KR102642232B1

KR102642232B1 - Composition for the treatment of asthma, comprising purified fractions of fermented bellflower as an active ingredient

Info

Publication number: KR102642232B1
Application number: KR1020220164764A
Authority: KR
Inventors: 황운상; 권기선; 이화영; 인수아; 이경희; 이해지; 김경진; 김성필; 김진만
Original assignee: (주)에스티알바이오텍
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2024-03-04

Abstract

본 발명은 목적은 도라지발효물 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공에 관한 것이다. 본 발명은 장기간 약물복용으로 인한 면역능 저하, 감염, 혈압 상승, 골다공증 또는 위궤양 같은 부작용을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 도라지발효물을 정제 가공하여 도라지발효물 정제분획을 수득하여 이용함으로써, 스테로이드계 약물의 부작용을 해소하고, 천식의 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.The object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of asthma containing a purified fraction of fermented bellflower root as an active ingredient. The present invention has been studied diligently to overcome side effects such as decreased immunity, infection, increased blood pressure, osteoporosis, or gastric ulcer caused by long-term drug use. By refining and processing the fermented bellflower root to obtain and use a purified fraction of the fermented bellflower root, the side effects of steroid drugs can be eliminated and it can be usefully used as a composition for the treatment and prevention of asthma.

Description

Composition for the treatment of asthma, comprising purified fractions of fermented bellflower as an active ingredient}

본 발명은 도라지발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating asthma containing a purified fraction of fermented bellflower root powder as an active ingredient.

천식은 기도에 발생하는 만성염증으로 인하여 기관지가 과민해지고 간헐적인 기도 수축이 발생하여 호흡곤란 증상을 유발하는 만성질병으로서, 아직까지는 완치방법이 없는 것으로 알려지고 있다. 천식환자가 알레르기 유발물질을 흡입하면 항체들이 인지하고 면역계를 활성화시켜 염증반응이 진행되어 기도의 염증과 부종, 기도의 수축을 야기하고 점액이 방출되면서 기관지가 좁아지면 이로 인해 다양한 천식의 증상들이 발현된다. 천식환자는 Th2 임파구가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13의 증가가 이루어지게 된다. 이들 중 IL-4는 점액 생성과 B세포의 증식을 촉진하고, IgE 항체의 생성을 유도, 항진시키며, 호흡곤란을 야기한다. IL-4는 히스타민이나 류코트리엔과 같은 염증매개물질을 분비하는 비만세포(mast cell)를 활성화시키는 IgE를 생성하고 폐조직으로 eosinophil을 전달하는 VCAM-1을 발현시키게 된다. 호흡곤란, 기침, 가래, 천명(음) 등 전형적인 천식의 호흡기증상 외에도 비전형적인 증상이 나타나기도 한다. 또한 IL-5는 호산구(eosinophils)의 침윤을 항진시키고, IL-13은 천식에 있어서 항원 유발성 기도 과인성 발달에 중요한 사이토카인이라는 사실이 밝혀지면서 알레르기의 면역학적 병인기전과 관련해서 Th2 면역반응에 초점을 맞추게 되었다.Asthma is a chronic disease in which bronchial hypersensitivity and intermittent airway constriction occur due to chronic inflammation in the airways, causing symptoms of difficulty breathing. It is known that there is no cure yet. When an asthma patient inhales an allergy-causing substance, the antibodies recognize it and activate the immune system, resulting in an inflammatory response, causing inflammation and swelling of the airway and constriction of the airway. As mucus is released and the bronchial tubes narrow, various asthma symptoms appear. do. In asthma patients, Th2 lymphocytes are activated and IL-4, IL-5, IL-9, and IL-13 increase. Among these, IL-4 promotes mucus production and proliferation of B cells, induces and enhances the production of IgE antibodies, and causes breathing difficulties. IL-4 produces IgE, which activates mast cells that secrete inflammatory mediators such as histamine and leukotrienes, and expresses VCAM-1, which delivers eosinophil to lung tissue. In addition to the typical respiratory symptoms of asthma, such as difficulty breathing, coughing, phlegm, and wheezing, atypical symptoms may also appear. In addition, as it was discovered that IL-5 enhances the infiltration of eosinophils and that IL-13 is an important cytokine in the development of antigen-induced airway hyperresponsiveness in asthma, the Th2 immune response is related to the immunological pathogenesis of allergy. came to focus on.

천식환자는 심박수 상승, 건성 수포음 등도 나타날 수 있고, 매우 심각한 천식 발작 동안에는 산소부족으로 청색증이 오고, 강한 흉통이 의식을 잃기 직전에 팔다리의 무감각을 느끼거나 손바닥에 땀이 나는 것을 느낄 수 있으며, 일반적인 치료에 반응하지 않는 심각한 천식 발작은 생명을 위협할 수 있으며, 호흡정지와 사망에 이를 수도 있다. 이러한 기관지 천식은 우리나라를 포함하여 세계적으로 대다수의 국가들에서 전체 인구 중 약 5 내지 10%의 인구가 앓고 있는 것으로 보고될 만큼 매우 흔한 질병으로서, 최근 들어 대기 등 환경오염의 속도가 빨라짐에 따라 그 유병률이 세계적으로 더욱 증가되고 있다. 미국 국립 심폐혈관연구소와 유럽호흡기학회에 의하면, 천식에 관한 연간 비용은 미국에서 161억 달러, EU에서 163억 달러로 예측되며, 천식질환의 특성상 장기간 약물복용이 불가피하지만, 종래의 스테로이드제나 평활근 이완제와 같은 천식치료제들은 면역능 저하, 감염, 심장에 대한 작용 등의 많은 부작용을 나타낸다. 천식의 치료에 사용되는 경구용 스테로이드제는 전신에 흡수되므로 혈압 상승, 골다공증, 위궤양 등과 같은 부작용이 생길 수 있다. 호흡기 흡입용 스테로이드제 역시 목이 쉬는 부작용이 있다.Asthma patients may also experience increased heart rate and dry crackles. During a very severe asthma attack, cyanosis may occur due to lack of oxygen, and strong chest pain may cause numbness in the limbs or sweaty palms just before losing consciousness. Severe asthma attacks that do not respond to treatment can be life-threatening, leading to respiratory arrest and death. This type of bronchial asthma is a very common disease, with approximately 5 to 10% of the total population reported to be suffering from it in most countries around the world, including Korea. Recently, as the speed of environmental pollution such as air has accelerated, its incidence has increased. The prevalence is increasing worldwide. According to the U.S. National Cardiopulmonary Institute and the European Respiratory Society, the annual cost of asthma is expected to be $16.1 billion in the U.S. and $16.3 billion in the EU. Due to the nature of asthma disease, long-term medication use is inevitable, but conventional steroids or smooth muscle relaxants Asthma treatments such as these have many side effects, such as decreased immune function, infection, and effects on the heart. Oral steroids used to treat asthma are absorbed throughout the body, so side effects such as increased blood pressure, osteoporosis, and stomach ulcers may occur. Inhaled steroids also have the side effect of hoarseness.

따라서 부작용이 적고, 근원적 치료 효과를 갖는 새로운 천식증 치료 약물이나 식품 조성물의 개발이 시급히 요구되며, 특히 종래의 천식증에 사용되는 스테로이드계 약물이 갖는 부작용을 해소할 수 있는 천식치료제 개발이 요구되고 있다. 이에, 상기와 같은 문제를 해결하기 위해서 본 발명을 완성하였다.
(선행문헌)
대한민국 공개특허공보 제10-2016-0064992호 (2016.06.08.)Therefore, there is an urgent need to develop a new asthma treatment drug or food composition that has fewer side effects and has a fundamental therapeutic effect. In particular, the development of an asthma treatment drug that can eliminate the side effects of steroid drugs used for conventional asthma is required. there is. Accordingly, the present invention was completed to solve the above problems.
(Prior literature)
Republic of Korea Patent Publication No. 10-2016-0064992 (2016.06.08.)

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 도라지발효분말 정제분획을 포함하는 천식 치료용 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The present invention was made to solve the problems in the prior art as described above, and relates to a composition or food composition for treating asthma containing a purified fraction of fermented bellflower root powder. However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

따라서 본 발명의 목적은 도라지발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.Therefore, the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating asthma containing the purified fraction of bellflower root fermented powder as an active ingredient.

이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Various embodiments described herein are described below with reference to the drawings. In the following description, various specific details, such as specific forms, compositions, and processes, are set forth in order to provide a thorough understanding of the invention. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details or in conjunction with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and manufacturing techniques are not described in specific detail so as not to unnecessarily obscure the invention. Reference throughout this specification to “one embodiment” or “an embodiment” means that a particular feature, form, composition or characteristic described in connection with the embodiment is included in one or more embodiments of the invention. Accordingly, the phrases “in one embodiment” or “an embodiment” appearing in various places throughout this specification do not necessarily refer to the same embodiment of the invention. Additionally, particular features, shapes, compositions, or properties may be combined in any suitable way in one or more embodiments.

본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless there is a special definition within the present invention, all scientific and technical terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art in the technical field to which the present invention pertains.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 도라지발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating asthma comprising a purified fraction of fermented bellflower root powder as an active ingredient.

