및 1.7 m/z의 격리 폭에서 충돌 유도 해리 모드; DDA에는 최소 500개의 신호가 필요했다. 질량 정확도를 개선하기 위해 주변 공기로부터 질량 이온 잠금(m/z 445.120024)이 활성화되었다.All samples were dissolved in solvent A (98% water in 0.1% FA). Specifically, the IP samples were centrifuged at 16,000 g for 5 minutes to remove any remaining beads. Samples were analyzed using high-resolution, accurate MS coupled to an Eksigent nanoLC system at the Mass Spectrometry Convergence Research Center. Peptide separation was performed using a homemade C12 reversed-phase analytical column with a linear gradient of 0–23% solvent B (100% ACN in 0.1% FA) over 95 min, 23–90% solvent B over 9 min. 90% solvent B for 6 min at a sustained flow rate of 300 nL/min. The LTQ-velos Orbitrap was operated in top 20 data dependent acquisition (DDA) mode. MS data were collected using the following settings. Electrospray source voltage 1.8 kV and 300 °C capillary temperature; FTMS Collision-induced dissociation mode in the 300-1800 m/z range, 60,000 resolution (m/z 400), 28 % NCE, and isolation width of 1.7 m/z; DDA required a minimum of 500 signals. To improve mass accuracy, mass ion locking (m/z 445.120024) from ambient air was enabled.
2-3. 숙시닐롬에 대한 데이터 분석 및 생물정보학2-3. Data analysis and bioinformatics for succinylome
단백질 및 Ksucc 단백질을 식별하기 위해 MS/MS 스펙트럼을 MaxQuant 1.5.1.0을 사용하여 처리하여 UniProtKB 인간 데이터베이스(71,772개의 단백질 서열 포함, 19029910)를 쿼리했다. 검색 매개변수는 20 ppm의 전체 질량 오류와 0.5 Da의 MS/MS 오류를 사용했다. 트립신/p를 소화 효소로 사용하여 2개의 누락된 절단을 허용했다. 고정된 변형은 시스테인의 카르바미도메틸화(carbamidomethylation)였습니다. 프로테오믹 분석(proteomic search)을 위해 메티오닌(methionine)의 산화와 N-말단의 아세틸화(acetylation)을 가변적으로 설정하였다. 숙시닐화 분석을 위해 변수 수정으로 Ksu를 추가했다. SILAC에 의한 정량화를 위해 Lys8(13C615N2) 및 Arg10(13C615N4)을 무거운 표지(H)로 지정하고 Lys0(12C614N2) 및 Arg0(12C614N4)을 가벼운 표지(L)로 설정했다. MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 전체 MS에서 SILAC 쌍(H/L)을 검출하고 정량화했다. 비율은 최소 비율 개수의 H/L 및 2를 결정했다. MaxQuant의 다른 매개변수는 기본값으로 설정되었다.To identify proteins and Ksucc proteins, MS/MS spectra were processed using MaxQuant 1.5.1.0 to query the UniProtKB human database (containing 71,772 protein sequences, 19029910). Search parameters used were a total mass error of 20 ppm and an MS/MS error of 0.5 Da. Trypsin/p was used as the digestion enzyme, allowing for two missed cleavages. The modification fixed was carbamidomethylation of cysteine. For proteomic search, oxidation of methionine and acetylation of the N-terminus were set to variable. For succinylation analysis, Ksu was added as a variable modification. For quantification by SILAC, Lys8(13C615N2) and Arg10(13C615N4) were designated as heavy labels (H), and Lys0(12C614N2) and Arg0(12C614N4) were set as light labels (L). SILAC pairs (H/L) were detected and quantified in full MS using MaxQuant software. The ratio was determined to be H/L and 2 of the minimum ratio number. Other parameters of MaxQuant were set to default values.
