KR102654677B1 - A use of MMP-1 marker for predicting enhanced bone marrow cell migration of Tonsil-derived mesenchymal stem cell or conditioned medium thereof - Google Patents
A use of MMP-1 marker for predicting enhanced bone marrow cell migration of Tonsil-derived mesenchymal stem cell or conditioned medium thereof Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지의 골수 세포 이동능 향상 예측을 위한 MMP-1 마커 및 이의 용도을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오마커인 MMP-1은 다양한 precursor cell들의 조합 세포들에 따른 heterogeneity의 문제점을 해결할 수 있도록, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지가 골수 세포의 이동능에 미치는 영향에 관한 정보를 제공한다. 이를 통해 골수 이식에 병용 또는 보조제로 투여가 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 결정할 수 있고, 이를 이용하여 골수 부전 등의 질환에 대한 치료제를 개발하는데 활용 가능하다.The present invention provides an MMP-1 marker and its use for predicting improved bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium.
MMP-1, a biomarker according to the present invention, provides information on the effect of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium on the migration ability of bone marrow cells to solve the problem of heterogeneity due to combination of various precursor cells. to provide. Through this, it is possible to determine tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that are suitable for administration in combination with or as an adjuvant for bone marrow transplantation, and can be used to develop treatments for diseases such as bone marrow failure.
Description
본 발명은 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 골수세포 이동능 증진 예측용 바이오마커 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a biomarker composition for predicting the enhancement of bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium comprising an agent for measuring the expression level of mRNA or protein of MMP-1, a kit comprising the composition, The present invention relates to a method of selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhance bone marrow cell migration ability using the MMP-1 biomarker.
줄기세포(Stem cell)는 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포로서 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징을 가지고 있다. 줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있으며, 다분화능이 특징인 성체 줄기세포는 만능 분화능을 지닌 배아줄기세포 및 IPS에 비해 암 발생의 위험, 면역거부반응 및 윤리적인 측면에서 비교적 자유롭기 때문에 많은 연구 및 치료제 개발이 진행 중이다.Stem cells are undifferentiated cells in the pre-differentiation stage that can be obtained from each tissue of the embryo, fetus, and adult and have characteristics such as self-renewal, differentiation, and immortality. Stem cells can be divided into pluripotency, multipotency, and unipotency stem cells according to their differentiation potential. Adult stem cells, which are characterized by pluripotency, are compared to embryonic stem cells and IPS, which have pluripotency. Because it is relatively free from the risk of cancer, immune rejection, and ethical aspects, much research and treatment development is in progress.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 상기와 같은 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수, 편도 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 다양한 질환의 치료제로 개발하고자 하는 노력이 꾸준히 이어져 오고 있다. Mesenchymal stem cells are known to be cells involved in tissue regeneration, treatment, and immune response, along with the multipotency described above. Using these characteristics, mesenchymal stem cells can be derived from umbilical cord blood, bone marrow, tonsils, etc. Efforts to develop treatments for various diseases by isolating and culturing cells have continued.
특히, 중간엽 줄기세포를 이용한 줄기 세포 치료제 개발에 있어서 골수 이식과 관련된 연구 개발이 활발하게 진행되고 있다. In particular, research and development related to bone marrow transplantation is actively underway in the development of stem cell treatments using mesenchymal stem cells.
골수 이식은 백혈병, 재생 불량성 빈혈 등 난치성 혈액질환을 치료하기 위한 중추적인 치료법으로서, 혈액생성을 담당하는 조혈모세포가 존재하는 골반뼈로부터 조혈모세포를 채취하여 환자에게 고용량의 항암제나 방사선 치료 후 투여하는 시술로 특히 백혈병 환자의 치료에 많이 이용된다. 골수 이식 후 생착까지 소요되는 약 2주간의 기간 동안에 골수의 기능이 얼마나 빠른 정도로 회복되느냐의 여부가 치료의 성공을 좌우하는 것으로 알려져 있다.Bone marrow transplantation is a central treatment method for treating intractable blood diseases such as leukemia and aplastic anemia. Hematopoietic stem cells are collected from the pelvic bone where hematopoietic stem cells responsible for blood production exist and administered to the patient after high-dose anticancer drugs or radiation treatment. This procedure is especially widely used in the treatment of leukemia patients. It is known that the success of treatment is determined by how quickly bone marrow function is restored during the approximately two-week period from bone marrow transplantation to engraftment.
이에 골수 기능의 신속한 회복을 위하여 골수 세포의 이식 후의 생착을 촉진하는 방법에 관한 연구가 계속되어 왔다. 이러한 생착 촉진에 있어서는 이식되는 골수 세포, 특히 조혈모세포의 이동 과정이 매우 중요한데, 골수 세포가 혈중에서 골수로 빠르게 이동하는 것이 이식을 성공시키는데 필수적이다. 즉, 성공적인 골수이식을 위해서는 주입한 공여자의 골수세포가 빠르게 비어있는 수여자의 골수로 이동하는 것을 주된 목적으로 해야 한다. 이러한 생착 촉진을 위해서 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)와 골수 세포를 함께 이식함으로써 조혈모세포의 생착량을 증가시키는 것이 많이 연구되고 있다. Accordingly, research has continued on methods to promote engraftment of bone marrow cells after transplantation in order to quickly restore bone marrow function. In promoting engraftment, the migration process of transplanted bone marrow cells, especially hematopoietic stem cells, is very important. Rapid migration of bone marrow cells from the blood to the bone marrow is essential for a successful transplant. In other words, for a successful bone marrow transplant, the main goal should be for the injected bone marrow cells from the donor to quickly move into the empty bone marrow of the recipient. To promote engraftment, much research is being done on increasing the engraftment amount of hematopoietic stem cells by transplanting mesenchymal stem cells and bone marrow cells together.
그런데, 중간엽 줄기 세포가 조혈모세포의 생착 과정 중 면역학적 측면, 싸이토카인 분비의 측면, 또는 homing 과정의 측면 등에 다양하게 영향을 미칠 수 있고 이에 따라 많은 작용 및 부작용들이 알려져 있다. 즉, 중간엽 줄기세포의 경우, 주변 환경, 계대 증가 등에 따라 그 자체의 특성이 달라질 수 있으며, 이로 인해 목적하는 효과를 달성하지 못한 채 부작용 문제로 임상 등이 중단되는 경우가 다수이다. 이에 따라, 사용될 세포들의 안정성을 확보하고 이를 치료제로 이용할 수 있는 여부를 확인하기 위한 바이오마커들의 발굴이 줄기 세포의 초기 설립 단계부터 반드시 수반되어야 한다. However, mesenchymal stem cells can have various effects on the immunological aspect, cytokine secretion aspect, or homing process aspect during the engraftment process of hematopoietic stem cells, and thus many effects and side effects are known. In other words, in the case of mesenchymal stem cells, their own characteristics may vary depending on the surrounding environment, increase in passage, etc., and as a result, clinical trials are often discontinued due to side effects without achieving the desired effect. Accordingly, the discovery of biomarkers to ensure the stability of the cells to be used and to confirm whether they can be used as therapeutic agents must be accompanied from the initial stage of establishing stem cells.
또한, 중간엽 줄기세포는 다양한 타입의 조직으로부터 유도될 수 있다. 그러나, 다양한 공급원으로부터 중간엽 줄기세포가 인비트로 증식 배양 조건에서 배양하는 방법의 차이, 줄기세포의 공여원의 차이 또는, 줄기세포의 추출 부위의 차이 등에 따라 다양성(heterogeneity)을 가질 수 있음이 알려져 있다. 이러한 문제점으로 줄기세포의 안정성 문제가 지속적으로 대두되고 있고, 동질의 특성을 가지는 줄기세포원들을 모을 수 있는 새로운 방법에 대한 연구 개발이 요구되고 있다. Additionally, mesenchymal stem cells can be derived from various types of tissues. However, it is known that mesenchymal stem cells from various sources can have heterogeneity due to differences in methods of culturing under in vitro proliferation culture conditions, differences in stem cell donor sources, or differences in stem cell extraction sites. there is. Due to these problems, the safety issue of stem cells continues to emerge, and research and development of new methods to collect stem cell sources with the same characteristics is required.