본 발명에서 도라지(Platycodon grandiflorum, 또는 bellflower)는 굵은 뿌리줄기를 가지고 있는 여러해살이풀이다. 줄기는 곧게 서고 40~80cm 정도의 높이로 자라며, 가지를 거의 치지 않는다. 잎은 마디마다 서로 어긋나게 자리하거나 2~3장의 잎이 한 자리에 나기도 한다. 잎은 길쭉한 계란 꼴 또는 타원 꼴로 생겼으며 잎자루라고 할 만한 것은 없다. 잎의 양끝이 뾰족하고 가장자리에는 날카로운 톱니를 가지고 있고, 잎 뒷면은 흰 가루를 쓰고 있는 것처럼 보인다. 줄기 끝에 종과 같이 생긴 여러 송이의 큰 꽃이 피는데, 꽃의 끝 부분이 다섯 갈래로 갈라져 있고 5개의 수술을 가지고 있다. 꽃의 지름은 4cm 안팎이고 빛깔은 짙은 하늘빛이나, 간혹 흰색으로 꽃이 피는 것도 있다. 뿌리줄기를 약재로 사용하는데, 뿌리줄기에 포함된 사포닌(Saponin)의 일종인 플라티코딘(Platycodin)과 플라티코디게닌(Platycodigenin) 등이 거담작용과 진해작용을 한다고 알려져 있다.In the present invention, bellflower (Platycodon grandiflorum, or bellflower) is a perennial herb with a thick rhizome. The stem stands erect and grows to a height of about 40 to 80 cm, with little branching. The leaves may be arranged alternately at each node, or 2 to 3 leaves may grow in one place. The leaves are shaped like an elongated egg or oval and have no petioles. Both ends of the leaf are pointed, the edges have sharp teeth, and the back of the leaf appears to be covered in white powder. Several large, bell-like flowers bloom at the end of the stem, and the ends of the flowers are split into five branches and have five stamens. The diameter of the flower is about 4cm and the color is dark blue, but sometimes the flower is white. The rhizome is used as a medicine, and platycodin and platycodigenin, a type of saponin contained in the rhizome, are known to have expectorant and antitussive effects.

본 발명에 따르면, 도라지 또는 도라지 분말은 도라지 전체 또는 일부로 구성된 것을 의미하며, 도라지 일부는 도라지 뿌리, 뿌리털, 줄기, 가지, 잎, 나무갓, 껍질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to the present invention, bellflower root or bellflower root powder means composed of the whole or part of bellflower root, and the bellflower part may be one or more selected from the group consisting of bellflower root, root hair, stem, branch, leaf, tree cap, and bark, but is limited thereto. It doesn't work.

본 발명에서 담자균류란, 진균류의 한 아문으로 유성생식 한 결과로 담자기라는 세포가 되어 홀씨를 만드는 균류이다. 스스로 양분을 만들지 못하여 다른 생물체에 붙어 기생하며, 버섯으로 알려진 것이 많은데 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯 따위가 대표적이다. 성숙한 버섯의 갓주름 면에는 담자기가 빽빽이 생긴다. 담자균류 버섯의 대부분은 고등식물의 유체에서 부생적으로 생활하며, 특히 셀룰로오스와 리그닌을 분해하여 물질의 생물학적 순환에 없어서는 안 될 중요한 역할을 하지만, 또 수목의 뿌리에 균근을 형성하여 공동생활을 하는 것도 많다. 그 밖에 식용균으로 중요시되거나 독버섯으로 주의를 해야 할 종류도 있다.In the present invention, Basidiomycota is a subphylum of fungi that, as a result of sexual reproduction, becomes a cell called a basidium and produces a spore seed. Since they cannot produce their own nutrients, they attach to other living organisms and become parasitic. There are many known as mushrooms, such as shiitake mushrooms, Sanghwang mushrooms, chaga mushrooms, maitake mushrooms, wood ear mushrooms, snowflake mushrooms, and skirt mushrooms. Basidia grow densely on the cap wrinkle surface of mature mushrooms. Most of the Basidiomycete mushrooms live saprophytically in the fluids of higher plants. In particular, they play an essential role in the biological cycle of substances by decomposing cellulose and lignin, but they also live communally by forming mycorrhizae on the roots of trees. There are many things. In addition, there are some species that are considered important as edible fungi or that require caution as poisonous mushrooms.

본 발명에서 균사란, 사상균(곰팡이)의 영양세포이다. 영양적 기능이나 생리적 기능 같은 기능 분화도 볼 수 있다. 형태적으로는 격벽의 유무가 분류에 사용되고 있으며, 포자의 발아관에서 발육하여 선단생장에 의해서 신장한다. 분지한 균사의 집단을 균사체(mycelium)라고 한다. 생리적 기능에 따라 배지나 기주의 표면 또는 내부에 들어가면서 신장하는 기저균사와 공기 중에서 신장하는 기생균사로 구별된다. 기생균사는 영양을 기저균사로부터의 이송에 의존하고 있으며, 그 일부는 포자 형성기관 등으로 분화한다. 유기물이 있고 적당한 습도와 온도 등 환경조건이 양호하면 여러 가지 균사조직을 형성한다. 자낭균류의 균사의 격막은 단순하지만 담자균류에서는 꺾쇠연결을 형성하는 것을 많이 볼 수 있다. 곰팡이류에서는 여러 갈래로 분지하여 실처럼 엉겨 있고, 버섯류에서는 집합하여 자실체를 만든다. 엽록소가 없어 광합성을 하지 못하고 기주생물에 붙어서 영양분을 흡수한다. 버섯인 담자균류의 경우, 포자에서 발아한 균사는 핵을 1개 가지고, 이것이 다른 균사와 융합하면 1개의 세포에 핵을 2개 가지게 된다. 핵을 1개 가진 균사를 1차 균사, 핵을 2개 가진 균사를 2차 균사라고 한다. 본 명세서에 있어서 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양받아 사용할 수 있다.In the present invention, mycelium is a vegetative cell of filamentous fungi (mold). Functional differentiation, such as nutritional or physiological functions, can also be seen. Morphologically, the presence or absence of a septum is used for classification, and it develops in the germ tube of the spore and extends by apical growth. A group of branched hyphae is called mycelium. Depending on their physiological function, they are divided into basal hyphae, which elongate as they enter the surface or interior of the medium or host, and parasitic hyphae, which elongate in the air. Parasitic hyphae depend on transportation of nutrients from basal hyphae, and some of them differentiate into spore-forming organs. If there is organic matter and environmental conditions such as appropriate humidity and temperature are good, various mycelial tissues are formed. The hyphal septa of Ascomycetes are simple, but in Basidiomycota they often form angle connections. In fungi, it branches into many branches and tangles like a thread, and in mushrooms, it gathers to form a fruiting body. Since it does not have chlorophyll, it cannot photosynthesize and attaches itself to host organisms to absorb nutrients. In the case of Basidiomycota, which are mushrooms, the hyphae sprouted from the spore have one nucleus, and when this hyphae fuses with another hyphae, one cell has two nuclei. Hyphae with one nucleus are called primary hyphae, and those with two nuclei are called secondary hyphae. In this specification, the basidiomycete mycelium can be used by selecting any one from the medicinal and edible basidiomycetes, such as shiitake mushroom, saenghwang mushroom, chaga mushroom, maitake mushroom, wood ear mushroom, snowflake mushroom, and skirt mushroom. These Basidiomycete hyphae are collected from the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM), Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC), Korea Cell Line Bank (KCLB), Korea Agricultural Microbial Resource Center (KACC), and American Standard Strain Culture Collection (ATCC). Strains can be purchased and used from organizations such as

본 발명에서 생물전환이란, 발효 및 효소처리 등의 생물학적 방법을 통해 첨가된 물질의 구조적 변화를 유도하여 화학적으로 변형된 형태로 전환시켜 새로운 성분의 생성을 유도하는 것을 말한다.In the present invention, bioconversion refers to inducing structural changes in added substances through biological methods such as fermentation and enzyme treatment, converting them into chemically modified forms, thereby inducing the creation of new ingredients.