검색 결과는 0.01 미만의 잘못된 발견 비율, 40 이상의 MaxQuant 점수, 잠재적인 오염 물질을 버리고 사이트 수정으로만 식별된 것으로 필터링되었다. 또한 Ksu 사이트는 > 0.75의 사이트 현지화 확률을 사용하여 지정되었다. Ksucc 비율은 단백질 수준으로 정규화되었다. 단백질 및 리신 숙시닐화 펩티드의 모든 비율은 log2 규모로 전환되었다.Search results were filtered for those with a false discovery rate of less than 0.01, a MaxQuant score of more than 40, potential contaminants were discarded, and only identified by site remediation. Additionally, Ksu sites were designated using a site localization probability of >0.75. Ksucc ratios were normalized to protein levels. All ratios of proteins and lysine succinylated peptides were converted to log 2 scale.
2-4. 단백질 공동 면역 침전2-4. Protein co-immunoprecipitation
LDHA(Cell Signaling Technology), SIRT5(abcam) 또는 마우스 IgG(Santa Cruz Biochemicals, Dallas, TX, USA) 항체와 protein G magnetic nanobeads(Bioneer, Daejeon, Korea)를 혼합하고 RT에서 30분 동안 회전 장치에서 배양한 다음 nanobeads로 두 번 세척했다. 적어도 500 ng의 단백질을 나노비드와 혼합한 다음 RT에서 1시간 동안 회전기에서 배양한 다음 나노비드로 두 번 세척했다. 용출 완충액을 첨가하고 5 내지 10분 동안 와류에서 용리시킨 다음, 95 ℃의 4 % SDS에서 10분 동안 인큐베이션하였다.Mix LDHA (Cell Signaling Technology), SIRT5 (abcam), or mouse IgG (Santa Cruz Biochemicals, Dallas, TX, USA) antibodies with protein G magnetic nanobeads (Bioneer, Daejeon, Korea) and incubate on a rotator for 30 min at RT. and then washed twice with nanobeads. At least 500 ng of protein was mixed with nanobeads and then incubated on a rotator for 1 h at RT and then washed twice with nanobeads. Elution buffer was added and eluted by vortexing for 5-10 minutes, followed by incubation in 4% SDS at 95°C for 10 minutes.
실시예 3. 전립선 암(PCa)의 진행에 대한 특징 확인Example 3. Confirmation of characteristics of prostate cancer (PCa) progression
3-1. 전립선 암(PCa)의 진행에서 SIRT5의 하향 조절된 수준 확인3-1. Downregulated levels of SIRT5 identified in the progression of prostate cancer (PCa)
도 1에 나타난 바와 같이, 대표적인 디숙시닐라제(desuccinylase)로서 작용하는 SIRT5는, 고도전이성 PCa 세포주의 PC-3M 세포에서 감소하였다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, SIRT5 수준의 감소로 인해 PC-3M 세포에서 Ksu 수준이 증가하는 것으로 관찰되었다. 증가된 Ksu 수준은 전이성 PCa 세포주에서 K-아세틸화, K-β-히드록시부틸화, K-말로닐화 및 K-글루타릴화를 비롯한 다른 아실화 중에서 가장 많은 발현 변화를 추가로 보여주었다. As shown in Figure 1, SIRT5, which acts as a representative desuccinylase, was decreased in PC-3M cells, a highly metastatic PCa cell line. Additionally, as shown in Figure 2, Ksu levels were observed to increase in PC-3M cells due to a decrease in SIRT5 levels. Increased Ksu levels further showed the most expression changes among other acylations, including K-acetylation, K-β-hydroxybutylation, K-malonylation, and K-glutarylation in metastatic PCa cell lines.
3-2. PCa 조직에서 LDHA-K118 숙시닐화(K118su)의 측정을 위한 간접 ELISA3-2. Indirect ELISA for measurement of LDHA-K118 succinylation (K118su) in PCa tissue
SIRT5와 PCa 진행 사이의 상관관계를 확인하기 위해 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 수행하여 PCa 조직에서 SIRT5 및 Ksu 수준을 평가했다. 대조군은 양성 전립선 비대증(BPH), T2 및 T3이고, 그 결과는 도 3에 나타내었다. To determine the correlation between SIRT5 and PCa progression, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to evaluate SIRT5 and Ksu levels in PCa tissues. The control groups were benign prostatic hyperplasia (BPH), T2, and T3, and the results are shown in Figure 3.
