JP5014780B2

JP5014780B2 - Method for immunological analysis of methylated heterogeneous nuclea ribonucleoprotein and use thereof

Info

Publication number: JP5014780B2
Application number: JP2006356426A
Authority: JP
Inventors: 靖彦小松; 有加松永; 寿子岩端; 敏充高山; 淳一小池
Original assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Current assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2026-12-28
Also published as: JP2008164517A

Description

本発明は、メチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインの免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬、並びに癌を検出する方法に関する。本発明は、癌の早期発見及び治療後のモニタリングに有用である。 The present invention relates to an immunological analysis method and immunological analysis reagent for methylated heterogeneous nuclea ribonucleoprotein, and a method for detecting cancer. The present invention is useful for early detection of cancer and monitoring after treatment.

医療技術の進歩にもかかわらず、癌は依然として世界レベルでの主要な死亡原因となっている。多くの癌は、その進行度によってステージＩ、ステージII、ステージIII及びステージIVの４つの病期（ステージ）に分けられている。これらのうち、ステージＩやステージIIの比較的早期の癌は、一般に小さく、転移も少ない。そのため、治療、例えば、外科的切除、放射線治療、又は化学治療等によって長期治癒を得ることが可能である。しかしながら、早期癌は基本的には無症状であり、早期癌を発見するためには、無症状の被験者を対象とする健康診断や人間ドックなどにおいて、癌を発見する必要がある。このような無症状の多くの被験者を対象とする検査は、スクリーニング検査と呼ばれているが、一般に検査対象の数が極端に多い。そのため、多くの検査対象者を検査するために、検査法は簡便で、かつ経済的でなければならない。また、一回の検査でいくつかの種類の癌、例えば、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、肺癌などを発見できるような検査であることが望ましい。現在、癌を発見するために使用されている腫瘍マーカー（癌マーカー）検査は、患者への侵襲が少なく好適な検査法であるが、比較的ステージの進んだ進行癌、末期癌での検出率が高く、現時点では、腫瘍マーカーの測定により早期の癌を検出することは困難だと考えられている。また、特定の癌を特異的に検出する腫瘍マーカーが多く、いくつかの腫瘍マーカーを組合わせて用いる必要がある。 Despite advances in medical technology, cancer remains the leading cause of death worldwide. Many cancers are divided into four stages (stages), stage I, stage II, stage III, and stage IV, depending on their degree of progression. Of these, relatively early stage I and stage II cancers are generally small and have few metastases. Therefore, long-term healing can be obtained by treatment such as surgical excision, radiation therapy, or chemotherapy. However, early cancer is basically asymptomatic, and in order to find early cancer, it is necessary to find cancer in a health checkup or a medical checkup for asymptomatic subjects. Such a test for many asymptomatic subjects is called a screening test, but the number of test objects is generally extremely large. Therefore, in order to inspect many test subjects, the inspection method must be simple and economical. In addition, it is desirable that the test can detect several types of cancers such as gastric cancer, liver cancer, pancreatic cancer, colon cancer, and lung cancer in one test. The tumor marker (cancer marker) test currently used to detect cancer is a suitable test method with less invasion to patients, but the detection rate for advanced and relatively advanced stage cancers. At present, it is considered difficult to detect early cancers by measuring tumor markers. In addition, there are many tumor markers that specifically detect specific cancers, and it is necessary to use several tumor markers in combination.

腫瘍マーカーの候補として、多くのタンパク質やペプチドが報告されている。例えば、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ｈｎＲＮＰと称する）も、その一つである。ｈｎＲＮＰは、ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシングにかかわっていると言われている分子群で、ｈｎＲＮＰファミリーには、１０以上の分子（例えば、Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ、ｈｎＲＮＰＣ−ｌｉｋｅ１、ｈｎＲＮＰＨ、ｈｎＲＮＰＨ‘、ｈｎＲＮＰＨ３、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＤ０、ｈｎＲＮＰＦ、ｈｎＲＮＰＧ、ｈｎＲＮＰＫ、ｈｎＲＮＰＬ、ｈｎＲＮＰＭ、ｈｎＲＮＰＱ、ｈｎＲＮＰＲ、ｈｎＲＮＰＵ、ｈｎＲＮＰＥ１、ｈｎＲＮＰＥ２、ｈｎＲＮＰＩ、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＲａｌｙ、ｈｎＲＮＰＡ０、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰＡ３、ｈｎＲＮＰＡ／Ｂ、ｈｎＲＮＰＪＫＴＢＰ）が含まれ、細胞内では、複数のｈｎＲＮＰ分子を含むｈｎＲＮＰ複合体を形成していると考えられている。核内でＤＮＡから転写されたヘテロ核ＲＮＡは、ｈｎＲＮＰ複合体に結合し、その後にスプライシングが起こり、ｍＲＮＡが形成された後に、核外に輸送される。核外への輸送にも特定のｈｎＲＮＰがかかわっており（非特許文献１）、また、ｈｎＲＮＰは核内及び細胞質内にのみ存在するわけではなく、培養細胞の細胞膜画分には、ｈｎＲＮＰ類のうち、ｈｎＲＮＰＡ１、Ａ２／Ｂ１、Ａ３、Ｃ１が存在することが報告されている（非特許文献２）。 Many proteins and peptides have been reported as tumor marker candidates. For example, heterogeneous nucleoriboprotein (hereinafter referred to as hnRNP) is one of them. hnRNP is a group of molecules that are said to be involved in the processing of mRNA precursors. The hnRNP family includes 10 or more molecules (eg, Cold-inducible RNA-binding protein, hnRNP C-like 1, hnRNP H, hnRNP H ′, hnRNP H3, hnRNP C1 / C2, hnRNP D0, hnRNP F, hnRNP G, hnRNP K, hnRNP L, hnRNP M, hnRNP Q, hnRNP R, hnRNP R, hnRNP R, hnRNP R, hnRNP R, hnRNP binding protein Rally, hnRNP A0, hnRNP A1, hnRNP A2 / B1, hnRNP A3, hnRNP A / B, hnRNP JKTBP) It is, within the cells, are believed to form an hnRNP complex comprising a plurality of hnRNP molecules. Heteronuclear RNA transcribed from DNA in the nucleus binds to the hnRNP complex and is subsequently spliced to form mRNA and then transported out of the nucleus. Specific hnRNPs are also involved in transport to the outside of the nucleus (Non-patent Document 1), and hnRNP does not exist only in the nucleus and cytoplasm. The cell membrane fraction of cultured cells contains hnRNPs. Among these, it has been reported that hnRNP A1, A2 / B1, A3, and C1 exist (Non-patent Document 2).

前記のｈｎＲＮＰ群のうち、痰中のｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１は初期肺癌の良いマーカーとなるという報告がある（非特許文献３）。また、肺癌組織中のｈｎＲＮＰＢ１の発現が亢進しているという報告（非特許文献４）、及び大腸癌においてｈｎＲＮＰＫの発現が亢進しているという報告もある（非特許文献５）。また、血中のｈｎＲＮＰＢ１ｍＲＮＡが肺癌のマーカーとなるという報告がなされている（非特許文献６）。しかしながら、これらの報告は、いずれも組織レベルのｈｎＲＮＰ発現及びｍＲＮＡの検出についての報告であり、健康診断等において組織におけるｈｎＲＮＰの発現やｍＲＮＡの発現を検査することは、現実的ではなく、一般的な腫瘍マーカーとして使用することのできるものではなかった。 Among the hnRNP groups, there is a report that hnRNP A2 / B1 in sputum is a good marker for early lung cancer (Non-patent Document 3). In addition, there are reports that the expression of hnRNP B1 in lung cancer tissues is increased (Non-patent Document 4) and reports that the expression of hnRNP K is increased in colorectal cancer (Non-Patent Document 5). In addition, it has been reported that hnRNP B1 mRNA in blood serves as a marker for lung cancer (Non-patent Document 6). However, these reports are all reports on tissue-level hnRNP expression and mRNA detection, and it is not realistic to examine the expression of hnRNP or mRNA in tissues in health examinations, etc. It could not be used as a tumor marker.

「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」（米国）、２００１年、第２１巻、ｐ．７３０７−“Molecular and Cellular Biology” (USA), 2001, Vol. 21, p. 7307- 「バイオケミカル・ファーマコロジー（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」（米国）、２００４年、第６７巻、ｐ．６５５−“Biochemical Pharmacology” (USA), 2004, Vol. 67, p. 655- 「クリニカル・キャンサー・リサーチ（ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｃｈ）」（米国）、１９９７年、第３巻、ｐ．２２３７−“Clinical Cancer Research” (USA), 1997, Vol. 3, p. 2237- 「キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｃｈ）」（米国）、１９９９年、第５９巻、ｐ．１４０４−“Cancer Research” (USA), 1999, Vol. 59, p. 1404- 「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ）」（英国）、２００６年、第９５巻、ｐ．９２１−“British Journal of Cancer” (UK), 2006, vol. 95, p. 921- 「ラング・キャンサー（ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ）」（米国）２００５年、第４８巻、ｐ．７７−“Lung Cancer” (USA) 2005, Vol. 48, p. 77-

本発明者らは、いくつかの種類の癌を同時に検出することができ、また、早期の癌を検出することのできる腫瘍マーカーについて鋭意研究したところ、同一人のヒト大腸癌組織サンプルと正常組織サンプルとにおけるタンパク質メチル化レベル（リジンメチル化、及びアルギニンメチル化）を比較することにより、癌部において、特定の分子のリジンメチル化及び全体的なアルギニンメチル化が亢進していることを見出した。つまり、癌化に伴いタンパク質のメチル化の亢進が特定のタンパク質で起こり、そのようなメチル化タンパク質の検出が、癌のマーカーとなる可能性が考えられた。また、前記大腸癌組織と正常組織の比較において、癌組織においてアルギニンをメチル化するプロテイン・アルギニン・メチルトランスフェラーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：以下、ＰＲＭＴと称する）の１つであるＰＲＭＴ１の発現がタンパク質レベルで亢進していることを見出した。
本発明者らは、更に、大腸癌組織においてメチル化されているタンパク質について鋭意研究を進めたところ、抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いてその複合体を免疫沈降し、抗メチルリジン（Ｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ：以下、ＭｅＫと称することがある）抗体、又は抗メチルアルギニン（ｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ：以下、ＭｅＲと称することがある）抗体でウェスタンブロッティングを行うことにより、複数のｈｎＲＮＰが細胞内で分子複合体として存在しており、ＭｅＲ化されたタンパク質及びＭｅＫ化された複数のタンパク質がｈｎＲＮＰであることを見出した。
また、本発明者は、抗ｈｎＲＮＰ抗体と抗ＭｅＫ抗体、又は抗ｈｎＲＮＰ抗体と抗ＭｅＲ抗体とを用い、癌患者の血液中のメチル化ｈｎＲＮＰ類を分析したところ、メチル化ｈｎＲＮＰ類が大腸癌患者の血液中においても増加していることを見出した。更に、驚くべきことに、大腸癌以外の癌である肺癌及び乳癌の患者の血液中においても、健常人と比較してメチル化ｈｎＲＮＰ類が増加していることがわかった。また、メチル化ｈｎＲＮＰは、進行癌や末期癌の患者だけでなく、症状が見られないステージＩの早期癌の患者の血液中でも高い比率で検出されることがわかった。
本発明は、こうした知見に基づくものである。 The inventors of the present invention have made extensive studies on tumor markers that can detect several types of cancers simultaneously and can detect early-stage cancers. By comparing protein methylation levels (lysine methylation and arginine methylation) in the sample, it was found that lysine methylation and overall arginine methylation of specific molecules were enhanced in the cancerous part. In other words, it is considered that protein methylation is increased in certain proteins with canceration, and detection of such methylated proteins may serve as a cancer marker. In comparison between the colon cancer tissue and normal tissue, the expression of PRMT1, which is one of protein arginine methyltransferase (hereinafter referred to as PRMT), which methylates arginine in the cancer tissue is at the protein level. We found that it was enhanced.
The present inventors further conducted extensive research on proteins methylated in colorectal cancer tissues. As a result, the complex was immunoprecipitated using an anti-hnRNP antibody, and anti-methyllysine (hereinafter, referred to as MeK). In some cases, a plurality of hnRNPs exist as a molecular complex in a cell and are converted to MeR by performing Western blotting with an antibody or an anti-methylarginine (hereinafter sometimes referred to as MeR) antibody. And a plurality of MeK proteins were found to be hnRNP.
Further, the present inventor analyzed methylated hnRNPs in the blood of cancer patients using anti-hnRNP antibodies and anti-MeK antibodies or anti-hnRNP antibodies and anti-MeR antibodies. It was also found that it increased in blood. Furthermore, it has been surprisingly found that methylated hnRNPs are increased in the blood of patients with lung cancer and breast cancer, which are cancers other than colorectal cancer, as compared with healthy individuals. Further, it was found that methylated hnRNP is detected in a high ratio not only in patients with advanced cancer or terminal cancer but also in blood of patients with stage I early cancer who do not have symptoms.
The present invention is based on these findings.