본 발명에서 발효란, 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효라고 하는 것은 효소작용에 의해 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유에너지를 내놓는 현상이지만, 일반적으로는 미생물이 유기물의 분해과정을 통해 대사물을 축적하는 현상을 말한다. 즉, 효모가 당을 무산소적으로 분해해서 에틸알코올과 이산화탄소로 하는 알코올 발효, 락트산균이 당을 무산소적으로 분해해서 락트산으로 하는 락트산 발효 등이 전형적인 발효이지만, 현재는 아세트산균이 공기 중의 산소를 이용해서 알코올을 아세트산으로 산화시키는 현상, 곰팡이가 공기 중의 산소를 이용해서 글루코오스를 글루콘산으로 산화시키는 현상 등도 각각 아세트산 발효, 글루콘산 발효 등으로 부르고 있다. 또 이러한 것들을 혐기적 발효, 호기적 발효(산화 발효)로 나누어 논하기도 하고, 위에 언급한 것 외의 혐기적 발효로는 글리세롤 발효, 아세톤부탄올 발효, 2, 3-부틸렌글리콜 발효, 부티르산 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이, 또 호기적 발효로는 시트르산 발효, 이타콘산 발효, 숙신산 발효, 2-케토글루타르산 발효, 옥살산 발효, 푸마르산 발효, 소르보오스 발효 등이 있다. 이외에 미생물에 의한 아미노산, 비타민, 항생물질의 생산도 예를 들면 글루탐산 발효, 리보플라빈 발효, 페니실린 발효 등으로 불리는데, 그다지 좋은 호칭은 아니다. 발효작용명은 생산물로 부르는 것이 원칙이나, 때로는 셀룰로오스 발효, 펙틴 발효 등으로 기질의 이름을 붙이기도 한다.In the present invention, fermentation refers to a process in which microorganisms decompose organic matter using their own enzymes. Fermentation is a phenomenon in which organic matter changes into a simple compound through enzyme action and releases free energy, but generally refers to a phenomenon in which microorganisms accumulate metabolites through the decomposition process of organic matter. In other words, alcohol fermentation in which yeast anaerobically decomposes sugar into ethyl alcohol and carbon dioxide, and lactic acid fermentation in which lactic acid bacteria anaerobically decompose sugar into lactic acid are typical fermentations, but currently, acetic acid bacteria consume oxygen in the air. The phenomenon of oxidizing alcohol to acetic acid and the phenomenon of mold oxidizing glucose to gluconic acid using oxygen in the air are also called acetic acid fermentation and gluconic acid fermentation, respectively. These are also divided into anaerobic fermentation and aerobic fermentation (oxidative fermentation) and discussed. Anaerobic fermentations other than those mentioned above include glycerol fermentation, acetone butanol fermentation, 2, 3-butylene glycol fermentation, butyric acid fermentation, and propionic acid. Fermentation, methane fermentation, etc. Aerobic fermentation includes citric acid fermentation, itaconic acid fermentation, succinic acid fermentation, 2-ketoglutaric acid fermentation, oxalic acid fermentation, fumaric acid fermentation, and sorbose fermentation. In addition, the production of amino acids, vitamins, and antibiotics by microorganisms is also called, for example, glutamic acid fermentation, riboflavin fermentation, and penicillin fermentation, which are not very good names. In principle, the name of the fermentation action is called the product, but sometimes the name of the substrate is given, such as cellulose fermentation or pectin fermentation.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정제분획은 고액분리분획(PG-F-S), 수용성분획(PG-F-W), 및 다당체분획(PG-F-P)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the purified fraction is a pharmaceutical composition selected from the group consisting of solid-liquid separation fraction (PG-F-S), water-soluble fraction (PG-F-W), and polysaccharide fraction (PG-F-P). .

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid; BALF)에서 면역글로불린 E(IgE)의 발현량을 감소시키거나, 혈청 내에서 면역글로불린 G(IgG), 및 면역글로불린 G1(IgG1)의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition reduces the expression level of immunoglobulin E (IgE) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation or increases immunoglobulin G (IgG) in serum. , and a pharmaceutical composition that reduces the expression level of immunoglobulin G1 (IgG1).

본 발명에서 약학 조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학 조성물은 염증활성 물질의 억제를 위해 사용되는 것이며, 이를 위한 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 약학 조성물에 상응하는 유효성분을 0.1 내지 100 중량%로 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.In the present invention, a pharmaceutical composition refers to a composition administered for a specific purpose. For the purpose of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention is used to inhibit inflammatory substances, and may include a composition for this purpose and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent. The pharmaceutical composition according to the present invention contains 0.1 to 100% by weight of an active ingredient corresponding to the pharmaceutical composition of the present invention based on the total weight of the composition. Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, and calcium silicate. , cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 면역세포 수를 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition that reduces the number of immune cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역세포는 림프구(Lymphocyte), 호산구(Eosinophil), 호중구(Neutrophil) 또는 대식세포(Macrophage)인 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the immune cell is a pharmaceutical composition in which the immune cell is a lymphocyte, an eosinophil, a neutrophil, or a macrophage.

본 발명에 따르면, 림프구(Lymphocyte)는 무과립성 백혈구의 일종을 의미하며, 면역 기능에 관여한다. 림프구에는 T세포, B세포, 및 자연살해세포가 포함되며, 무과립성 백혈구 중 가장 많은 수를 차지하고, 전체 백혈구 중에서도 30%를 차지한다.According to the present invention, lymphocyte refers to a type of agranular white blood cell and is involved in immune function. Lymphocytes include T cells, B cells, and natural killer cells, and make up the largest number of agranular white blood cells and 30% of all white blood cells.

본 발명에 따르면, 호산구(Eosinophil)는 호산구 과립구라고도 하며, 세포질에 호산성 과립을 가지고 있는 과립구성 백혈구의 일종이다. 직경은 약 9 내지 10μm 정도로 적혈구보다 조금 크며, 핵은 연결된 두 개의 둥근 엽으로 구성되어 있고, 세포질은 H&E 염색에 붉은 색으로 염색되는 호산성 과립이 채워져 있다.According to the present invention, eosinophils, also called eosinophilic granulocytes, are a type of granulocytic white blood cell that has eosinophilic granules in the cytoplasm. The diameter is about 9 to 10 μm, slightly larger than that of a red blood cell, the nucleus is composed of two connected round lobes, and the cytoplasm is filled with eosinophilic granules that stain red on H&E staining.

본 발명에 따르면, 호중구(Neutrophil)는 포유류에서 가장 많은 비율을 차지하는 백혈구이다. 선천성면역에 주요한 역할을 하며, 골수에 있는 줄기세포에서 형성되고, 수명은 짧으며 이동성이 높다. 호중구는 분절형 호중구와 띠형 호중구로 세분할 수 있으며, 호중구는 호산구, 호염기구와 함께 다형핵세포족에 속한다. According to the present invention, neutrophils are white blood cells that account for the largest proportion in mammals. It plays a major role in innate immunity, is formed from stem cells in the bone marrow, has a short lifespan and is highly mobile. Neutrophils can be subdivided into segmental neutrophils and band-shaped neutrophils, and neutrophils belong to the polymorphonuclear cell family along with eosinophils and basophils.

본 발명에 따르면, 대식세포(Macrophage)는 병원체를 삼키고 소화하는 면역계의 백혈구 유형으로, 암세포, 미생물, 세포 찌꺼기 및 외부물질과 같이 우리 몸에 해로운 물질을 인식하여 제거하는 기능을 갖고 있다. 이 과정을 감염과 부상으로부터 숙주를 방어하는 작용을 하는 식균작용(phagocytosis) 이라고 한다.According to the present invention, macrophages are a type of white blood cell of the immune system that engulfs and digests pathogens, and has the function of recognizing and removing substances harmful to our body, such as cancer cells, microorganisms, cell waste, and foreign substances. This process is called phagocytosis, which acts to defend the host against infection and injury.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 및 인터루킨 13(IL-13)의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition increases the expression levels of interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), and interleukin 13 (IL-13) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation. It is a pharmaceutical composition that reduces.

본 발명에 따르면, 인터루킨(interleukin)은 백혈구 및 일부 다른 신체 세포에서 발현 및 분비되는 사이토카인 그룹을 의미한다. 인간 게놈은 50개 이상의 인터루킨 및 관련 단백질을 암호화한다.According to the present invention, interleukin refers to a group of cytokines expressed and secreted by white blood cells and some other body cells. The human genome encodes more than 50 interleukins and related proteins.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 혈청(serum)에서 저하된 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 12(IL-12), 및 인터루킨 10(IL-10)의 농도를 회복시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition restores the decreased concentration of interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12), and interleukin 10 (IL-10) in serum. It is a pharmaceutical composition.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증매개물질을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition that reduces inflammatory mediators in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 염증매개물질은 에오탁신(Eotaxin), 혈관세포접착분자-1(VCAM-1), 또는 류코트리엔 C4(Leukotriene C4; LTC4)인 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the inflammatory mediator is a pharmaceutical composition in which the inflammatory mediator is eotaxin, vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), or leukotriene C4 (LTC4).

본 발명에 따르면, 에오탁신(Eotaxin)은 호산구에 특이적인 케모카인으로서, 각종 염증반응에 있어 호산구의 동원을 일으키는 강력한 매개체이고, 혈중 에오탁신은 알레르기 염증반응의 표지자로서 기관지천식 환자에서 증상의 중증도를 반영할 수 있어, 기관지천식 환자의 상태를 감시하는데 이용될 수 있다.According to the present invention, eotaxin is a chemokine specific for eosinophils and is a powerful mediator that causes the recruitment of eosinophils in various inflammatory reactions, and eotaxin in the blood is a marker of allergic inflammatory reactions that determines the severity of symptoms in patients with bronchial asthma. It can be used to monitor the condition of patients with bronchial asthma.

본 발명에 따르면, 혈관세포접착분자-1(VCAM-1)은 분화 클러스터 106으로도 알려져 있으며, 인간에서 VCAM-1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이고 VCAM-1은 세포접착분자로 기능한다.According to the present invention, vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), also known as differentiation cluster 106, is a protein encoded by the VCAM-1 gene in humans, and VCAM-1 functions as a cell adhesion molecule.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 인터루킨 6(IL-6), 및 케모카인 리간드 1(CXCL1)의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition that reduces the expression level of interleukin 6 (IL-6) and chemokine ligand 1 (CXCL1) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation. .