위와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 골수 이식에 효과적일 수 있는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 얻기 위한 방법을 찾기 위해 노력하였다. 그 과정에서 편도 유래 줄기세포의 공여체에 따라 다양성을 가지는 세포들을 분류하고, MMP-1의 발현이 높은 편도 유래 줄기세포 및 이의 조정배지가 골수 세포의 이동능을 우수하게 지지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. Against the above background, the present inventors tried to find a method for obtaining tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that can be effective in bone marrow transplantation. In the process, cells with diversity were classified according to the donor of tonsil-derived stem cells, and it was confirmed that tonsil-derived stem cells with high expression of MMP-1 and their conditioned medium can excellently support the migration ability of bone marrow cells. The present invention has been completed.
본 발명의 하나의 목적은 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 골수세포 이동능 증진 예측용 바이오마커 조성물 및/또는 키트를 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide a biomarker composition and/or kit for predicting the enhancement of bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium, including an agent for measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein. It is provided.
본 발명의 다른 하나의 목적은 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 골수 이식 보조를 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지 선별용 바이오마커 조성물 및/또는 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a biomarker composition and/or kit for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance, including an agent for measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein. It is provided.
본 발명의 다른 하나의 목적은 MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhances bone marrow cell migration ability using the MMP-1 biomarker.
본 발명의 다른 하나의 목적은 MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance using the MMP-1 biomarker.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 골수세포 이동능 증진 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.In one embodiment for achieving the above object, a biomarker composition for predicting enhancement of bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium comprising an agent for measuring the expression level of mRNA or protein of MMP-1 provides.
MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) (RefSeq (mRNA): NM_002421, NM_001145938, RefSeq (Protein): NP_001139410, NP_002412)은 MMP 유전자의 염색체 11q22.3에 위치하는 MMP 유전자 클러스터의 일부이다. 배아 발달, 생식 및 조직 재형성과 같은 정상적인 생리적 과정과 관절염 및 전이와 같은 질병 과정에서 세포 외 기질의 분해에 관여하는 것으로 알려져 있고, 특히, MMP-1은 콜라겐 I 형, II 형 및 III 형을 분해하는 것으로 알려져 있다. MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) (RefSeq (mRNA): NM_002421, NM_001145938, RefSeq (Protein): NP_001139410, NP_002412) is part of the MMP gene cluster located on chromosome 11q22.3. It is known to be involved in the degradation of extracellular matrix during normal physiological processes such as embryonic development, reproduction, and tissue remodeling and disease processes such as arthritis and metastasis. In particular, MMP-1 degrades collagen types I, II, and III. It is known to do so.
본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포"는 미분화 상태에서 무한 증식능력(self-renewal capacity)과 더불어 특정한 분화유도자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(multi-differentiation potency)을 가진 세포를 말한다. 중간엽 줄기세포는 그 추출 부위에 따라 여러가지 precursor cell들로 조합되어 세포 구성상 다양성(heterogeneity)을 가질 수 있다. 이러한 세포의 다양성은 비임상 및 임상 시험 등에서 variation을 가져올 수 있기 때문에, 동질의 특성을 가지는 중간엽 줄기세포를 분류할 필요성이 있다. In the present invention, the term "mesenchymal stem cell" refers to an undifferentiated state that has infinite proliferation capacity (self-renewal capacity) and the ability to differentiate into cells of various tissues by a specific differentiation-inducing stimulus (multi-differentiation potency). refers to cells Mesenchymal stem cells can have heterogeneity in cell composition by combining various precursor cells depending on the extraction site. Because the diversity of these cells can lead to variations in non-clinical and clinical trials, there is a need to classify mesenchymal stem cells with similar characteristics.
본 발명에서 용어 "편도"란, 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여, 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직을 의미한다. 상기 편도는 인두편도, 귀인두관편도, 구개편도, 혀편도 등을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 편도는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 제공하는 원천조직으로 사용된다. 본 발명의 용어 "편도 유래 중간엽 줄기세포"는 편도에서 유래한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미한다. 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포는 인간 유래인 것일 수 있다. In the present invention, the term "tonsil" refers to a tissue located inside the throat and the back of the nose that primarily defends the body from substances such as bacteria invading from the outside and at the same time acts as a lymphoepithelial immune tissue. do. The tonsils include pharyngeal tonsils, auropharyngeal tonsils, palatal tonsils, and lingual tonsils. In the present invention, the tonsil is used as a source tissue to provide tonsil-derived mesenchymal stem cells. As used herein, the term “tonsil-derived mesenchymal stem cells” refers to mesenchymal stem cells (MSCs) derived from tonsils. The tonsil-derived mesenchymal stem cells may be of human origin.
편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양 기간은 바람직하게는 4일 이상이며, 보다 바람직하게는 7일 이상이며, 보다 더 바람직하게 7 내지 30일 이내의 배양 기간을 가질 수 있다. 바람직하게 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포는, 편도선 절제 수술을 받은 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취할 경우, 채취한 편도조직을 완충액으로 세척한 후, 효소혼합액을 처리하여 결합조직을 분해하고, 이때 부유된 조직을 원심분리하고, 잘라진 조직 내의 세포 혼합액을 Ficoll을 이용한 세포분획법과 원심분리법으로 하층의 침전된 부분만을 배양하고, 세포바닥에의 부착능을 보이는 세포부분만을 분리한 후, 배양접시 바닥에의 부착능을 보이는 세포 중 세포표면 표지자를 이용한 면역화학방법을 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.The culture period of tonsil-derived mesenchymal stem cells is preferably 4 days or more, more preferably 7 days or more, and even more preferably 7 to 30 days. Preferably, the tonsil-derived mesenchymal stem cells can be collected and used from tonsil tissue isolated from a patient who has undergone tonsillectomy surgery, but the method is not limited thereto. When collecting from tonsil tissue isolated from a patient, the collected tonsil tissue is washed with a buffer solution, treated with an enzyme mixture to decompose the connective tissue, the suspended tissue is centrifuged, and the cell mixture in the cut tissue is treated with Ficoll. Only the sedimented portion of the lower layer was cultured using cell fractionation and centrifugation, and only the cell portion showing the ability to adhere to the cell bottom was separated, followed by an immunochemical method using cell surface markers among the cells showing the ability to adhere to the bottom of the culture dish. You can isolate tonsil-derived mesenchymal stem cells using .
본 발명에서 사용되는 용어, "편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지(Tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium; T-MSC CM)"는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 배양액만 수거한 배지로서, 편도 유래 중간엽 줄기세포 자체를 포함하지 않고 이의 배양액만을 포함하는 배지를 말한다. 본 발명에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 세포를 제거한 후 수득된 배양액 자체, 배양 상층액 또는 이의 농축물이거나 이의 건조물일 수 있다.The term used in the present invention, "Tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM)," refers to a medium obtained by culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells and collecting only the culture medium. It refers to a medium that does not contain the derived mesenchymal stem cells themselves but only their culture medium. In the present invention, the conditioned medium for tonsil-derived mesenchymal stem cells may be the culture medium itself, the culture supernatant, or a concentrate thereof obtained after culturing the tonsil-derived mesenchymal stem cells and removing the cells, or the dried product thereof.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지는 분열 중인 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 배지 내로 추출되어 나오는 성장인자, 사이토카인 등을 포함하는 배지로서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 발현 특징에 따라 타 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지와 유효성분의 구성이 상이하다. 본 발명에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 수득하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 수득하기 위하여, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 대략 60 ~ 90%의 confluency가 될 때까지 배양한 후, 배양 배지를 새로운 배지로 교체한다. 그 다음, 세포를 더 배양한 후, 조정 배지를 수집하고 농축하여 이를 사용한다. The tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium of the present invention is a medium containing growth factors, cytokines, etc. extracted from dividing tonsil-derived mesenchymal stem cells into the medium, according to the expression characteristics of the tonsil-derived mesenchymal stem cells. The composition of the active ingredients is different from that of other mesenchymal stem cell conditioned media. In the present invention, the conditioned medium for tonsil-derived mesenchymal stem cells can be obtained by various methods known in the art. For example, to obtain a conditioned medium for tonsil-derived mesenchymal stem cells, the tonsil-derived mesenchymal stem cells are cultured until approximately 60 to 90% confluency, and then the culture medium is replaced with new medium. Then, after culturing the cells further, the conditioned medium is collected, concentrated, and used.
