KR102649246B1 - Pd-1 부착 나노케이지 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 부착 나노케이지 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 PD-1 부착 나노케이지(PdNC)는 PD-1 및 프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L) 신호를 차단하고 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME) (효과기 단계) 및 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN) (인지 단계)의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도함으로써, PD-1 및 PD-L 차단 기반 요법의 적응성을 증대시키는 바, 다양한 종류의 암 치료에 적용할 수 있다.

Description

PD-1 부착 나노케이지 및 이의 용도{PD-1-decorated nanocages and uses thereof}

본 발명은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 부착 나노케이지 및 이의 용도에 관한 것이다.

면역 체크 포인트 차단(Immune checkpoint blockade)-기반 치료는 암 환자에서 상당한 임상적 이점을 나타내었다. 특히 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 및 프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L) 차단 기반 치료법은 비소 세포 폐암, 흑색종 및 신장 세포암과 같은 다양한 암에 대해 놀라운 임상적 성공을 거두었다. PD-1은 면역 세포, 주로 활성화된 T 세포의 표면에서 발현되며, T 세포 상의 PD-1은 PD-L1 또는 PD-L2와 특이적으로 결합하여 면역 억제를 일으킨다. 종양 세포는 PD-L1 및 PD-L2를 과발현함으로써 면역 감시에서 탈출한다.

이에, PD-1과 그 리간드의 상호 작용을 방해하고 암에 대한 면역 반응을 높이기 위해 단일 클론 항체가 개발되었으며, 이들은 상당한 항종양 효과를 나타내었다. 그러나, PD-1 및 PD-L 차단은 이러한 상당한 임상적 이점에도 불구하고 소수의 환자에서만 유의한 효과를 나타내어 여러 암에 적용하기에 제한이 있어 왔다. 이에, PD-1 및 PD-L 차단 기반 치료에 있어서 보다 효과적인 치료법과 전략이 요구되고 있다.

PD-1 및 PD-L 차단 기반 치료는 일반적으로 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)에서 T 세포를 재활성화함으로써 그 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. PD-L1은 수지상 세포(Dendritic cells, DC)와 같은 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)를 포함하는 면역 세포에 의해 발현된다. DC는 가장 강력한 APC이며 림프 기관에서 T 세포의 프라이밍(priming), 활성화 및 재활성화를 매개하여 항종양 면역에 중요한 역할을 한다. 최근 보고에 따르면, 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN)에서 PD-1 및 PD-L 차단은 효과적인 암 면역 요법에 중요하며, 전이성 림프절에서 PD-1 및 PD-L의 발현 상태가 불량한 예후 특징과 관련이 있음이 입증되었다. 또한, DC의 PD-L1이 새로 활성화되고 재활성화되는 T 세포의 억제에 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, T 세포 고갈을 억제하고 DC 매개 T 세포 활성화 및 재활성화를 유도할 수 있는 TME 및 TDLN 모두에서 PD-1 및 PD-L을 차단하기 위한 효과적인 시스템 개발에 상당한 관심을 기울이고 있다.

한편, 나노 스케일 재료는 다양한 특정 분자에 대한 높은 표면 및 부피 비율과 생체기능화 능력으로 인해 약물 전달과 같은 의료 분야에서 널리 사용되어 왔다. 특히, 나노 스케일 재료는 나노 물질의 가장 중요한 특징인 작은 크기로 인해 다양한 표적 장기에 생체기능 분자를 효율적으로 전달할 수 있다. 대략 10-100 nm 크기의 물질은 주로 림프관에 들어가는 반면 10 nm 미만의 물질은 주로 혈액 모세 혈관을 통해 흡수되는 것으로 알려져 있다. 최근 보고에서는 S-니트로화 나노 입자(S-nitrosated nanoparticles, SNO-NP)를 사용하는 림프 표적 전달 시스템을 개발하였으며, 중간 크기(30nm) SNO-NP가 수동 림프 배출 및 침투를 통해 총 림프절(lymph node, LN) 축적을 소형(10nm) 및 대형(100nm) SNO-NP에 비해 크게 증가시킨다는 것을 입증했다. 또 다른 보고에서는 종양 내 주입된 10-20 nm 크기의 melittin-NP를 개발하였으며, 이는 LN으로 배출되고 APC가 활성화되어 전신 항종양 면역 반응을 유도함을 확인하였다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 PD-1을 페리틴(ferritin) 나노케이지에 유전적으로 통합하여 PD-1 부착 나노케이지(PdNCs)를 제작하고, 이의 TME(효과기 단계) 및 TDLN(인지 단계)의 두 면역 체크 포인트에서의 항종양 면역 활성화에 따른 우수한 항암 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. L.F. Sestito, S.N. Thomas, Biomaterials 265 (2021) 120411.

본 발명의 하나의 목적은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 및 자기조립 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 및 자기조립 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 융합단백질이 자기조립되어 형성되는 단백질 나노케이지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 나노케이지를 포함하는 약물 전달체를 공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 나노케이지를 포함하는 약물 전달 시스템을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 하나의 양태는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 및 자기조립 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "면역 체크 포인트 차단(Immune checkpoint blockade)"은 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된, 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지하는 특정 단백질을 차단 또는 억제하는 것을 의미한다. 상기 특정 단백질이 차단되면 종양 특이적 T 세포와 같은 면역세포가 암세포를 더 잘 사멸시킬 수 있다. 상기 면역 체크 포인트로 현재까지 알려진 것은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 또는 그의 리간드인 PD-L1/PD-L2, 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 있다.

본 발명에서 용어, "프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1)"은 면역 세포, 주로 활성화된 T 세포의 표면에서 발현되며, T 세포 상의 PD-1은 프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L)인 PD-L1 또는 PD-L2와 특이적으로 결합하여 면역 억제를 일으킨다. 종양 세포는 PD-L1 및 PD-L2를 과발현함으로써 면역 감시에서 탈출하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PD-1은 이로 특별히 제한되는 것은 아니나, 뮤린(murine) 유래 PD-1일 수 있고, 구체적으로 뮤린 PD-1의 외부 도메인 중 가용성(soluble) PD-1(sPD-1)의 단량체일 수 있다.

상기 PD-1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에서 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 76%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 발명의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.

본 발명에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "나노케이지(nanocage, NC)"는 중공의 나노입자(hollow nanoparticle)를 의미하며, 무기 나노케이지와 유기 나노케이지가 포함될 수 있다. 상기 무기 나노케이지는 금속 나노입자를 끓는 물에서 다른 금속과 반응시킴으로써 생성되는 속이 빈 금속 나노입자로, 예컨대, 은(Ag) 나노입자를 끓는 물에서 염화금산(HAuCl₄)과 반응시킴으로써 생성되는 속이 빈 다공성의 금(Au) 나노입자 등이 있다. 상기 유기 나노케이지는 자기조립 단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지인 단백질 나노케이지가 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 나노케이지는 자기조립 단백질의 자기조립에 의해 생성되는 유기 나노케이지, 즉, 단백질 나노케이지일 수 있다.

본 발명에서 용어, "자기조립 단백질(self-assembled protein)"은 특별한 유도물질의 도움이 없이 발현과 동시에 규칙적인 배열에 의해 다량체(multimer)를 형성함으로써 나노입자를 형성할 수 있는 단백질을 의미한다. 상기 자기조립 단백질의 예로는 페리틴(ferritin), sHsp(small heat shock protein), vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, 및 다양한 바이러스 캡시드 단백질 및 박테리오파지 캡시드 단백질 등이 있다. 상기 자기조립 단백질에 관해서는 Hosseinkhani 등(Chem. Rev., 113(7): 4837-4861, 2013)에 기술되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.

상기 바이러스 캡시드 단백질 및 박테리오파지 캡시드 단백질은 박테리오파지 MS2 캡시드 단백질, 박테리오파지 P22 캡시드 단백질, Qβ 박테리오파지 캡시드 단백질, CCMV 캡시드 단백질, CPMV 캡시드 단백질, RCNMV 캡시드 단백질, ASLV 캡시드 단백질, HCRSV 캡시드 단백질, HJCPV 캡시드 단백질, BMV 캡시드 단백질, SHIV 캡시드 단백질, MPV 캡시드 단백질, SV40 캡시드 단백질, HIV 캡시드 단백질, HBV 캡시드 단백질, 아데노바이러스 캡시드 단백질 및 rotavirus VP6 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 자기조립 단백질은 페리틴일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 자기조립 단백질인 페리틴은 페리틴 중쇄 단백질 또는 페리틴 경쇄 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 페리틴 중쇄 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로 인간 유래 페리틴 중쇄 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 페리틴은 서열번호 3 내지 13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 PD-1 및 자기조립 단백질은 링커로 연결될 수 있다.

구체적으로, PD-L1 및 PD-L2에 결합할 수 있는 상기 PD-1의 외부 도메인은, 링커와 함께 페리틴 중쇄 서브 유닛의 C-말단에 유전적으로 통합될 수 있다(도 2A). 페리틴 서브 유닛의 C-말단 E-나선 및 유연한 글리신(G)이 풍부한 링커의 구조적 유연성은 리간드의 결합능에 대한 충분한 접근성을 제공할 것으로 예상되었다.