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid; BALF)에서 투여농도에 의존적으로 면역글로불린 E(IgE)의 발현량을 감소시키거나, 혈청 내에서 면역글로불린 G(IgG), 및 면역글로불린 G1(IgG1), 면역글로불린 G2a(IgG2a)의 발현량을 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition reduces the expression level of immunoglobulin E (IgE) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation depending on the administration concentration, or increases immunity in serum. It is a pharmaceutical composition that reduces the expression levels of globulin G (IgG), immunoglobulin G1 (IgG1), and immunoglobulin G2a (IgG2a) depending on the administration concentration.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 면역세포의 수를 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition that reduces the number of immune cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation in a dependent manner on the administration concentration.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 및 인터루킨 13(IL-13)의 발현량을 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition increases the expression levels of interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), and interleukin 13 (IL-13) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at the site of inflammation. It is a pharmaceutical composition that reduces depending on the administered concentration.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 혈청(serum)에서 저하된 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 12(IL-12), 및 인터루킨 10(IL-10)의 농도를 투여농도에 의존적으로 회복시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition reduces the concentration of interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12), and interleukin 10 (IL-10) in serum at the administered concentration. It is a pharmaceutical composition that restores dependence.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증매개물질을 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition that reduces inflammatory mediators in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of the inflamed area in a dose-dependent manner.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 염증매개물질은 에오탁신(Eotaxin), 혈관세포접착분자 1(VCAM-1), 류코트리엔 C₄(Leukotriene C₄; LTC₄), 또는 프로스타글란딘 D₂(Prostaglandin D₂; PGD₂) 인 것인, 약학 조성물이다. According to a specific embodiment of the present invention, the inflammatory mediator is Eotaxin, vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), Leukotriene C ₄ (LTC ₄ ), or _{Prostaglandin} D ₂ ₂ ; PGD ₂ ) is a pharmaceutical composition.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 도라지발효물 정제분획을 유효성분으로 포함하는, 천식의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a food composition for preventing or improving asthma, comprising a purified fraction of fermented bellflower root as an active ingredient.

본 발명에서 식품 조성물이란, 천식의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물로 다양하게 이용되는 것으로서, 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연식품인 도라지 및 이의 생물전환된 발효물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 100%의 비율로 첨가할 수 있다. 여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 100 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In the present invention, the food composition refers to a food composition that is used in various ways to prevent or improve asthma. The food composition containing the composition of the present invention as an active ingredient is used in various foods, such as beverages, gum, tea, and vitamins. It can be manufactured in the form of complex preparations, powders, granules, tablets, capsules, cookies, rice cakes, bread, etc. The food composition of the present invention is composed of bellflower root, a natural food with little toxicity and side effects, and its bioconverted fermented product, so it can be safely used even when taken for a long period of time for preventive purposes. When the composition of the present invention is included in a food composition, it can be added in an amount of 0.1 to 100% of the total weight. Here, when the food composition is manufactured in the form of a beverage, there are no particular limitations other than containing the food composition in the indicated ratio, and various flavoring agents or natural carbohydrates can be contained as additional ingredients like ordinary beverages. That is, natural carbohydrates include common sugars such as monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, polysaccharides such as sucrose, dextrin, and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. can do. Examples of the flavoring agent include natural flavoring agents (thaumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.). In addition, the present invention The food composition includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, It may contain stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. These components can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not so important, but 100 weight of the composition of the present invention It is generally selected in the range of 0.1 to 100 parts by weight per part.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정제분획은 고액분리분획, 수용성분획, 및 다당체분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 식품 조성물이다.According to a specific embodiment of the present invention, the purified fraction is a food composition selected from the group consisting of a solid-liquid separation fraction, a water-soluble fraction, and a polysaccharide fraction.

본 발명에서 상기 배양배지화는 도라지를 분말화하여 액상에서 도라지 분말을 가수분해효소로 처리한 후 살균하여 도라지 배지로 만드는 것일 수 있다. In the present invention, the culture medium may be made by pulverizing bellflower root, treating the bellflower root powder with a hydrolytic enzyme in a liquid phase, and then sterilizing it to make bellflower root medium.

본 발명에서 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나일 수 있다. In the present invention, the hydrolytic enzyme may be at least one of an amylase series hydrolytic enzyme and a cellulase series hydrolytic enzyme.

본 발명에서, 상기 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 또는 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물일 수 있다. In the present invention, the cellulose decomposing enzyme may be cellulase alone or may be a combination of one or more selected from the group consisting of cellulase, hemicellulase, pectinase, or glucanase.

본 발명에서 제공하는 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The composition provided by the present invention may be used in the form of a pharmaceutical composition, cosmetic composition, or food composition, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 생물전환된 도라지발효물 발효액에서 불용성 잔사를 제거하는 단계;According to another aspect of the present invention, the present invention includes the steps of (a) removing insoluble residues from the fermented broth of bioconverted bellflower root;

(b) 상기 (a)단계의 발효액에서 지방구를 제거하는 단계; 및(b) removing fat globules from the fermentation broth of step (a); and

(c) 상기 (b)단계의 발효액에서 고분자성 다당체를 제외한 저분자성 불순물을 추가로 정제하는 단계;를 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.(c) further purifying low-molecular-weight impurities excluding high-molecular-weight polysaccharides from the fermentation broth of step (b); providing a method for producing a pharmaceutical composition for preventing or treating asthma, including the step.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계는 고액분리분획(PG-F-S)을 수득하는 것인, 제조방법이다. According to a specific embodiment of the present invention, step (a) is a production method for obtaining a solid-liquid separation fraction (PG-F-S).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 수용성분획(PG-F-W)을 수득하는 것인, 제조방법이다.According to a specific embodiment of the present invention, step (b) is a production method for obtaining a water-soluble fraction (PG-F-W).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 남은 발효액에서 유기용매로 지방구(지용성 불순물)를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법이다.According to a specific embodiment of the present invention, step (b) is a production method that further includes the step of removing fat globules (fat-soluble impurities) from the remaining fermentation broth with an organic solvent.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계는 다당체분획(PG-F-P)을 수득하는 것인, 제조방법이다.According to a specific embodiment of the present invention, step (c) is a production method for obtaining a polysaccharide fraction (PG-F-P).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계에서의 저분자 불순물은 300,000 da이하의 물질인 것인, 제조방법이다.According to a specific embodiment of the present invention, the low-molecular-weight impurity in step (c) is a material of 300,000 da or less.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 에탄올 침전법 및 한외여과(Ultrafiltration)를 이용하는 것인, 제조방법이다.According to a specific embodiment of the present invention, the purifying step is a production method using ethanol precipitation and ultrafiltration.

본 발명에 따르면, 한외여과(Ultrafiltration)는 압력 또는 농도 구배와 같은 힘이 반투막을 통해 분리되도록 하는 막 여과를 의미한다. 물과 저분자량의 용질이 투과막을 통과하는 동안 고분자량의 용질은 투과막을 통과하지 못하고 보유물에 유지된다. 이 분리공정은 거대분자 용액, 특히 단백질 용액의 정제 및 농축을 위한 산업 및 연구에 사용된다.According to the present invention, ultrafiltration refers to membrane filtration in which forces such as pressure or concentration gradient cause separation through a semipermeable membrane. While water and low molecular weight solutes pass through the permeable membrane, high molecular weight solutes do not pass through the permeable membrane and are retained in the retentate. This separation process is used in industry and research for purification and concentration of macromolecular solutions, especially protein solutions.

본 발명에 따르면, 생물전환공정에 의해 생산된 도라지발효물(PG-F)은 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 도라지발효물의 분말을 20배의 물에 녹인 용해액 또는 도라지발효물 발효액을 10,000rpm, 30분간 원심분리 또는 여과하여 불용성 잔사를 제거하여 고액분리분획(PG-F-S)으로 수득하거나, 고액분리분획 상등액을 동결 건조하여 고액분리분획 분말로 수득할 수 있으며, 혹은 고액분리분획에서 지방구를 제거하여 수용성분획(PG-F-W)으로 수득하거나, 수용성분획을 동결건조하여 수용성분획 분말로 수득할 수 있으며, 혹은 수용성분획에 5배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 동결건조하여 면역활성을 갖는 고분자성 조다당체분획의 분말을 수득하였다. 상기 조다당체분획은 이후, 한외여과(ultra filteration) 과정을 추가로 거쳐 다당체분획(PG-F-P)으로 정제하게 된다. 그 결과로, 고액분리분획(PG-F-S), 수용성분획(PG-F-W) 및 다당체분획(PG-F-P)을 수득하였다. 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S)은 생물전환된 도라지발효물(PG-F) 발효액에서 불용성 잔사를 제거하는 과정으로 수득되어지며, 도라지발효물 수용성분획(PG-F-W)은 지방구를 분산형태에서 유기용매로 제거하는 단계를 포함한다. 또한, 도라지발효물 다당체분획(PG-F-P)은 수용성분획(PG-F-W)의 정제과정 이후 추가로 에탄올 침전법 및 한외여과(ultrafilteration)를 이용하여 고분자성 다당체를 제외한 저분자성 불순물을 제거하는 과정을 추가로 포함하여 수득되어진다. According to the present invention, bellflower fermented product (PG-F) produced through a bioconversion process was subjected to an enzyme inactivation process and sterilization process at 90°C for 1 hour, then freeze-dried and powdered. In addition, the powder of the bellflower fermented product having the above-mentioned immune-activating effect was dissolved in 20 times the amount of water, or the bellflower fermented product was centrifuged or filtered at 10,000 rpm for 30 minutes to remove insoluble residues and converted into a solid-liquid fraction (PG-F-S). Alternatively, the solid-liquid separation supernatant can be freeze-dried to obtain solid-liquid separation powder, or fat globules can be removed from the solid-liquid separation fraction to obtain a water-soluble fraction (PG-F-W), or the water-soluble fraction can be freeze-dried to obtain a water-soluble fraction. It can be obtained as a powder, or by adding 5 times the amount of ethanol to the water-soluble fraction to induce precipitation at 4°C for more than 24 hours and freeze-drying the precipitate to obtain a powder of the high-molecular-weight crude polysaccharide fraction with immunoactivity. The crude polysaccharide fraction is then purified into a polysaccharide fraction (PG-F-P) through an additional ultra filtration process. As a result, a solid-liquid fraction (PG-F-S), a water-soluble fraction (PG-F-W), and a polysaccharide fraction (PG-F-P) were obtained. The bellflower fermented product solid-liquid fraction (PG-F-S) is obtained through the process of removing insoluble residues from the bioconverted bellflower fermented product (PG-F) fermentation broth, and the bellflower fermented water soluble fraction (PG-F-W) is obtained by removing fat globules. It includes a step of removal with an organic solvent in dispersed form. In addition, the bellflower fermented polysaccharide fraction (PG-F-P) is a process of removing low-molecular impurities excluding high-molecular polysaccharides using ethanol precipitation and ultrafiltration after the purification process of the water-soluble fraction (PG-F-W). It is obtained by additionally including.