본 발명에 있어서 조성물은 위와 같은 동질의 특성으로 골수 세포, 특히 조혈모세포(바람직하게, 골수 유래 조혈 모세포)의 이동능을 증진시키는 우수한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 분류하여 골수 이식의 치료제 및/또는 보조제로 이용할 수 있게 한다. 또한, 본 발명에 있어서 동일한 추출 부위에서 추출된 편도 유래 중간엽 줄기세포라도 이를 제공하는 공여체에 따라 특성이 상이할 수 있는 바, 동일한 원천조직으로부터 유래된 편도 유래 중간엽 줄기세포 중에서 우수한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 분류하여 골수 이식이 필요한 환자에 적합한 세포 또는 이의 조정 배지를 제공한다. In the present invention, the composition is classified into excellent tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhance the migration ability of bone marrow cells, especially hematopoietic stem cells (preferably, bone marrow-derived hematopoietic stem cells) with the same characteristics as above, for bone marrow transplantation. It can be used as a treatment and/or adjuvant. In addition, in the present invention, even tonsil-derived mesenchymal stem cells extracted from the same extraction site may have different characteristics depending on the donor providing them, and among tonsil-derived mesenchymal stem cells derived from the same source tissue, the tonsil-derived mesenchymal stem cells are superior. The mesenchymal stem cells or their conditioned medium are classified to provide cells or their conditioned medium suitable for patients in need of bone marrow transplantation.
"골수 세포(bone marrow cell; BMC)"는 골수를 이루는 세포들을 의미하는 것으로, 조혈 및 비조혈 세포가 있으며, 조혈 세포는 모든 형태의 혈액 세포로 분화할 수 있고, 순환계의 혈액 리니지(linage)를 제공한다. 본 발명에서 골수 세포는 조혈 모세포, 보다 바람직하게 골수 유래 조혈모세포일 수 있다.“Bone marrow cell (BMC)” refers to the cells that make up the bone marrow. There are hematopoietic and non-hematopoietic cells. Hematopoietic cells can differentiate into all types of blood cells and blood lineage of the circulatory system. provides. In the present invention, the bone marrow cells may be hematopoietic stem cells, more preferably bone marrow-derived hematopoietic stem cells.
본 발명에서 사용되는 용어, "조혈모세포(hematopoietic stem cell)"는 혈액을 구성하는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 혈액 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 의미하는 것으로, 골수와 말초 혈액에 존재한다.The term "hematopoietic stem cell" as used in the present invention refers to cells that have the ability to differentiate into blood cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets that make up blood, and are present in the bone marrow and peripheral blood. do.
골수 세포와 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 함께 투여하는 경우 골수 세포의 생착이 촉진될 수 있는데, 이러한 생착 촉진에서는 골수 세포의 이동능이 매우 중요하다. 본 발명에 따른 MMP-1 마커의 발현이 높은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 골수 세포와 함께 투여하면 골수 세포의 골수로의 이동능을 크게 증진시킴으로써 이식받은 개체에서 골수세포 충실도(bone marrow cellularity)가 빠르게 증가하고, 말초 혈액 세포가 빠르게 회복(혈중 순환 적혈구 수가 증가하는 등)될 수 있으며, 골수세포의 콜로니 형성 능력이 향상 시키는 등의 작용을 통해 골수 이식의 효능을 크게 증진 시킬 수 있다. When bone marrow cells and tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium are administered together, engraftment of bone marrow cells can be promoted, and the migration ability of bone marrow cells is very important in promoting this engraftment. When tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium with high expression of the MMP-1 marker according to the present invention are administered together with bone marrow cells, the migration ability of bone marrow cells to the bone marrow is greatly improved, thereby increasing bone marrow cell fidelity in transplant recipients. Marrow cellularity can rapidly increase, peripheral blood cells can recover quickly (increasing the number of circulating red blood cells, etc.), and the colony-forming ability of bone marrow cells can be improved, thereby greatly improving the efficacy of bone marrow transplantation. there is.
본 발명에서 “골수세포 이동능”이란 골수 세포, 특히 조혈모세포가 골수에서 자가 복제(duplication)와 증식(proliferation)을 할 수 있으며 혈액 내 여러 세포 (적혈구, 혈소판, 호산구, 호염구, 단핵구, 중성구, T 림프구, B림프구, 자연살상세포, 가지돌기 세포)로 분화(differentiation)할 수 있는 능력을 가지는바, 이러한 세포를 골수로 이동시키는 능력을 의미한다. In the present invention, “myeloid cell migration ability” means that bone marrow cells, especially hematopoietic stem cells, can self-replicate and proliferate in the bone marrow, and various cells in the blood (red blood cells, platelets, eosinophils, basophils, monocytes, neutrophils, It has the ability to differentiate into T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, and dendritic cells), which means the ability to move these cells to the bone marrow.
본 발명에서 "편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 골수세포 이동능 증진 예측용 바이오마커"는 치료 목적 등으로 투여된 골수 세포의 이동능, 특히 골수로의 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지인지 여부에 관한 정보를 제공하는 바이오마커이다. 구체적으로, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지가 골수 세포의 이동능 측면에 차이를 나타냄을 확인할 수 있도록 정보를 제공할 수 있는 선별/분류를 위한 바이오마커이다. 본 발명의 목적상 MMP-1의 발현 수준이 높아 골수 세포의 이동능을 높일 수 있는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지인지, 또는 유전자의 발현 수준이 낮아 골수 세포의 이동능 개선 효과가 낮은 이용 가능성이 낮은 줄기세포 또는 이의 조정배지인지 여부를 탐지할 수 있는 바이오마커를 의미한다.In the present invention, "biomarker for predicting the enhancement of bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium" is a tonsil-derived medium that enhances the migration ability of bone marrow cells administered for therapeutic purposes, especially to the bone marrow. It is a biomarker that provides information on whether it is a mesenchymal stem cell or its conditioned medium. Specifically, it is a biomarker for selection/classification that can provide information to confirm that tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium show differences in the migration ability of bone marrow cells. For the purpose of the present invention, it is the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that can increase the migration ability of bone marrow cells due to the high expression level of MMP-1, or the low expression level of the gene, which has a low effect of improving the migration ability of bone marrow cells. It refers to a biomarker that can detect whether it is a stem cell or its conditioned medium with low availability.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, MMP-1이 높게 발현하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 골수 세포와 함께 처리하는 경우, 골수 세포의 이동능이 크게 증가한다. 이에 따라, 이를 골수이식 등에 대한 치료제/보조제, 골수부전 치료제/보조제 등으로 이용할 가능성이 높다. 반면, MMP-1이 낮게 발현하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 골수 세포와 함께 처리하는 경우, 골수 세포 이동능 측면에서 개선 효과가 매우 낮다. 이에 따라, 이러한 세포 또는 이의 조정배지의 경우 골수 이식 등에 사용하지 않는 세포 또는 조정 배지로 분류될 수 있다. 이러한 정보를 통하여, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 골수 이식에 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별 및 분류할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, when tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium, which highly express MMP-1, are treated together with bone marrow cells, the migration ability of bone marrow cells is greatly increased. Accordingly, there is a high possibility of using it as a treatment/adjuvant for bone marrow transplantation, a treatment/adjuvant for bone marrow failure, etc. On the other hand, when tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium expressing low MMP-1 are treated together with bone marrow cells, the improvement effect in terms of bone marrow cell migration ability is very low. Accordingly, these cells or their conditioned medium can be classified as cells or conditioned medium not used for bone marrow transplantation, etc. Through this information, tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium suitable for bone marrow transplantation can be selected and classified using the composition according to the present invention.
따라서, 본원 발명에서는 위 MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수 이식 보조를 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지 선별할 수 있도록 정보를 제공할 수 있다.Therefore, the present invention can provide information to select tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance using the above MMP-1 biomarker.
위와 같이, 본원 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 골수 이식 보조를 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지 선별용 바이오마커 조성물을 제공한다. As described above, the present invention is an aspect for achieving the above object, and provides tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance, including an agent for measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein. A biomarker composition for screening is provided.