상기 링커는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 나노케이지는 PD-1 및 자기조립 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성되어 표면에 PD-1이 고밀도로 부착될 수 있다.

상기 나노케이지는 PD-1 부착 페리틴 나노케이지, PD-1 부착 나노케이지, PdNC 등과 혼용될 수 있다.

본 발명의 나노케이지는 표면에 PD-1이 고밀도로 부착되어, PD-1이 부착되지 않은 페리틴 나노케이지 및 sPD-1 대비 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 암세포에 대한 결합능이 증가될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, PD-1이 부착되지 않은 페리틴 나노케이지(wtNC)는 트랜스페린 수용체(TfR)를 통해 CT26.CL25 세포에 대한 결합능을 나타내었으나(완충액 대조군의 1.29 배), PdNC는 wtNC에 비해 CT26.CL25 세포에 더 효율적으로 그리고 농도 의존적으로 결합하였다(완충액 대조군의 8.80 배) (도 3A). CT26.CL25 세포에 과발현된 PD-L1 및 PD-L2에 결합된 PdNC의 양이 상향 조절된 것으로 확인되어, 종양 세포에 대한 PdNC의 결합이 생체 내 종양 미세 환경 조건에 대해 훨씬 더 증가할 수 있음을 나타내었다.

형광 현미경 이미지에서도 PdNC로 처리한 CT26.CL25 세포가 wtNC보다 더 많은 형광을 나타내었다(도 3B).

종양 세포 표면의 PD-L 발현은 종종 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME) 내 IFN-γ에 의해 상향 조절되는 것으로 알려져 있다. 이와 일관되게, IFN-γ로 처리한 종양 세포의 표면에서 PD-L1 및 PD-L2의 발현 수준이 크게 증가하였다(도 4). 이와 유사한 맥락에서, PdNC의 결합은 IFN-γ 처리된 세포에서 유의하게 증가하였다.

본 발명의 다른 일 구현예에서, PdNCs와 sPD-1은 모두 농도 의존적으로 PD-L1과 PD-L2에 결합하였으나, PD-L1과 PD-L2에 결합된 sPD-1은 낮은 친화도를 가짐을 확인하였다(도 5A). PdNC는 나노몰 및 서브 나노몰 친화도로 PD-L1 및 PD-L2에 결합되었다. PdNC는 두 리간드에 대해 sPD-1보다 더 높은 결합 속도(k_a) 및 더 낮은 해리 속도(k_d)를 나타내었으며, PdNC의 평형 해리 상수(K_D)가 sPD-1에 비해 PD-L1의 경우 1057 배, PD-L2의 경우 647 배 감소함에 따라, PdNC 표면의 PD-1은 강화된 결합 효과로 리간드에 의해 쉽게 인식되었다.

이로부터, 본 발명의 PD-1이 부착된 페리틴 나노케이지는 PD-1이 부착되지 않은 페리틴 나노케이지 및 sPD-1 대비 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 암세포에 대한 결합능이 증가되었음을 알 수 있다.

본 발명의 나노케이지는 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 암세포에 결합하여 길항 활성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 나노케이지는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 또는 프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand) 중 선택되는 어느 하나 이상의 신호를 차단할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 뮤린 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포와 동족 TCR을 활성화하도록 설계된 단백질을 PdNC, sPD-1 또는 wtNC로 처리하였다. 이후, 지속적으로 PD-1, TCR 및 1 차 T 세포를 대체한 핵 인자 활성화 T 세포(nuclear factor activated T cell, NFAT)-유도성 루시퍼라제를 발현하는 Jurkat 세포주를 추가하고, 6 시간 동안 공동 배양한 결과, Jurkat T 세포에서 저용량 PdNC의 처리는 PD-1/PD-L1 결합을 통해 TCR 활성화와 NFAT 매개 루시퍼라제 발현을 성공적으로 증가시켰다(도 5B). wtNC 처리된 Jurkat T 세포에 대한 신호 변화는 없었으나(도 6), PdNC- 및 sPD-1 처리된 세포는 용량 의존적 TCR 활성화 신호를 나타내었다.

한편, 더 높은 sPD-1 용량의 처리로 관찰된 Jurkat T 세포에서 NFAT 매개 루시퍼라제 발현이 상당히 증가하였다. 특히, PdNC는 761.3pM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 나타내어 sPD-1(457.3nM)보다 624 배 높은 수치를 나타내었다.

이로부터, 본 발명의 PD-1이 부착된 페리틴 나노케이지는 향상된 친화도로 인하여 인식을 실질적으로 향상시켜, 항암 면역 요법을 위한 길항제 역할을 할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 나노케이지는 효과기 단계 및 인지 단계의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도할 수 있다(도 1).

상기 항종양 면역 활성화는 수지상 세포(Dendritic cell, DC) 매개 종양 특이적 T 세포 활성화일 수 있다. DC는 가장 강력한 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)이며 림프 기관에서 T 세포의 프라이밍(priming), 활성화 및 재활성화를 매개하여 종양 특이적 T 세포를 활성화시켜 암세포 사멸에 기여할 수 있다.

상기 효과기 단계에서의 항종양 면역 활성화는 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, PdNC 처리는 TME의 CD3+ CD45.2+ CD8+ T 세포에서 T 세포의 증식 및 활성화 기능에 대한 마커인 ki67 및 IFN-γ 발현을 증가시켰으며(도 8B), PdNCs 처리 그룹은 다른 그룹과 비교하여 CD8+ T 세포와 DC의 상당한 종양 침투증가를 유도하였다(도 8C-E). 특히, PdNC 처리된 마우스에서 종양 침투 CD8+ T 세포의 상당한 증가가 확인되었다(완충액 대조군의 4.64 배) (도 8D).

이로부터, 본 발명의 나노케이지에 의해 TME에서 T 세포 면역의 활성화를 유도함을 알 수 있다.

상기 인지 단계에서의 항종양 면역 활성화는 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN)에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 종양 내 주사된 PdNC는 주입 후 1 시간 뒤부터 빠르게 배출되어 TDLN에 축적되었다(도 7A). 주입 후 6 시간 및 18 시간 뒤, wtNC 처리된 마우스의 TDLN의 형광 강도는 그 크기로 인해 점차 증가했지만 PdNC 처리된 마우스의 TDLN의 형광 강도는 모든 시점에서 가장 높았다. 특히, 24 시간에 PdNC 처리된 마우스의 TDLN에서 다른 그룹보다 더 강한 형광 강도가 관찰되었다.

또한, PdNC 처리는 TDLN의 DC에서 공동 자극 분자(CD40 및 CD86)의 증가를 유도하여 DC 성숙을 향상시켰으며(도 7B), PdNC 처리는 CD8+ T 세포에서 항원 경험 T 세포에 대한 마커인 CD44+를 증가시켰다(도 7C).

뿐만 아니라, PdNC 처리는 IFN-γ 분비를 상당히 증가시켰다(도 7D-E).

이로부터, 본 발명의 나노케이지가 TDLN에 효율적으로 도달하고 축적되며, PD-1/PD-Ls 상호 작용을 효율적으로 차단하여 DC 성숙 및 T 세포 활성화를 향상시키고, TDLN에서 활성화된 DC 매개 항종양 T 세포 면역 반응을 강화함을 알 수 있다.

본 발명의 나노케이지는 종양 성장 억제 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, PdNC 처리 그룹은 다른 그룹에 비해 종양 성장을 극적으로 감소시켰다(도 8A 및 도 9). PdNC는 종양 부피를 75 % 억제한 반면, 24 배 더 높은 몰투여량으로 투여된 sPD-1은 종양 부피의 유의한 감소가 나타나지 않았다. 또한, PdNC 처리 그룹은 단 한 번의 주사만으로도 약 33 %(9 마리 중 3 마리)에서 완전한 종양 퇴행을 나타내었다.

이로부터, 본 발명의 나노케이지가 종양 성장 억제 활성이 있음을 알 수 있다.

본 발명의 나노케이지는 면역학적 기억을 형성할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, PdNC 처리된 종양이 없는 마우스에 상기 CT26.CL25 마우스 모델에 CT26.CL25 종양 접종 후 21 일째의 동종 종양 세포를 주입하였을 때 종양 성장이 나타나지 않음을 확인하였다(도 8F).

이로부터, 본 발명의 나노케이지에 의해 면역학적 기억이 형성되었음을 확인하였다.

본 발명의 나노케이지는 생체 내 독성을 나타내지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, PdNC로 처리한 마우스를 포함하여 모든 그룹의 마우스에서 체중 감소가 없었으며, 그룹 간에 큰 차이가 없었다(도 10). 또한 PdNC 처리된 마우스의 간, 폐 및 신장을 포함한 주요 기관의 H&E 염색 이미지는 대조군과 비교하여 차이가 없었다(도 11).