従って、本発明は、(1)抗ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン（ｈｎＲＮＰ）Ａ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰＫ抗体、抗ｈｎＲＮＰＭ抗体及び抗ｈｎＲＮＰＱ抗体から成る群から選択される少なくとも１つの抗体と、
(2) メチルリジン及びアシンメトリックジメチルアルギニンから成る群から選択されるメチルアミノ酸残基に結合する少なくとも１つの抗体と
を用いる、サンドイッチ法による大腸癌患者、肺癌患者又は乳癌患者の血漿又は血清試料中のメチル化リジン及び／又はメチル化アルギニンを含むｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ、ｈｎＲＮＰＨ、ｈｎＲＮＰＫ、ｈｎＲＮＰＭ又はｈｎＲＮＰＱの複合体の免疫学的分析方法に関する。
本発明による免疫測定方法の好ましい態様においては、前記メチル化ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテインが、ヘテロジニアス・ヌクレア・リボヌクレオプロテイン２つ以上を含む複合体を形成している。 Accordingly, the present invention provides (1) anti-heterogeneous nuclease ribonucleoprotein (hnRNP) A1 antibody, anti-hnRNP C1 / C2 antibody, anti-hnRNP F / H antibody, anti-hnRNP K antibody, anti-hnRNP M antibody and anti-hnRNP At least one antibody selected from the group consisting of Q antibodies;
(2) at least one antibody that binds to a methyl amino acid residue selected from the group consisting of methyllysine and asymmetric dimethylarginine;
HnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H, hnRNP K containing methylated lysine and / or methylated arginine in plasma or serum samples of colon cancer patients, lung cancer patients or breast cancer patients by sandwich method, The present invention relates to a method for immunological analysis of a complex of hnRNP M or hnRNP Q.
In a preferred embodiment of the immunoassay method according to the present invention, the methylated heterogeneous nucleoribonucleoprotein forms a complex containing two or more heterogeneous nucleoribonucleoproteins.

また本発明は、(1)抗ｈｎＲＮＰＡ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰＫ抗体、抗ｈｎＲＮＰＭ抗体及び抗ｈｎＲＮＰＱ抗体から成る群から選択される少なくとも１つの抗体と、
(2) メチルリジン及びアシンメトリックジメチルアルギニンから成る群から選択されるメチルアミノ酸残基に結合する少なくとも１つの抗体と
を含む、免疫化学的なサンドイッチ法による大腸癌患者、肺癌患者又は乳癌患者の血漿又は血清試料中のメチル化リジン及び／又はメチル化アルギニンを含むｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ、ｈｎＲＮＰＨ、ｈｎＲＮＰＫ、ｈｎＲＮＰＭ又はｈｎＲＮＰＱの複合体を測定する大腸癌、肺癌又は乳癌の診断キットにも関する。
なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
また本明細書において、「ｈｎＲＮＰ」は、特に断らない限り、不特定の１種のｈｎＲＮＰを意味し、「ｈｎＲＮＰ類」は不特定の複数のｈｎＲＮＰを意味する。そして、特定のｈｎＲＮＰについては、例えば、「ｈｎＲＮＰＫ」と示す。また、「ｈｎＲＮＰファミリー」は、ｈｎＲＮＰに分類される全てのｈｎＲＮＰを含むことを意味し、「ｈｎＲＮＰ複合体」は、複数のｈｎＲＮＰが結合した複合体を意味する。 The present invention also provides (1) at least one selected from the group consisting of anti-hnRNP A1 antibody, anti-hnRNP C1 / C2 antibody, anti-hnRNP F / H antibody, anti-hnRNP K antibody, anti-hnRNP M antibody and anti-hnRNP Q antibody. Two antibodies,
(2) at least one antibody that binds to a methyl amino acid residue selected from the group consisting of methyllysine and asymmetric dimethylarginine;
HnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H containing methylated lysine and / or methylated arginine in plasma or serum samples of colon cancer patients, lung cancer patients or breast cancer patients by immunochemical sandwich method , HnRNP K, hnRNP M, or hnRNP Q complex measurement kit for colorectal cancer, lung cancer or breast cancer .
Note that “analysis” in this specification includes both “detection” for determining the presence or absence of an analysis target compound and “quantification” for determining the presence of the analysis target compound.
In the present specification, unless otherwise specified, “hnRNP” means one unspecified type of hnRNP, and “hnRNPs” means a plurality of unspecified hnRNPs. The specific hnRNP is indicated, for example, as “hnRNP K”. In addition, “hnRNP family” means that all hnRNPs classified as hnRNP are included, and “hnRNP complex” means a complex in which a plurality of hnRNPs are bound.

本発明によれば、組織や血液中のメチル化ｈｎＲＮＰ類を分析することにより、癌を検出することが可能である。また、早期癌の患者の血清においても、メチル化ｈｎＲＮＰ類を検出することが可能であり、癌の早期発見が可能である。 According to the present invention, cancer can be detected by analyzing methylated hnRNPs in tissues and blood. In addition, methylated hnRNPs can be detected in the serum of patients with early cancer, and early detection of cancer is possible.

本発明の分析方法によって分析することのできるｈｎＲＮＰ類のメチル化されているアミノ酸残基は、アルギニン及び／又はリジンである。すなわち、メチル化ｈｎＲＮＰ類は、メチル化アルギニン及び／又はメチル化リジンを含む。メチル化ｈｎＲＮＰ類としては、例えば、メチル化されたｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ、ｈｎＲＮＰＨ、ｈｎＲＮＰＫ、ｈｎＲＮＰＭ又はｈｎＲＮＰＱである。 The methylated amino acid residue of hnRNPs that can be analyzed by the analysis method of the present invention is arginine and / or lysine. That is, methylated hnRNPs include methylated arginine and / or methylated lysine. Examples of the methylated hnRNPs include methylated hnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H, hnRNP K, hnRNP M, or hnRNP Q.

前記のように、タンパク質に含まれるアミノ酸残基のうち、メチル化されるアミノ酸残基としては、アルギニン又はリジンが知られている。タンパク質のメチル化は一群のメチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素により担われており、アルギニン残基をメチル化する酵素として、８種類のタンパク質アルギニンメチル化酵素（Ｐｒｏｔｅｉｎａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下、ＰＲＭＴと称することがある）が報告されている。中でも幅広い分子量に亘ってアルギニンメチル化を起こす酵素として、ＰＲＭＴ１が知られており、この分子の基質としていくつかのｈｎＲＮＰ類が報告されている。しかしながら、ｈｎＲＮＰ類のアルギニンメチル化の生理学的な意義、又は疾患との関係は明らかではなかった。 As described above, arginine or lysine is known as an amino acid residue to be methylated among amino acid residues contained in a protein. Protein methylation is carried out by a group of enzymes called methyltransferases, and eight types of protein arginine methyltransferases (hereinafter sometimes referred to as PRMT) are enzymes that methylate arginine residues. Has been reported. Among them, PRMT1 is known as an enzyme that causes arginine methylation over a wide molecular weight, and several hnRNPs have been reported as substrates of this molecule. However, the physiological significance of arginine methylation of hnRNPs or the relationship with disease was not clear.

本発明者は、大腸癌患者の癌組織と正常組織とにおいて、ＰＲＭＴ１の発現（タンパク質）を調べたところ、癌組織においてＰＲＭＴ１の発現が亢進していることを見出した。また、大腸癌細胞株、肺腺癌細胞株、肺扁平上皮癌細胞株、乳癌細胞株、肝癌細胞株、神経芽細胞種細胞株、横紋筋肉種細胞株、などの癌細胞株において、８種類のＰＲＭＴのｍＲＮＡの発現を調べたところ、多くの細胞で何種類かのＰＲＭＴのｍＲＮＡの発現が亢進していることを見出した。従って、被検試料中のＰＲＭＴを分析することによって、癌を検出することが可能である。好ましくは、ＰＲＭＴ１を分析することによって癌を検出することが可能である。 The inventor examined PRMT1 expression (protein) in cancer tissues and normal tissues of colorectal cancer patients, and found that PRMT1 expression was increased in cancer tissues. In cancer cell lines such as colon cancer cell lines, lung adenocarcinoma cell lines, lung squamous cell carcinoma cell lines, breast cancer cell lines, liver cancer cell lines, neuroblastoma cell lines, striated muscle species cell lines, etc. When the expression of various types of PRMT mRNA was examined, it was found that the expression of several types of PRMT mRNA was increased in many cells. Therefore, cancer can be detected by analyzing PRMT in a test sample. Preferably, cancer can be detected by analyzing PRMT1.

一方、ｈｎＲＮＰファミリーにおいては、リジン残基のメチル化は報告されておらず、リジン残基をメチル化するメチルトランスフェラーゼについての報告もなされていなかった。本発明者は、ｈｎＲＮＰ類に含まれるリジン残基がメチル化されていることを見出し、特に、癌患者においてメチル化されたｈｎＲＮＰ類が増加していることがわかった。後述する抗ｈｎＲＮＰ抗体又はメチルリジンに結合する抗体を用いることにより、細胞や組織、特には癌細胞や癌組織からメチルリジンを含むｈｎＲＮＰを分離及び精製することが可能である。本発明のメチルリジンを含むｈｎＲＮＰ類には、前記メチル化ｈｎＲＮＰが含まれるが、好ましくは、メチルリジンを含むｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ、ｈｎＲＮＰＨ、ｈｎＲＮＰＫ、又はｈｎＲＮＰＭである。 On the other hand, in the hnRNP family, no methylation of lysine residues has been reported, and no methyltransferase that methylates lysine residues has been reported. The present inventor found that lysine residues contained in hnRNPs were methylated, and in particular, it was found that methylated hnRNPs are increasing in cancer patients. By using an anti-hnRNP antibody or an antibody that binds to methyllysine described later, it is possible to separate and purify hnRNP containing methyllysine from cells and tissues, particularly cancer cells and cancer tissues. The hnRNPs containing methyllysine of the present invention include the above-mentioned methylated hnRNP, preferably hnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H, hnRNP K, or hnRNP M containing methyllysine.

本発明の分析方法によって分析されるメチル化ｈｎＲＮＰ類は、少なくとも１つ以上のメチル化アミノ酸残基を含む。メチル化アミノ酸残基は、前記のメチル化リジン又はメチル化アルギニンである。 The methylated hnRNPs analyzed by the analysis method of the present invention contain at least one or more methylated amino acid residues. The methylated amino acid residue is the aforementioned methylated lysine or methylated arginine.

メチル化リジン（ＭｅＫ）には、モノメチルリジン、ジメチルリジン及びトリメチルリジンが含まれる。モノメチルリジンは、一般式（１）：

で表され、リジンの側鎖のアミノ基の水素原子１つがメチル基で置換されたリジンである。ジメチルリジンは、一般式（２）：

で表され、リジンの側鎖のアミノ基の水素原子の２つがメチル基で置換されたリジンである。トリメチルリジンは、一般式（３）：

で表され、リジンの側鎖のアミノ基の水素原子の２つがメチル基で置換され、更にもう一つのメチル基が窒素原子に付加した構造を有するリジンである。 Methylated lysine (MeK) includes monomethyllysine, dimethyllysine and trimethyllysine. Monomethyllysine has the general formula (1):

In the lysine, one hydrogen atom of the amino group in the side chain of lysine is substituted with a methyl group. Dimethyllysine has the general formula (2):

In the lysine, two hydrogen atoms of the amino group in the side chain of lysine are substituted with methyl groups. Trimethyllysine has the general formula (3):

The lysine has a structure in which two hydrogen atoms of the amino group in the side chain of lysine are substituted with a methyl group, and another methyl group is added to the nitrogen atom.

リジンメチル化ｈｎＲＮＰに含まれるメチル化リジンは、特に限定されず、前記モノメチルリジン、ジメチルリジン、又はトリメチルリジンのうちのいずれか１つ以上であればよく、２種類以上のメチル化リジンを含んでいてもよい。また、メチル化ｈｎＲＮＰ類におけるメチル化リジンの位置及び数は、特に限定されない。すなわち、メチル化ｈｎＲＮＰ類において、１つ以上のリジンがメチル化されていればよく、従って、メチル化ｈｎＲＮＰ類は、メチル化されていないリジンを含むことができる。 The methylated lysine contained in the lysine methylated hnRNP is not particularly limited, and may be any one or more of the monomethyllysine, dimethyllysine, and trimethyllysine, and includes two or more types of methylated lysine. Also good. Further, the position and number of methylated lysine in methylated hnRNPs are not particularly limited. That is, in methylated hnRNPs, one or more lysines need only be methylated, and therefore methylated hnRNPs can contain unmethylated lysines.

メチル化アルギニン（ＭｅＲ）には、アシンメトリックジメチルアルギニン（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ：以下、ＡＤＭＡと称することがある）、シンメトリックジメチルアルギニン（以下、ＳＤＭＡと称することがある）、モノメチルアルギニン（以下、ＭＭＡと称することがある）が含まれる。ＡＤＭＡとは、一般式（４）：

で表される、アルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子２つが、メチル基で置換されたアルギニンである。本発明の抗体が反応しない、ＳＤＭＡとは、一般式（５）：

で表されるアルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子及びイミノ基の水素原子がメチル基に置換されたアルギニンである。ＭＭＡとは、一般式（６）：

で表される、アルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子１つがメチル基に置換されたアルギニンである。 Examples of methylated arginine (MeR) include asymmetric dimethylarginine (hereinafter sometimes referred to as ADMA), symmetric dimethylarginine (hereinafter sometimes referred to as SDMA), and monomethylarginine (hereinafter referred to as MMA). May be included). ADMA is a general formula (4):

The arginine in which two hydrogen atoms of the amino group of the side chain of arginine represented by SDMA to which the antibody of the present invention does not react is a general formula (5):

The hydrogen atom of the amino group and the hydrogen atom of the imino group in the side chain of arginine represented by the formula are substituted with a methyl group. MMA is general formula (6):

The arginine in which one hydrogen atom of the amino group in the side chain of arginine is substituted with a methyl group.