전립선 조직을 RIPA 완충액(Thermo)으로 용해하고, 1 mg 조직 샘플을 50 mL 코팅 완충액(0.2 M 중탄산나트륨, pH 9.4)과 혼합하고 96-well 플레이트(Corning)에서 실온에서 7시간 동안 배양한 다음 세척 완충액(TBS-T pH 7.2)으로 3회 세척하고 차단 완충액(TBS-T 중 3% BSA)에서 4 °C에서 밤새 인큐베이션했다. LDHA-K118su(CTM-212; PTM Biolabs)에 대한 1차 항체를 1:1000으로 희석하고 각 웰에 첨가하고 실온에서 7시간 동안 인큐베이션한 다음 세척 완충액으로 3회 세척하였다. HRP가 결합된 토끼 항체를 1:2000으로 희석하여 각 well에 첨가하고 3시간 동안 배양한 후 세척 완충액으로 5회 세척하였다. TMB 기질 용액(Thermo Fisher Scientific)을 각 well에 첨가하였다. 10~15분 후 색이 제대로 변하면 stop solution(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하고 OD450 nm를 측정하였다. Prostate tissue was lysed with RIPA buffer (Thermo), and 1 mg tissue samples were mixed with 50 mL coating buffer (0.2 M sodium bicarbonate, pH 9.4) and incubated in 96-well plates (Corning) at room temperature for 7 h, then washed. Washed three times with buffer (TBS-T pH 7.2) and incubated overnight at 4 °C in blocking buffer (3% BSA in TBS-T). Primary antibody against LDHA-K118su (CTM-212; PTM Biolabs) was diluted 1:1000, added to each well, incubated at room temperature for 7 h, and then washed three times with wash buffer. HRP-conjugated rabbit antibody was diluted 1:2000 and added to each well, incubated for 3 hours, and then washed 5 times with washing buffer. TMB substrate solution (Thermo Fisher Scientific) was added to each well. After 10 to 15 minutes, when the color changed properly, stop solution (Thermo Fisher Scientific) was added and OD450 nm was measured.
도 3에 나타난 바와 같이, ELISA는 SIRT5가 더 고도로 전이된 PCa 세포인 PC-3M에서 감소함에 따라 SIRT5 수준이 더 진행된 PCa 조직에서 유의하게 감소되었음을 보여주었다. PCa 조직에서 감소된 SIRT5 수준에 따라 T2 환자 조직에 비해 T3 환자에서 Ksu 수준이 유의하게 증가하여 탈숙시닐화 활성이 감소한 결과를 나타낸다. 또한, SIRT5는 환자의 조직에서 Ksu와 음의 상관관계가 있었다. As shown in Figure 3, ELISA showed that SIRT5 levels were significantly reduced in more advanced PCa tissues, as SIRT5 was decreased in PC-3M, a more highly metastatic PCa cell. In accordance with the reduced levels of SIRT5 in PCa tissue, Ksu levels were significantly increased in T3 patients compared to T2 patient tissues, resulting in decreased desuccinylation activity. Additionally, SIRT5 was negatively correlated with Ksu in patient tissues.