이로부터, 본 발명의 나노케이지에 의한 유의한 독성이 없음을 알 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 PD-1 부착 나노케이지(PdNC)를 제작하고, 상기 나노케이지가 PD-1 및 PD-L 신호를 차단하고 TME(효과기 단계) 및 TDLN(인지 단계)의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도함으로써, PD-1 및 PD-L 차단 기반 요법의 적응성을 증대시킬 수 있음을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

본 발명의 융합단백질은 이의 정제를 용이하게 하기 위해 N-말단 또는 C-말단에 정제용 태그 펩타이드가 추가로 포함될 수 있다. 상기 태그 펩타이드는 일예로, HisX6 펩타이드, GST 펩타이드, FLAG 펩타이드, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, V5 에피토프 펩타이드, Myc 펩타이드 및 HA 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1) 및 자기조립 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 암의 "예방(prevention)" 및/또는 "치료(treatment)"의 용도를 갖는 것일 수 있다.

예방적 용도에 있어, 본 발명의 조성물은 본 발명에 기술된 질환, 장애, 또는 상태를 가지고 있거나 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 개체에 투여될 수 있다. 치료적 용도에 있어, 본 발명의 조성물은 본 발명에 기술된 장애를 이미 앓고 있는 환자와 같은 개체에 본 발명에 기술된 질병, 장애, 또는 상태의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여될 수 있다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 상태의 심각도 및 경과, 이전의 치료, 개체의 건강 상태와 약물에 대한 반응성, 및 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달려있을 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 당업계에 알려진 암이라면 제한 없이 포함할 수 있고, 예를 들면 폐암(예, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암(예, 췌관암, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위암(예, 유두 선암, 점액성 선암, 선편평상피암종), 십이지장암, 소장암, 대장암(예, 결장암, 직장암, 항문암, 가족성 대장암, 유전성 비용종증 대장암, 소화관 간질 종양), 유방암(예, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암), 난소암(예, 상피성 난소암종, 고환외 배세포 종양, 난소성 배세포 종양, 난소 저악성도 종양), 고환 종양, 전립선암(예, 호르몬-의존성 전립선암, 호르몬-비의존성 전립선암), 간암(예, 간세포암, 원발성간암, 간외 담관암), 갑상선암(예, 갑상선 수질암종), 신장암(예, 신세포암종, 신우와 요관의 이행 상피암종), 자궁암(예, 자궁경부암, 자궁체암, 자궁 육종), 뇌종양(예, 수모세포종, 신경교종, 송과체 성세포종양, 모양세포성 성세포종, 미만성 성세포종, 퇴형성성 성세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암(예, 기저세포암, 악성 흑색종), 육종(예, 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수 증식 질환), 원발 미상 암 등일 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로써 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분인 본 발명의 나노케이지의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 내지 90 중량%로, 구체적으로는 1 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 내용액제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구용 제제에는 희석제, 결합제, 팽윤제, 활택제 등의 약제학적 첨가제가 더 포함될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 활택제들도 사용된다.

상기 희석제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 유당, 덱스트린, 마니톨, 소르비톨, 전분, 미결정셀룰로오스, 인산수소칼슘, 무수인산수소칼슘, 탄산칼슘, 당류 등을 포함할 수 있다.

상기 결합제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 코포비돈, 젤라틴, 전분, 슈크로즈, 메칠셀룰로오스, 에칠셀룰로오스, 히드록시에칠셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필알킬셀룰로오스 등을 포함할 수 있다.

상기 팽윤제는 가교된 폴리비닐피롤리돈, 가교된 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 가교된 칼슘 카르복시메칠셀룰로오스, 가교된 카르복시메칠셀룰로오스, 나트륨 녹말 글리콜레이트, 카트복시메틸 녹말, 나트륨 카르복시메틸 녹말, 칼륨 메타크릴레이트-디 비닐벤젠 공중합체, 아밀로오스, 가교된 아밀로오스, 녹말 유도체, 미결정셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 시클로덱스트린 및 덱스트린 유도체로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

상기 활택제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 스테아린산, 스테아린산염, 탈크, 옥수수전분, 카나우바왁스, 경질무수규산, 규산마그네슘, 합성규산알루미늄, 경화유, 백납, 산화티탄, 미결정셀룰로오스, 마크로골 4000 및 6000, 미리스틴산이소프로필, 인산수소칼슘, 활석 등을 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 내용액제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 주사제로는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 500mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 200mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 구체적으로는 경구 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 반려동물을 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물은 항암제와 병용 투여할 수 있다.

또는, 본 발명에 있어서, 상기 나노케이지는 내부에 항암제가 담지된 것일 수 있다. 구체적으로, 나노케이지로의 항암제의 담지는 약물이 용해된 세포 배양 배지 내에서 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1) 및 자기조립 단백질을 포함하는 융합단백질을 포함하는 재조합 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 배양함으로써 달성될 수 있고, 이로부터 생산되어 분리된 나노케이지를 항암제가 용해된 용매에 넣고 교반함으로써 생성할 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 2가 금속이온(예컨대, Cu²⁺, Fe²⁺, 및 Zn²⁺)과 항암제의 복합체를 형성시킨 후 제조된 페리틴 중쇄 나노케이지의 내부 공극에 상기 2가 금속이온-항암제 복합체가 스며들도록 완충액 상에서 반응시킴으로써 항암제를 적재하는 방법, pH 차이에 의한 페리틴 중쇄 나노케이지의 해체-재조립(disassemble-reassemble) 과정을 통하여 내부 공극에 항암제를 적재하는 방법, 이온 농도차에 의한 공극 열림 현상에 의하여 페리틴 중쇄 나노케이지에 항암제를 적재하는 방법 등이 있으며, 당업계에 알려진 단백질 나노케이지 내 화합물 담지 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 예를 들면, 탁산계 항암제, 스타틴, 알킬화 약물(Alkylating agents), 백금 제제(Platinum-based drug), 항대사산물(Antimetabolites), 항생제(Antibiotics), 빈카 알칼로이드계(Vinca alkaloids) 항암제, 표적 치료제, 면역 항암제, 암 백신(Cancer Vaccine), 세포 치료제(Cell therapy), 종양 용해성 바이러스(Oncolytic virus) 및 이들의 조합 등일 수 있고, 상기 항암 요법은 방사선요법(Radiotherapy), 광역학 요법(Photodynamic therapy) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 항암제를 모두 포함할 수 있다.

상기 탁산계 항암제의 예로는 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 라로탁셀(Larotaxel) 및 카바지탁셀(Cabazitaxel) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 스타틴은 이로 제한되는 것은 아니나, 지용성 스타틴일 수 있다. 상기 지용성 스타틴의 예로는 심바스타틴(simvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin) 및 피타바스타틴(pitavastatin) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 알킬화 약물의 예로는 니트로겐 머스타드(Nitrogen mustard)계 약물, 에틸렌이민(Ethylenimine) 및 메틸메라민(Methylmelamine)계 약물, 메틸히드라진(Methylhydrazine) 유도체, 알킬 설포네이트(Alkyl Sulfonate)계 약물, 니트로소우레아(Nitrosourea)계 약물 및 트리아진(Triazine)계 약물 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 백금 제제의 예로는 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인

상기 항대사산물은 엽산 길항제(Folate antagonist)계 약물, 퓨린 길항제(Purine antagonist)계 약물 및 피리미딘 길항제(Pyrimidine antagonist)계 약물 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 항생제의 예로는 에토포시드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 이다루비신(Idarubicin), 에피루비신(Epirubicin), 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin, Adriamycin), 다우노루비신(Daunorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 미토마이신-C(Mitomycin C) 및 미토잔트론(Mitoxantrone) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 빈카 알칼로이드계 항암제의 예로는 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine) 및 비노렐빈(Vinorelbine) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 표적 치료제의 예로는 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 표적 치료제, HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2) 표적 치료제, CD20(B cell marker) 표적 치료제, CD33(Myeloid Cell Surface Antigen) 표적 치료제, CD52(cluster of differentiation 52) 표적 치료제, CD30(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 8) 표적 치료제, bcr-abl(breakpoint cluster region protein-Tyrosine-protein kinase)/c-Kit(tyrosine kinase receptor) 표적 치료제, ALK(anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase) 표적 치료제, 항-혈관신생(Antiangiogenics) 표적 치료제, mTOR(Mammalian target of rapamycin) 표적 치료제, CDK4/6(Cyclin-dependent kinase 4/6) 표적 치료제, PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase) 표적 치료제, 프로테아좀(Proteasome) 저해제, 티로신 키나제(tyrosine kinase) 길항제, 프로테인 키나제 C(protein kinase C) 억제제 및 파네실 트랜스퍼라제(Farnesyl transferase) 억제제 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 면역 항암제의 예로는 항-프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1), 항-프로그램된 세포 사멸 단백질 1(Programmed cell death protein 1, PD-1) 상호작용 억제제, 항-프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L) 상호작용 억제제, CTLA4(Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4, CD152)/B7-1/B7-2 상호작용억제제 및 CD47(Cluster of Differentiation 47)/SIRP(Signal-regulatory protein) 상호작용억제제 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물의 투여는 항암 요법과 병용될 수 있다. 상기 항암 요법은 예를 들면, 방사선요법(Radiotherapy), 광역학 요법(Photodynamic therapy) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 항암 요법을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 융합단백질이 자기조립되어 형성되는 단백질 나노케이지를 제공한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 나노케이지를 포함하는, 약물 전달체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 나노케이지를 포함하는, 약물 전달 시스템을 제공한다.