アルギニンメチル化ｈｎＲＮＰに含まれるメチル化アルギニンは、特に限定されず、前記アシンメトリックジメチルアルギニン、シンメトリックジメチルアルギニン、モノメチルアルギニンのうちのいずれか１つ以上であればよく、２種類以上のメチル化アルギニンを含んでいてもよい。また、メチル化ｈｎＲＮＰ類におけるメチル化アルギニンの位置及び数は、特に限定されない。すなわち、メチル化ｈｎＲＮＰ類において、１つ以上のアルギニンがメチル化されていればよく、従って、メチル化ｈｎＲＮＰ類は、メチル化されていないアルギニンを含むことができる。 The methylated arginine contained in the arginine methylated hnRNP is not particularly limited, and may be any one or more of the asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, and monomethylarginine, and two or more kinds of methylated arginine. May be included. Further, the position and number of methylated arginine in methylated hnRNPs are not particularly limited. That is, in methylated hnRNPs, it is sufficient that one or more arginines are methylated, and thus methylated hnRNPs can contain unmethylated arginine.

また、本発明の免疫学的分析方法によって、分析できるメチル化ｈｎＲＮＰは、リジンのみがメチル化されているもの、アルギニンのみがメチル化されているもの、又はリジン及びアルギニンがメチル化されているものでもよい。 The methylated hnRNP that can be analyzed by the immunological analysis method of the present invention is one in which only lysine is methylated, one in which only arginine is methylated, or one in which lysine and arginine are methylated But you can.

本発明者は、メチル化リジン及び／又はメチル化アルギニンを含む複数のメチル化ｈｎＲＮＰが、癌細胞中において、複合体を形成していることを見出した。また、癌患者の血液中においても、メチル化リジン又はメチル化アルギニンを含む複数のメチル化ｈｎＲＮＰが、複合体を形成していることを見出した。本発明による免疫学的分析方法によれば、単独のメチル化ｈｎＲＮＰを分析することもできるが、メチル化ｈｎＲＮＰ複合体を分析することも可能である。メチル化ｈｎＲＮＰ複合体は、少なくとも２つ以上の前記メチル化ｈｎＲＮＰを含むが、好ましくはメチル化リジン及び／又はメチル化アルギニンを含むｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ、ｈｎＲＮＰＨ、ｈｎＲＮＰＫ、又はｈｎＲＮＰＭを含むことができる。 The present inventor has found that a plurality of methylated hnRNPs including methylated lysine and / or methylated arginine form a complex in cancer cells. Moreover, it discovered that several methylated hnRNP containing methylated lysine or methylated arginine forms the complex also in the blood of a cancer patient. According to the immunological analysis method of the present invention, a single methylated hnRNP can be analyzed, but a methylated hnRNP complex can also be analyzed. The methylated hnRNP complex comprises at least two or more of the above methylated hnRNP, preferably hnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H, hnRNP K, comprising methylated lysine and / or methylated arginine, Or hnRNP M.

本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法によれば、癌を検出することが可能である。本発明によれば、複数の種類の癌を同時に、そして高感度に検出することができ、大腸癌、肺癌及び乳癌を高率に検出することができる。多くの癌は、その進行度によって４つの病期（ステージ）ステージＩ、ステージII、ステージIII及びステージIVに分けることができる。ステージＩやステージIIのような早期のステージの癌患者の検体において、多くの腫瘍マーカーは、検出されない。本発明の癌を検出する方法によれば、癌のステージに関係なく、癌を高感度に検出することが可能であり、特に、早期の癌であるステージＩの癌も検出することができる。 According to the immunological analysis method for methylated hnRNP of the present invention, cancer can be detected. According to the present invention , a plurality of types of cancer can be detected simultaneously and with high sensitivity, and colorectal cancer, lung cancer and breast cancer can be detected at a high rate. Many cancers can be divided into four stages (stage), stage II, stage III, and stage IV according to their degree of progression. Many tumor markers are not detected in specimens of early stage cancer patients such as stage I and stage II. According to the method for detecting cancer of the present invention, it is possible to detect cancer with high sensitivity regardless of the stage of cancer, and in particular, it is also possible to detect stage I cancer, which is an early stage cancer.

本発明方法においては、任意の哺乳動物（特にはヒト）の血漿又は血清を被検試料として用いることができる。
In the method of the present invention, plasma or serum of any mammal (particularly human) can be used as a test sample.

本発明者は、後述する実施例に示すとおり、癌患者においては、健常人と比較して、試料中に含まれているメチル化ｈｎＲＮＰの濃度が統計学的に有意に高くなることを見出した。具体的には、抗ｈｎＲＮＰ抗体及び抗ＡＤＭＡ抗体を用いる免疫学的分析法（以下、ＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法と称することがある）によって、健常人、大腸癌、肺癌及び乳癌において、それぞれ６、４８、８０、５０％が陽性であり、抗ｈｎＲＮＰ抗体及び抗メチルリジン抗体を用いる免疫学的分析法（以下、ＭｅＫ−ｈｎＲＮＰ法と称することがある）によって、それぞれ６、５７、８０、７８％が陽性であった。これらの値は、従来の腫瘍マーカーよりも高い陽性率を示した。このように、本発明の癌を検出する方法においては、検査対象者から採取した被検試料中に含まれているメチル化ｈｎＲＮＰを分析することによって、癌を検出することができる。メチル化ｈｎＲＮＰの分析は、免疫学的分析方法に基づいて行うことができる。 The present inventor has found that the concentration of methylated hnRNP contained in the sample is statistically significantly higher in cancer patients than in healthy individuals, as shown in the examples described later. . Specifically, by an immunological analysis method using an anti-hnRNP antibody and an anti-ADMA antibody (hereinafter sometimes referred to as an ADMA-hnRNP method), in healthy individuals, colon cancer, lung cancer and breast cancer, 6, 48, 80, 50% are positive, and 6, 57, 80, 78% are positive by immunological analysis using an anti-hnRNP antibody and anti-methyllysine antibody (hereinafter sometimes referred to as MeK-hnRNP method), respectively. there were. These values showed a higher positive rate than conventional tumor markers. Thus, in the method for detecting cancer of the present invention, cancer can be detected by analyzing methylated hnRNP contained in a test sample collected from a subject. Analysis of methylated hnRNP can be performed based on immunological analysis methods.

本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法に使用することのできる抗ＭｅＫ抗体は、前記モノメチルリジン、ジメチルリジン又はトリメチルリジンに結合することができ、リジンに結合しない抗体であれば限定されず、モノメチルリジン、ジメチルリジン及びトリメチルリジンのうちの１つに特異的に結合する抗体でもよく、２つ以上に結合する抗体でもよい。例えば、モノメチルリジン及びジメチルリジンに結合することができ、リジンに結合しない抗体として、国際公開第２００５／０５４２９６号パンフレットに記載のモノメチルリジン及びジメチルリジンに結合する抗体を挙げることができる。具体的には、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５９５号であるハイブリドーマＭＥＫ３Ｄ７から産生されるＭＥＫ３Ｄ７抗体、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５９６号であるハイブリドーマＭＥＫ４Ｅ１０から産生されるＭＥＫ４Ｅ１０抗体、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５９７号であるハイブリドーマＭＥＫ５Ｆ７から産生されるＭＥＫ５Ｆ７抗体、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５９３号であるハイブリドーマＭＥＫ２−５Ａ１１から産生されるＭＥＫ５Ａ１１抗体、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５９４号であるハイブリドーマＭＥＫ２−５Ｂ１１から産生されるＭＥＫ２−５Ｂ１１抗体を挙げることができる。 The anti-MeK antibody that can be used in the immunological analysis method for methylated hnRNP of the present invention is not limited as long as it can bind to the monomethyllysine, dimethyllysine or trimethyllysine and does not bind to lysine. , An antibody that specifically binds to one of monomethyllysine, dimethyllysine, and trimethyllysine, or an antibody that binds to two or more. For example, antibodies that can bind to monomethyllysine and dimethyllysine but do not bind to lysine include the antibodies that bind to monomethyllysine and dimethyllysine described in WO 2005/054296. Specifically, the MEK3D7 antibody produced from the hybridoma MEK3D7 having accession number FERM P-19595, the MEK4E10 antibody produced from the hybridoma MEK4E10 having accession number FERM P-19596, and the accession number FERM P-19597 MEK5F7 antibody produced from hybridoma MEK5F7, MEK5A11 antibody produced from hybridoma MEK2-5A11 with accession number FERM P-19593, MEK2-5B11 antibody produced from hybridoma MEK2-5B11 with accession number FERM P-19594 Can be mentioned.

本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法に使用することのできる抗ＭｅＲ抗体は、前記ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡに結合することができ、アルギニンに結合しない抗体であれば限定されないが、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡのうちの１つに特異的に結合する抗体を用いることもでき、２つ以上に結合することのできる抗体を用いることもできる。例えば、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡのうちの１つに特異的に結合する抗体としては、ＡＤＭＡに結合し、ＳＤＭＡ、ＭＭＡ及びリジンに結合しない抗体が挙げられ、具体的には、特願２００５−３７８９６５に記載の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０４５８号であるハイブリドーマＡＤＭＡ２−２Ｈ５から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。 The anti-MeR antibody that can be used in the immunological analysis method for methylated hnRNP according to the present invention is not limited as long as it can bind to the above-mentioned ADMA, SDMA, or MMA and does not bind to arginine. An antibody that specifically binds to one of SDMA, SDMA, or MMA can be used, or an antibody that can bind to more than one can be used. For example, an antibody that specifically binds to one of ADMA, SDMA, or MMA includes an antibody that binds to ADMA and does not bind to SDMA, MMA, and lysine. Mention may be made of the monoclonal antibody produced from the hybridoma ADMA2-2H5 having the accession number FERM BP-10458 described in 378965.

本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法に使用することのできる抗ｈｎＲＮＰ抗体は、ｈｎＲＮＰ群のいずれかのｈｎＲＮＰに結合することのできる抗体であれば、特に限定されるものではないが、例えば、抗Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ、抗ｈｎＲＮＰＣ−ｌｉｋｅ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＨ抗体、抗ｈｎＲＮＰＨ‘抗体、抗ｈｎＲＮＰＨ３抗体、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰＤ０抗体、抗ｈｎＲＮＰＦ抗体、抗ｈｎＲＮＰＧ抗体、抗ｈｎＲＮＰＫ抗体、抗ｈｎＲＮＰＬ抗体、抗ｈｎＲＮＰＭ抗体、抗ｈｎＲＮＰＱ抗体、抗ｈｎＲＮＰＲ抗体、抗ｈｎＲＮＰＵ抗体、抗ｈｎＲＮＰＥ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＥ２抗体、抗ｈｎＲＮＰＩ抗体、抗ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＲａｌｙ抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ０抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ３抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ／Ｂ抗体、抗ｈｎＲＮＰＪＫＴＢＰ抗体、又はこれらの抗体の２種以上の混合物を挙げることができる。また、ｈｎＲＮＰ類は、スプライシングの違いにより異なるタンパク質となるｈｎＲＮＰも含まれ、部分的に同一のアミノ酸配列を有するｈｎＲＮＰが存在する。そのため、２種類以上のｈｎＲＮＰに結合することのできる抗体があり、そのような抗体も、本発明の分析方法に使用することが可能である。好ましくは、抗ｈｎＲＮＰＡ０抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＣ１＋Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰＧ抗体、抗ｈｎＲＮＰＫ抗体、抗ｈｎＲＮＰＭ抗体、抗ｈｎＲＮＰＱ抗体、又はこれらの抗体の混合物を使用することができ、より好ましくは、抗ｈｎＲＮＰＡ１抗体、抗ｈｎＲＮＰＣ１＋Ｃ２抗体、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ抗体、抗ｈｎＲＮＰＫ抗体、抗ｈｎＲＮＰＭ、又は抗ｈｎＲＮＰＱ抗体を使用することができる。 The anti-hnRNP antibody that can be used in the immunological analysis method for methylated hnRNP of the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that can bind to any hnRNP in the hnRNP group. For example, anti-Cold-inducible RNA-binding protein, anti-hnRNP C-like 1 antibody, anti-hnRNP H antibody, anti-hnRNP H ′ antibody, anti-hnRNP H3 antibody, anti-hnRNP C1 / C2 antibody, anti-hnRNP D0N antibody, anti-hnRP Antibody, anti-hnRNP G antibody, anti-hnRNP K antibody, anti-hnRNP L antibody, anti-hnRNP M antibody, anti-hnRNP Q antibody, anti-hnRNP R antibody, anti-hnRNP U antibody, anti-hnRNP E1 antibody, anti-hnRNP E2P anti-hnR Antibody, anti-RNA -Binding protein Rally antibody, anti-hnRNP A0 antibody, anti-hnRNP A1 antibody, anti-hnRNP A2 / B1 antibody, anti-hnRNP A3 antibody, anti-hnRNP A / B antibody, anti-hnRNP JKTBP antibody, or a mixture of two or more of these antibodies Can be mentioned. In addition, hnRNPs include hnRNPs that become different proteins due to splicing differences, and there are hnRNPs having partially the same amino acid sequence. Therefore, there are antibodies that can bind to two or more types of hnRNP, and such antibodies can also be used in the analysis method of the present invention. Preferably, anti-hnRNP A0 antibody, anti-hnRNP A1 antibody, anti-hnRNP A2 / B1 antibody, anti-hnRNP C1 + C2 antibody, anti-hnRNP F / H antibody, anti-hnRNP G antibody, anti-hnRNP K antibody, anti-hnRNP M antibody, anti-hnR An antibody or a mixture of these antibodies can be used, more preferably anti-hnRNP A1 antibody, anti-hnRNP C1 + C2 antibody, anti-hnRNP F / H antibody, anti-hnRNP K antibody, anti-hnRNP M, or anti-hnRNP Q antibody Can be used.