3-3. SIRT5 녹다운 시킨 SIRT5-KO에서 LDHA의 숙시닐기화 증가3-3. Increased succinyl grouping of LDHA in SIRT5-KO with SIRT5 knockdown
SIRT5 녹다운 시킨 SIRT5-KO에서 LDHA의 숙시닐기화가 높은 것을 확인한 면역침강(immunoprecipitation) 수행 한 후, 웨스턴 블롯(western blot)으로 증명하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, SIRT5 녹다운은 LDHA 석시닐화 수준을 높임을 확인할 수 있다. 면역 침강된 LDHA의 수준은 pan-succinyl-lysine 및 acetyl-lysine 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(western blot)으로 측정하였다. Immunoprecipitation was performed to confirm that succinyl phosphorylation of LDHA was high in SIRT5-KO where SIRT5 was knocked down, and this was confirmed by western blot. As shown in Figure 11, it can be seen that SIRT5 knockdown increases the level of LDHA succinylation. The level of immunoprecipitated LDHA was measured by Western blot using pan-succinyl-lysine and acetyl-lysine antibodies.
3-4. LDHA-K118 숙시닐화(K118su)에 따른 LDH 활성 증가 확인3-4. Confirmation of increased LDH activity due to LDHA-K118 succinylation (K118su)
PC-3M 세포의 높은 이동(migration) 및 침입(invasion)은 SIRT5의 기질로서 LDHA 숙시닐화와 관련이 있는 것으로 추정될 수 있다. LDH 활성은 PC-3 세포에 비해 SIRT5-KO 및 PC-3M 세포에서 유의하게 증가하였다. The high migration and invasion of PC-3M cells may be related to LDHA succinylation as a substrate of SIRT5. LDH activity was significantly increased in SIRT5-KO and PC-3M cells compared to PC-3 cells.
LDH 활성을 조절하는 정확한 숙시닐화인 리신 위치를 규명하기 위한 연구를 진행하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, LDHA의 7개의 숙시닐화 된 부위는 K5, K76, K81, K118, K126, K232 및 K243에서 PC-3 및 PC-3M 세포의 전체 숙시닐롬 연구를 통해 확인되었다. LDHA에서 알려진 아세틸화 및 유비퀴틸화의 위치는 숙시닐화로 표시되었다. PC-3M 세포에서 LDHA의 7개의 숙시닐화 된 부위가 검출되었으며, 그 중 K5, K76, K118, K232를 포함한 4개 부위가 PC-3 세포에 비해 2배 이상 증가하였다. 따라서 PC-3M 세포에서 증가된 4개의 LDHA Ksu 부위는 SIRT5의 기질로 제안될 수 있다.Research was conducted to identify the exact location of succinylation lysine that regulates LDH activity. As shown in Figure 5, seven succinylated sites of LDHA at K5, K76, K81, K118, K126, K232, and K243 were identified through whole succinylome studies of PC-3 and PC-3M cells. Known sites of acetylation and ubiquitylation in LDHA were indicated as succinylation. Seven succinylated sites of LDHA were detected in PC-3M cells, of which four sites, including K5, K76, K118, and K232, increased more than two-fold compared to PC-3 cells. Therefore, the four LDHA Ksu sites increased in PC-3M cells could be proposed as substrates of SIRT5.
LDH 활성을 조절하는 부위를 찾기 위해 4개의 숙시닐화 된 부위 각각을 단백질 숙시닐화에서 동일한 생리학적 특성을 나타내는 글루탐산(E)으로 개별적으로 돌연변이시켰다. 도 7(A)에 나타난 바와 같이, K5, K76, K118 및 K232의 글루탐산으로의 점 돌연변이는 LDHA 숙시닐화에서 상당한 유도를 초래했다. 4개의 돌연변이 중 K118E 돌연변이 LDHA가 LDHA K118의 숙시닐화에 의해 LDH 활성을 증가시킬 수 있는 가장 높은 활성을 보였다. To find the site that regulates LDH activity, each of the four succinylated sites was individually mutated to glutamic acid (E), which exhibits the same physiological properties in protein succinylation. As shown in Figure 7(A), point mutations of K5, K76, K118, and K232 to glutamic acids resulted in a significant induction in LDHA succinylation. Among the four mutations, K118E mutant LDHA showed the highest activity in increasing LDH activity by succinylation of LDHA K118.