본 발명에서 용어, "약물 전달체"는 스스로는 약리활성을 가지지 않거나 혹은 약리활성을 가지더라도 별도의 약리성분을 탑재하여 병변 부위 또는 목적 세포까지 이동함으로써 탑재된 약리성분의 약리활성을 더욱 증진시키기 위한 여하한 형태의 담체를 의미한다.

본 발명에서 용어, "약물 전달 시스템"은 약물 전달체가 pH, 환원, 저산소증, 반응성 산소종과 같은 자극에 반응하여 물리화학적 변화를 나타내도록 디자인한 것을 의미한다.

상기 양태에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 부착 나노케이지(PdNC)는 PD-1 및 프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L) 신호를 차단하고 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME) (효과기 단계) 및 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN) (인지 단계)의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도함으로써, PD-1 및 PD-L 차단 기반 요법의 적응성을 증대시키는 바, 다양한 종류의 암 치료에 적용할 수 있다.

도 1은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1)/프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L) 신호를 차단하고 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME) (효과기 단계) 및 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN) (인지 단계)의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도하는 PdNC의 개략도이다. 첫째, PdNC는 TME 내에서 종양 특이적 T 세포를 재활성화 할 수 있으며, 이는 종양 세포의 죽음과 종양 항원의 방출을 촉진할 수 있다. 둘째, PdNC는 종양 항원 특이적 DC와 함께 림프 모세혈관 및 TDLN으로 효율적으로 배출될 수 있으며, 이는 T 세포상의 PD-1과 DC상의 PDL 사이의 간섭을 통해 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다. 그 후, (재)활성화 된 종양 특이적 T 세포가 TME로 이동하여 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
도 2는 E. coli 발현 시스템에 의해 자체 조립된 나노 스케일 케이지형 구조로 생합성된 PdNC의모식도이다. (A) hFTN의 3D 단백질 구조(파란색, PDB 3AJO) 및 뮤린 PD-1의 엑토 도메인(마젠타, PDB 1NPU)를 기반으로 한 E. coli에서의 PdNC 벡터 맵(왼쪽) 및 합성 절차(오른쪽)를 보여주는 개략도이다. 유연한 링커 펩티드(빨간색, L로 표시)를 hFTN과 PD-1 사이에 삽입하였다. 발현된 PdNC 단량체는 24 개의 PD-1이 부착된 나노케이지로 자가 조립되었다. (B) 빈 벡터(Ctrl) 또는 표시된 PdNC(왼쪽) 및 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 PdNC(오른쪽)을 코딩하는 플라스미드로 형질 전환된 E. coli BL21(DE3) 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석 결과. PdNC의 생산을 확인하였다. M, 단백질 분자 마커; Sol., 세포 용해물의 가용성 분획; 및 Insol., 세포 용해물의 불용성 분획. 또한, 38.7 kDa는 이론적으로 계산된 PdNC의 분자이다. (C) TEM 이미지 및 정제된 PdNC의 (D) DLS 분석은 나노 크기의 구형 케이지와 같은 구조를 나타내었다. wtNC는 야생형 페리틴 나노케이지를 나타내었다.
도 3은 PdNC의 PD1/PDL 축에서 종양과의 결합을 나타낸 도이다. (A 및 B) CT26.CL25 세포(IFN-γ 전처리 또는 무처리)를 각 NC에 대해 표시된 농도로 인큐베이션하고 항-페리틴 항체 및 Alexa 488(녹색) 항체로 염색하였다. NC와 종양 세포의 결합은 유세포 분석 또는 IF 현미경을 통해 분석하였다. (A) 농도에 따른 NC 결합 친화도를 나타내는 대표적인 히스토그램 이미지(위). 결합 친화도는 대조군(아래) (n = 4)에 대한 상대 MFI로 표시하였다. (B) 종양 세포 및 40 nM NC(녹색) 결합의 대표적인 이미지. 핵은 Hoechst(파란색) (n = 3)로 대조 염색하였다(스케일 막대 = 50μm). P 값은 일원 분산 분석(ANOVA) 및 Tukey의 사후 테스트를 수행하여 분석되었다(*** p <0.001).
도 4는 IFN-γ의 CT26.CL25 종양 세포에서의 PD-L1 또는 PD-L2 발현 상향 조절을 나타낸 도이다. 표시된 양의 IFN-γ로 처리한 후 CT26.CL25 세포(왼쪽) 및 히스토그램(오른쪽)에서 PD-L1 또는 PD-L2의 상대적 MFI 수준을 나타내었다. 일원 분산 분석 및 Tukey의 사후 테스트가 수행되었다(*** p <0.001) (n = 3).
도 5는 PdNC의 PD-L에 대해 고도로 강화된 결합 동역학으로 개선된 길항 활성을 나타낸 도이다. (A) 덱스트란 칩에서 고정화된 PD-L1 및 PD-L2에 대한 PdNC 또는 sPD-1의 친화도 및 동역학에 대한 SPR 분석의 대표적인 센서 그램 및 요약. PdNC(2.5-500 nM) 또는 sPD-1(1-50 μM)에 2 점 연속 희석액을 주입하고 센서 그램을 1 : 1 결합 모델에 맞춰 결합 역학을 도출하였다. KD = kd/ ka. (B) 생물 발광 PD-1/PD-L1 차단 리포터 생물 검정을 사용하여 분석한 PdNC 또는 sPD-1의 길항 활성. 데이터는 PdNC 또는 sPD-1로 처리된 Jurkat T 세포에서 PD-1/PD-L1 차단 및 TCR 활성화를 통한 NFAT 매개 루시퍼라제 발현으로부터의 완충액 제어에 대한 RLU의 평균으로 나타내었다(n = 3). P 값은 일원 분산 분석 및 Tukey의 사후 테스트를 수행하여 분석되었다(* p <0.05, ** p <0.01).
도 6은 생체 발광 PD-1/PD-L1 차단 리포터 바이오 어세이 분석 결과이다. wtNC는 길항 활성을 나타내지 않았다. 데이터는 wtNC로 처리된 Jurkat T 세포에서 PD-1/PD-L1 차단 및 TCR 활성화를 통한 NFAT 매개 루시퍼라제 발현의 대조군에 대한 상대 생물 발광(RLU)의 수단으로 나타내었다 (n = 3).
도 7은 PdNC의 TDLN 효율적 표적화 및 항종양 면역 반응 향상을 나타낸 도이다. (A) Cy5.5-표지 된 PdNC, wtNC, sPD-1 또는 유리 Cy5.5의 종양 내 주입 후 지정된 시간(1 시간, 6 시간, 18 시간 또는 24 시간)에서 TDLN의 생체 외 이미지(아래) 및 TDLN/종양 신호 비율의 정량화(위)(n = 4-5). (B-E) PdNC, wtNC, sPD-1 또는 완충액(대조군) 주입 후 3 일에 마우스에서 TDLN을 절제하여 분석하였다. (B) CD11c+ DC에서 CD40 및 CD86의 발현은 유세포 분석에 의해 평가되었다. 데이터는 대조군에 대한 상대 MFI의 수단으로 표시되었다(n = 4-5). (C) CD8+ T 세포의 CD44 발현은 유세포 분석에 의해 분석되었으며 대조군에 대한 상대 MFI로 표시하였다(n = 4-5). (D) TDLN의 단일 세포를 gp70 또는 β-gal 펩티드와 24 시간 동안 공동 배양하고 방출된 IFN-γ를 ELISA로 결정하였다(n = 3-4). (E) DC의 교차 프라이밍 능력은 TDLN 및 CD8+ 비장 세포에서 CD11c+ 세포를 공동 배양하여 IFN-γ ELISA를 통해 확인하였다(n = 4-5). P 값은 일원 분산 분석 및 Tukey의 사후 테스트 또는 스튜던트 t-검정을 수행하여 분석되었다(* p <0.05, ** p <0.01).
도 8은 PdNC의 종양에 대한 CD8+ T 세포 활성화 매개 면역에 의한 종양 성장 억제를 나타낸 도이다. (A) 완충액, sPD-1, wtNC 또는 PdNC로 1회 처리된 BALB/c 마우스를 보유한 CT26.CL25에 대한 종양 부피의 시간 경과 변화(n = 6-10). (B) 종양 조직으로부터 CD8+ 세포의 활성화는 PdNC, wtNC, sPD-1 또는 완충액(대조군) 주입 후 3 일에 평가하였다. TME의 CD3+ CD45.2+ CD8+ T 세포는 anti-ki67 또는 IFNγ 항체로 표지되었다. ki67+ 또는 IFNγ+ 양성 집단의 백분율은 유세포 분석을 수행하여 분석하였다(n = 3-4). (C) PdNC, wtNC, sPD-1 또는 완충액(대조군) 주입 후 15 일째에 CT26.CL25 베어링 마우스의 종양 조직에서 확인한 대표적인 CD8+ T 세포 침윤 이미지. (D) 종양 섹션에서 CD8+ T 세포 침윤의 정량화; 이들은 (C)를 포함하여 형광 이미지에서 분석되었으며, CD8+ 세포/mm²의 수는 Image J 소프트웨어를 사용하여 계산하였다(n = 3-5, 각 이미지에 대해 여러 개의 다른 필드). (E) 종양 조직으로부터의 DC 침윤은 PdNC, wtNC, sPD-1 또는 완충액(대조군) 주입 후 3 일에 평가하였다. TME에서 CD45.2+ CD11c+ 세포의 백분율은 유세포 분석으로 검출되었다(n = 4-5). (F) (A)의 종양이 없는 마우스에서 원발성 종양의 반대 부위(n = 3)에 4 주 후 1 Х 10⁶ 개의 종양 세포를 다시 주입하였다. 일원 분산 분석 및 Tukey의 사후 테스트가 수행되었다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).
도 9는 도 8A의 실험 종료 후 절제된 종양의 무게. 일원 분산 분석 및 Tukey의 사후 테스트가 수행되었다(*** p <0.001) (n = 6-10).
도 10은 완충액, sPD-1, wtNC 또는 PdNC로 처리된 CT26.CL25 종양 마우스 모델의 체중 변화(n = 6-10).
도 11은 표시된 기관에서 완충액(PBS), sPD1, wtNC 및 PdNC의 잠재적 독성을 측정하기 위한 H&E 염색 결과이다(n = 2-5, 각 이미지에 대해 여러 개의 다른 필드).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1) 부착 나노케이지(nanocages, NC) (PdNC)의 제조 및 이의 물리 화학적 특성