抗体の種類は、特に限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体の抗体フラグメントなどを挙げることができるが、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することで、得ることができる。 The type of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a recombinant antibody, or an antibody fragment thereof, and preferably a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof. Examples of antibody fragments include F (ab ′) ₂ , Fab ′, Fab, or Fv. These antibody fragments can be obtained, for example, by digesting an antibody with a proteolytic enzyme (for example, pepsin or papain) by a conventional method, and subsequently purifying the protein by a conventional protein separation and purification method. .

前記のメチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いる本発明の免疫学的分析方法には、固相酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と称する）などの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡ法と称する）、放射性免疫測定法（以下、ＲＩＡ法と称する）、蛍光標識免疫測定法（以下、ＦＩＡと称する）、凝集法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノブロット法、又は各種の免疫組織染色法などが含まれる。 The immunological analysis method of the present invention using an antibody that binds to the methylated amino acid residue includes an enzyme immunoassay method (hereinafter referred to as EIA method) such as a solid phase enzyme immunoassay method (hereinafter referred to as ELISA method). Radioimmunoassay method (hereinafter referred to as RIA method), fluorescent labeling immunoassay method (hereinafter referred to as FIA), agglutination method, immunoprecipitation method, Western blot method, immunoblot method, or various immunohistochemical staining Laws are included.

本発明の（Ａ）メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いる免疫学的分析方法は、
（Ａ−１）メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を被検試料と接触させる工程、及び
（Ａ−２）メチル化ｈｎＲＮＰと前記抗体との免疫複合体を検出する工程
を含む。メチル化アミノ酸残基に結合する抗体は、免疫複合体を検出するために標識抗体であることが好ましい。 The immunological analysis method using an antibody that binds to (A) a methylated amino acid residue of the present invention comprises:
(A-1) a step of bringing an antibody that binds to a methylated amino acid residue into contact with a test sample, and (A-2) a step of detecting an immune complex between the methylated hnRNP and the antibody. The antibody that binds to a methylated amino acid residue is preferably a labeled antibody in order to detect immune complexes.

前記免疫学的分析方法（Ａ）は、具体的には、被検試料中のメチル化ｈｎＲＮＰを１次元の電気泳動又は２次元の電気泳動により分離し、次にウエスタンブロット法により、工程（Ａ−１）及び工程（Ａ−２）を行うことにより、メチル化ｈｎＲＮＰを分析することが可能である。また、ＦＩＡ法、免疫組織染色法、イムノブロット法などにより、前記工程（Ａ−１）及び工程（Ａ−２）を行うこともできる。 Specifically, in the immunological analysis method (A), methylated hnRNP in a test sample is separated by one-dimensional electrophoresis or two-dimensional electrophoresis, and then subjected to a step (A -1) and step (A-2) can be performed to analyze methylated hnRNP. Moreover, the said process (A-1) and process (A-2) can also be performed by FIA method, an immunohistochemical staining method, an immunoblot method, etc.

本発明の免疫学的分析方法では、更に、前記抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いることができる。（Ｂ）メチル化アミノ酸残基に結合する抗体及び抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いる免疫学的分析方法は、
（Ｂ−１）ｈｎＲＮＰに結合する抗体を被検試料と接触させる工程、
（Ｂ−２）メチル化ｈｎＲＮＰ、又はメチル化ｈｎＲＮＰと前記ｈｎＲＮＰに結合する抗体との免疫複合体に、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を接触させる工程、及び
（Ｂ−３）メチル化ｈｎＲＮＰとメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とからなる免疫複合体、又はメチル化ｈｎＲＮＰと前記ｈｎＲＮＰに結合する抗体とメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とからなる免疫複合体を検出する工程
を含むことができる。 In the immunological analysis method of the present invention, the anti-hnRNP antibody can be further used. (B) An immunological analysis method using an antibody that binds to a methylated amino acid residue and an anti-hnRNP antibody,
(B-1) contacting an antibody that binds to hnRNP with a test sample;
(B-2) contacting an antibody that binds to a methylated amino acid residue with an immune complex of methylated hnRNP or methylated hnRNP and an antibody that binds to the hnRNP; and (B-3) methylated hnRNP. And a step of detecting an immune complex comprising an antibody that binds to a methylated amino acid residue, or an immune complex that comprises a methylated hnRNP and an antibody that binds to the hnRNP and an antibody that binds to the methylated amino acid residue. be able to.

工程（Ｂ−１）においては、被検試料に含まれているメチル化ｈｎＲＮＰとｈｎＲＮＰに結合する抗体とを結合させる。ｈｎＲＮＰに結合する抗体は、単独の抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いてもよいが、複数の抗体を組合わせて使用してもよい。ＥＬＩＳＡ法では、抗ｈｎＲＮＰ抗体を不溶性の担体に固相化して用いることもできる。また、工程（Ｂ−１）を免疫沈降などによって行う場合は、抗ｈｎＲＮＰ抗体は、液相で使用することができる。この工程において、メチル化ｈｎＲＮＰとｈｎＲＮＰに結合する抗体との免疫複合体が形成させる。 In step (B-1), methylated hnRNP contained in the test sample and an antibody that binds to hnRNP are combined. As an antibody that binds to hnRNP, a single anti-hnRNP antibody may be used, or a plurality of antibodies may be used in combination. In the ELISA method, the anti-hnRNP antibody can be used by immobilizing it on an insoluble carrier. Moreover, when performing a process (B-1) by immunoprecipitation etc., an anti- hnRNP antibody can be used in a liquid phase. In this step, an immune complex is formed between methylated hnRNP and an antibody that binds to hnRNP.

工程（Ｂ−２）においては、得られた免疫複合体、又は免疫複合体から分離したメチル化ｈｎＲＮＰとメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とを結合させる。具体的には、メチル化ｈｎＲＮＰのメチル化アミノ酸残基に抗体が結合する。それにより、メチル化ｈｎＲＮＰ、ｈｎＲＮＰに結合する抗体及びメチル化アミノ酸残基に結合する抗体からなる免疫複合体、又はメチル化ｈｎＲＮＰとメチル化アミノ酸残基に結合する抗体とからなる免疫複合体が形成される。メチル化アミノ酸残基に結合する抗体は、前記のモノメチルリジン、ジメチルリジン、あるいはトリメチルリジンに結合する抗体、又はＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、又はＭＭＡに結合する抗体を用いることができる。これの抗体は単独で使用してもよいが、何種類かの抗体を組合わせて使用してもよい。この工程において用いる抗体は、工程（Ｂ−３）において、免疫複合体からのシグナルを検出するために標識抗体であることが好ましい。ＥＬＩＳＡ法では、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体は、メチル化ｈｎＲＮＰと前記ｈｎＲＮＰに結合する抗体との免疫複合体に液相で反応させることができる。また、工程（Ｂ−２）をウエスタンブロット法などによって行う場合は、ブロット膜などに結合したメチル化ｈｎＲＮＰに、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を液相で結合させる。 In the step (B-2), the obtained immune complex or the methylated hnRNP separated from the immune complex is bound to the antibody that binds to the methylated amino acid residue. Specifically, the antibody binds to a methylated amino acid residue of methylated hnRNP. Thereby, an immune complex composed of methylated hnRNP, an antibody that binds to hnRNP and an antibody that binds to a methylated amino acid residue, or an immune complex composed of an antibody that binds to methylated hnRNP and a methylated amino acid residue is formed. Is done. As an antibody that binds to a methylated amino acid residue, the aforementioned antibody that binds to monomethyllysine, dimethyllysine, or trimethyllysine, or an antibody that binds to ADMA, SDMA, or MMA can be used. These antibodies may be used alone, or several types of antibodies may be used in combination. The antibody used in this step is preferably a labeled antibody in order to detect a signal from the immune complex in step (B-3). In the ELISA method, an antibody that binds to a methylated amino acid residue can be reacted in a liquid phase with an immune complex of methylated hnRNP and the antibody that binds to the hnRNP. When step (B-2) is performed by Western blotting or the like, an antibody that binds to a methylated amino acid residue is bound in a liquid phase to methylated hnRNP bound to a blot membrane or the like.

工程（Ｂ−３）においては、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を含む免疫複合体を、シグナルとして検出する。具体的には、標識されたメチル化アミノ酸残基の酵素などを基質と反応させ、発色又は発光などによって検出する。また、標識物質である蛍光物質やラジオアイソトープなどを直接検出することもできる。
前期工程（Ｂ−１）及び工程（Ｂ−２）は、工程（Ｂ−１）を行い、次に工程（Ｂ−２）行うこともできるが、同時に行うことも可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ法では、工程（Ｂ−１）及び工程（Ｂ−２）を同時に行うことにより、メチル化ｈｎＲＮＰ、ｈｎＲＮＰに結合する抗体、及びメチル化アミノ酸残基に結合する抗体からなる免疫複合体が形成される。 In the step (B-3), an immune complex including an antibody that binds to a methylated amino acid residue is detected as a signal. Specifically, a labeled methylated amino acid residue enzyme or the like is reacted with a substrate and detected by color development or luminescence. It is also possible to directly detect a fluorescent substance or a radioisotope as a labeling substance.
The first step (B-1) and the step (B-2) can be performed simultaneously with the step (B-1) and then the step (B-2). For example, in the ELISA method, an immune complex comprising a methylated hnRNP, an antibody that binds to hnRNP, and an antibody that binds to a methylated amino acid residue by simultaneously performing steps (B-1) and (B-2). Is formed.

更に、工程（Ｂ−１）で使用するｈｎＲＮＰに結合する抗体の代わりにメチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用い、工程（Ｂ−２）で使用するメチル化アミノ酸残基に結合する抗体の代わりにｈｎＲＮＰに結合する抗体を用いることもできる。この場合、工程（Ｂ−２）で使用する抗体は、免疫複合体を検出するため、標識抗体であることが好ましい。 Furthermore, instead of the antibody that binds to hnRNP used in step (B-1), an antibody that binds to a methylated amino acid residue is used instead of the antibody that binds to hnRNP, and the antibody that binds to the methylated amino acid residue used in step (B-2) Alternatively, an antibody that binds to hnRNP can be used. In this case, the antibody used in the step (B-2) is preferably a labeled antibody in order to detect an immune complex.

前記（Ｂ）の免疫学的分析方法は、具体的には、免疫沈降とウエスタンブロット法を組み合わせて行うことができる。例えば、ｈｎＲＮＰに結合する抗体を被検試料に添加し、ｈｎＲＮＰと抗体の免疫複合体を形成させる。これに、ＰｒｏｔｅｉｎＡ又はＰｒｏｔｅｉｎＧなどの結合したゲルなどを添加し、免疫複合体をゲルに結合させる。遠心分離などでゲルを回収し、加熱、界面活性剤、及び／又は高塩濃度による処理などによって免疫複合体を分離させる。得られたｈｎＲＮＰを電気泳動し、ＰＶＤＦ膜などのブロット膜に転写する。ブロット膜を、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）でブロッキングする。その後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で標識したメチル化アミノ酸残基に結合する抗体を接触させ、メチル化ｈｎＲＮＰに結合させる。ブロット膜を洗浄し、酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。 Specifically, the immunological analysis method (B) can be performed by combining immunoprecipitation and Western blotting. For example, an antibody that binds to hnRNP is added to the test sample to form an immune complex of hnRNP and the antibody. To this, a bound gel such as Protein A or Protein G is added, and the immune complex is bound to the gel. The gel is recovered by centrifugation or the like, and the immune complex is separated by treatment with heating, a surfactant, and / or a high salt concentration. The obtained hnRNP is electrophoresed and transferred to a blot membrane such as a PVDF membrane. The blot membrane is blocked with an appropriate blocking agent (for example, bovine serum albumin or gelatin). Thereafter, an antibody that binds to a methylated amino acid residue labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) is contacted to bind to methylated hnRNP. The blot membrane is washed, a chromogenic substrate or a luminescent substrate for the enzyme is added, and the signal is detected by reacting the enzyme with the substrate.

また、前記（Ｂ）の免疫学的分析方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用して行うこともできる。例えば、まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ｈｎＲＮＰに結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、メチル化ｈｎＲＮＰが含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とメチル化ｈｎＲＮＰを接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたメチル化ｈｎＲＮＰと結合するメチル化アミノ酸残基に結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−メチル化ｈｎＲＮＰ−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。 In addition, the immunological analysis method (B) can be performed using a sandwich ELISA method. For example, first, an antibody (capture antibody or primary antibody) that binds to hnRNP is immobilized on an insoluble carrier such as a microplate or beads. Next, in order to prevent non-specific adsorption to the capture antibody or the insoluble carrier, the insoluble carrier is blocked with an appropriate blocking agent (for example, bovine serum albumin or gelatin). A test sample containing methylated hnRNP is added to a plate or bead on which the capture antibody is immobilized together with the primary reaction solution, and the capture antibody and methylated hnRNP are brought into contact with each other to be bound (primary reaction step). Thereafter, antigens and contaminants not bound to the capture antibody are washed with an appropriate washing solution (for example, a phosphate buffer containing a surfactant). Next, a labeled antibody (secondary antibody) in which an antibody that binds to a methylated amino acid residue that binds to the captured methylated hnRNP and an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) is added is added, and the captured antigen is added. A labeled antibody is bound to (secondary reaction step). By this reaction, an immune complex of a capture antibody-methylated hnRNP-labeled antibody is formed on a carrier such as a microplate. The unlabeled labeled antibody is washed with a washing solution, a chromogenic substrate or a luminescent substrate for the enzyme of the labeled antibody is added, and a signal is detected by reacting the enzyme with the substrate.