또한, 도 7(B)에 나타난 바와 같이, K118E 돌연변이 LDHA 과발현 세포의 침윤이 증가함을 확인하였다. LDHA의 리신 118에서 숙시닐화를 확인하기 위해, succinyl-LDHA K118 항체를 담체 단백질이 결합된 succinyl-K118 펩타이드로 토끼를 면역시켜 새로 생성하였다. Additionally, as shown in Figure 7(B), it was confirmed that the invasion of cells overexpressing K118E mutant LDHA increased. To confirm succinylation at lysine 118 of LDHA, succinyl-LDHA K118 antibody was newly generated by immunizing rabbits with succinyl-K118 peptide conjugated to the carrier protein.
3-5. PCa에서 K118su를 선택적으로 인지하는 항체(anti-LDHAK118su) 확인3-5. Confirmation of an antibody (anti-LDHAK118su) that selectively recognizes K118su in PCa
항체(anti-LDHAK118su)를 생성시키는 방법은 아래와 같다.The method for generating antibody (anti-LDHAK118su) is as follows.
K118에서 석시닐화된 LDHA에 특이적인 폴리클로날 항체(항-석시닐화된 K118-LDHA, CTM-121)는 PTM Biolabs와 협력하여 생산하였다. 토끼를 숙시닐화된 LDHA 펩티드(CRNVNIF-Ksu-FIIPNVVK 및 RKRNVNIF-Ksu-FIIPNC)로 면역화시켰다. 면역화 된 토끼의 항혈청은 먼저 변형되지 않은 펩티드로 고갈한 다음 석시닐화된 K118 펩티드를 사용하여 정제하였다. A polyclonal antibody specific for succinylated LDHA at K118 (anti-succinylated K118-LDHA, CTM-121) was produced in collaboration with PTM Biolabs. Rabbits were immunized with succinylated LDHA peptides (CRNVNIF-Ksu-FIIPNVVK and RKRNVNIF-Ksu-FIIPNC). Antisera from immunized rabbits were first depleted with unmodified peptides and then purified using succinylated K118 peptide.
항체(anti-LDHAK118su) 생성 결과(도 12)는 아래와 같다. The results of antibody (anti-LDHAK118su) production (Figure 12) are as follows.
ELISA 결과와 일치하게, 정제된 항체는 변형된 펩타이드에 대해 매우 우수한 면역 반응을 보였다. 검출 한계는 4ng 미만이며, 신호는 대조군 펩타이드를 인식하지 못했다.Consistent with the ELISA results, the purified antibody showed a very good immune response to the modified peptide. The detection limit was less than 4 ng, and the signal did not recognize the control peptide.
이전 연구에서와 같이 LDHA 활성은 K5에서 아세틸화 또는 Y10에서 인산화와 같은 단백질 변형에 의해 조절된다. LDHA의 K5 아세틸화는 인간 췌장암에서 LDHA의 리소아말 분해를 유도하여 LDHA 수준을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 암에서 LDHA 레버의 조절에서 LDHA의 아세틸화와 숙시닐화는 반대 역할을 할 수 있다. LDHA에서 아세틸화와 숙시닐화 사이의 상관관계를 연구하기 위해 PC-3 세포를 각각 아세테이트와 숙시네이트로 처리했다. 도 8(A)에 나타난 바와 같이, 아세테이트를 처리하여 LDHA 아세틸화를 증가시켰을 때, LDHA는 이전 연구에서와 같이 감소했다. 동일한 세포에서 숙시네이트를 처리한 경우, K118 잔기에서 숙시닐화가 증가하였다. 도 8(B)에 나타난 바와 같이, LDHA-K118의 숙시닐화는 7가지 유형의 PCa 관련 세포주에서 SIRT5 발현이 증가함에 따라 감소했다.As in previous studies, LDHA activity is regulated by protein modifications such as acetylation at K5 or phosphorylation at Y10. K5 acetylation of LDHA is known to reduce LDHA levels by inducing lysosomal degradation of LDHA in human pancreatic cancer. Acetylation and succinylation of LDHA may play opposing roles in the regulation of the LDHA lever in cancer. To study the correlation between acetylation and succinylation in LDHA, PC-3 cells were treated with acetate and succinate, respectively. As shown in Figure 8(A), when LDHA acetylation was increased by treatment with acetate, LDHA decreased as in previous studies. When the same cells were treated with succinate, succinylation increased at the K118 residue. As shown in Figure 8(B), succinylation of LDHA-K118 decreased with increasing SIRT5 expression in seven types of PCa-related cell lines.