프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand 1, PD-L1) 및 PD-L2에 결합할 수 있는 PD-1의 외부(ecto) 도메인이 부착될 수 있도록 표면 공학에 의해 설계된 페리틴(ferritin) 나노케이지를 제작하였다.

구체적으로, 야생형 인간 페리틴 중쇄(hFTN) 나노케이지(nanocages) (wtNC) 및 뮤린(murine) PD-1의 외부 도메인 중 가용성(soluble) PD-1(sPD-1)의 단량체(서열번호 1)를 cDNA 클론(Sino Biological Inc)의 PCR을 이용하여 합성하였다.

한편, 프라이머로 PCR 증폭의 연장(extension)을 수행하여 인간 페리틴 중쇄(hFTN)와 뮤린 PD-1의 외부 도메인을 연결할 아미노 서열로 이루어진 유연한 링커(GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE, 서열번호 14)를 제조하였다. 니켈 친화도 크로마토그래피 및 입체 구조 간섭법을 통해 정제하기 위해 뮤린 PD-1의 외부 도메인에 히스티딘 태그를 부착하고, 이를 상기 제조한 링커와 함께 인간 페리틴 중쇄 서브 유닛의 C-말단에 유전적으로 통합시켰다(도 2A). 페리틴 서브 유닛의 C-말단 E-나선 및 유연한 글리신(G)이 풍부한 링커의 구조적 유연성은 리간드의 결합능에 대한 충분한 접근성을 제공할 것으로 예상되었다.

상기 합성한 wtNC, sPD-1 및 인간 페리틴 중쇄와 뮤린 PD-1의 세포막 외부 도메인 사이에 링커를 포함하는 PdNC의 각 DNA 단편을 pT7 벡터와 연결하여 플라스미드(pT7-wtNC, pT7-sPD-1 및 pT7-PdNC)를 생성하였다. 플라스미드 구축 후 발현 벡터를 대장균(Escherichia coli, E. coli) BL21(DE3) 균주로 형질 전환하고, 형질 전환된 세포를 암피실린(ampicillin) 내성 배지와 함께 배양하여 선별하였다. 이들 세포는 LB 배지(Amp+) OD600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 1mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 를 첨가한 후, 단백질 발현을 유도하고 20℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수득한 후 이를 재현탁하고 초음파로 균질화하였다. 니켈 친화도 크로마토그래피를 사용하여 가용성 단백질을 정제하고 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다. 리포 다당류(lipopolysaccharides)를 제거하기 위해 제조업체 (Thermo Scientific)에서 제공한 프로토콜에 따라 내 독소 제거 절차를 수행하였다.

E. coli에 의해 발현되는 pT7-PdNC로부터 생산된 재조합 단백질은 케이지형 구조로 자가 조립되었으며, 이에 따라 페리틴 표면에 24 개의 PD-1이 부착된 나노케이지(PdNC)가 제조되었다. SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과, PdNC는 E. coli 발현 시스템을 사용하여 가용성 단백질에서 성공적으로 생합성되었으며, 발현 및 정제된 재조합 PdNC는 38.7 kDa에서 단일 밴드로 나타났다(도 2B).

다음으로, 정제된 PdNC 및 wtNC의 크기를 동적 광산란(Dynamic light scattering, DLS) 분석하기 위해, Zetasizer nano Zs(Malvern Instrument)로 분석하고, 정제된 각 샘플 1μg을 여과된 PBS 1ml에 희석하고 다음의 파라미터 조건(온도: 25℃, 고정각: 173°, 굴절률 1.450)에서 분석하였다.

또한, PdNC의 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 Tecnai F20 Cryo TEM (FEI Company)을 사용하여 분석하였으며, 여기서 0.1 mg/ml의 PdNC를 탄소 필름이 있는 구리 그리드(grid) 위에 놓고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액으로 음성 염색하였다.

그 결과, 야생형 페리틴 나노케이지(wtNC)의 구형 형태와 유사하게 PdNC는 직경이 약 20nm 인 구형 입자를 나타내었고, PdNC의 평균 직경은 wtNC의 평균 직경보다 큰 21.95nm로 측정되었다(도 2D). PdNC의 TEM 이미지는 도 2C와 같았다.

상기 결과로부터, 나노케이지 표면에 PD-1 분자를 고밀도로 부착한 PdNC를 성공적으로 제조하였음을 알 수 있다.

실시예 2.PD-L1 및 PD-L2 상향 조절된 종양 세포에 대한 PdNC 결합 여부 확인

PdNC의 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 종양 세포에 대한 결합능을 조사하기 위해, 유세포 분석과 형광 현미경 분석을 수행하였다.

구체적으로, β-갈락토시다제(β-galactosidase, β-gal)와 클래스 I 분자 H-2 Ld를 모두 안정적으로 발현하는 CT26.CL25 결장 종양 세포(ATCC)는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% AA(antibiotic-antimycotic) (Gibco)를 포함하는 배지(RPMI-1640, Welgene)에서 5% CO₂ 및 37℃로 배양하였다. 본 실시예에서 사용된 세포에서는 마이코플라스마 오염이 검출되지 않았다.

세포막에서 PD-L1 및 PD-L2의 양을 확인하기 위해 2 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 100 pi 디쉬에 파종하고 60 또는 300 ng 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)로 처리하였다. 다음날, 5 x 10⁵ 개의 세포를 4℃에서 15 분 동안 3 % BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 PBS(phosphate-buffered saline)로 사전 차단하고 4℃에서 30 분 동안 PD-L1 또는 PD-L2 항체(R & D Science)로 처리하였다. 샘플을 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 세척한 후 Alexa Fluor 488-접합된 항-염소 IgG 2 차 항체(Jackson ImmunoResearch)로 4℃에서 20 분 동안 염색하였다. 세포 표면의 PD-L1 또는 PD-L2 발현을 유세포 분석(flow cytometry, n = 3)을 사용하여 측정하였다.

또한, PdNC의 세포 결합능을 확인하기 위해 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포(IFN-γ 전처리 또는 무처리)를 4℃에서 1 시간 동안 3 % BSA/PBS로 사전 차단하였다. 그런 다음 10nM, 20nM 또는 40nM의 PdNC, 40nM의 wtNC 또는 PBS와 함께 37℃에서 10 분 동안 배양하였다. 이후, 세포를 4℃에서 20 분 동안 항-페리틴 중쇄 1 차 항체(Abcam) 및 Alexa Fluor 488-결합 항-염소 IgG 2 차 항체(Jackson ImmunoResearch)로 세척하고 표지하였다. 그런 다음 각 세포에 대한 NC의 결합능을 유세포 분석을 통해 검출하였다(n = 4). NC의 세포 결합능에 대한 형광 현미경 분석을 위해, 3 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 35 pi 공초점 디쉬에 시딩(seeding)하였다. 다음날 PBS로 세척한 후 실온에서 5 분 동안 4% PFA(paraformaldehyde)로 세포를 고정시켰다. 그 후, 세포를 실온에서 15 분 동안 3% BSA/PBS로 사전 차단하고 4℃에서 20 분 동안 40 nM의 PdNC, wtNC 또는 완충액과 함께 배양하였다. 그런 다음 세포를 4℃에서 20 분 동안 항-페리틴 중쇄 1 차 항체 및 Alexa Fluor 488-접합된 항-염소 IgG 2 차 항체로 표지하였다. 마지막으로, 핵은 실온에서 10 분 동안 1% BSA로 희석된 hoechest(H3570)로 염색하였다(n = 3).