本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの分析方法において使用する捕捉抗体とは、被検試料中のメチル化ｈｎＲＮＰを捕捉する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、不溶性担体に固相化される固相抗体である。また、本発明のメチル化ｈｎＲＮＰの分析方法において使用する検出抗体とは、捕捉抗体によって捕捉された被検試料中のメチル化ｈｎＲＮＰを検出する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、酵素などによって標識された標識抗体である。前記の説明では、抗ｈｎＲＮＰ抗体を捕捉抗体として、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を検出抗体として用いた場合について説明しているが、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を捕捉抗体として、抗ｈｎＲＮＰ抗体を検出抗体として用いることも可能である。 The capture antibody used in the method for analyzing methylated hnRNP of the present invention is an antibody that captures methylated hnRNP in a test sample. In the sandwich method using the insoluble carrier, the capture antibody is immobilized on an insoluble carrier. Solid phase antibody. The detection antibody used in the method for analyzing methylated hnRNP of the present invention is an antibody that detects methylated hnRNP in a test sample captured by a capture antibody, and is a sandwich method using the insoluble carrier. Then, it is a labeled antibody labeled with an enzyme or the like. In the above description, an anti-hnRNP antibody is used as a capture antibody, and an antibody that binds to a methylated amino acid residue is used as a detection antibody. However, an antibody that binds to a methylated amino acid residue is used as a capture antibody. It is also possible to use an anti-hnRNP antibody as a detection antibody.

抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ^１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に会わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含む。ハプテンにはビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ＦＩＴＣなどが含まれる。例えばビオチンを抗体に結合させ、プローブ複合体を作成した場合、ビオチンに親和性のあるアビジンにＨＲＰなどの酵素、フルオレセインなどの蛍光物質、又はアクリニジウム誘導体などの発光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを検出することができる。 Examples of the enzyme labeling antibody include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, β-galactosidase, and luciferase. Further in addition to the enzyme, as a labeling substance can be used light-emitting materials such as acridinium derivatives, fluorescent substances such as europium, a radioactive substance, such as I ^125. In addition, a substrate or a luminescence inducing substance can be appropriately selected according to the labeling substance. Furthermore, the labeled antibody in the present invention includes an antibody to which a substance that can be used for detection of an antigen-antibody reaction signal such as a hapten, a low molecular weight peptide, or a lectin is bound as a detection marker. Haptens include biotin, dinitrophenyl (DNP), FITC and the like. For example, when a probe complex is prepared by binding biotin to an antibody, an avidin having an affinity for biotin is labeled with an enzyme such as HRP, a fluorescent substance such as fluorescein, or a luminescent substance such as an acrinidium derivative, Signals can be detected by color reaction, fluorescence, luminescence, etc. after reaction.

本発明の癌の診断用である免疫学的分析用試薬には、前記メチル化アミノ酸残基に結合する抗体及びｈｎＲＮＰに結合する抗体を含むことができる。癌の診断用である免疫学的分析用試薬は、メチル化ｈｎＲＮＰと抗体を接触させる抗原抗体反応時に用いる試薬であれば特に限定されない。例えば、前記の免疫沈降及びウエスタンブロットに用いる試薬でもよく、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる試薬でもよい。試薬はメチル化アミノ酸残基に結合する抗体及び／又はｈｎＲＮＰに結合する抗体を単独で含んでもよく、両方の抗体を含んでもよい。免疫学的分析用試薬に用いる緩衝液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液又はヘペス緩衝液など、従来公知の緩衝液から適宜選択することができる。また、免疫学的分析用試薬には、その他の成分、例えば、抗原や抗体を安定化させるための、ウシ血清アルブミンなどのキャリアータンパク質、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、また非特異反応を抑えるための界面活性剤などを含有させることもできる。 The immunological analysis reagent for cancer diagnosis of the present invention can include an antibody that binds to the methylated amino acid residue and an antibody that binds to hnRNP. The reagent for immunological analysis used for cancer diagnosis is not particularly limited as long as it is a reagent used in an antigen-antibody reaction in which methylated hnRNP is contacted with an antibody. For example, it may be a reagent used for the immunoprecipitation and Western blot, or a reagent used for the sandwich ELISA method. The reagent may include an antibody that binds to methylated amino acid residues and / or an antibody that binds to hnRNP alone, or may include both antibodies. The buffer used for the immunological analysis reagent can be appropriately selected from conventionally known buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, and Hepes buffer. In addition, reagents for immunological analysis include other components such as carrier proteins such as bovine serum albumin for stabilizing antigens and antibodies, preservatives such as sodium azide, and non-specific reactions. These surfactants can also be contained.

本発明の癌診断用免疫学的分析キットは、ｈｎＲＮＰに結合する抗体が固相化された不溶性担体（例えば、９６ウェルプレート又はビーズ）、及び前記メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を検出プローブとして含む癌診断用の免疫学的分析試薬を含むことができる。癌診断用の免疫学的分析試薬は溶液の状態で提供されてよいが、凍結乾燥されて粉末状態で提供されてもよい。本発明の癌診断用免疫学的分析キットは、メチル化ｈｎＲＮＰ、及び使用説明書などを含むことができる。 The immunodiagnostic kit for cancer diagnosis of the present invention comprises an insoluble carrier (for example, 96-well plate or bead) on which an antibody that binds to hnRNP is immobilized, and a probe that detects an antibody that binds to the methylated amino acid residue. An immunological analysis reagent for cancer diagnosis can be included. The immunological analysis reagent for diagnosing cancer may be provided in the form of a solution, but may be lyophilized and provided in a powder state. The immunological analysis kit for cancer diagnosis of the present invention can contain methylated hnRNP and instructions for use.

《作用》
多くの癌において、血液中にメチル化アミノ酸残基を含むｈｎＲＮＰ類が増加する理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。癌組織中の癌細胞においては、ＰＲＭＴ１などのタンパク質アルギニンメチル化酵素、及びｈｎＲＮＰ類のリジン残基をメチル化するメチルトランスフェラーゼの発現が亢進しているものと考えられる。癌細胞においては、これらのメチル化酵素により、ｈｎＲＮＰ類のアルギニン及び／又はリジンがメチル化され、更に、血液中にメチル化されたｈｎＲＮＰが単独で、又はｈｎＲＮＰ複合体として、分泌されているものと考えられる。 <Action>
The reason why hnRNPs containing methylated amino acid residues increase in blood in many cancers has not been completely elucidated, but can be inferred as follows. However, the present invention is not limited by the following description. It is considered that expression of protein arginine methyltransferases such as PRMT1 and methyltransferase that methylates lysine residues of hnRNPs is enhanced in cancer cells in cancer tissues. In cancer cells, arginine and / or lysine of hnRNPs are methylated by these methylating enzymes, and hnRNP methylated in the blood alone or as a hnRNP complex is secreted it is conceivable that.

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.

《実施例１：大腸癌組織及び正常組織におけるタンパク質メチル化レベルの比較》
（Ａ）大腸癌患者１２人の癌部の組織及び非癌部の組織を分析に用いた。凍結されたサンプルの一部を切除後、重量を測定し、組織重量１ｇ当り４ｍＬのサンプル処理バッファー（９．８ＭＵｒｅａ，０．５％ＣＨＡＰＳ，１０ｍＭＤＴＴ）を加えた。バッファー中で、鋏を用いて細かく切り刻んだ後、チップ式の超音波破砕機で組織懸濁液を調製した。組織懸濁液を１００００ｒｐｍで５分遠心後、上清をサンプルとして使用した。得られた上清を、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥｂｕｆｆｅｒ（１３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，１４％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，８０ｍＭＤＴＴ，０．０１％ＢＰＢ）で１：１に希釈し、３７℃で３０分インキュベートした。
（Ｂ）サンプルのタンパク質の分解をチェックするために、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、１０μｇのタンパク量を電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ａｂ６２７６を反応させた。二次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ＥＣＬＰｌｕｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）を用い、シグナルを検出した。図１に示される様に、いずれの検体もほぼ等しい量のβアクチンを発現していることが確認でき、保存されていた癌組織のタンパク質は劣化していないことがわかった。
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調整したサンプルを用いて、タンパク質メチル化レベルの測定を行った。抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ＡＣ−１５の代わりに、ＨＲＰ標識した抗メチルリジン抗体ＭＥＫ３Ｄ７（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ５，４６５３，２００５；特許国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７９５９）、又は抗ＡＤＭＡ抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５（特願２００５−３７８９６３）を用いたこと、及び二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体使用しなかったこと以外は、前記工程（Ｂ）の操作を繰り返した。ＨＲＰ標識は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＥＺ−ＬｉｎｋＰｌｕｓＡｃｔｉｖａｔｅｄＰｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いて行った。結果を図２（メチルリジン）及び図３（ＡＤＭＡ）に示した。抗メチルリジン抗体を用いてメチル化タンパク質を検出した場合、約４５ｋ、４０ｋ、２５ｋ、２２ｋ、１５ｋ程度の分子量を有するタンパク質を含む複数のタンパク質が、非癌部（Ｎ）よりも癌部（Ｔ）において濃く染まっており、これらのメチル化タンパク質の増加が認められた。一方、抗ＡＤＭＡ抗体を用いてメチル化タンパク質を検出した場合、７０ｋ、４０Ｋ、２２ｋ程度の分子量を有するタンパク質が、特に顕著に検出されたが、基本的には全分子量領域のタンパク質が、非癌部よりも癌部において強く染色され、メチル化が亢進していた。 << Example 1: Comparison of protein methylation levels in colon cancer tissue and normal tissue >>
(A) The tissue of the cancer part and the tissue of a non-cancer part of 12 colon cancer patients were used for the analysis. A portion of the frozen sample was excised and weighed, and 4 mL of sample processing buffer (9.8 M Urea, 0.5% CHAPS, 10 mM DTT) was added per gram of tissue weight. After finely chopping with a scissors in a buffer, a tissue suspension was prepared with a chip-type ultrasonic crusher. The tissue suspension was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as a sample. The resulting supernatant was diluted 1: 1 with 2 × SDS-PAGE buffer (130 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 14% glycerol, 80 mM DTT, 0.01% BPB), and 30 ° C. at 30 ° C. Incubated for minutes.
(B) In order to check the degradation of the protein in the sample, 10 μg of the protein amount was electrophoresed using 12% SDS polyacrylamide gel, transferred to a PVDF membrane, and anti-β-actin antibody (Abcam) ab6276 Reacted. As a secondary antibody, an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody was reacted, and a signal was detected using ECL Plus (GE HealthCare). As shown in FIG. 1, it was confirmed that all the specimens expressed almost the same amount of β-actin, and it was found that the stored cancer tissue protein was not deteriorated.
(C) The protein methylation level was measured using the sample prepared in the step (A). Instead of anti-β-actin antibody (Abcam) AC-15, HRP-labeled anti-methyllysine antibody MEK3D7 (Proteomics 5,4653,2005; patent international application number PCT / JP2004 / 017959), or anti-ADMA antibody ADMA2-2H5 (special The operation of the step (B) was repeated except that the application 2005-378963) was used and the HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as the secondary antibody was not used. HRP labeling was performed using Pierce's EZ-Link Plus Activated Peroxidase. The results are shown in FIG. 2 (methyl lysine) and FIG. 3 (ADMA). When a methylated protein is detected using an anti-methyllysine antibody, a plurality of proteins including proteins having molecular weights of about 45 k, 40 k, 25 k, 22 k, and 15 k are more cancerous (T) than non-cancerous (N). In these samples, the methylated protein was increased, and an increase in these methylated proteins was observed. On the other hand, when methylated protein was detected using an anti-ADMA antibody, proteins having molecular weights of about 70 k, 40 K, and 22 k were detected particularly prominently. Staining was stronger in the cancer area than in the area, and methylation was increased.

《実施例２：大腸癌組織及び正常組織におけるタンパク質アルギニンメチル化酵素発現レベルのタンパク質レベルでの比較》
実施例１の工程（Ａ）で得られたサンプルのタンパク質アルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴ１の発現レベルを、ウェスタンブロッティングで検出した。抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ａｂ６２７６の代わりに、抗ＰＲＭＴ１抗体（Ａｂｃａｍａｂ７０２７）を用いた以外は、前記実施例１の工程（Ｂ）の操作を繰り返した。結果を図４に示す。前記実施例１で示された抗ＡＤＭＡ抗体を使用したウェスタンブロッティングにおける、全体的なタンパク質の染色の濃淡とほぼ一致して、ＰＲＭＴ１の発現量が変動していることが分かった。このことは、図３において見られた全体的なタンパク質アルギニンメチル化の亢進が、ＰＲＭＴ１分子の発現亢進により担われている可能性を示唆している。 << Example 2: Comparison of protein arginine methylase expression level at the protein level in colon cancer tissue and normal tissue >>
The expression level of protein arginine methylase PRMT1 in the sample obtained in step (A) of Example 1 was detected by Western blotting. The operation of the step (B) of Example 1 was repeated except that an anti-PRMT1 antibody (Abcam ab7027) was used instead of the anti-β-actin antibody (Abcam) ab6276. The results are shown in FIG. In Western blotting using the anti-ADMA antibody shown in Example 1, it was found that the expression level of PRMT1 fluctuated substantially in agreement with the overall protein staining. This suggests that the overall increase in protein arginine methylation seen in FIG. 3 may be borne by increased expression of the PRMT1 molecule.