본 발명에 따르면, 천식의 발병과 관련하여 ①알레르기를 유발하는 알레르기항원(외부항원)이 우리 몸에 들어와 항원특이 Th2세포의 활성화가 이루어지고, ②활성화된 Th2세포가 분비하는 사이토카인에 의해 B세포가 IgE 항체 생성 B세포로 전환되어 IgE 항체 생성이 유도되어 분비되면, ③분비된 IgE 항체가 비만세포(mast cell)와 결합하여 비만세포의 감작이 유도되고, ④이때 재차 외부에서 들어온 알레르기항원이 비만세포 표면에 결합된 IgE와 결합하면서 비만세포가 활성화되어 히스타민과 같은 여러가지 화학적 알레르기 매개물질을 분비하면서 알레르기 증상이 나타나게 된다.According to the present invention, in relation to the onset of asthma, ① allergens (external antigens) that cause allergies enter the body and activate antigen-specific Th2 cells, and ② B by cytokines secreted by activated Th2 cells. When cells are converted into IgE antibody-producing B cells and the production of IgE antibodies is induced and secreted, ③ the secreted IgE antibodies bind to mast cells, inducing sensitization of the mast cells, and ④ at this time, allergens introduced from outside again. When combined with IgE bound to the surface of these mast cells, the mast cells are activated and secrete various chemical allergy mediators such as histamine, causing allergy symptoms.

천식의 알레르기 반응은 초기반응과 후기반응으로 나눌 수 있다. 초기반응은 수분 내에 발생하며 비만세포로부터 histamine, β-hexoaminidase, serotonin과 같이 이미 생성되어 있는 매개물질과 새로 합성된 지방성분의 매개물질을 분비하고, 후기반응은 수시간 내에 발생하며 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13 등)을 합성 분비하여 염증반응을 지속시킨다. 비만세포에 의해 새롭게 생성된 지방성분의 매개물질과 사이토카인은 알레르기 급성 및 만성 염증반응을 유발하는 주요인자이다. ⑤T세포와 비만세포에서 분비된 IL-5 등에 의해 말초 및 조직에서 호산구의 침윤이 유도, 항진되면 호산구과다증이 유발되어 호산구성 염증이 발생하게 되는데 이를 호산구성 알레르기라고 부르며, 호산구과다증이 알레르기성 과민반응 유도에 직접적인 원인이 된다. 또한 IL-13은 항원 유발성 기도 과민성 발달에 중요한 역할을 한다.Allergic reactions in asthma can be divided into early reactions and late reactions. The initial reaction occurs within a few minutes, and mast cells secrete mediators already produced such as histamine, β-hexoaminidase, and serotonin, as well as mediators of newly synthesized lipid components. The later reaction occurs within several hours and produces cytokines (IL). -4, IL-5, IL-13, etc.) are synthesized and secreted to sustain the inflammatory response. Fat mediators and cytokines newly produced by mast cells are major factors that cause allergic acute and chronic inflammatory responses. ⑤ When the infiltration of eosinophils is induced and promoted in the periphery and tissues by IL-5 secreted from T cells and mast cells, hypereosinophilia is induced and eosinophilic inflammation occurs. This is called eosinophilic allergy, and hypereosinophilia is allergic hypersensitivity. It is directly responsible for inducing a reaction. Additionally, IL-13 plays an important role in the development of antigen-induced airway hyperresponsiveness.

이 중 천식의 알레르기반응에서 Th2 사이토카인이 분비되기까지의 과정을 더 자세히 설명하면 7단계로 나눌 수가 있다. Among these, if we explain in more detail the process from the allergic reaction of asthma to the secretion of Th2 cytokines, it can be divided into seven stages.

본 발명에 따르면, 천식에 있어서 알레르겐이나 바이러스 등에 의한 공격은 ①기관지의 상피세포, 섬유아세포, 비만세포에서 TSLP를 생성하고(1단계), ②TSLP는 미성숙 수지상세포를 활성화시키고(2단계), ③TSLP에 의해 활성화된 미성숙 수지상세포는 케모카인 IL-8과 에오탁신-2를 분비하고 이것이 호산구와 호중구를 끌어들일 뿐만 아니라, 또한 TARC(thymus and activation-regulated chemokine)와 MDC(macrophage-derived chemokine)를 분비하여 Th2세포들을 끌어들인다(3단계). ④TSLP에 의해 활성화된 골수계수지상세포(mDC)는 성숙해지고, TSLP에 의해 활성화된 성숙 수지상세포는 OX40L을 표면에 발현하고 림프절로 이동하게 된다(4단계). ⑤림프절에서 성숙 수지상세포는 항원에 특이적인 naive CD4⁺T세포가 염증성 Th2세포가 되도록 촉진시킨다. Th2세포들은 IL-4, IL-5, IL-13 과 TNF를 생산하지만 IL-10을 생산하지는 않는다(5단계). ⑥염증부위에서는 TARC와 MDC가 생성되기 때문에 염증성 Th2세포는 림프절에서 염증이 일어나는 곳으로 이동하게 된다(6단계). ⑦병변부위(염증부위)로 이동한 염증성 Th2세포에 의해서 병변부위에서는 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13과 TNF가 생성되며, 이 사이토카인은 IgE 생성과 호산구 증가와 점액물질의 생성과 섬유아세포의 증식을 촉진한다(7단계).According to the present invention, in asthma, attacks by allergens, viruses, etc. ① produce TSLP in bronchial epithelial cells, fibroblasts, and mast cells (step 1), ② TSLP activates immature dendritic cells (step 2), and ③ TSLP Immature dendritic cells activated by secrete the chemokines IL-8 and eotaxin-2, which not only attract eosinophils and neutrophils, but also secrete TARC (thymus and activation-regulated chemokine) and MDC (macrophage-derived chemokine). Attract Th2 cells (step 3). ④Myeloid dendritic cells (mDC) activated by TSLP mature, and mature dendritic cells activated by TSLP express OX40L on their surface and migrate to the lymph nodes (step 4). ⑤ In the lymph nodes, mature dendritic cells promote antigen-specific naïve CD4 ⁺ T cells to become inflammatory Th2 cells. Th2 cells produce IL-4, IL-5, IL-13, and TNF, but do not produce IL-10 (stage 5). ⑥Because TARC and MDC are produced at the site of inflammation, inflammatory Th2 cells move from the lymph nodes to the area where inflammation occurs (step 6). ⑦Th2 cytokines IL-4, IL-5, IL-13, and TNF are produced at the lesion site by inflammatory Th2 cells that migrate to the lesion site (inflammation site), and these cytokines produce IgE, increase eosinophils, and mucus. Promotes the production of substances and the proliferation of fibroblasts (step 7).

본 발명에 따르면, 알레르기질환의 근본적인 원인은 면역 불균형으로 알려져 있으며, 이는 다양한 생물학적 신호전달의 결과물이다. 천식에 있어서 이러한 비정상적 신호전달의 시작은 바로 기관지의 상피세포에서 분비되는 IL-25, IL-33, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin, 흉선기질상림포포이에틴) 등의 사이토카인으로, 이들 사이토카인은 ILC2 세포를 활성화시킨다. 또한 알레르겐이 몸에 침투되면 IL-25 및 IL-33은 T세포에 직접 작용하여 Th2세포로 분화시키며, TSLP는 수지상세포를 자극하여 Th2세포로 분화를 유도하는데, 이 과정에서 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13의 분비가 이루어져 Th2 면역반응에 의한 IgE 의존성 알레르기질환이 시작되게 된다. 또한 천식에 있어서 상피세포는 LPS 등에 의한 TLR 활성화를 통해 IL-1β, TNF-α 등의 염증성 사이토카인을 분비하여 주변 smooth muscle cells, fibroblast, mast cells, eosinophils, basophils 세포들의 CC 케모카인과 Th2 사이토카인의 생성 및 분비를 향상시켜 영향을 미친다.According to the present invention, the fundamental cause of allergic diseases is known to be immune imbalance, which is the result of various biological signaling. In asthma, the start of this abnormal signaling is cytokines such as IL-25, IL-33, and TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) secreted from bronchial epithelial cells. These cytokines are ILC2 Activates cells. Additionally, when an allergen penetrates the body, IL-25 and IL-33 act directly on T cells to differentiate them into Th2 cells, and TSLP stimulates dendritic cells to induce differentiation into Th2 cells. In this process, IL-25, a Th2 cytokine, is released. -4, IL-5, IL-9, and IL-13 are secreted, resulting in the onset of IgE-dependent allergic disease caused by a Th2 immune response. In addition, in asthma, epithelial cells secrete inflammatory cytokines such as IL-1β and TNF-α through TLR activation by LPS, etc., thereby increasing CC chemokines and Th2 cytokines in surrounding smooth muscle cells, fibroblasts, mast cells, eosinophils, and basophils cells. It has an effect by improving the production and secretion of