상기 바이오마커 조성물은 골수세포의 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지에 관한 정보를 제공한다. 즉, 선별된 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지는 골수 세포의 이동능을 크게 증가시킨다. The biomarker composition provides information about tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhances the migratory ability of bone marrow cells. That is, selected tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium significantly increase the migration ability of bone marrow cells.
본 발명의 기술분야에서 상기 바이오마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 또는 프로브이나, 이로 제한되지 않는다.In the technical field of the present invention, the agent for measuring the mRNA level of the biomarker is preferably a primer or probe, but is not limited thereto.
프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.A primer is a short nucleic acid sequence that has a free 3' hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand.
프로브는 mRNA와 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있으며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 자연 또는 변형된 핵산 단편을 의미한다. 혼성화에 사용되는 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.A probe refers to a natural or modified nucleic acid fragment such as RNA or DNA that can hybridize to mRNA and a specific nucleotide sequence and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA. Probes used for hybridization may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc. Suitable conditions for hybridization can be determined by controlling temperature, ionic strength (buffer concentration), and the presence of compounds such as organic solvents. These stringent conditions may vary depending on the sequence being hybridized.
통상의 기술자는, 공지된 본 발명의 바이오마커 유전자 핵산 서열로부터 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍 또는 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 인지하는 프로브를 디자인할 수 있고, 이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있도록 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등의 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.A person skilled in the art can design a primer pair that specifically amplifies a specific region of the gene or a probe that specifically recognizes a specific region of the gene from the known nucleic acid sequence of the biomarker gene of the present invention, and this technology It can be chemically synthesized using methods known in the art. Additionally, it can be modified using labels such as radioactive isotopes, fluorescent molecules, biotin, etc. to provide a detectable signal directly or indirectly.
본 기술분야에서 바이오마커 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체로, MMP-1에 대하여 각각 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체 등을 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv의 형태도 포함한다.In the present technical field, agents for measuring biomarker protein levels are preferably antibodies, and include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies that each specifically bind to MMP-1. Antibodies of the invention can also be used in intact form, having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule, e.g., Fab, F(ab'), F(ab') 2 and forms of Fv.
MMP-1에 특이적인 각각의 항체는 기존의 항체뿐만 아니라 공지된 방법으로 제조될 수 있는 항체를 모두 포함한다.Each antibody specific for MMP-1 includes both existing antibodies as well as antibodies that can be produced by known methods.
이를 이용하여, 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다. Using this, quantitative immunoassays (e.g., radioimmunoassay method, radioimmunoprecipitation method, enzyme-linked immunosorbent method (ELISA), dot blot analysis, Western blot, inhibition or competition assay, and sandwich assay) are performed. It can be conducted visually or qualitatively.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 골수세포 이동능 증진 예측용 바이오마커 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. In one embodiment for achieving the above object, a biomarker composition for predicting the enhancement of bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium comprising an agent for measuring the expression level of mRNA or protein of MMP-1. To provide a kit containing.
본 발명에서 골수세포 이식 보조란 당업계에서 일반적으로 사용되는 골수세포이식 치료 또는 골수세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제제를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 골수이식이 필요한 개체에 골수이식 후 골수세포의 생착, 골수세포 이동능 등을 촉진하여 골수세포 또는 이를 포함하는 치료제의 효과를 증진시킬 수 있다. 이러한 보조제 또는 보조제의 역할로 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지가 이용될 수 있다. In the present invention, bone marrow cell transplantation auxiliary refers to an agent that can be used as an auxiliary agent to enhance the effect of bone marrow cell transplantation or bone marrow cell therapy commonly used in the art. By using the auxiliary agent according to the present invention, bone marrow transplantation is necessary. After bone marrow transplantation to an individual, the effect of bone marrow cells or a therapeutic agent containing them can be improved by promoting the engraftment of bone marrow cells and the ability to migrate bone marrow cells. Tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium may be used as such an adjuvant or adjuvant.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 골수 이식 보조를 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지 선별용 바이오마커 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. In one embodiment for achieving the above object, a biomarker composition for selection of tonsil-derived mesenchymal stem cells or conditioned medium thereof for bone marrow transplantation assistance comprising an agent for measuring the expression level of mRNA or protein of MMP-1 is provided. We provide a kit that includes:
상기 키트에는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지로부터 MMP-1의 발현 증가 또는 감소에 관한 바이오마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.The kit includes primers or antibodies that can selectively recognize biomarker genes or their proteins related to increased or decreased expression of MMP-1 from tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium, as well as sugars used in immunological analysis. Includes tools, reagents, etc. commonly used in the field. These tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling agents capable of producing a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, etc. If the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate that can measure enzyme activity and a reaction stopper. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, It may be polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이로 구성되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있다. The kit includes a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) device, a real-time PCR device, an ELISA plate, a dip-stick device, an immunochromatography test strip, and a radial fractionation immunoassay device, and a flow-through device. It may have a form such as a flow-through device, and is preferably configured as a microarray, but is not limited thereto. Additionally, when antibodies are provided on a protein chip on which multiple proteins can be immobilized, the formation of antigen-antibody complexes for two or more antibodies can be observed.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법을 제공한다. As one aspect for achieving the above object, a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhances bone marrow cell migration ability using the MMP-1 biomarker is provided.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법을 제공한다. As one aspect for achieving the above object, a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance using the MMP-1 biomarker is provided.
구체적 양태로서, MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법은, (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 MMP-1의 발현량이 기준치와 대비하여 증가하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 단계;를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 이루어질 수 있다.In a specific embodiment, the method of selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhances bone marrow cell migration ability using the MMP-1 biomarker includes (a) a sample from the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium; steps to obtain; (b) measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein in the sample; and (c) selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium in which the expression level of MMP-1 in step (b) increases compared to the reference value. This method can be done in vitro.
또한, 구체적 양태로서, MMP-1 바이오마커를 이용하여 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법은, (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 MMP-1의 발현량이 기준치와 대비하여 증가하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지로 선별하는 단계;를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 이루어질 수 있다. In addition, in a specific embodiment, the method of selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance using the MMP-1 biomarker includes (a) selecting a sample from the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium; Steps to get; (b) measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein in the sample; and (c) selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium in which the expression level of MMP-1 in step (b) increases compared to the baseline as tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance. Step; may include. This method can be done in vitro.
구체적으로, 상기 단계 (a) 단계의 시료를 얻는 단계는 mRNA 또는 단백질의 발현수준 측정을 위한 통상의 mRNA 또는 단백질 시료를 얻는 단계이다. 이러한 시료의 수득은 편도 유래 중간엽 줄기세포 자체 또는 이의 조정배지로부터 당업계에 알려진 방법 또는 시료 수득을 위한 키트 등을 이용하여 손쉽게 취득할 수 있다. Specifically, the step of obtaining a sample in step (a) is a step of obtaining a typical mRNA or protein sample for measuring the expression level of mRNA or protein. Such samples can be easily obtained from tonsil-derived mesenchymal stem cells themselves or their conditioned medium using methods known in the art or kits for sample acquisition.
상기 (b) 단계에서의 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정은 앞서 언급된 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 이용하여 앞서 언급된 내용과 통상의 기술 범위의 측정 방법을 통해 위 MMP-1의 발현 수준을 측정할 수 있다. To measure the expression level of MMP-1 mRNA or protein in step (b), the conventional method of measuring the expression level of the previously mentioned mRNA or protein can be used. For example, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) devices, Real time PCR devices, ELISA plates, dip-stick devices, immunochromatographic test strips, and radial split immunoassay devices, and flow -The expression level of MMP-1 can be measured using a flow-through device, etc., using the measurement methods mentioned above and within the scope of common technology.
상기 결과로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 종류(즉, 상이한 공여체 또는 공여자로부터 수득된 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지)에 따라 상이하게 증가하거나 감소하는 MMP-1의 발현량을 확인할 수 있고, 그 결과를 기초로 하여 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하거나 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별할 수 있다. From the above results, the expression level of MMP-1 increases or decreases differently depending on the type of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium (i.e., tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium obtained from different donors or donors). can be confirmed, and based on the results, tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhance bone marrow cell migration ability can be selected, or tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance can be selected. .