《実施例３：癌細胞及び正常細胞におけるタンパク質アルギニンメチル化酵素発現レベルのｍＲＮＡレベルでの比較》
タンパク質アルギニンメチル化酵素は、これまで８種類が同定されクローニングされている。これら全てのＰＲＭＴについて、正常細胞及び癌細胞における発現レベルの比較をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて実施した。
ヒト培養癌細胞株として、大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣより入手）、ＲＫＯ（ＡＴＣＣより入手）、肺腺癌細胞ＡＢＣ−１（ＪＣＲＢより入手）、ＬＣ−ＭＳ（ＪＣＲＢより入手）、肺扁平上皮癌細胞Ｈ５２０（ＡＴＣＣより入手）、ＥＢＣ−１（東北大学加齢研より入手）、乳癌細胞ＭＣＦ−７（東北大学加齢研より入手）、Ｔ４７Ｄ（大日本製薬より入手）、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（大日本製薬より入手）、Ｈｕｈ−７（ＪＣＲＢより入手）、神経芽細胞種細胞ＩＭＲ３２（大日本製薬より入手）、及び横紋筋肉種細胞Ａ６７３（大日本製薬より入手）の１２株を用いた。ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ−７は、ＤＭＥＭ培地を用い、それ以外の細胞株は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養した。正常ヒト肝細胞は、ＴｉｓｓｕｅＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＮＪ，ＵＳＡ）で製造され、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭＡ，ＵＳＡ）から供給されているものを、株式会社ケー・エー・シー（栗東市、滋賀県）より購入して用いた。本研究で用いた正常ヒト肝細胞は、ＰＣＲ分析についてはＳｅｒｉａｌＮｏ．ＨＨ−１３４及びＨＨ−１５７の細胞を用い、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ解析においては、これらに加えＨＨ−１１６、ＨＨ１８４、及びＨＨ−１８９の細胞を使用した。肝細胞からのｔｏｔａｌＲＮＡの抽出は、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔを用いて行った。
各ＰＲＭＴアイソザイムのｍＲＮＡを検出するためのプライマーは、ｗｅｂ上で公開されているＰｒｉｍｅｒ３ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計した。各アイソザイムのｃＤＮＡ配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔに登録されている配列情報を用いた。Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅを３００−４００に設定、ＭｉｓｐｒｉｍｉｎｇＬｉｂｒａｒｙをｈｕｍａｎに設定した上で、他はｄｅｆａｕｌｔのままで検索を行った。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ上で複数情報間の不一致が報告されている時は、その領域を含まないｃＤＮＡ配列を検索に用いた。上記方法により設計したプライマー配列及び予想されるＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅは表１に示す通りである。 << Example 3: Comparison of protein arginine methylase expression levels in cancer cells and normal cells at the mRNA level >>
Eight kinds of protein arginine methylases have been identified and cloned so far. For all these PRMTs, comparison of expression levels in normal cells and cancer cells was performed using RT-PCR.
As human cultured cancer cell lines, colon cancer cell lines HT-29 (obtained from ATCC), RKO (obtained from ATCC), lung adenocarcinoma cell ABC-1 (obtained from JCRB), LC-MS (obtained from JCRB), lung Squamous cell carcinoma cell H520 (obtained from ATCC), EBC-1 (obtained from Tohoku University Age Research Institute), breast cancer cell MCF-7 (obtained from Tohoku University Age Research Institute), T47D (obtained from Dainippon Pharmaceutical), hepatoma cell 12 strains of strain HepG2 (obtained from Dainippon Pharmaceutical), Huh-7 (obtained from JCRB), neuroblastoma cell IMR32 (obtained from Dainippon Pharmaceutical), and rhabdomyosarcoma cell A673 (obtained from Dainippon Pharmaceutical) Was used. HepG2 and Huh-7 were cultured in DMEM medium, and other cell lines were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS. Normal human hepatocytes are manufactured by Tissue Transformation Technologies (NJ, USA) and purchased from BD Biosciences (MA, USA) from KA Corporation (Ritto City, Shiga Prefecture). Used. Normal human hepatocytes used in this study were serial No. for PCR analysis. HH-134 and HH-157 cells were used, and in addition to these, HH-116, HH184, and HH-189 cells were used in Western blot analysis. Total RNA was extracted from hepatocytes using QIAGEN's RNeasy mini kit.
Primers for detecting mRNA of each PRMT isozyme were designed using Primer3 server (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) published on the web. . As the cDNA sequence of each isozyme, sequence information registered in Swiss prot was used. The product size was set to 300-400, the Missing Library was set to human, and the search was performed with the rest being default. When a discrepancy between multiple informations was reported on Swiss proto, a cDNA sequence that did not contain that region was used for the search. Table 1 shows the primer sequences designed by the above method and the expected PCR product size.

ＲＴ−ＰＣＲは、基本的には２００ｎｇのｔｏｔａｌＲＮＡのテンプレートを用いて行った。ランダムプライマーを用い、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用い、それぞれのＰＲＭＴのプライマーペアを用いてＰＣＲ反応を実施した。
まず、ｔｏｔａｌＲＮＡ２００ｎｇを全量１０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解し、ｒａｎｄｏｍ６−ｍｅｒ溶液（５０μＭ）を２μＬ加え、６５℃で１０分インキュベートした後、氷冷した。そこに、ｘ５１ｓｔｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ１μＬ、０．１ＭＤＴＴ１μＬ、２０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ０．５μＬ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III ＲＴａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１．５μＬを加え、４３℃で３０分反応させた後、９５℃で５分処理し酵素を失活させた（ＲＴｐｒｏｄｕｃｔ）。
ＰＣＲ反応は、ＲＴｐｒｏｄｕｃｔ１μＬに、ｘ１０ＬＡＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５μＬ、２０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ５μＬ、２５ｍＭＭｇＣｌ_２５μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ）を各０．４μＬ、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ０．２５μＬ、Ｄ．Ｗ．３３μＬを加え、９４℃−５ｍｉｎ加熱した。その後、９４℃−３０ｓｅｃ、６０℃−３０ｓｅｃ、７２℃−２ｍｉｎのサイクルを３０ｃｙｃｌｅｓ繰り返し、７２℃−７ｍｉｎの温度サイクル条件でＰＣＲを実施した。反応産物は、臭化エチジウム入りの２％アガロースゲルで泳動し、紫外光照射により可視化した。
結果を図５に示した。以下、ＰＲＭＴアイソザイムごとに結果の概略をまとめる。
（ＰＲＭＴ１）ヒト正常肝細胞ＨＨ−１５７で特に発現が低く、次いでＨＨ−１３４で低いが、それ以外の癌細胞株では高発現である。
（ＰＲＭＴ２）ヒト正常肝細胞ＨＨ−１５７では、今回の分析条件ではバンドは認められない。ＨＨ−１３４ではごくわずかに検出される。癌細胞株では基本的には発現しているが、一部の細胞（ＲＫＯ、ＡＢＣ−１、ＨｅｐＧ２、ＨＴ−２９、ＬＣ−ＭＳ）でやや低い発現となっている。癌の種類としては、大腸癌及び肺腺癌で低めである。
（ＰＲＭＴ３）これも基本的にＰＲＭＴ−１と同じパターンを示した。但し、大腸癌及び肺腺癌でやや低値である。
（ＰＲＭＴ４）ＰＲＭＴ３と同じ傾向であるが、ＨＨ−１３４においてもほとんどバンドは検出されない。
（ＰＲＭＴ５）これもＰＲＭＴ１と似たパターンであるが、ＲＫＯ及びＬＣ−ＭＳで低値である。
（ＰＲＭＴ６）乳癌細胞の二つ、神経芽細胞種ＩＭＲ３２、及び骨格筋肉腫Ａ６７３以外は非常に低値である。
（ＰＲＭＴ７）ＰＲＭＴ５とほぼ同じパターンで発現している。すなわち、正常組織及び細胞で非常に低く、それ以外はＨＴ−２９及びＡＢＣ−１で低値である。
（ＰＲＭＴ８）予想されるｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅの位置に、全くバンドは見出されなかった。このプライマー以外にも２通りのプライマーを設計して検討したが（ｄａｔａｎｏｔｓｈｏｗｎ）、やはり全く発現は検出されなかった。 RT-PCR was basically performed using a 200 ng total RNA template. CDNA was synthesized by reverse transcription using random primers. Using the obtained cDNA as a template, PCR reaction was performed using each PRMT primer pair.
First, 200 ng of total RNA was dissolved in 10 μL of DEPC-treated water, 2 μL of a random 6-mer solution (50 μM) was added, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 10 minutes, and then ice-cooled. Thereto was added 1 μL of x5 1st strand buffer, 1 μL of 0.1M DTT, 0.5 μL of 20 mM dNTP Mix, 0.5 μL of SuperScript III RTase (Invitrogen), and 1.5 μL of DEPC-treated water, and reacted at 43 ° C. for 30 minutes, and then 95. The enzyme was inactivated by treatment at 5 ° C. for 5 minutes (RT product).
PCR reaction was carried out using RT product 1 μL, x10LA PCR buffer 5 μL, 20 mM dNTP Mix 5 μL, 25 mM MgCl ₂ 5 μL, Forward and Reverse primer (50 μM) each 0.4 μL, TaKaRa Ex. W. 33 μL was added and heated at 94 ° C. for 5 min. Thereafter, a cycle of 94 ° C.-30 sec, 60 ° C.-30 sec, 72 ° C.-2 min was repeated 30 cycles, and PCR was carried out under a temperature cycle condition of 72 ° C.-7 min. The reaction product was run on a 2% agarose gel containing ethidium bromide and visualized by irradiation with ultraviolet light.
The results are shown in FIG. The following summarizes the results for each PRMT isozyme.
(PRMT1) The expression is particularly low in human normal hepatocytes HH-157, and then low in HH-134, but is highly expressed in other cancer cell lines.
(PRMT2) In human normal hepatocytes HH-157, no band is observed under the present analysis conditions. Very little is detected with HH-134. Although it is basically expressed in cancer cell lines, it is slightly low in some cells (RKO, ABC-1, HepG2, HT-29, LC-MS). The types of cancer are low in colorectal cancer and lung adenocarcinoma.
(PRMT3) This also basically showed the same pattern as PRMT-1. However, it is slightly low in colorectal cancer and lung adenocarcinoma.
(PRMT4) Although it has the same tendency as PRMT3, almost no band is detected in HH-134.
(PRMT5) This is also a pattern similar to PRMT1, but has a low value in RKO and LC-MS.
(PRMT6) Except for two breast cancer cells, neuroblastoma type IMR32, and skeletal myoma A673, the values are very low.
(PRMT7) It is expressed in almost the same pattern as PRMT5. That is, it is very low in normal tissues and cells, and is low in HT-29 and ABC-1 in other cases.
(PRMT8) No band was found at the expected product size position. In addition to this primer, two types of primers were designed and examined (data not shown), but no expression was detected.

癌細胞におけるタンパク質の全体的なＡＤＭＡ化を担っている可能性がある酵素は、ＰＲＭＴ−１、３、又は４であると考えられ、特に、ＰＲＭＴ１は、今回の実験で示した発現パターンからも、大腸癌組織のタンパク質のアルギニンのメチル化の原因酵素となっている可能性が最も高いと思われる。 Enzymes that may be responsible for the overall ADMA of proteins in cancer cells are thought to be PRMT-1, 3, or 4, and in particular, PRMT1 is also expressed from the expression pattern shown in this experiment. It seems likely that the enzyme responsible for the methylation of arginine in the protein of colon cancer tissue is the most likely.