그 결과, 도 3A와 같이 wtNC는 트랜스페린 수용체(TfR)를 통해 다양한 암 세포에 결합할 수 있는 바, CT26.CL25 세포에 대한 결합 패턴을 나타내었다(완충액 대조군의 1.29 배). 그러나 PdNC는 wtNC에 비해 CT26.CL25 세포에 더 효율적으로 그리고 농도 의존적으로 결합하였다(완충액 대조군의 8.80 배). 또한, CT26.CL25 세포에 과발현된 PD-L1 및 PD-L2에 대한 PdNC의 양이 상향 조절한 것으로 확인되어, 종양 세포에 대한 PdNC의 결합이 생체 내 종양 미세 환경 조건에 대해 훨씬 더 증가할 수 있음을 나타내었다.

형광 현미경 이미지에서도 PdNC로 처리한 CT26.CL25 세포가 wtNC보다 더 많은 형광을 나타내었다(도 3B).

종양 세포 표면의 PD-L 발현은 종종 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME) 내 IFN-γ에 의해 상향 조절되는 것으로 알려져 있다. 이와 일관되게, IFN-γ로 처리한 종양 세포의 표면에서 PD-L1 및 PD-L2의 발현 수준이 크게 증가하였다(도 4). 이와 유사한 맥락에서, PdNC의 결합은 IFN-γ 처리된 세포에서 유의하게 증가하였다.

실시예 3. PD-L1 및 PD-L2에 대한 PdNC의 친화도 및 길항(antagonistic) 활성 확인

PD-L1 및 PD-L2에 대한 PdNC의 결합 친화도와 동역학을 조사하기 위해 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR) 분석을 수행하고 그 결과를 가용성 PD-1(sPD-1)의 단량체 형태와 비교하였다.

구체적으로, 뮤린(murine) PD-L1(50010-M08H, Sino biological) 또는 PD-L2(50804-M08H, Sino biological)에 대한 PdNC 또는 sPD-1의 결합 친화도 및 동역학은 SPR 기기(SR7500 DC, Buffalo, Reichert Inc.)로 분석하였다. 분석 전에 SR7000 금 센서 슬라이드(Reichert Inc.)를 러닝 완충액으로 안정화시켰다. 이후, 아세트산 나트륨 완충액(pH = 5)에서 뮤린 PD-L1 또는 PD-L2를 덱스트란 칩의 표면에 고정시켰다. 분석 물질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 칩에 BSA(15 nM)를 코팅하였다. PdNC 및 sPD-1은 실행 완충액과 동일한 Tris 완충액(20mM, pH = 7.4)에 현탁되었다. PdNC(2.5 nM-500 nM) 또는 sPD-1(1 μM -50 μM)은 분석 전에 2 점 연속 희석되었다. 각 샘플을 연속적인 속도(50μl/분)로 흐르게 하였다. 샘플과 리간드의 결합은 실시간으로 분석되었으며, 적정 센서그램은 Scrubber 2.0(BioLogic Software) 및 KaleidaGraph(Synergy Software)를 이용하여 Langmuir(A+ B ⇔ AB)의 1 : 1 결합 모델을 사용하여 분석되었다.

그 결과, 도 5A와 같이, PdNCs와 sPD-1은 모두 농도 의존적으로 PD-L1과 PD-L2에 결합하였으나, PD-L1과 PD-L2에 결합된 sPD-1은 낮은 친화도를 가짐을 확인하였다. PdNC는 나노몰 및 서브 나노몰 친화도로 PD-L1 및 PD-L2에 결합되었다. PdNC는 두 리간드에 대해 sPD-1보다 더 높은 결합 속도(k_a) 및 더 낮은 해리 속도(k_d)를 나타내었으며, PdNC의 평형 해리 상수(K_D)가 sPD-1에 비해 PD-L1의 경우 1057 배, PD-L2의 경우 647 배 감소함에 따라, PdNC 표면의 PD-1은 강화된 결합 효과로 리간드에 의해 쉽게 인식되었다.

상기 결과로부터, PdNC가 향상된 길항 효율성을 제공할 수 있음을 알 수 있다.

다음으로, 생물 발광 PD-1/PD-L1 차단 생물 검정을 사용하여 PdNC의 시험관 내 길항 활성을 입증하였다.

구체적으로, 뮤린 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포와 동족 TCR을 활성화하도록 설계된 단백질을 PdNC, sPD-1 또는 wtNC로 처리하였다. 이후, 지속적으로 PD-1, TCR 및 1 차 T 세포를 대체한 핵 인자 활성화 T 세포(nuclear factor activated T cell, NFAT)-유도성 루시퍼라제를 발현하는 Jurkat 세포주를 추가하고, 6 시간 동안 공동 배양하였다. 다중 검출 마이크로 플레이트 리더(Spectramax i3x, R & D 메이트)를 사용하여 상대 생물 발광(Relative bioluminescence, RLU)을 검출하였다. 최대 유효 농도의 절반(EC50)은 실험 데이터(n = 3)의 Hill 방정식을 사용하여 계산하였다.

그 결과, Jurkat T 세포에서 저용량 PdNC의 처리는 PD-1/PD-L1 축의 간섭을 통해 TCR 활성화와 NFAT 매개 루시퍼라제 발현을 성공적으로 증가시켰다(도 5B). wtNC 처리된 Jurkat T 세포에 대한 신호 변화는 없었으나(도 6), PdNC- 및 sPD-1 처리된 세포는 용량 의존적 TCR 활성화 신호를 나타내었다.

한편, 더 높은 sPD-1 용량의 처리로 관찰된 Jurkat T 세포에서 NFAT 매개 루시퍼라제 발현이 상당히 증가하였다. 특히, PdNC는 761.3pM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 나타내어 sPD-1(457.3nM)보다 624 배 높은 수치를 나타내어, 앞서 확인한 결합 친화도 분석 결과와 일치하였다.

상기 결과로부터, PdNC는 향상된 친화도로 인하여 인식을 실질적으로 향상시켜, 항암 면역 요법을 위한 길항제 역할을 할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4. 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN)에서 PdNC의 DC 매개 T 세포 활성화 축적 및 유도 확인

수지상 세포(Dendritic cells, DC) 매개 T 세포 프라이밍과 림프절(lymph node, LN)에서의 활성화는 효율적인 항종양 면역을 달성하는 데 중요한 것으로 알려져 있으며(Siddiqui, K., et al., Immunity, 50 (2019) 195-211.e110), 특히, LN의 생체 내 영상화를 통해 항원 제시 DC는 시간당 500-5000 개의 T 세포와 상호 작용하며, DC와 동족 T 세포 간의 상호 작용은 면역 후 약 하루 동안 지속되는 것으로 확인된 바(R. Obst, Front. Immunol., 6 (2015), p. 563), 1 시간, 6 시간, 18 시간 및 24 시간에서의 TDLN에 대한 PdNC의 전달 효율을 조사하였다.

구체적으로, sPD-1 48μM, wtNC 2μM 또는 PdNC 2μM를 Cyanine5.5(Cy5.5) NHS 에스테르(Bioacts) 48μM와 혼합한 다음 4℃에서 밤새 배양하여, Cy5.5 NHS 에스테르로 표지된 PdNC, sPD-1 및 wtNC를 제작하였다. NC와 접합되지 않은 유리 cy5.5는 Ultra Centrifugal Filter(Milipore)를 이용하여 분리하였다. 마우스에 주입하기 전, Cy5.5-접합된 샘플을 마이크로 플레이트 리더(GloMax Discover, Promega)로 분석하여 샘플 간의 형광 강도를 일치시켰다.

한편, 8 주령 BALB/c 흰색 및 BALB/c 누드 마우스(OrientBio)를 병원균이 없는 조건에서 사육하였다. 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 옆구리에 접종하였다. BALB/c 누드 마우스에 CT26.CL25 종양 세포를 이식하고 종양 크기가 약 200mm³에 도달했을 때 Cy5.5 NHS 에스테르로 표지된 PdNC, sPD-1, wtNC 또는 유리 염료(Cy5.5)를 종양 내로 주입하였다. 주입 후 1 시간, 6 시간, 18 시간 또는 24 시간에 종양에 대한 LN의 상대적 형광 신호 강도를 확인하기 위해 LN 및 종양 조직을 지정된 시점에서 절제하였다. 절제된 TDLN과 종양 조직을 IVIS 스펙트럼(IVIS® Lumina Series III, Caliper Life Sciences)으로 시각화하였다. 상대 형광 강도는 종양 조직대비TDLN의 상대 강도로 계산하였다(n = 4-5).