여기서 기준치 또는 기준 수준이라 함은 통상의 줄기세포들에서 발현되는 MMP-1의 발현 수준일 수 있다. 또는 골수 세포의 이동능 수준이 낮은 줄기세포 또는 이의 조정배지에서 측정된 MMP-1의 발현 수준일 수 있다. 이러한 기준치 또는 기준 수준은 목적에 따라 조금씩 상이해 질 수 있으나, 생체 내 투여되는 골수세포와 함께 이용되기에 적합한 세포로 분류하기 위한 적절한 기준이 되는 수준을 명확히 제공한다. Here, the reference value or reference level may be the expression level of MMP-1 expressed in normal stem cells. Alternatively, it may be the expression level of MMP-1 measured in stem cells or their conditioned medium with a low level of migration ability of bone marrow cells. These reference values or reference levels may vary slightly depending on the purpose, but clearly provide a level that serves as an appropriate standard for classifying cells as suitable for use with bone marrow cells administered in vivo.
본 발명은 또한, 상기 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법 또는 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법에 따라 선별된, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 제공한다. The present invention also provides a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhances the bone marrow cell migration ability, or a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for assisting bone marrow transplantation. , tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium are provided.
상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 MMP-1의 발현량이 높은 것(예를 들어, 위 언급된 기준치 이상)을 그 특징으로 한다. The tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium are characterized by a high expression level of MMP-1 (for example, above the above-mentioned standard value).
본 발명은 또한, 상기 골수세포 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법 또는 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 방법에 따라 선별된 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that enhances the bone marrow cell migration ability, or a method for selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for assisting bone marrow transplantation. A pharmaceutical composition comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium is provided.
본 발명은 또한, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 골수 세포를 포함하는 골수 부전 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for preventing or treating bone marrow failure, comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium and bone marrow cells.
본 발명은 또한 상기 언급된 선별하는 방법에 따라 선별된, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지 조정 배지를 포함하는 골수 세포 이식 보조제를 제공한다.The present invention also provides a bone marrow cell transplantation aid comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or conditioned medium thereof, selected according to the above-mentioned selection method.
본 발명은 또한, (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중, MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 MMP-1의 발현량이 기준치와 대비하여 증가하는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 선별하는 단계; 및 (d) 상기 선별된 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 골수 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계;를 포함하는 골수 부전의 치료 방법을 제공한다. The present invention also includes the steps of (a) obtaining a sample from tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium; (b) measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein in the sample; (c) selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium in which the expression level of MMP-1 in step (b) increases compared to the reference value; and (d) administering the selected tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium and bone marrow cells to a subject in need thereof.
상기 골수부전(bone marrow failure)은 정상적 골수의 기능이 어떤 이유로든 상실하게 된 상태를 의미한다. 예컨대, 백혈구, 혈소판, 적혈구 등의 수치가 정상 수치와 대비하여 감소된 상태가 골수부전의 하나의 상태로 설명될 수 있다. 골수 부전은 백혈병, 골수이형성증, 재생불량성 빈혈과 같은 일차적인 골수부전과 항암 화학요법이나 방사선 치료법 등에 의해서 유발되는 이차적 골수부전을 포함한다. 예를 들어, 상기 골수부전은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 재생불량성 빈혈, 다발성골수종, 악성 림프종, 골수증식종양, 골수형성이상증후군, 발작성 야간혈색소뇨증, 면역부전증, 혈색소이상증, 판코니 빈혈, 전신성 홍반성 낭창 또는 항암제 치료 이후의 이차적 골수부전일 수 있으나, 이로 제한되지 아니한다.The bone marrow failure refers to a state in which normal bone marrow function is lost for any reason. For example, a state in which the levels of white blood cells, platelets, red blood cells, etc. are reduced compared to normal levels can be explained as a state of bone marrow failure. Bone marrow failure includes primary bone marrow failure, such as leukemia, myelodysplasia, and aplastic anemia, and secondary bone marrow failure, caused by chemotherapy or radiation therapy. For example, the bone marrow failure may include acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, aplastic anemia, multiple myeloma, malignant lymphoma, myeloproliferative tumor, myelodysplastic syndrome, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, It may be, but is not limited to, immunodeficiency, hemochromatosis, Fanconi anemia, systemic lupus erythematosus, or secondary bone marrow failure after anticancer drug treatment.
본 발명의 약학 조성물은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 골수세포의 시너지 효과에 따른 골수 부전 질환의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지와 골수세포는 이들 각각을 별도로 사용하는 것과 대비하여 이 둘을 조합하였을 때 현저한 시너지 효과를 가져 골수부전 치료에 현저한 효능을 나타낸다. 특히, 본 발명의 방법에 따라 선별된 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 골수세포의 이동능을 크게 증진시키고 세포 다양성을 최소화하여 부작용 없이 치료 효과를 보다 더 우수하게 나타낼 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention exhibits a significant effect in preventing or treating bone marrow failure diseases due to the synergistic effect of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium and bone marrow cells. Specifically, the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium and bone marrow cells of the present invention have a remarkable synergistic effect when combined compared to using each of them separately, showing remarkable efficacy in treating bone marrow failure. In particular, tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium selected according to the method of the present invention can greatly enhance the migration ability of bone marrow cells and minimize cell diversity, resulting in better therapeutic effects without side effects.
본 발명의 조성물은 조합물의 형태로 제공될 수 있다. The compositions of the present invention may be provided in the form of a combination.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.The composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.The type of carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art can be used. Non-limiting examples of the carrier include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, albumin injection solution, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, maltodextrin, glycerol, ethanol, etc. You can. These may be used individually or in combination of two or more types.
또한, 본 발명의 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.In addition, if necessary, the composition of the present invention can be used by adding other pharmaceutically acceptable additives such as excipients, diluents, antioxidants, buffers or bacteriostatic agents, fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants, and binders. Alternatively, it can be used by additionally adding a lubricant, etc.
본 발명의 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 더욱 바람직하게는 주사제 또는 주입제로 제제화될 수 있다.The composition of the present invention can be formulated and used in a variety of suitable formulations for oral or parenteral administration, but is more preferably formulated as a formulation for parenteral administration, and even more preferably as an injection or infusion. You can.
본 발명의 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 주사제 또는 주입제로 제제화하는 경우, 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.To prepare the composition of the present invention for parenteral administration, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, topical preparations, etc. can be used. The non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, Vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, etc. may be used. In addition, when formulated as an injection or infusion, the composition of the present invention can be mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, and the composition can be formulated for unit administration in an ampoule or vial.
또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 직장, 피하, 근육, 복강, 정맥, 동맥, 뇌척수강내, 골수 내 등으로 투여가능하며, 바람직하게는 골수 내로 투여될 수 있다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다.In addition, it can be implanted and administered using administration methods commonly used in the art, and preferably can be engraftment or transplantation directly into the diseased area of a patient requiring treatment, but is not limited thereto. For example, the composition of the present invention can be administered rectally, subcutaneously, muscle, abdominal cavity, vein, artery, intrathecally, intramedullary, etc., and preferably, intramedullary. In addition, the above administration can be done both non-surgically using a catheter and surgical administration such as injection or transplantation after incision of the diseased area.
본 발명의 조성물은 골수부전을 앓고 있는 개체, 구체적으로 골수세포의 이식을 필요로 하는 개체에 있어서, 이식되었거나 이식될 예정의 골수세포가 생착이 신속하고 원활히 이루어질 수 있도록 골수 이식과 동시 또는 이시(골수 이식 전 또는 후 포함)의 적절한 시기에 투여될 수 있다.The composition of the present invention is used simultaneously with or later than bone marrow transplantation so that the transplanted or scheduled bone marrow cells can engraft quickly and smoothly in an individual suffering from bone marrow failure, specifically an individual in need of bone marrow cell transplantation. It can be administered at an appropriate time (including before or after bone marrow transplantation).