《実施例４：抗ｈｎＲＮＰ抗体による細胞ｌｙｓａｔｅからの免疫沈降》
大腸癌組織でメチル化されているタンパク質の探索のために、大腸癌細胞ＲＫＯのタンパク質の解析を行った。
（Ａ）５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１２０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０に、ＲｏｃｈｅのＣｏｍｐｌｅｔｅｍｉｎｉＥＤＴＡｆｒｅｅを加えた緩衝液を用いて、大腸癌細胞ＲＫＯのｌｙｓａｔｅを調製した。得られた細胞ｌｙｓａｔｅを、タンパク質濃度１．１ｍｇ／ｍＬに調整し、各種抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降に用いた抗体は、抗ｈｎＲＮＰＡ０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−１６５０９、ヤギポリクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＡ１（Ａｂｃａｍ社、ａｂ５８３２、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１（Ａｂｃａｍ社、ａｂ６１０２、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＣ１＋Ｃ２（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１０２９４、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１０６８９、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−１４５８１、ヤギポリクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＫ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−２８３８０、マウスモノクローナル抗体）、抗ｈｎＲＮＰＭ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−２０００２、マウスモノクローナル抗体）、及び抗ｈｎＲＮＰＱ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１０６８７、マウスモノクローナル抗体）である。更に、ＡＤＭＡ化が知られているｈｎＲＮＰ以外の二種のタンパク質に対する抗体、抗ＰＡＢＰ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−３２３１８、マウスモノクローナル抗体）、及び抗Ｓａｍ６８（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ−１２３８、マウスモノクローナル抗体）を用いた。ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ５００μＬに、抗体１μｇを添加し、４℃で一晩ローテートした後に、ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｅｐｈａｒｏｓｅＦＦを２０μＬ添加し、更に４℃で４時間ローテートした。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１２０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０で洗浄後、２ｘＳＤＳＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加え、５分間ボイルしてサンプルを調製した。
（Ｂ）サンプルとして免疫沈降によって得られたサンプルを用いたこと、及び抗βアクチン抗体（Ａｂｃａｍ社）ａｂ６２７６の代わりに、前記各種抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いたこと以外は、前記実施例１の工程（Ｂ）の操作を繰り返した。但し、一次抗体としてヤギで作製されたものを用いた場合は、ＨＲＰ標識された抗ヤギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた。結果を図６−８に示した。抗ｈｎＲＮＰＡ１、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、抗ｈｎＲＮＰＫ、抗ｈｎＲＮＰＭ、抗ｈｎＲＮＰＱ、抗ＰＡＢＰ、及び抗Ｓａｍ６８を用いた場合に、特に、多くのタンパク質が免疫沈降された。 Example 4: Immunoprecipitation from cell lysate with anti-hnRNP antibody
In order to search for proteins methylated in colorectal cancer tissues, proteins of colorectal cancer cells RKO were analyzed.
(A) Colon cancer cell RKO lysate was prepared using a buffer solution in which Roche's Complete mini EDTA free was added to 50 mM Tris-HCl, pH 8, 120 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40. The obtained cell lysate was adjusted to a protein concentration of 1.1 mg / mL and immunoprecipitated using various anti-hnRNP antibodies. The antibodies used for immunoprecipitation were anti-hnRNP A0 (SantaCruz, sc-16509, goat polyclonal antibody), anti-hnRNP A1 (Abcam, ab5832, mouse monoclonal antibody), anti-hnRNP A2 / B1 (Abcam, ab6102, mouse) Monoclonal antibody), anti-hnRNP C1 + C2 (Abcam, ab10294, mouse monoclonal antibody), anti-hnRNP F / H (Abcam, ab10689, mouse monoclonal antibody), anti-hnRNP G (SantaCruz, sc-14581, goat polyclonal antibody), Anti-hnRNP K (SantaCruz, sc-28380, mouse monoclonal antibody), anti-hnRNP M (SantaCruz, sc-20002, mouse monoclonal) Le antibodies), and anti-hnRNP Q (Abcam Inc., Ab10687, a murine monoclonal antibody). Furthermore, antibodies against two proteins other than hnRNP, which are known to be ADMA-modified, anti-PABP (SantaCruz, sc-32318, mouse monoclonal antibody), and anti-Sam68 (SantaCruz, sc-1238, mouse monoclonal antibody) Using. 1 μg of antibody was added to 500 μL of cell lysate and rotated overnight at 4 ° C., then 20 μL of Protein A Sepharose FF was added, and further rotated at 4 ° C. for 4 hours. After washing with 50 mM Tris-HCl, pH 8, 120 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, a sample buffer for 2 × SDS PAGE was added and boiled for 5 minutes to prepare a sample.
(B) The steps of Example 1 except that the sample obtained by immunoprecipitation was used as a sample and that the above various anti-hnRNP antibodies were used instead of anti-β-actin antibody (Abcam) ab6276. The operation of B) was repeated. However, when a primary antibody produced by goat was used, an anti-goat IgG antibody labeled with HRP was used as the secondary antibody. The results are shown in FIGS. 6-8. Many proteins were immunoprecipitated, especially when using anti-hnRNP A1, anti-hnRNP C1 / C2, anti-hnRNP F / H, anti-hnRNP K, anti-hnRNP M, anti-hnRNP Q, anti-PABP, and anti-Sam68. .

《実施例５：抗ｈｎＲＮＰ抗体による免疫沈降と抗メチルリジン抗体及び抗ＡＤＭＡ抗体による検出》
実施例４の工程（Ａ）で得られたサンプルを、抗メチルリジン抗体及び抗ＡＤＭＡ抗体で検出した。抗ｈｎＲＮＰ抗体の代わりに、抗メチルリジン抗体又は抗ＡＤＭＡ抗体を用いたこと以外は、実施例４の工程（Ｂ）を繰り返した。結果を図９に示した。抗ＡＤＭＡ抗体による検出において、ｈｎＲＮＰＡ１による免疫沈降物中からはほぼｈｎＲＮＰＡ１の分子量に相当する位置にバンドが検出された。また、ＰＡＢＰ、Ｓａｍ６８に対する抗体での免疫沈降物においても、基本的には、それぞれＰＡＢＰ、及びＳａｍ６８の分子量に相当する位置にメインのバンドが見られた。それに対して、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、ｈｎＲＮＰＫ、ｈｎＲＮＰＭに対する抗体で免疫沈降したサンプルにおいては、それぞれ用いた抗体に対応する分子の位置だけでなく、広い分子量領域に亘って種々のバンドが検出されることが分かった。この結果は、これらの抗体が種々のｈｎＲＮＰを含む分子複合体を免疫沈降する能力があることを示している。
一方、抗ＭｅＫ抗体による検出において、基本的は抗ＡＤＭＡ抗体で検出した際と類似の染色パターンを示したが、抗ＡＤＭＡ抗体では染まらなかったバンドも染色されることが分かった。ここで染色されているタンパク質の多くはｈｎＲＮＰ群のタンパク質である可能性が高いので、この結果は、ｈｎＲＮＰの中にはアルギニンメチル化だけでなく、リジンメチル化も生じている可能性を強く示唆する。
これまで、ｈｎＲＮＰ複合体の検出は、細胞を放射ラベルした後に免疫沈降物をオートラジオグラフィーで検出する手法が主に取られており、今回の様な感度で非ＲＩの条件で複合体を一括して検出できたのは、初めてのことである。 Example 5: Immunoprecipitation with anti-hnRNP antibody and detection with anti-methyllysine antibody and anti-ADMA antibody
The sample obtained in step (A) of Example 4 was detected with an anti-methyllysine antibody and an anti-ADMA antibody. Step (B) of Example 4 was repeated except that an anti-methyllysine antibody or an anti-ADMA antibody was used instead of the anti-hnRNP antibody. The results are shown in FIG. In detection with the anti-ADMA antibody, a band was detected at a position corresponding to the molecular weight of hnRNP A1 from the immunoprecipitate by hnRNP A1. In addition, in the immunoprecipitates obtained with antibodies against PABP and Sam68, basically, main bands were observed at positions corresponding to the molecular weights of PABP and Sam68, respectively. In contrast, in samples immunoprecipitated with antibodies against hnRNP C1 / C2, hnRNP F / H, hnRNP K, and hnRNP M, not only the position of the molecule corresponding to the antibody used, but also a wide molecular weight range. It was found that no band was detected. This result indicates that these antibodies are capable of immunoprecipitation of molecular complexes containing various hnRNPs.
On the other hand, the detection with the anti-MeK antibody basically showed a staining pattern similar to that detected with the anti-ADMA antibody, but it was found that the band that was not stained with the anti-ADMA antibody was also stained. Since many of the proteins stained here are likely to be hnRNP group proteins, this result strongly suggests that not only arginine methylation but also lysine methylation may occur in hnRNP. .
Until now, the hnRNP complex has been mainly detected by autoradiography after the cells are radiolabeled, and the complex is collectively collected under non-RI conditions with the sensitivity as described above. It was the first time that I was able to detect it.

《実施例６：ｈｎＲＮＰ複合体が形成されていることの確認》
実施例５の検討で、いくつかの抗ｈｎＲＮＰ抗体による免疫沈降物には、免疫沈降に用いた抗体が反応する以外のｈｎＲＮＰタンパク質も含まれていることが示唆された。そのことを確かめるために、実施例４の工程（Ａ）で得られた抗ｈｎＲＮＰＡ１、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体で免疫沈降したサンプルを、これら４種の抗体を用いて検出した。抗ｈｎＲＮＰ抗体の代わりに、抗ｈｎＲＮＰＡ１、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体を用いたこと以外は、実施例４の工程（Ｂ）を繰り返した。結果を図１０に示した。抗ｈｎＲＮＰＡ１抗体で免疫沈降したサンプルはｈｎＲＮＰＡ１抗体でのみ検出されたことから、この抗体はｈｎＲＮＰ複合体を免疫沈降する能力は低いものと思われる。この結果は、実施例５での染色パターンと一致する。一方、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体で免疫沈降したサンプルを検出すると、それぞれの抗体のみではなく、抗ｈｎＲＮＰＡ１、抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫの全ての抗体で検出された。従って、少なくともこれら４種の抗体で検出されるｈｎＲＮＰは複合体を形成しており、その複合体は抗ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、抗ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体により免疫沈降されることが分かった。 << Example 6: Confirmation that hnRNP complex is formed >>
In the examination of Example 5, it was suggested that the immunoprecipitates obtained with some anti-hnRNP antibodies contained hnRNP proteins other than those to which the antibody used for immunoprecipitation reacts. In order to confirm this, a sample immunoprecipitated with anti-hnRNP A1, anti-hnRNPC1 / C2, anti-hnRNPF / H and anti-hnRNPK antibodies obtained in step (A) of Example 4 was used to prepare these four types of antibodies. Detected. Step (B) of Example 4 was repeated except that anti-hnRNP A1, anti-hnRNPC1 / C2, anti-hnRNPF / H, and anti-hnRNPK antibody were used in place of the anti-hnRNP antibody. The results are shown in FIG. Since the sample immunoprecipitated with the anti-hnRNP A1 antibody was detected only with the hnRNP A1 antibody, this antibody appears to have a low ability to immunoprecipitate the hnRNP complex. This result is consistent with the staining pattern in Example 5. On the other hand, when samples immunoprecipitated with anti-hnRNP C1 / C2, anti-hnRNP F / H, and anti-hnRNP K antibodies were detected, not only the respective antibodies but also anti-hnRNP A1, anti-hnRNP C1 / C2, anti-hnRNP F / H , And all antibodies of anti-hnRNP K. Therefore, hnRNP detected by at least these four antibodies forms a complex, which can be immunoprecipitated by anti-hnRNP C1 / C2, anti-hnRNP F / H, and anti-hnRNP K antibodies. I understood.

《実施例７：メチル化ｈｎＲＮＰ複合体のサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出》
メチル化ｈｎＲＮＰ及び／又はメチル化ｈｎＲＮＰ複合体を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。市販の抗ｈｎＲＮＰ抗体（抗ｈｎＲＮＰＡ１、抗ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１、抗ｈｎＲＮＰＭ、抗ｈｎＲＮＰＱ、及び抗ｈｎＲＮＰＫ）を１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡ用のＢｌａｃｋｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに室温、３時間で固相化した。１％ＢＳＡでブロッキングした後に、メチル化ｈｎＲＮＰが含まれているＨｅｐＧ２細胞ｌｙｓａｔｅを０．５％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りのＰＢＳで種々の希釈倍率で添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りＰＢＳ）で洗浄後、標識抗体希釈液（０．５％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りのＰＢＳ）で１μｇ／ｍＬに調製したＡＤＭＡ２−２Ｈ５−ＨＲＰ又はＭＥＫ３Ｄ７−ＨＲＰを添加して、室温で１時間インキュベートした。その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＥＬＩＳＡＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出した。その結果、抗ｈｎＲＮＰＱ抗体及び抗ｈｎＲＮＰＫ抗体を用いて固相化した条件で高い反応性が見られ、特に抗ｈｎＲＮＰＫ抗体を用いた時が最も強い反応性を示した。 << Example 7: Detection of methylated hnRNP complex by sandwich ELISA >>
A sandwich ELISA system was constructed to detect methylated hnRNP and / or methylated hnRNP complex. A commercially available anti-hnRNP antibody (anti-hnRNP A1, anti-hnRNP A2 / B1, anti-hnRNP M, anti-hnRNP Q, and anti-hnRNP K) is diluted with PBS at a concentration of 1 μg / mL, and is added to each well of a black plate for ELISA. Solid-phased at room temperature for 3 hours. After blocking with 1% BSA, HepG2 cell lysate containing methylated hnRNP was added at various dilutions with PBS containing 0.5% BSA, 0.1% Triton X-100, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Incubated. After washing with a washing solution (PBS containing 0.1% Triton X-100), ADMA2-2H5 prepared to 1 μg / mL with a labeled antibody diluent (PBS containing 0.5% BSA, 0.1% Triton X-100) -HRP or MEK3D7-HRP was added and incubated for 1 hour at room temperature. Thereafter, a signal was detected using SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce). As a result, high reactivity was observed under the condition where the anti-hnRNP Q antibody and the anti-hnRNP K antibody were immobilized, and the strongest reactivity was exhibited particularly when the anti-hnRNP K antibody was used.