본 발명에 따르면, TSLP는 아토피피부염 발생에 중요한 역할을 담당하는 것으로 밝혀져 있으나, 천식의 발생에도 관여하는 것으로 밝혀진 사이토카인이다. TSLP는 IL-7 유사 사이토카인으로 흉선기질세포의 배양액에서 처음 발견되었다. TSLP는 신체와 환경의 경계면(피부, 호흡기, 소화기, 안구 등)에서 면역반응을 조절하는 중요 인자로써 피부 각질형성세포 및 기관지 상피세포에서 주로 분비된다. 최근 연구에 따르면, 피부 각질형성세포와 기관지 상피세포 외에도 비만세포(mast cells), 기도평활근(airway smooth muscle), 섬유아세포(fibroblasts) 등에서도 TSLP가 분비되어 면역반응을 조절하고, 과발현될 경우 면역 불균형을 일으킨다고 알려졌다.According to the present invention, TSLP is a cytokine that has been shown to play an important role in the development of atopic dermatitis, but is also involved in the development of asthma. TSLP is an IL-7-like cytokine that was first discovered in cultures of thymic stromal cells. TSLP is an important factor that regulates immune responses at the interface between the body and the environment (skin, respiratory system, digestive system, eyes, etc.) and is mainly secreted by skin keratinocytes and bronchial epithelial cells. According to a recent study, in addition to skin keratinocytes and bronchial epithelial cells, TSLP is also secreted by mast cells, airway smooth muscle, and fibroblasts to regulate immune responses, and when overexpressed, TSLP increases immunity. It is known to cause imbalance.

최근 연구된 문헌에 의하면 TSLP 단백질 및 mRNA가 알레르기질환 환자의 병소에서 증가되어 있는 것이 발견되었으며, 천식환자 기관지 세척액에서 TSLP가 검출되었으며, 질병의 심각성과 기도 표피세포에서의 TSLP 발현 증가 사이에 상관관계가 있음이 보고되었고, 피부세포에서 분비된 TSLP 때문에 항원 노출 시 알레르기성 염증반응이 심화되고 천식 발병이 촉진되는 것이 밝혀졌다. 또한 피부에서 TSLP 발현을 증가시킨 동물모델(마우스)와 인간에서 심각한 알레르기성 질환을 나타내었다.According to recent literature, TSLP protein and mRNA were found to be increased in the lesions of allergic disease patients, TSLP was detected in the bronchial lavage fluid of asthma patients, and there was a correlation between the severity of the disease and increased TSLP expression in airway epithelial cells. It has been reported that TSLP secreted from skin cells intensifies allergic inflammatory reactions and promotes the development of asthma when exposed to antigens. In addition, serious allergic diseases were shown in animal models (mice) and humans with increased TSLP expression in the skin.

TSLP 분비를 촉진시키는 원인으로는 천식에 있어서 단백질분해효소 활성 항원(protease allergen)과 이외에도 바이러스(virus), 박테리아 및 박테리아 부산물(bacteria and bacterial products), 염증성 사이토카인, 화학물질 등이 있으며, 과발현 될 경우 면역 불균형을 일으키게 된다. 면역 불균형을 일으키는 기전은 하기 서술하는 바와 같다. TSLP 수용체(TSLPR)는 주로 조혈세포에 발현되어 있으며, 수지상세포(dendritic cells, DC)에 가장 많이 발현되어 있다. 수지상세포의 생존 시간은 TSLP 때문에 증가하게 되고, 이로 인해 제II급 주조직적합복합체분자(major histocompatibility complex II) 및 공자극분자인 CD86과 CD40의 발현이 증가하며, Th2 CD4+T 세포와 나이브(naive) CD4+T 세포 유입을 증가시키는 CCL17(TARC)과 CCL22(MDC) 분비 또한 증가하게 된다. 더욱이 Th2 분화를 증가시키는 OX40L 발현이 증가하고, Th1 분화에 관여하는 IL-12 발현이 감소하게 되어, TSLP는 결과적으로 수지상세포가 Th2 반응을 유도하는 과정을 촉진한다. 더불어 TSLP는 호산구, 비만세포, 자연살해 T 세포의 유입 및 IL-13과 같은 사이토카인 분비를 촉진시켜 면역 불균형을 심화시킨다.Causes that promote TSLP secretion include protease allergens in asthma, viruses, bacteria and bacterial products, inflammatory cytokines, and chemicals, and may be overexpressed. In this case, it causes immune imbalance. The mechanism causing immune imbalance is as described below. TSLP receptor (TSLPR) is mainly expressed in hematopoietic cells, and is most abundant in dendritic cells (DC). The survival time of dendritic cells increases due to TSLP, which increases the expression of class II major histocompatibility complex II and costimulatory molecules CD86 and CD40, and increases the number of Th2 CD4 + T cells and naïve ( The secretion of CCL17 (TARC) and CCL22 (MDC), which increase the influx of naive) CD4 + T cells, also increases. Moreover, the expression of OX40L, which increases Th2 differentiation, increases, and the expression of IL-12, which is involved in Th1 differentiation, decreases. As a result, TSLP promotes the process by which dendritic cells induce a Th2 response. In addition, TSLP deepens immune imbalance by promoting the influx of eosinophils, mast cells, and natural killer T cells and the secretion of cytokines such as IL-13.

본 발명에 따르면, TSLP은 천식에 있어서 주로 기도 및 비점막의 상피세포에서 만들어지며 미성숙 골수계수지상세포(mDC)를 자극하는데, 이때 상기의 미성숙 수지상세포가 성숙 수지상세포로 되기 위해 heterodimeric TSLP receptor(수용체)를 발현한다. TSLP-activated 수지상세포는 naive CD4+ T cells를 Th2 표현형으로 분화시키고, Th2 chemotactic cytokine인 CCL17(TARC) 및 CCL22(MDC)와 함께 costimulatory molecule인 OX40 ligand를 발현하여 Th2 기억세포의 증식을 촉진시킨다. 뿐만 아니라 TSLP는 수지상세포에 발현되는 IL-12 p40 수용체를 억제하고, Th1 면역반응을 억제하여 더욱 더 Th2 면역반응을 촉진한다. TSLP는 Th2 세포에서의 IL-4 유전자의 전사를 활성화시키고, 비만세포에서 IL-13의 생성을 촉진시키며, 호염구의 반응을 증대시켜 호산구를 침윤시킴으로써 알레르기 염증반응을 악화시킨다. TSLP는 천식환자의 기도에 매우 높은 수준으로 발현되고, 발현 정도는 질병의 중증도 및 CCL17의 발현과 관련되어 있다. 또한, TSLP는 알레르기비염 환자 및 아토피피부염 환자의 상피세포에서 발현된다. 마우스에서 피부 각질형성세포에서의 TSLP 과발현은 감작된 흡입항원에 대한 염증반응을 증폭시키므로, 어린이에서 아토피피부염이 천식으로 이어진다는 점에서 알레르기 행진의 기전을 제공한다.According to the present invention, TSLP is mainly produced in epithelial cells of the respiratory tract and nasal mucosa in asthma and stimulates immature myeloid dendritic cells (mDC). In this case, the immature dendritic cells use the heterodimeric TSLP receptor to become mature dendritic cells. ) is expressed. TSLP-activated dendritic cells differentiate naive CD4+ T cells into a Th2 phenotype and promote the proliferation of Th2 memory cells by expressing the costimulatory molecule OX40 ligand along with the Th2 chemotactic cytokines CCL17 (TARC) and CCL22 (MDC). In addition, TSLP inhibits the IL-12 p40 receptor expressed on dendritic cells, suppresses the Th1 immune response, and further promotes the Th2 immune response. TSLP activates the transcription of the IL-4 gene in Th2 cells, promotes the production of IL-13 in mast cells, and worsens the allergic inflammatory response by increasing the response of basophils and infiltrating eosinophils. TSLP is expressed at very high levels in the airways of asthma patients, and its expression level is related to disease severity and CCL17 expression. Additionally, TSLP is expressed in epithelial cells of patients with allergic rhinitis and atopic dermatitis. Overexpression of TSLP in skin keratinocytes in mice amplifies the inflammatory response to sensitized inhalant antigens, providing a mechanism for the allergic march in that atopic dermatitis leads to asthma in children.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 목적은 도라지발효물 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.(a) The object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of asthma containing a purified fraction of fermented bellflower root as an active ingredient.

(b) 본 발명은 장기간 약물복용으로 인한 면역능 저하, 감염, 혈압 상승, 골다공증 또는 위궤양 같은 부작용을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 도라지발효물을 정제 가공하여 도라지발효물 정제분획을 수득하여 이용함으로써, 스테로이드계 약물의 부작용을 해소하고, 천식의 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.(b) The present invention has been studied diligently to overcome side effects such as decreased immune function, infection, increased blood pressure, osteoporosis, or gastric ulcer caused by long-term drug use. By refining and processing the fermented bellflower root to obtain and use a purified fraction of the fermented bellflower root, the side effects of steroid drugs can be eliminated and it can be usefully used as a composition for the treatment and prevention of asthma.