본 발명의 조성물은 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지를 0.4 mg/ml 내지 1 mg/ml 농도로 포함할 수 있으며, 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 1.0 X 105개/ml 내지 1.0 X 109 개/ml, 구체적으로 1.0 X 106 개/ml 내지 1.0 X 108개/ml의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 골수 세포, 바람직하게 조혈모세포를 1.0 X 105개/ml 내지 1.0 X 109 개/ml, 구체적으로 1.0 X 106 개/ml 내지 1.0 X 108개/ml로 포함할 수 있다.The composition of the present invention may include tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium at a concentration of 0.4 mg/ml to 1 mg/ml, and tonsil-derived mesenchymal stem cells at a concentration of 1.0 /ml, specifically , it may be included at a concentration of 1.0 Additionally , bone marrow cells , preferably hematopoietic stem cells, may be included at 1.0
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 동시 또는 이시에 골수 세포를 투여하는 경우, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 골수 세포의 투여량은 골수세포의 생착을 충분히 촉진시킬 수 있도록 적절히 조절될 수 있다. 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.When administering bone marrow cells simultaneously or simultaneously with the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium of the present invention, the dosage of the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium and bone marrow cells is sufficient to promote engraftment of bone marrow cells. It can be adjusted appropriately so that It should be understood that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of various related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age, and gender, and therefore, the dosage may be determined in any way. It does not limit the scope of the present invention.
본 발명의 조성물의 유효량, 유효 투여량은 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 효과가 충분히 발휘될 수 있도록 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.The effective amount and effective dosage of the composition of the present invention may vary depending on the formulation method of the composition, administration method, administration time and/or administration route, etc., and the type and degree of response to be achieved by administration of the composition and the subject of administration. Various factors including the type of the subject, age, weight, general health, symptoms or severity of the disease, gender, diet, excretion, ingredients of other compositions used simultaneously or simultaneously with the subject, and similar factors well known in the medical field. It may vary depending on factors, and a person skilled in the art can easily determine the dosage so that the desired effect can be sufficiently achieved.
본 발명에서, "골수세포의 이식이 필요한 개체"는 이에 제한되는 것은 아니나, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 재생불량성 빈혈, 판코니 빈혈, 면역부전증, 다발성 골수종, 골수증식종양, 골수형성이상증후군, 호지킨림프종 등과 같은 골수부전 질환을 앓고 있는 환자뿐만 아니라 항암제 투여 또는 방사선 조사 등으로 골수 세포가 손상되어 골수세포 이식을 필요로 하는 모든 개체를 포함 할 수 있다.In the present invention, “individuals in need of bone marrow cell transplantation” are not limited thereto, but include acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, aplastic anemia, Fanconi anemia, immunodeficiency, and multiplex. This includes not only patients suffering from bone marrow failure diseases such as myeloma, myeloproliferative tumor, myelodysplastic syndrome, and Hodgkin's lymphoma, but also all individuals who require bone marrow cell transplantation due to damage to bone marrow cells due to administration of anticancer drugs or radiation. there is.
본 발명에서 골수세포 이식 보조제란 당업계에서 일반적으로 사용되는 골수세포이식 치료 또는 골수세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제제를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 골수이식이 필요한 개체에 골수이식 후 골수세포의 생착, 골수세포 이동능 등을 촉진하여 골수세포 또는 이를 포함하는 치료제의 효과를 증진시킬 수 있다. 본 발명의 이식 보조제는 골수부전을 앓고 있는 개체, 구체적으로 골수세포의 이식을 필요로 하는 개체에 있어서, 이식되었거나 이식될 예정의 골수세포가 생착이 신속하고 원활히 이루어질 수 있도록 골수세포 이식과 동시 또는 이시(골수 이식 전 또는 후 포함)의 적절한 시기에 투여될 수 있다.In the present invention, bone marrow cell transplantation adjuvant refers to an agent that can be used as an auxiliary agent to enhance the effect of bone marrow cell transplantation treatment or bone marrow cell treatment commonly used in the art. By using the adjuvant according to the present invention, bone marrow transplantation is required. After bone marrow transplantation to an individual, the effect of bone marrow cells or a therapeutic agent containing them can be improved by promoting the engraftment of bone marrow cells and the ability to migrate bone marrow cells. The transplantation adjuvant of the present invention is used simultaneously with bone marrow cell transplantation or to ensure rapid and smooth engraftment of transplanted or scheduled bone marrow cells in individuals suffering from bone marrow failure, specifically in need of bone marrow cell transplantation. It may be administered at an appropriate time (including before or after bone marrow transplantation).
본 발명에 따른 바이오마커인 MMP-1은 다양한 precursor cell들의 조합 세포들에 따른 heterogeneity의 문제점을 해결할 수 있도록, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지가 골수 세포의 이동능에 미치는 영향에 관한 정보를 제공한다. 이를 통해 골수 이식에 병용 또는 보조제로 투여가 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 결정할 수 있고, 이를 이용하여 골수 부전 등의 질환에 대한 치료제를 개발하는데 활용 가능하다.MMP-1, a biomarker according to the present invention, provides information on the effect of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium on the migration ability of bone marrow cells to solve the problem of heterogeneity due to combination of various precursor cells. to provide. Through this, it is possible to determine tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium that are suitable for administration in combination with or as an adjuvant for bone marrow transplantation, and can be used to develop treatments for diseases such as bone marrow failure.
도 1은 공여자 차이에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지의 골수 세포 이동능 증진 차이를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 편도 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 및 골수 유래 중간엽 줄기세포의 MMP-1 발현 수준을 확인할 결과를 나타낸다.
도 3은 골수세포 이동증진 향상 우수군(3, 10, 11, 21, 24 및 25)과 골수세포 이동 증진 향성 저하군(4, 9, 18 및 22)의 조정 배지 내 MMP-1의 함량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 MMP-1 발현을 억제한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 처리할 때 골수 세포 이동능이 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다. Figure 1 shows the results of confirming differences in the enhancement of bone marrow cell migration ability of tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned media according to differences in donors.
Figure 2 shows the results of confirming the MMP-1 expression level of tonsil-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
Figure 3 shows the content of MMP-1 in the conditioned medium of the excellent bone marrow cell migration enhancement group (3, 10, 11, 21, 24, and 25) and the low bone marrow cell migration enhancement tropism group (4, 9, 18, and 22). Indicates the confirmed result.
Figure 4 shows the results confirming that bone marrow cell migration ability is reduced when treated with conditioned medium of tonsil-derived mesenchymal stem cells that suppress MMP-1 expression.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Examples are presented to aid understanding of the present invention. The following examples are provided to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the examples.
<실시예 1> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 수립 <Example 1> Establishment of tonsil-derived mesenchymal stem cells
편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cell, T-MSC) 는 이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도적출술을 시행하는 환자로부터 적출된 편도 조직으로부터 얻어 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 serum-free DMEM 하에 배양되었다. Tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSC) were obtained from tonsillar tissue removed from a patient undergoing tonsillectomy at the ENT Surgery Department of Ewha Womans University Mokdong Hospital and contained 10% FBS, 1% penicillin/ Cultured in serum-free DMEM supplemented with streptomycin.
구체적으로, 총 25명의 다른 공여자로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포를 얻었으며, 이를 공여자별로 나누어서 각각 별도로 보관 및 배양하였다. Specifically, tonsil-derived mesenchymal stem cells were obtained from a total of 25 different donors, and these were divided for each donor and stored and cultured separately.
한편, 지방 유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)는 Promocell, ATCC, 및 Invitrogen에서 제공되는 동일 계대의 세포를 사용하였으며, 골수 중간엽 줄기세포(BMMSC)의 경우 서울 연세대학교 세브란스 병원 세포치료센터, ATCC, 및 Promocell로부터 제공되는 동일 계대의 세포를 사용하였다. Meanwhile, for adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC), cells of the same passage provided by Promocell, ATCC, and Invitrogen were used, and for bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC), Cell Therapy Center, Yonsei University Severance Hospital, Seoul, ATCC, and cells of the same passage provided by Promocell were used.