그 결과, 종양 내 주사된 PdNC는 주입 후 1 시간 뒤부터 빠르게 배출되어 TDLN에 축적되었다(도 7A). 주입 후 6 시간 및 18 시간 뒤, wtNC 처리된 마우스의 TDLN의 형광 강도는 그 크기로 인해 점차 증가했지만 PdNC 처리된 마우스의 TDLN의 형광 강도는 모든 시점에서 가장 높았다. 특히, 24 시간에 PdNC 처리된 마우스의 TDLN에서 다른 그룹보다 더 강한 형광 강도가 관찰되었다.

상기 결과로부터, PdNC가 TDLN에 효율적으로 도달하고 축적됨을 확인하였다.

다음으로, 동일한 CT26.CL25 동계 종양 마우스 모델을 사용하여, 앞서 확인한 PdNC의 효율적인 TDLN-표적화 능력이 TDLN에서 항종양 면역 반응을 촉진할 수 있는지 여부를 평가하였다.

구체적으로, 1 x 10⁶ 개의 CT26.CL25 세포를 BALB/c 흰색 마우스의 왼쪽 옆구리에 접종하였다. 접종 후 6 일째에 종양 크기가 약 70mm³에 도달했을 때 PdNC(23.7mg/kg), wtNC(13.1mg/kg), sPD-1(10.0mg/kg) 또는 PBS를 종양에 주입하였다(n = 6-10). 종양 크기는 3 일마다 캘리퍼로 확인하고 방정식[(폭² x 길이)/2]를 적용하여 계산하였다. 종양이 없는 마우스는 완전한 remission 후 4 주 후에 1 x 10⁶ 개의 CT26.CL25 세포를 원발성 종양의 반대 부위에 재주사하였다.

생체 내 DC 성숙을 분석하기 위해 CT26.CL25 종양 보유 마우스에 PdNC, wtNC, sPD-1 또는 PBS를 주입하였다. 주사 후 3 일에 TDLN을 추출하고 CT26.CL25 종양 접종 후 9 일에 주사기 플런저(plunger)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 원심분리하여 펠릿을 만든 후, 적혈구(red blood cells, RBC)를 용해 완충액(Biolegend)으로 용해시켰다. 단일 세포 현탁액 유래 CD11c+ DC에서 CD40 또는 CD86의 상대적 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI) (대조군에 대한 상대적 MFI)는 CD11c(APC, Biolegend)+ CD40(PE, Biolegend) 또는 CD86 항체 (PE, Biolegend)를 사용한 유세포 분석으로 분석하였다. 쥐 IgG2a 동위원소(PE, Biolegend) 및 아르메니아 햄스터(Armenian Hamster) IgG 이소타입 항체(APC, Biolegend)가 대조군으로 사용되었다(n = 4-5).

또한, 항원 경험 T 세포를 확인하기 위해 TDLN 단일 세포 현탁액을 항-CD8(FITC, Biolegend) 및 항-CD44(PE, Biolegend) 항체로 염색하였다. 상대 MFI는 유세포 분석을 통해 분석되었다(n = 4-5).

그 결과, PdNC 처리는 TDLN의 DC에서 공동 자극 분자(CD40 및 CD86)의 증가를 유도하여 DC 성숙을 향상시켰다(도 7B).

또한, 도 7C에 나타난 바와 같이, PdNC 처리는 CD8+ T 세포에서 항원 경험 T 세포에 대한 마커인 CD44+를 증가시켰다.

상기 결과로부터, PdNC가 PD-1/PD-Ls 상호 작용을 효율적으로 차단하여 DC 성숙 및 T 세포 활성화를 향상시켰음을 알 수 있다.

다음으로, 종양 특이적 면역이 발생했는지 확인하기 위해 TDLN의 단일 세포 현탁액을 CT26.CL25 종양 세포 관련 항원인 종양 특이적 gp70 및 β-gal 펩타이드로 처리하였다.

구체적으로, TDLN의 단일 세포 현탁액의 5 x 10⁵ 개의 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고 5 μg/ml의 gp70 또는 β-gal과 함께 배양하였다. 24 시간 후, 상등액을 수집하고 IFN-γ ELISA 키트(R & D Systems) (n = 3-4)를 사용하여 종양 특이 면역 반응을 평가하였다.

그 결과, 예상한 바와 같이 PdNC 처리는 wtNCs와 sPD-1와 달리, gp70 및 β-gal에 대한 IFN-γ 분비를 상당히 증가시켰다(도 7D).

다음으로, PD1/PD-Ls 상호 작용이 프라이밍 또는 활성화 동안 T 세포 기능을 제한한다는 것은 잘 알려져 있는 바(S.J.P. Blake, et al., PLoS One, 10 (2015), Article e0119483), PdNC가 DC의 크로스 프라임(cross-prime) 능력을 강화하는지 여부를 조사하기 위해, TDLN의 CD11c+ 세포와 CD8+ 비장 세포가 공동 배양된 플레이트의 상층액으로부터 IFN-γ 분비를 측정하여 크로스 프라이밍 분석을 수행하였다.

구체적으로, CD11c+ 또는 CD8+ 세포를 TDLN 또는 비장의 단일 세포 현탁액으로부터 CD11c+ 또는 CD8 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리하였다. 그 후, CD11c+ 세포 3 x 10⁴ 개와 CD8+ 세포 1.2 x 10⁵ 개를 96 웰 플레이트에 100 ng/ml의 IL-2와 함께 시딩하였다. 48 시간 후, 상층액을 사용하여 IFN-γ ELISA 키트(R & D Systems) (n = 4-5)로 IFN-γ의 양을 조사하였다.

그 결과, PdNC 처리 그룹은 다른 그룹에 비해 현저한 IFN-γ 분비를 나타내었다(도 7E).

상기 결과로부터, PdNC의 향상된 전달 및 길항 능력이 TDLN에서 활성화된 DC 매개 항종양 T 세포 면역 반응을 강화함을 알 수 있다.

실시예 5. PdNC에 의한 종양 성장 억제 효과

PdNC 처리에 따른 항종양 면역을 기반으로 향상된 종양 성장 억제 효과를 평가하였다. 종양의 평균 크기가 70mm³에 도달하였을 때 마우스에 PdNC, sPD-1, wtNC 또는 완충액을 종양 내 단일 주사하였다.

그 결과, 도 8A 및 도 9와 같이, PdNC 처리 그룹은 다른 그룹에 비해 종양 성장을 극적으로 감소시켰다. PdNC는 종양 부피를 75 % 억제한 반면, 24 배 더 높은 몰투여량으로 투여된 sPD-1은 종양 부피의 유의한 감소가 나타나지 않았다. 또한, PdNC 처리 그룹은 단 한 번의 주사만으로도 약 33 %(9 개 중 3 개)에서 완전한 종양 퇴행을 나타내었다.

다음으로, 생체 내 잠재적 독성을 분석하기 위해 CT26.CL25를 보유한 7 주령 BALB/c 흰색 마우스에 PdNC, wtNC, sPD-1 또는 PBS를 투여하였다. 주입 48 시간 후, 각 그룹 내 마우스의 체중을 측정하고, 종양 조직, 간, 폐 및 신장을 적출하여 포르말린(Sigma)으로 고정하고 파라핀 블록에 삽입하였다. 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(eosin) (H&E) 염색을 위해 파라핀 블록을 4μg 두께의 섹션으로 절단하고, 자일렌을 1 시간 동안 처리하여 파라핀을 제거한 후 에탄올을 5분 간 처리하여 재수화하였다. 그런 다음 슬라이드를 헤마톡실린 10 분 및 에오신 30 초로 처리하여 염색하였다. 탈 이온수 또는 수돗물로 세척한 후, 조직 손상 여부를 형광 현미경(Olympus BX51)으로 분석하였다(n = 2-5, 각 이미지에 대해 여러 개의 다른 필드).

그 결과, PdNC로 처리한 마우스를 포함하여 모든 그룹의 마우스에서 체중 감소가 없었으며, 그룹 간에 큰 차이가 없었다(도 10). 또한 PdNC 처리된 마우스의 간, 폐 및 신장을 포함한 주요 기관의 H&E 염색 이미지는 완충제 대조군과 비교하여 차이가 없었으며, 이는 PdNC에 인한 유의한 독성이 없음을 나타내었다(도 11).

다음으로, 실험이 끝날 때 처리된 마우스의 종양 조직을 절제하여 항종양 면역 반응을 분석하였다.

CT26.CL25 종양 접종 후 9 일째에 수확된 종양을 종양 해리 키트 및 gentleMACS machine(MACS, Miltenyi Biotec)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 전환하였다. RBC는 용해 완충액으로 용해되었고, 자가사멸된 세포(apoptotic cell)를 키트(dead cell removal kit)로 제거하였다. 현탁액을 CD8 특이적 자기 비드로 분류하여 CD8+ 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 항-CD8α(FITC, Biolegend) 항체, 항-mouse IFN-γ(APC, Biolegend) 항체 또는 항-mouse Ki-67 항체(PE, Biolegend)로 처리하였다(n = 3-4). TME에서 DC 침투를 분석하기 위해 현탁액을 항-마우스 CD45.2+ 항체(PerCP Cy5.5, Biolegend)와 항-마우스 CD11c+ 항체(APC, Biolegend)로 표지하고, 그 후 유세포 분석으로 분석하였다(n = 4-5).