도 8(C)에 나타난 바와 같이, SIRT5와 LDHA 사이의 상호 작용 가능성을 확인하기 위해 co-IP 실험을 수행했다. 각각 항-SIRT5(anti-SIRT5) 및 항-LDHA(anti-LDHA)를 사용하여 PC-3 세포에서 수행되었다. co-IP 실험에서 LDHA 및 SIRT5 항체가 사용되었을 때 SIRT5와 LDHA의 공동 침전은 면역블롯을 사용하여 각각 입증되었다. 반대로 SIRT5가 면역침전되면 LDHA가 함께 침전된다. 상기 결과로부터 LDHA-K118su는 SIRT5를 사용하여 탈숙시닐화 됨을 추정할 수 있다. 도 9에 나타난 바와 같이, 환자 조직에서 PCa가 진행됨에 따라 LDH 활성은 SIRT5 감소와 관련된 T2 및 T3 등급에서 BPH에 비해 크게 증가했고, 총 Ksu는 PCa 진행에 따라 증가했다. 보다 정확한 결과를 위해 본 발명에서 생산한 LDHA-K118su 특이 항체로 실험했을 때 PCa 조직에서의 LDHA-K118su 발현도 PCa 진행 단에 따라 유의하게 증가하였다. 진행된 PCa에서는 SIRT5가 감소하고, 숙시닐화 된 LDHA가 증가하여 온전한 LDHA보다 활성이 더 높았다. 도 10에 나타난 바와 같이, 숙시닐화 된 LDHA가 전립선암의 진행을 촉진한다고 제안된다. As shown in Figure 8(C), co-IP experiments were performed to confirm the possibility of interaction between SIRT5 and LDHA. This was performed on PC-3 cells using anti-SIRT5 and anti-LDHA, respectively. When LDHA and SIRT5 antibodies were used in co-IP experiments, co-precipitation of SIRT5 and LDHA was demonstrated using immunoblot, respectively. Conversely, when SIRT5 is immunoprecipitated, LDHA is co-precipitated. From the above results, it can be assumed that LDHA-K118su is desuccinylated using SIRT5. As shown in Figure 9, as PCa progressed in patient tissues, LDH activity significantly increased compared to BPH at grades T2 and T3, associated with decreased SIRT5, and total Ksu increased with PCa progression. For more accurate results, when tested with the LDHA-K118su specific antibody produced in the present invention, LDHA-K118su expression in PCa tissue also significantly increased depending on the stage of PCa progression. In advanced PCa, SIRT5 was decreased and succinylated LDHA was increased, showing higher activity than intact LDHA. As shown in Figure 10, it is suggested that succinylated LDHA promotes the progression of prostate cancer.
본 발명인 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A에 특이적으로 결합하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물과 키트 및 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 따르면, 전립선암 진행을 진단하여 적절한 치료방향을 결정할 수 있어, 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하므로, 불량한 예후의 전립선 암 환자의 전립 선 암 재발 및 사망률을 감소시킬 수 있으므로, 전립선 암 환자의 효과적인 치료에 유용하게 활용할 수 있다.According to the present invention, a biomarker composition and kit for diagnosing prostate cancer in which lysine specifically binds to succinylated lactate dehydrogenase A, and a method for providing information for diagnosing prostate cancer, it is possible to diagnose the progression of prostate cancer and determine an appropriate treatment direction. Therefore, it is possible to provide a treatment method tailored to each patient, thereby reducing the recurrence and mortality rate of prostate cancer in prostate cancer patients with poor prognosis, and thus can be useful in the effective treatment of prostate cancer patients.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.As such, a person skilled in the art will understand that the technical configuration of the present invention described above can be implemented in other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive, and the scope of the present invention is indicated by the claims described later rather than the detailed description above, and the meaning and scope of the claims and their All changes or modified forms derived from the equivalent concept should be construed as falling within the scope of the present invention.