《実施例８：メチル化ｈｎＲＮＰ複合体のサンドイッチＥＬＩＳＡによる癌患者血清の測定》
大腸癌患者、肺癌患者、乳癌患者の血清中のメチル化ｈｎＲＮＰを、ＥＬＩＳＡ法によって分析した。抗ｈｎＲＮＰＫ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚｓｃ−２８３８０）を、ＰＢＳで１ μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、室温、３時間で、ＥＬＩＳＡ用ｂｌａｃｋｐｌａｔｅに固相化した。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ、２％ＳｕｃｒｏｓｅｉｎＰＢＳを用いて、室温で２．５時間ブロッキングした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りＰＢＳで洗浄後、３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｘ１００、ＭｏｕｓｅＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）／ＰＢＳで３倍に希釈した検体を添加した。室温で１時間反応後、洗浄液で洗浄し、標識抗体希釈液で、１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＨＲＰ標識抗メチルリジン抗体（ＭＥＫ３Ｄ７−ＨＲＰ）又はＨＲＰ標識抗ＡＤＭＡ抗体−ＨＲＰ（ＡＤＭＡ２−２Ｈ５−ＨＲＰ）を添加し、室温で１時間反応させた。（以下、それぞれ、ＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法及びＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法と称することがある）洗浄液で洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＥＬＩＳＡＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅを用いて検出した。メチル化ｈｎＲＮＰを含む標準物質としては、ＨｅｐＧ２細胞ｌｓｙａｔｅを３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｘ１００、ＭｏｕｓｅＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）／ＰＢＳで希釈したものを用いた。ＨｅｐＧ２細胞ｌｙｓａｔｅを３倍希釈した時の測定値で全ての測定値を除し、更に１００倍した暫定的な相対値を用いて結果を評価した。
健常人血清１８名、大腸癌患者血清２３名、肺癌血清１５名、乳癌血清５０名分について、測定値をグラフにプロットした結果を図１１に示した。健常人における値の平均値＋２ＳＤを仮のカットオフ値として設定して、陽性率を判定すると、ＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法で検出した場合に、健常人、大腸癌、肺癌、及び乳癌のそれぞれにおいて、６、４８、８０、５０％、ＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法で検出した場合に、それぞれ、６、５７、８０、７８％の陽性率の値を示し、高感度で癌患者血清を検出できることが分かった。特にＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法はダイナミックレンジが広かった。 Example 8 Measurement of Cancer Patient Serum by Methylated hnRNP Complex Sandwich ELISA
The methylated hnRNP in the serum of colon cancer patients, lung cancer patients, and breast cancer patients was analyzed by ELISA. Anti-hnRNP K antibody (SantaCruz sc-28380) was diluted with PBS to a concentration of 1 μg / mL and immobilized on a black plate for ELISA at room temperature for 3 hours. After washing with PBS, blocking was performed for 2.5 hours at room temperature using 1% BSA and 2% sucrose in PBS. After washing with PBS containing 0.1% Triton X-100, a sample diluted 3 times with 3% BSA, 0.1% Tx100, Mouse IgG (100 μg / mL) / PBS was added. After reacting at room temperature for 1 hour, washed with a washing solution, diluted with a labeled antibody diluent to a concentration of 1 μg / mL, HRP-labeled anti-methyllysine antibody (MEK3D7-HRP) or HRP-labeled anti-ADMA antibody-HRP (ADMA2-2H5-HRP) ) Was added and allowed to react for 1 hour at room temperature. (Hereinafter, they may be referred to as MEK-hnRNP method and ADMA-hnRNP method, respectively) After washing with a washing solution, detection was performed using SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate. As a standard substance containing methylated hnRNP, HepG2 cell lysate diluted with 3% BSA, 0.1% Tx100, Mouse IgG (100 μg / mL) / PBS was used. All the measurement values were divided by the measurement values when the HepG2 cell lysate was diluted 3-fold, and the results were evaluated using a provisional relative value further multiplied by 100.
FIG. 11 shows the results of plotting measured values on a graph for 18 healthy human sera, 23 colon cancer patient sera, 15 lung cancer sera, and 50 breast cancer sera. When the average value + 2SD in healthy people is set as a provisional cut-off value and the positive rate is determined, it is 6 in each of healthy people, colon cancer, lung cancer, and breast cancer when detected by the ADMA-hnRNP method. 48, 80, 50%, when detected by the MEK-hnRNP method, respectively, showed positive rate values of 6, 57, 80, 78%, respectively, and it was found that cancer patient serum could be detected with high sensitivity. In particular, the MEK-hnRNP method has a wide dynamic range.

また、今回の検出結果を従来の腫瘍マーカーでの検出率と比較するために、全ての検体でＣＥＡ及びＢＦＰを、大腸癌に関しては更にＣＡ１９−９を、肺癌に関しては更にＣＹＦＲＡを、乳癌に関しては更にＣＡ１５−３及びＢＣＡ２２５を市販のキットを用いて測定した。使用したキットは、それぞれ、ＣＥＡ（ＣＥＡ，ＥＬＩＳＡｋｉｔ，Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ，ＨｏｐｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＴＭ−２０１）、ＢＦＰ（カイノス、ラナザイムＢＦＰプレート）、ＣＡ１９−９（ＰａｎｏｍｉｃｓＢＣ１０１７）、ＣＹＦＲＡ（ＣＹＦＲＡ２１−１，ＥＬＩＳＡ，ＤＲＧＥＩＡ−３９４３）、ＣＡ１５−３（ＰａｎｏｍｉｃｓＢＣ１０１５）、ＢＣＡ２２５（ＫアッセイＩＩＢＣＡ２２５，ＭＢＬ７７２１）である。また、初期癌の検出感度を評価するために、各癌患者検体の中からＳｔａｇｅ−１の検体について解析した。結果を表２に示す。大腸癌においては、市販のいずれの腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９）よりも、本発明の方法が高い陽性率を示していた。大腸癌のＳｔａｇｅ−１の検体は２例であったが、ＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法及びＡＤＭＡ−ｈｎＲＮＰ法のいずれの測定においても陽性であった。市販の腫瘍マーカーではＢＦＰのみが、これらの検体で陽性を示していた。肺癌においては、ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＣＹＦＲＡのいずれの陽性率よりも、本発明の方法が高い陽性率を示していた。Ｓｔａｇｅ−１の検体についても６７％と高い陽性率を示した。乳癌においても、従来のいずれの腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５）よりも本発明の方法が高い陽性率を示しており、特にＭＥＫ−ｈｎＲＮＰ法における陽性率が高かった。Ｓｔａｇｅ−１のサンプルにおいても８０％と高い陽性率をしめしており、この値は従来の腫瘍マーカーよりも高値であった。
以上の結果は、血清中のメチル化ｈｎＲＮＰを測定することにより高感度で腫瘍患者を識別できることを示すものである。 In addition, in order to compare the detection result of this time with the detection rate of the conventional tumor marker, CEA and BFP were used for all specimens, CA19-9 was further used for colorectal cancer, CYFRA was further used for lung cancer, and breast cancer was used. Furthermore, CA15-3 and BCA225 were measured using a commercially available kit. The kits used were CEA (CEA, ELISA kit, Microwell, Hope Laboratories TM-201), BFP (Kainos, Ranazyme BFP plate), CA19-9 (Panomics BC1017), CYFRA (CYFRADR1, GEISA DRA, GEISA DRA, GEISA 21A, ELISA). -3943), CA15-3 (Panomics BC1015), BCA225 (K Assay II BCA225, MBL7721). Moreover, in order to evaluate the detection sensitivity of an early stage cancer, the specimen of Stage-1 was analyzed from each cancer patient specimen. The results are shown in Table 2. In colorectal cancer, the method of the present invention showed a higher positive rate than any commercially available tumor marker (CEA, BFP, CA19-9). Although there were 2 specimens of Stage-1 colorectal cancer, they were positive in both the MEK-hnRNP method and the ADMA-hnRNP method. Of the commercially available tumor markers, only BFP was positive in these samples. In lung cancer, the method of the present invention showed a higher positive rate than any positive rate of CEA, BFP, and CYFRA. The stage-1 specimen also showed a high positive rate of 67%. Also in breast cancer, the method of the present invention showed a higher positive rate than any conventional tumor marker (CEA, BFP, CA15-3, BCA225), and the positive rate in the MEK-hnRNP method was particularly high. The Stage-1 sample also showed a high positive rate of 80%, which was higher than the conventional tumor marker.
The above results indicate that tumor patients can be identified with high sensitivity by measuring methylated hnRNP in serum.

本発明による免疫学的分析方法により、メチル化ｈｎＲＮＰを分析することができる。提供される免疫学的分析方法を用いて、癌患者及び健常人の血清中のｈｎＲＮＰ複合体中のメチル化タンパク質レベルを測定すると、明らかに癌患者血清中で高値を示し、本発明の分析方法が癌の検出に有用であることが示された。また、ｈｎＲＮＰ複合体中のメチル化タンパク質レベルは、初期癌血清においても有意に高値を示したことから、癌の早期発見にも有用な方法である。 Methylated hnRNP can be analyzed by the immunological analysis method according to the present invention. When the level of methylated protein in the hnRNP complex in the sera of cancer patients and healthy individuals is measured using the provided immunological analysis method, it clearly shows a high value in the serum of cancer patients, and the analysis method of the present invention Has been shown to be useful in detecting cancer. In addition, the methylated protein level in the hnRNP complex was significantly high even in the early cancer serum, which is a useful method for early detection of cancer.

１２人の大腸がん患者検体におけるβアクチンの発現を示すウエスタンブロットの写真である。It is a photograph of a Western blot showing expression of β-actin in 12 colorectal cancer patient specimens. １２人の大腸がん患者検体におけるＭｅＫ含有タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。It is a photograph of a Western blot showing expression of MeK-containing protein in 12 colorectal cancer patient specimens. １２人の大腸がん患者検体におけるＡＤＭＡ含有タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。It is a photograph of a Western blot showing expression of ADMA-containing protein in 12 colorectal cancer patient specimens. １２人の大腸がん患者検体におけるＰＲＭＴ１の発現を示すウエスタンブロットの写真である。It is a photograph of a Western blot showing expression of PRMT1 in 12 colorectal cancer patient specimens. 人正常肝細胞、肝癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、肺扁平上皮癌細胞、乳癌細胞、神経芽細胞腫細胞及び横紋筋肉腫細胞におけるＰＲＭＴ１〜ＰＲＭＴ８のｍＲＮＡの発現を示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。Photo of RT-PCR showing expression of PRMT1-PRMT8 mRNA in human normal hepatocytes, liver cancer cells, colon cancer cells, lung cancer cells, lung squamous cell carcinoma cells, breast cancer cells, neuroblastoma cells and rhabdomyosarcoma cells It is. 大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰＡ０、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１、及びｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２）を用いて免疫沈降し、同じ抗体でウエスタンブロットを行った写真である。It is a photograph obtained by immunoprecipitation of colonic cancer cell RKO cell Lysate using anti-hnRNP antibodies (hnRNP A0, hnRNP A1, hnRNP A2 / B1, and hnRNP C1 / C2), and Western blotting with the same antibody. 大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、ｈｎＲＮＰＧ、ｈｎＲＮＰＩ、及びｈｎＲＮＰＫ）を用いて免疫沈降し、同じ抗体でウエスタンブロットを行った写真である。It is the photograph which immunoprecipitated the cell Lysate of colon cancer cell RKO using the anti- hnRNP antibody (hnRNP F / H, hnRNP G, hnRNP I, and hnRNP K), and performed Western blotting with the same antibody. 大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰＭ、ｈｎＲＮＰＱ、ｈｎＲＮＰＰＡＢＰ、及びｈｎＲＮＰＳａｍ６８）を用いて免疫沈降し、同じ抗体でウエスタンブロットを行った写真である。It is the photograph which immunoprecipitated the cell Lysate of colon cancer cell RKO using the anti- hnRNP antibody (hnRNP M, hnRNP Q, hnRNP PABP, and hnRNP Sam68), and performed Western blotting with the same antibody. 大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを１２種類の抗ｈｎＲＮＰ抗体を用いて免疫沈降し、抗ＡＤＭＡ抗体（Ａ）及び抗ＭｅＫ抗体（Ｂ）でウエスタンブロットを行った写真である。It is the photograph which immunoprecipitated the cell Lysate of colon cancer cell RKO using 12 types of anti-hnRNP antibodies, and performed Western blotting with the anti-ADMA antibody (A) and the anti-MeK antibody (B). 大腸癌細胞ＲＫＯの細胞Ｌｙｓａｔｅを４種類の抗ｈｎＲＮＰ抗体（ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＣ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰＦ／Ｈ、及びｈｎＲＮＰＫ）を用いて免疫沈降し、同じ４種の抗体でウエスタンブロットを行い、ｈｎＲＮＰ複合体を確認した写真である。Cell lysate of colon cancer cell RKO was immunoprecipitated using 4 types of anti-hnRNP antibodies (hnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F / H, and hnRNP K), and Western blotting was performed with the same 4 types of antibodies. It is the photograph which confirmed the hnRNP complex. 抗ｈｎＲＮＰＫ抗体と抗ＡＤＭＡ抗体（Ａ）、又は抗ｈｎＲＮＰＫ抗体と抗ＡＤＭＡ抗体（Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡ法により、大腸癌、肺癌、乳癌の患者血清中のメチル化ｈｎＲＮＰを測定したプロット図である。Plot of measurement of methylated hnRNP in serum of patients with colorectal cancer, lung cancer, breast cancer by ELISA using anti-hnRNP K antibody and anti-ADMA antibody (A), or anti-hnRNP K antibody and anti-ADMA antibody (B) It is.

Claims

(1) From the group consisting of anti-heterogeneous nuclea ribonucleoprotein (hnRNP) A1 antibody, anti-hnRNP C1 / C2 antibody, anti-hnRNP F / H antibody, anti-hnRNP K antibody, anti-hnRNP M antibody and anti-hnRNP Q antibody At least one antibody selected;
(2) at least one antibody that binds to a methyl amino acid residue selected from the group consisting of methyllysine and asymmetric dimethylarginine;
HnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H, hnRNP K containing methylated lysine and / or methylated arginine in plasma or serum samples of colon cancer patients, lung cancer patients or breast cancer patients by sandwich method, A method for immunological analysis of a complex of hnRNP M or hnRNP Q.

The immunological analysis method according to claim 1, wherein the methylated heterogeneous nucleoribonucleoprotein forms a complex containing two or more heterogeneous nuclea ribonucleoproteins.

(1) at least one antibody selected from the group consisting of an anti-hnRNP A1 antibody, an anti-hnRNP C1 / C2 antibody, an anti-hnRNP F / H antibody, an anti-hnRNP K antibody, an anti-hnRNP M antibody and an anti-hnRNP Q antibody;
(2) at least one antibody that binds to a methyl amino acid residue selected from the group consisting of methyllysine and asymmetric dimethylarginine;
HnRNP A1, hnRNP C1 / C2, hnRNP F, hnRNP H containing methylated lysine and / or methylated arginine in plasma or serum samples of colon cancer patients, lung cancer patients or breast cancer patients by immunochemical sandwich method , A diagnostic kit for colon cancer, lung cancer or breast cancer that measures a complex of hnRNP K, hnRNP M, or hnRNP Q.

The diagnostic kit according to claim 3, wherein the methylated heterogeneous nucleoribonucleoprotein forms a complex including two or more heterogeneous nuclea ribonucleoproteins.