도 1은 도라지발효물의 정제공정도이다.
도 2는 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능을 비교하기 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 나타내는 그래프이다.
도 3은 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능을 확인하기 위하여 대식세포주인 MH-S 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 나타내는 그래프이다.
도 4는 사람 유래 B세포주인 U266.B1 세포를 이용하여 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 IgE 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 5는 Rat 유래 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 탈과립 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 천식 억제 활성을 평가하기 위하여 ovalbumin과 aluminium hydroxide에 의해 유발된 천식 마우스모델을 제작하는 스케줄을 나타내는 모식도이다.
도 7은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 기관지폐포세척액(BALF) 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 BALF 내 총 면역세포의 수 및 세포 population에 미치는 효과를 평가한 그래프이다.
도 9는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인한 그래프이다.
도 10은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13)의 양을 측정한 그래프이다.
도 11은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 사이토카인(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정한 그래프이다.
도 12는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF와 혈액을 회수한 후 BALF 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 15는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포의 수 및 세포 population에 미치는 효과를 확인한 그래프이다.
도 16은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인한 그래프이다.
도 17은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13) 생성 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 18은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 cytokines(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 생성 회복 효과를 평가한 그래프이다.
도 19는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TSLP의 양을 측정하여 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.
도 20은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 염증매개물질(Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD₂)의 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.
도 21은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.Figure 1 is a purification process diagram of fermented bellflower root.
Figure 2 shows the innate immune activity efficacy of bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder of PG-F (solid-liquid fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) in RAW264.7 cells, a macrophage cell line. This is a graph showing the cytokine secretion ability and secretion pattern.
Figure 3 shows the innate immune activation efficacy of bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder of PG-F (solid-liquid fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) in MH-S cells, a macrophage cell line. This is a graph showing the cytokine secretion ability and secretion pattern.
Figure 4 shows IgE by treatment of bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder of PG-F (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) using U266.B1 cells, a human-derived B cell line. This is a graph measuring the production inhibition ability.
Figure 5 shows the degranulation inhibition effect of treatment with bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder of PG-F (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) in RBL-2H3 cells, a rat-derived mast cell line. This is a graph representing .
Figure 6 is a schematic diagram showing a schedule for producing an asthma mouse model induced by ovalbumin and aluminum hydroxide to evaluate asthma suppressing activity.
Figure 7 shows bronchoalveolar lavage fluid ( This is a graph showing the effect of suppressing immunoglobulin production in BALF) and serum.
Figure 8 shows total immunity in BALF after feeding bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph evaluating the number of cells and the effect on the cell population.
Figure 9 shows lung tissue sacrificed after feeding raw bellflower root, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph confirming my inflammation-relieving effect.
Figure 10 shows BALF obtained by feeding raw bellflower root, bellflower fermented powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F in an asthma mouse model induced by OVA and then sacrificing the diet. This is a graph measuring the amount of Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) present in BALF after recovery.
Figure 11 shows the blood of bellflower root, bellflower fermented powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F in an OVA-induced asthma mouse model, then sacrificed. This is a graph measuring the amount of Th1 cytokines (IL-2, IL-12) and IL-10 present in serum after recovery.
Figure 12 shows BALF obtained by feeding raw bellflower root, bellflower fermented powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F in an asthma mouse model induced by OVA and then sacrificing the diet. This is a graph showing the effect of suppressing the production of inflammatory mediators in BALF after recovery.
Figure 13 shows BALF obtained by feeding raw bellflower root, bellflower fermented powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F in an asthma mouse model induced by OVA and then sacrificing the diet. This is a graph showing the effect of suppressing the production of inflammatory cytokines and chemokines present in BALF after recovery.
Figure 14 shows BALF and blood recovered by sacrificing diets with different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph measuring the effect of suppressing immunoglobulin production in BALF and serum.
Figure 15 shows BALF recovered by sacrificing the diet with different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph confirming the total number of immune cells and the effect on the cell population.
Figure 16 shows the relief of inflammation in lung tissue by feeding different doses of bellflower fermented solid-liquid fraction (PG-FS) powder to confirm the concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA and then sacrificing it. This is a graph confirming the effect.
Figure 17 shows BALF recovered by sacrificing the diet with different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA. This graph confirms the effect of suppressing the production of Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) present in BALF.
Figure 18 is a mouse model of asthma induced by OVA, in order to confirm the concentration (dose) dependence, after feeding different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder and then sacrificing and collecting blood. This is a graph evaluating the recovery effect of the production of Th1 cytokines (IL-2, IL-12) and IL-10 present in serum.
Figure 19 shows BALF recovered by sacrificing the diet with different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph that evaluates the effect of suppressing production by measuring the amount of TSLP present in BALF.
Figure 20 shows BALF recovered by sacrificing the diet at different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph evaluating the effect of suppressing the production of inflammatory mediators (Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD ₂ ) present in BALF.
Figure 21 shows BALF recovered by sacrificing the diet at different doses of bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-FS) powder to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA. This is a graph evaluating the effect of suppressing the production of inflammatory cytokines and chemokines present in BALF.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예1. 발효 및 효소 처리의 생물전환공정Example 1. Bioconversion process of fermentation and enzyme treatment

실시예1-1. 도라지 전처리 및 도라지 수득 작업Example 1-1. Bellflower pretreatment and balloon harvest work

구입한 도라지의 원물로부터 분말화하기까지의 전처리 작업을 위하여 원재료 상태의 곰팡이 오염도를 측정한 후, 도라지 원재료의 이물 및 오염물 제거를 위한 수세작업을 하였다. 수세작업은 총3단계를 거쳐 수행하였으며 ①이물 및 곰팡이 포자를 제거하기 위한 공기 세척 단계, ②잔류 농약 등의 제거를 위한 물 세척 단계, ③미생물 등의 오염을 제거하기 위한 알코올(Et-OH) 세척 단계를 통해 원재료의 수세작업을 수행하였다. 수세 및 절단작업을 마친 원재료는 대량건조가 가능한 열풍건조기에서 건조작업을 수행한 후 조분쇄 및 미분쇄 공정을 거쳐 도라지 원재료의 분말화 작업을 수행하였다.In order to preprocess the purchased bellflower root from raw material to powder, the degree of mold contamination of the raw material was measured, and then water washing was performed to remove foreign substances and contaminants from the raw bellflower root material. The washing process was carried out in three stages: ① an air washing step to remove foreign substances and mold spores, ② a water washing step to remove residual pesticides, etc., and ③ alcohol (Et-OH) to remove contamination such as microorganisms. The raw materials were washed with water through the washing step. After washing and cutting, the raw materials were dried in a hot air dryer capable of mass drying, and then went through coarse grinding and fine grinding processes to powder the bellflower root materials.

실시예1-2. 도라지발효물(PG-F) 수득Example 1-2. Obtain bellflower fermented product (PG-F)

이물 및 곰팡이 오염을 제거한 도라지분말은 액상 배양배지화를 위해 20배수의 물을 첨가한 후 효소 처리 및 열처리 살균공정을 수행하였다. 아밀라아제(amylase) 계열의 가수분해효소를 사용하였고, 상기 효소를 첨가 후 60℃에서1시간 반응시키고, 고온에서 30분간 살균 처리하여 도라지의 배양(발효)배지화를 수행하였다. 이 때, 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있으며 이 경우 제품설명서에서 제시하는 적정량 및 적정 조건(pH, 온도)에서 실시하였다.The bellflower root powder from which foreign substances and mold contamination were removed was subjected to enzyme treatment and heat treatment sterilization processes after adding 20 times the amount of water to convert it into a liquid culture medium. A hydrolytic enzyme of the amylase series was used, and after adding the enzyme, it was reacted at 60°C for 1 hour and sterilized at high temperature for 30 minutes to transform bellflower root into a culture (fermentation) medium. At this time, commercially available enzyme products can be used, and in this case, the test was conducted at the appropriate amount and under appropriate conditions (pH, temperature) suggested in the product instructions.

이후, 상기 배양(발효)배지에 별도로 배양한 담자균류 균사 중 표고버섯균사를 첨가하였다. 생물전환공정의 발효공정은 담자균류 균사 종균배양액을 10%(v/v) 접종하고 28 내지 30 ℃ 및 pH 4.5 내지 7의 조건에서 3 내지 5일간 배양하여 발효물을 수득하였다. 상기의 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으나 표고버섯균사가 바람직하며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 또한, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양 받아 사용할 수 있다.Afterwards, shiitake mushroom hyphae among the separately cultured basidiomycete hyphae were added to the culture (fermentation) medium. In the fermentation process of the bioconversion process, 10% (v/v) of basidiomycete mycelial seed culture was inoculated and cultured for 3 to 5 days under conditions of 28 to 30 ° C and pH 4.5 to 7 to obtain a fermented product. The above basidiomycete mycelium can be used by selecting any one from the medicinal and edible basidiomycetes, such as shiitake mushroom, saenghang mushroom, chaga mushroom, maitake mushroom, wood ear mushroom, snowflake mushroom, and skirt mushroom. is preferable, and the effect was confirmed to be the same. In addition, these Basidiomycete hyphae are collected from the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM), Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Life Resources Center (KCTC), Korea Cell Line Bank (KCLB), Korea Agricultural Microbial Resource Center (KACC), and the American Standard Strain Culture Collection Center ( Strains can be purchased and used from organizations such as ATCC).