Claims (14)
A biomarker composition for diagnosing prostate cancer, comprising an antibody that specifically binds to lactate dehydrogenase A (LDHA), in which the 118th lysine residue in the amino acid sequence is succinylated.
SIRT5 단백질이 상기 락테이트 탈수소 효소 A에서 리신의 숙시닐화를 조절하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물.
According to clause 1,
A biomarker composition for diagnosing prostate cancer, wherein the SIRT5 protein regulates succinylation of lysine in lactate dehydrogenase A.
A composition for predicting prognosis of prostate cancer, comprising an agent for measuring the mRNA expression level of a lysine-succinylated lactate dehydrogenase A (LDHA) protein or a gene encoding the protein.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 예후 예측용 조성물.
According to clause 4,
A composition for predicting prostate cancer prognosis, wherein the agent for measuring the expression level of the protein further comprises an antibody specific for the protein.
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 예후 예측용 조성물.
According to clause 4,
A composition for predicting the prognosis of prostate cancer, wherein the agent for measuring the mRNA expression level includes a primer pair, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the mRNA.
b) 측정된 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
a) measuring the expression level of lactate dehydrogenase A in which lysine is succinylated in a biological sample isolated from a subject; and
b) comparing the measured expression level of lactate dehydrogenase A, in which lysine is succinylated, with that of a normal control group.
상기 a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
According to clause 7,
A method of providing information for the diagnosis of prostate cancer, wherein the biological sample in step a) is blood, plasma, or serum.
상기 a) 단계는 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준을 항원-항체 반응 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
According to clause 7,
In step a), the expression level of lactate dehydrogenase A, in which lysine is succinylated, is measured using an antigen-antibody reaction method.
상기 b) 단계는 측정된 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우, 전립선암으로 진단하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
According to clause 7,
In step b), if the measured expression level of lactate dehydrogenase A, in which lysine is succinylated, is higher than that of the normal control group, prostate cancer is diagnosed.
B) 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
A) measuring the mRNA expression level of the gene encoding lactate dehydrogenase A protein in which lysine is succinylated in a biological sample isolated from the subject; and
B) comparing the mRNA expression level of the gene or the expression level of the protein with a control sample. A method of providing information necessary for predicting the prognosis of prostate cancer, comprising:
상기 A) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 전립선암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
According to claim 11,
A method of providing information necessary for predicting the prognosis of prostate cancer, wherein the biological sample in stage A) is blood, plasma, or serum.
상기 A) 단계는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 항원-항체 반응 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 전립선암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
According to claim 11,
Step A) is a method of providing information necessary for predicting the prognosis of prostate cancer, characterized in that the mRNA expression level of the gene encoding the protein is measured using an antigen-antibody reaction method.
상기 B) 단계는 측정된 리신이 숙시닐화 된 락테이트 탈수소 효소 A의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우, 전립선암 예후가 나쁠 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 전립선암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.According to claim 11,
Step B) provides information necessary for predicting the prognosis of prostate cancer, wherein the prognosis of prostate cancer is judged to be poor when the measured expression level of lactate dehydrogenase A, in which lysine is succinylated, is higher than that of the normal control group. How to.
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| Li Xiang et al, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2020.), vol 39, pp 1-17. |
| Shi Liang et al, Molecular oncology (2019.), vol 13.2, pp 358-375. |
| Xian Zhi-Yong et al, Tumor Biology (2015.), vol 36, pp 8093-8100. |
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