<실시예 2> 중간엽 줄기세포의 조정배지의 제조 <Example 2> Preparation of conditioned medium for mesenchymal stem cells
위 제조된 줄기세포로부터 조정 배지를 제조하기 위하여 100mm 디쉬에 TMSC(Tonsil-derived mesenchymal stem cell) 디쉬 면적의 80%가 찰 정도로 배양한 다음, serum-free RPMI1640 media 10 ml에서 48시간 배양하였다. To prepare conditioned medium from the stem cells prepared above, TMSC (Tonsil-derived mesenchymal stem cells) were cultured in a 100 mm dish until 80% of the dish area was filled, and then cultured in 10 ml of serum-free RPMI1640 media for 48 hours.
그리고 나서, 중간엽 줄기세포로부터 얻은 supernatant를 100G, 5분 centrifugation 후 상층액을 0.2um syringe filter (sartorius stedim, Germany,S6534)로 필터링하였다. 필터한 medium을 centrifugal filter (Amicon, UFC900396)로 4℃, 5000G, 1시간 20분 농축하여 조정배지(Conditioned medium, CM)를 얻었다. Then, the supernatant obtained from mesenchymal stem cells was centrifuged at 100G for 5 minutes, and the supernatant was filtered with a 0.2um syringe filter (sartorius stedim, Germany, S6534). The filtered medium was concentrated using a centrifugal filter (Amicon, UFC900396) at 4°C, 5000G, 1 hour and 20 minutes to obtain conditioned medium (CM).
<실시예 3> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 Migration Assay<Example 3> Migration Assay of tonsil-derived mesenchymal stem cells
8주된 수컷 C57BL/6 생쥐에서 분리한 골수세포를 분리하였다. Bone marrow cells were isolated from 8-week-old male C57BL/6 mice.
구체적으로, 8주된 수컷 C57BL/6 생쥐 안락사 시킨 후 쥐의 양쪽 다리의 골수(Bone marrow)를 수확하였다. 수확한 골수를 70% 에탄올에서 2분, PBS에서 2분 세척한 후 serum free RPMI1640 media에서 골수 양 끝을 잘라주었다. 자른 골수에 serum free RPIMI1640 media를 통과시켜 세포를 분리하였다. 분리된 세포가 있는 media를 70um strainer(SPL, 93070)에 걸렀다. 300G, 5분 centrifugation 후 ACK Lysing Buffer로 red blood cell을 깬 후 조혈모세포(hematopoietic stem cell)을 얻었다. Specifically, 8-week-old male C57BL/6 mice were euthanized, and bone marrow from both legs of the mice was harvested. The harvested bone marrow was washed in 70% ethanol for 2 minutes and PBS for 2 minutes, and then both ends of the bone marrow were cut in serum free RPMI1640 media. Cells were separated by passing serum free RPIMI1640 media through the cut bone marrow. Media containing separated cells was filtered through a 70um strainer (SPL, 93070). After centrifugation at 300G for 5 minutes, red blood cells were broken with ACK Lysing Buffer and hematopoietic stem cells were obtained.
Migration assay를 위하여, 하위챔버 (FALCON, 351147)에 600 ul serum-free RPMI1640 medium, SDF-1α(0.2 ng/ml, Peprotech, 300-25A-50UG)를 넣었다. 상위챔버 (Costar, 3421) 대조군에 각 plate well당 골수세포 1x106 cell과 serum-free media 100 ul를 상위챔버에 넣었다. 실험군은 골수세포 1x106 cell과 1x105 cell에 대한 배지(Conditioned medium, CM) 100 ul를 상위챔버에 넣었다. 그리고 나서, 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. For migration assay, 600 ul serum-free RPMI1640 medium, SDF-1α (0.2 ng/ml, Peprotech, 300-25A-50UG) was added to the lower chamber (FALCON, 351147). Upper chamber (Costar, 3421) For the control group, 1x10 6 bone marrow cells per each plate well and 100 ul of serum-free media were placed in the upper chamber. In the experimental group, 100 ul of conditioned medium (CM) for bone marrow cells 1x10 6 cells and 1x10 5 cells were placed in the upper chamber. Then, it was incubated at 37°C for 4 hours.
상기 실시예 1에서 제조한 총 25명의 다른 공여자(TMSC.No로 넘버링)로부터의 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 이용하여 Migration assay를 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. Migration assay was performed using the conditioned medium of tonsil-derived mesenchymal stem cells from a total of 25 different donors (numbered as TMSC.No.) prepared in Example 1, and the results are shown in Figure 1.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 공여자 별로 골수 이동능 향상 정도가 상이함을 확인하였다. 즉, 공여자에 따라 줄기세포의 다양성이 존재하여 골수 이식 보조에 적합한 중간엽 줄기세포에 관한 분류가 필요함을 확인하였다. As can be seen in Figure 1, it was confirmed that the degree of improvement in bone marrow migration ability was different for each donor of tonsil-derived mesenchymal stem cells. In other words, it was confirmed that there is diversity in stem cells depending on the donor, and that classification of mesenchymal stem cells suitable for bone marrow transplantation is necessary.
<실시예 4> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 RNAseq 및 Proteomics (Mass spectrometry) 분석 <Example 4> RNAseq and Proteomics (Mass spectrometry) analysis of tonsil-derived mesenchymal stem cells
편도 유래 중간엽 줄기세포의 공여자별 특성을 RNAseq 및 Proteomics (Mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다. The characteristics of each donor of tonsil-derived mesenchymal stem cells were analyzed using RNAseq and Proteomics (Mass spectrometry).
Proteomics를 이용하여 세포 배지를 분석하기 위하여, 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 Serum이 포함되지 않은 배지에서 48시간 키운 후 그 배지를 Proteomics를 통해 분석하였다. 그 결과, 골수세포 이동 향상능이 우수한 그룹에서만 발현되는 단백질이 Type 1 interstial collagenase인 Matrix metalloproteinase-1 (MMP1)임을 확인하였다. To analyze the cell medium using proteomics, tonsil-derived mesenchymal stem cells were grown in serum-free medium for 48 hours and the medium was analyzed through proteomics. As a result, it was confirmed that the protein expressed only in the group with excellent ability to improve bone marrow cell migration was Matrix metalloproteinase-1 (MMP1), a type 1 interstial collagenase.
또한, 전반적인 발현량을 지방 유래 중간엽 줄기세포(ADMSC) 및 골수 중간엽 줄기세포의 MMP1 유전자 발현량을 비교하고, 이를 도 2에 나타내었다. In addition, the overall expression level of the MMP1 gene was compared with that of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC) and bone marrow mesenchymal stem cells, and this is shown in Figure 2.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, Matrix metalloproteinase-1 (MMP1)의 전반적 발현량은 지방 유래 중간엽 줄기세포(ADMSC) 및 골수 중간엽 줄기세포와 대비하여 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 높게 나옴을 확인하였다. As can be seen in Figure 2, the overall expression level of Matrix metalloproteinase-1 (MMP1) was confirmed to be higher in tonsil-derived mesenchymal stem cells compared to adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC) and bone marrow mesenchymal stem cells. did.
<실시예 5> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지에서의 ELISA 분석을 통한 MMP-1 발현 확인 <Example 5> Confirmation of MMP-1 expression through ELISA analysis in conditioned medium of tonsil-derived mesenchymal stem cells
실시예 2의 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 골수 세포 이동능에 차이를 보여주었던 골수세포 이동증진 향상 우수군과 골수세포 이동 증진 향성 저하군에 대해 실험을 수행하였다.An experiment was performed on the group with excellent bone marrow cell migration enhancement and the group with poor bone marrow cell migration enhancement tropism, which showed differences in bone marrow cell migration ability in the tonsil-derived mesenchymal stem cells of Example 2.
구체적으로, ELISA로 골수세포 이동 향상능 우수 그룹과 저하 그룹에서의 MMP-1의 분비양을 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. Specifically, the secretion amount of MMP-1 in the group with excellent and poor bone marrow cell migration enhancement ability was measured using ELISA, and the results are shown in Figure 3.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 골수세포 이동증진 향상 우수군(3, 10, 11, 21, 24 및 25)과 골수세포 이동 증진 향성 저하군(4, 9, 18 및 22)는 현저하게 MMP-1 발현에서 차이를 나타내었다. As can be seen in Figure 3, the group with excellent myeloid cell migration enhancement (3, 10, 11, 21, 24, and 25) and the group with poor myeloid cell migration enhancement tropism (4, 9, 18, and 22) significantly decreased MMP. -1 showed a difference in expression.