그 결과, 도 8B와 같이, PdNC 처리는 TME의 CD3+ CD45.2+ CD8+ T 세포에서 T 세포의 증식 및 이펙터 기능에 대한 마커인 ki67 및 IFN-γ 발현을 증가시켰으며, 이는 TME에서 T 세포 면역의 활성화를 시사하였다.

다음으로, CT26.CL25 마우스 모델에 CT26.CL25 종양 접종 후 21 일에 종양 조직을 추출하여 OCT 화합물(Leica Biosystems)에 삽입하였다. 동결된 블록을 만든 후, 샘플을 CD8+ 세포 염색을 위해 회전 마이크로톰으로 절편화하였다. 섹션은 2 시간 동안 3% BSA 및 PBS로 사전 차단되었다. 그 후, 냉동된 샘플을 CD8α(BD Pharmigen) 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 섹션을 세척하고 Alexa Fluor 488-접합된 2 차 항체(Jackson ImmunoResearch)와 함께 배양하였다. 쥐 IgG2a 이소타입 대조군 항체(Jackson ImmunoResearch)를 대조군으로 사용하였다. 종양 조직 내에서 표지된 CD8+ T 세포를 형광 현미경(Nikon eclipse Ti)을 이용하여 검출하였다. mm² 당 종양 조직에 침투한 T 세포의 수는 ImageJ를 사용하여 계산하였다(각 이미지에 대해 n = 3-5 개의 각각 다른 필드).

그 결과, PdNCs 처리 그룹은 다른 그룹과 비교하여 TME에서 종양 침투 CD8+ T 세포와 DC에서 상당한 증가를 유도하였다(도 8C-E). 특히, PdNC 처리된 마우스에서 종양 침투 CD8+ T 세포의 상당한 증가가 확인되었다(완충액 대조군의 4.64 배) (도 8D).

또한, PdNC 처리된 종양이 없는 마우스에 상기 CT26.CL25 마우스 모델에 CT26.CL25 종양 접종 후 21 일째의 종양 조직 유래 종양 세포를 주입하였을 때 종양 성장이 나타나지 않아, 특정 면역학적 기억이 형성되었음을 확인하였다(도 8F).

상기 결과로부터, PdNC는 TME 및 TDLN에서 DC 매개 T 세포 활성화를 상향 조절함으로써 항종양 반응을 유도할 수 있으며, 이는 종양 미세 환경에서 바람직한 항종양 면역의 형성을 유도함을 확인하였다.

상기 실시예의 결과에 따라, 본 발명의 PD-1 부착 나노케이지(PdNC)는 PD-1 및 PD-L 신호를 차단하고 TME(효과기 단계) 및 TDLN(인지 단계)의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도함으로써, PD-1 및 PD-L 차단 기반 요법의 적응성을 증대시키는 바, 다양한 종류의 암 치료에 적용할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> PD-1-decorated nanocages and uses thereof <130> KPA210530-KR <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> sPD-1 AA <400> 1 Met His His His His His His Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg 1 5 10 15 Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn 20 25 30 Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu 35 40 45 Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala 50 55 60 Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile 65 70 75 80 Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr 85 90 95 Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His 100 105 110 Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr 115 120 125 <210> 2 <211> 396 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> sPD-1 NT <400> 2 catatgcatc atcatcacca ccacctagag gtccccaatg ggccctggag gtccctcacc 60 ttctacccag cctggctcac agtgtcagag ggagcaaatg 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Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 65 70 75 80 Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 85 90 95 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 115 120 125 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala 130 135 140 Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 145 150 155 160 Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly 165 170 175 Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 14 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu 20 25 30

Claims (32)

1. 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1)이 페리틴 중쇄 단백질의 C-말단에 연결된 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 나노케이지는 효과기 단계 및 인지 단계의 두 면역 체크 포인트에서 항종양 면역 활성화를 유도하는 것이 특징인, 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 효과기 단계에서의 항종양 면역 활성화는 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)에서 이루어지는 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,상기 인지 단계에서의 항종양 면역 활성화는 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN)에서 이루어지는 것인, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 항종양 면역 활성화는 수지상 세포(Dendritic cell) 매개 종양 특이적 T 세포 활성화인 것인, 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 나노케이지는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 또는 프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand) 중 선택되는 어느 하나 이상의 신호를 차단하는 것인, 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 및 상기 페리틴 중쇄 단백질 사이에 링커 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 프로그램된 세포 사멸 단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 페리틴은 서열번호 3 내지 13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
   
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 항암제와 병용 투여되는 것인, 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 항암제는 탁산계 항암제, 스타틴, 알킬화 약물(Alkylating agents), 백금 제제(Platinum-based drug), 항대사산물(Antimetabolites), 항생제(Antibiotics), 빈카 알칼로이드계(Vinca alkaloids) 항암제, 표적 치료제, 면역 항암제, 암 백신(Cancer Vaccine), 세포 치료제(Cell therapy), 종양 용해성 바이러스(Oncolytic virus) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 항암 요법과 병용되는 것인, 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 항암 요법은 방사선요법(Radiotherapy) 및 광역학 요법(Photodynamic therapy)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
    
15. 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1)이 페리틴 중쇄 단백질의 C-말단에 연결된 융합단백질이 자기조립되어 형성된 단백질 나노케이지.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 프로그램된 세포 사멸 단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 나노케이지.
    
17. 제15항 또는 제16항의 단백질 나노케이지 내부에 항암제가 담지된 항암 단백질 나노케이지.
    
18. 삭제
19. 제17항에 있어서, 상기 항암제는 탁산계 항암제, 스타틴, 알킬화 약물(Alkylating agents), 백금 제제(Platinum-based drug), 항대사산물(Antimetabolites), 항생제(Antibiotics), 빈카 알칼로이드계(Vinca alkaloids) 항암제, 표적 치료제, 면역 항암제, 암 백신(Cancer Vaccine), 세포 치료제(Cell therapy), 종양 용해성 바이러스(Oncolytic virus) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
20. 제19항에 있어서, 상기 탁산계 항암제는 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 라로탁셀(Larotaxel) 및 카바지탁셀(Cabazitaxel)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
21. 제19항에 있어서, 상기 스타틴은 지용성 스타틴인 것인, 나노케이지.
    
22. 제21항에 있어서, 상기 지용성 스타틴은 심바스타틴(simvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin) 및 피타바스타틴(pitavastatin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
23. 제19항에 있어서, 상기 알킬화 약물은 니트로겐 머스타드(Nitrogen mustard)계 약물, 에틸렌이민(Ethylenimine) 및 메틸메라민(Methylmelamine)계 약물, 메틸히드라진(Methylhydrazine) 유도체, 알킬 설포네이트(Alkyl Sulfonate)계 약물, 니트로소우레아(Nitrosourea)계 약물 및 트리아진(Triazine)계 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
24. 제19항에 있어서, 상기 백금 제제는 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
25. 제19항에 있어서, 상기 항대사산물은 엽산 길항제(Folate antagonist)계 약물, 퓨린 길항제(Purine antagonist)계 약물 및 피리미딘 길항제(Pyrimidine antagonist)계 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
26. 제19항에 있어서, 상기 항생제는 에토포시드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 이다루비신(Idarubicin), 에피루비신(Epirubicin), 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin, Adriamycin), 다우노루비신(Daunorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 미토마이신-C(Mitomycin C) 및 미토잔트론(Mitoxantrone)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
27. 제19항에 있어서, 상기 빈카 알칼로이드계 항암제는 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
28. 제19항에 있어서, 상기 표적 치료제는 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 표적 치료제, HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2) 표적 치료제, CD20(B cell marker) 표적 치료제, CD33(Myeloid Cell Surface Antigen) 표적 치료제, CD52(cluster of differentiation 52) 표적 치료제, CD30(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 8) 표적 치료제, bcr-abl(breakpoint cluster region protein-Tyrosine-protein kinase)/c-Kit(tyrosine kinase receptor) 표적 치료제, ALK(anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase) 표적 치료제, 항-혈관신생(Antiangiogenics) 표적 치료제, mTOR(Mammalian target of rapamycin) 표적 치료제, CDK4/6(Cyclin-dependent kinase 4/6) 표적 치료제, PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase) 표적 치료제, 프로테아좀(Proteasome) 저해제, 티로신 키나제(tyrosine kinase) 길항제, 프로테인 키나제 C(protein kinase C) 억제제 및 파네실 트랜스퍼라제(Farnesyl transferase) 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
29. 제19항에 있어서, 상기 면역 항암제는 항-프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1), 항-프로그램된 세포 사멸 리간드(programmed cell death-ligand, PD-L) 상호작용 억제제, CTLA4(Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4, CD152)/B7-1/B7-2 상호작용억제제 및 CD47(Cluster of Differentiation 47)/SIRP(Signal-regulatory protein) 상호작용억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노케이지.
    
30. 제15항 또는 제16항의 단백질 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
31. 제17항의 단백질 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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