특히, 우수 그룹에서의 평균 MMP-1의 농도는 126 ng/ml이었고, 저하 그룹에서의 평균 농도는 42 ng/ml으로, 우수 그룹에서의 MMP-1 농도가 저하 그룹에 비해 2.99배 높음을 확인하였다. In particular, the average MMP-1 concentration in the excellent group was 126 ng/ml, and the average concentration in the poor group was 42 ng/ml, confirming that the MMP-1 concentration in the good group was 2.99 times higher than that in the poor group. did.
위 결과로부터 MMP-1 발현형 뿐만 아니라 분비형을 이용하여서 골수세포 이동증진능이 좋은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 분류할 수 있음을 확인하였다. From the above results, it was confirmed that tonsil-derived mesenchymal stem cells with good ability to promote bone marrow cell migration can be classified using not only MMP-1 expression type but also secretion type.
<실시예 5> MMP-1 발현 억제에 따른 골수 세포 이동능 확인 <Example 5> Confirmation of bone marrow cell migration ability according to inhibition of MMP-1 expression
MMP-1 발현 변화가 편도 유래 준간엽 줄기세포의 골수 세포 이동능에 영향을 주는 것을 확인하기 위하여 siRNA로 MMP-1의 발현을 억제하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, 100 mm 디쉬에 TMSC(Tonsil-derived mesenchymal stem cell) 디쉬 면적의 60%가 찰 정도로 기른 다음 si-MMP1(20nM, Invitrogen, 26814379) 처리하여 MMP-1의 발현을 knockdown 시켰다. 그리고 나서 72시간 후, serum-free RPMI-1640 media 10 ml에서 48시간 배양하였다. 다음으로, 편도 중간엽 줄기세포로부터 얻은 supernatant를 100G, 5분 centrifugation 후 상층액을 0.2um syringe filter로 필터링하였다. 필터링한 medium을 centrifugal filter로 4℃, 5000G, 1시간 20분 농축하여 조정 배지(Conditioned medium, CM)을 얻었다.To confirm that changes in MMP-1 expression affect the bone marrow cell migration ability of tonsil-derived quasi-mesenchymal stem cells, an experiment was performed by inhibiting the expression of MMP-1 with siRNA. Specifically, TMSC (Tonsil-derived mesenchymal stem cells) were grown in 100 mm dishes until 60% of the dish area was filled, and then treated with si-MMP1 (20 nM, Invitrogen, 26814379) to knockdown the expression of MMP-1. Then, 72 hours later, the cells were cultured in 10 ml of serum-free RPMI-1640 media for 48 hours. Next, the supernatant obtained from tonsil mesenchymal stem cells was centrifuged at 100G for 5 minutes, and the supernatant was filtered through a 0.2um syringe filter. The filtered medium was concentrated using a centrifugal filter at 4°C, 5000G, 1 hour and 20 minutes to obtain conditioned medium (CM).
그리고 나서, 위 실시예 2에서와 유사하게 Migration assay를 통해 골수세포의 이동능에 변화를 확인하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. Then, similar to Example 2 above, changes in the migration ability of bone marrow cells were confirmed through a migration assay, and the results are shown in Figure 4.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, siRNA로 MMP-1의 발현을 저해시킨 실험 군(si-MMP-1)에서는 골수세포 이동능이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 반면, MMP-1이 정상적으로 발현되는 실험군(si-Neg)의 경우 골수세포 이동능을 보다 우수하게 개선시킴을 확인하였다. As can be seen in Figure 4, in the experimental group (si-MMP-1) in which the expression of MMP-1 was inhibited with siRNA, the migration ability of bone marrow cells was confirmed to be significantly reduced. On the other hand, in the case of the experimental group (si-Neg) in which MMP-1 was normally expressed, it was confirmed that the bone marrow cell migration ability was significantly improved.
위 결과들로부터 본원 발명에 따른 바이오마커인 MMP-1이 미분화된 줄기세포들, 특히 다양한 precursor cell들의 조합 세포들에 따른 heterogeneity의 문제점을 해결할 수 있도록, 골수 세포 이동능을 증진시킬 수 있는 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지에 관한 정보를 제공하였다. 즉, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지 중 골수 이식 보조 등에 적합하게 이용될 수 있는 세포 및 조정 배지에 대한 정보를 제공할 수 있는 바이오마커로 MMP-1이 제공될 수 있다. 또한 분비형 단백질에 대한 확인을 통해서 관련 정보를 얻을 수 있다는 점에서도 장점을 가진다. From the above results, MMP-1, a biomarker according to the present invention, is suitable for improving bone marrow cell migration ability to solve the problem of heterogeneity caused by undifferentiated stem cells, especially combination cells of various precursor cells. Information regarding derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium was provided. In other words, MMP-1 can be provided as a biomarker that can provide information about cells and conditioned media that can be suitably used to aid bone marrow transplantation, among tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium. It also has the advantage of being able to obtain relevant information through identification of secreted proteins.
성공적인 골수 이식을 위해서는 주입한 공여자의 골수 세포가 빠르게 비어있는 수여자의 골수로 이동하는 것이 중요한데, 본원 발명에 따른 기술은 이러한 골수로의 세포 이동에 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지에 대한 정보를 구체적으로 제공하는 점에서 기술적 우수성이 인정된다. For successful bone marrow transplantation, it is important for the injected bone marrow cells from the donor to quickly move into the empty bone marrow of the recipient. The technology according to the present invention uses tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium suitable for cell migration into the bone marrow. Technical excellence is recognized in that it provides detailed information.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.This specification omits detailed description of content that can be fully recognized and inferred by a person of ordinary skill in the technical field of the present invention, and changes to the technical idea or essential structure of the present invention other than the specific examples described in this specification. Various modifications are possible within the scope of not doing so. Accordingly, the present invention may be practiced in ways other than those specifically described and exemplified in this specification, which can be understood by those skilled in the art.
Claims (17)
상기 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 분리된 복수의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 비교하여 각각의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 골수세포 이동능 증진 효과를 예측하기 위한 것인, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 공여자별 골수세포 이동능 증진 효과 예측용 바이오마커 조성물.A biomarker composition for predicting the effect of enhancing bone marrow cell migration ability for each donor of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium, comprising an agent for measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein,
The composition compares the expression level of MMP-1 mRNA or protein of a plurality of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium isolated from a plurality of different donors, and the bone marrow of each tonsil-derived mesenchymal stem cell or its conditioned medium A biomarker composition for predicting the effect of enhancing cell migration ability for each donor of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium.
(b) 상기 수집된 각각의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지로부터 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정한 각각의 발현수준을 비교하여 MMP-1 발현수준이 가장 높은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 선별하는 단계;를 포함하는 골수세포의 이동능을 증진시키는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지의 선별 방법. (a) collecting each tonsil-derived mesenchymal stem cell or conditioned medium thereof isolated from a plurality of different donors;
(b) measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein from each of the collected tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium; and
(c) selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells with the highest MMP-1 expression level by comparing the expression levels measured above; tonsil-derived mesenchymal stem cells that enhance the migration ability of bone marrow cells, including Method for selection of conditioned medium.
(b) 상기 수집된 각각의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지로부터 MMP-1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정한 각각의 발현수준을 비교하여 MMP-1 발현수준이 가장 높은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 선별하는 단계;를 포함하는 골수 이식 보조용 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지의 선별 방법.
(a) collecting each tonsil-derived mesenchymal stem cell or conditioned medium thereof isolated from a plurality of different donors;
(b) measuring the expression level of MMP-1 mRNA or protein from each of the collected tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium; and
(c) selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells with the highest MMP-1 expression level by comparing the expression levels measured above; tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium for bone marrow transplantation assistance, including Screening method.
Priority Applications (2)
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020210090110A KR102654677B1 (en) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | A use of MMP-1 marker for predicting enhanced bone marrow cell migration of Tonsil-derived mesenchymal stem cell or conditioned medium thereof |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20230009566A KR20230009566A (en) | 2023-01-17 |
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ID=84801937
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Stem Cells, 27(6):1366-75.(2009.02.26.) |
Also Published As
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