상기 발효물에 대한 생물전환공정의 효소처리는 섬유소분해효소 중 셀룰라아제를 사용하였다. 이때, 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소제가 함께 포함된 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있다. 이 경우, 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량)을 첨가하여 실시하였다. 효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소분해효소인 라미넥스(Laminex:Tricoderma reesei 유래 복합물), 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물) 등의 섬유소분해효소에서 어느 하나 또는 복수를 선택하여 사용할 수 있으나 라미넥스가 바람직하며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 라미넥스 효소제의 제품설명서에서 제시하는 추천 농도(0.05%)로 첨가하고, 50 내지 60 ℃조건에서1 내지 3시간 동안 250 rpm으로 회전시키며 효소/기질반응을 수행하였다. 생물전환공정에 의해 생산된 도라지-F(도라지발효물)는 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거치고 동결건조하여 PG-F(도라지발효분말)을 최종 수득하였다.For the enzyme treatment of the bioconversion process for the fermented product, cellulase, one of the cellulolytic enzymes, was used. At this time, cellulase can be used alone, or commercially available enzyme products containing various enzymes such as cellulase, hemicellulase, pectinase, and glucanase can be used. You can. In this case, it was carried out by adding an appropriate amount (the optimal amount presented in the product instructions for each enzyme). Enzymes that are sold commercially include the fibrinolytic enzyme Laminex (complex derived from Tricoderma reesei), Viscozyme (complex derived from Aspergillus), Cellulase (complex derived from Aspergillus niger), and Filtrase (complex derived from Aspergillus niger). One or more of the fibrinolytic enzymes can be selected and used, such as Rapidase (a complex derived from Tricoderma reesei), Rapidase (a complex derived from Aspergillus niger), and Sumizyme (a complex containing pectinase derived from Aspergillus niger). It was confirmed that NEX is preferable and that the effect is the same. The recommended concentration (0.05%) suggested in the product description of the Laminex enzyme was added, and the enzyme/substrate reaction was performed by rotating at 250 rpm for 1 to 3 hours at 50 to 60°C. Bellflower-F (bellflower-fermented product) produced through the bioconversion process was subjected to enzyme inactivation and sterilization at 90°C for 1 hour and freeze-dried to finally obtain PG-F (bellflower-fermented powder).

실시예1-3. 도라지발효물의 순차적 정제에 따른 정제분획의 정제 방법Example 1-3. Method for purifying purified fractions based on sequential purification of fermented bellflower root

발효 및 효소처리의 생물전환공정에 의해 생산된 도라지발효물은 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 도라지발효물의 분말을 20배의 물에 녹인 용해액 또는 도라지발효물 발효액을 원심분리를 이용하거나 여과망을 통과시켜 불용성 잔사를 제거하여 고액분리분획(PG-F-S)으로 수득하거나 고액분리분획 상등액을 동결 건조하여 고액분리분획 분말로 수득할 수 있으며, 고액분리분획에서 지방구를 제거하여 수용성분획(PG-F-W)으로 수득하거나 수용성분획 상등액을 동결건조하여 수용성분획 분말로 수득할 수 있으며. 또한 수용성분획에 5배의 에탄올을 첨가하여4℃에서24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 회수하여 고면역활성을 갖는 고분자성 조다당체분획을 수득할 수 있으며, 조다당체분획은 이후, 한외여과(ultra-filtration) 과정을 추가로 거친 후 동결건조하여 고순도 다당체분획의 분말을 수득할 수 있으며, 상기 다당체분획은 생물전환된 산물을 의미하며, 도라지발효물 다당체분획(PG-F-P)이다. 상기 도라지발효물의 정제공정도는 도 1에 나타내었다.The fermented bellflower root product produced through the bioconversion process of fermentation and enzyme treatment was subjected to an enzyme inactivation process and sterilization process at 90°C for 1 hour, then freeze-dried and powdered. In addition, the powder of the bellflower fermented product having the above-mentioned immune-activating effect was dissolved in 20 times the amount of water or the bellflower fermented product was centrifuged or passed through a filter to remove insoluble residues to obtain a solid-liquid fraction (PG-F-S). Alternatively, the solid-liquid fraction supernatant can be freeze-dried to obtain a solid-liquid fraction powder, and fat globules can be removed from the solid-liquid fraction to obtain a water-soluble fraction (PG-F-W), or the water-soluble fraction supernatant can be freeze-dried to obtain a water-soluble fraction powder. You can do it. In addition, 5 times the amount of ethanol is added to the water-soluble fraction to induce precipitation at 4°C for more than 24 hours, and the precipitate is recovered to obtain a high-molecular-weight crude polysaccharide fraction with high immune activity. The crude polysaccharide fraction is then subjected to ultrafiltration ( After an additional ultra-filtration process, it is possible to obtain a powder of high-purity polysaccharide fraction by freeze-drying. The polysaccharide fraction refers to a bioconversion product and is bellflower fermented product polysaccharide fraction (PG-F-P). The purification process of the fermented balloon flower product is shown in Figure 1.

이하, 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S), 도라지발효물 수용성분획(PG-F-W), 및 도라지발효물 다당체분획(PG-F-P)의 수득 방법에 대해 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the method for obtaining the bellflower fermented product solid-liquid fraction (PG-F-S), bellflower fermented product water-soluble fraction (PG-F-W), and bellflower fermented product polysaccharide fraction (PG-F-P) will be described in detail.

실시예1-3-1. 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 수득Example 1-3-1. Obtaining bellflower fermented solid-liquid fraction (PG-F-S)

상기 실시예 1-2에서 수득한 PG-F에 포함된 불용성 잔사를 제거하기 위해 여과 또는 원심분리 공정을 수행하였다. 즉, 불용성 잔사의 제거에 60 mesh 및 200 mesh의 공극 크기를 지닌 여과망을 통과시키거나 10,000 rpm, 30분간 원심분리하여 불용성 잔사를 제거하였다. 소규모 생산에서는 원심분리공정이 편하나, 대규모 생산에서는 여과망을 사용하는 것이 바람직하다. 불용성 잔사가 제거된 여과액(또는 상등액)을 동결건조하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말을 수득하였다. A filtration or centrifugation process was performed to remove insoluble residues contained in the PG-F obtained in Example 1-2. That is, to remove the insoluble residue, the filter was passed through a filter net with pore sizes of 60 mesh and 200 mesh or centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes. In small-scale production, the centrifugation process is convenient, but in large-scale production, it is preferable to use a filter net. The filtrate (or supernatant) from which the insoluble residue was removed was freeze-dried to obtain fermented bellflower root solid-liquid fraction (PG-F-S) powder.

조금 더 상세하게는 도라지발효물 1 L를 60 mesh 및 200 mesh 여과망이 2단으로 적층된 습식진동체로 여과하여 그 상등액 0.75 L를 수득하고 동결건조하여 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 분말을 수득하였다.In more detail, 1 L of bellflower fermented product was filtered through a wet vibrating screen with two layers of 60 mesh and 200 mesh filter nets, and 0.75 L of the supernatant was obtained and freeze-dried to obtain bellflower fermented product solid-liquid separation fraction (PG-F-S) powder. was obtained.

실시예1-3-2. 도라지발효물 수용성분획(PG-F-W) 수득Example 1-3-2. Obtaining bellflower fermented water fraction (PG-F-W)

상기 도라지발효물 고액분리분획 상등액에 포함된 지방구(지용성 불순물)를 제거하기 위해 유기용매를 이용한 층분리 공정을 수행하였다. 상기의 유기용매는 헥세인(Hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메테인(Dichloromethane) 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으나, 디클로로메테인이 바람직하다. PG-F 또는 PG-F-S의 동일부피의 디클로로메테인 유기용매를 첨가하고, 30분간 50 ~ 150 rpm의 속도로 교반하여 지방구를 상분리 한다. 이후 지방구 상분리액을 8,000 ~ 12,000 g의 원심력으로 원심분리하여 지방구가 제거된 수용층을 수득한다. 이후 얻어진 원심분리 수용액층을 동결건조하여 도라지발효물 수용성분획(PG-F-W)분말을 수득하였다.A layer separation process using an organic solvent was performed to remove fat globules (fat-soluble impurities) contained in the supernatant of the solid-liquid separation fraction of the bellflower fermented product. The above organic solvent may be any one of hexane, ethyl acetate, chloroform, and dichloromethane, but dichloromethane is preferred. Add an equal volume of dichloromethane organic solvent of PG-F or PG-F-S, and stir at a speed of 50 to 150 rpm for 30 minutes to phase separate the fat globules. Thereafter, the fat sphere phase separation liquid is centrifuged at a centrifugal force of 8,000 to 12,000 g to obtain an aqueous layer from which the fat spheres have been removed. Afterwards, the obtained centrifuged aqueous solution layer was freeze-dried to obtain fermented balloon flower aqueous fraction (PG-F-W) powder.

조금 더 상세하게는 도라지발효물 고액분리분획(PG-F-S) 0.75 L에 디클로로메테인 0.75 L를 첨가하고, 격렬히 흔들어 혼합한 뒤 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 수용성분획 0.7 L를 수득하고 동결건조하여 도라지발효물 수용성분획(PG-F-W) 분말을 수득하였다.In more detail, 0.75 L of dichloromethane was added to 0.75 L of the bellflower fermented solid-liquid fraction (PG-F-S), shaken vigorously to mix, centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes to obtain 0.7 L of the water-soluble fraction, and freeze-dried. Thus, water-soluble fraction (PG-F-W) powder of fermented bellflower root was obtained.

실시예1-3-3. 도라지발효물 다당체분획(PG-F-P) 수득Example 1-3-3. Obtaining bellflower fermented product polysaccharide fraction (PG-F-P)

추가로 도라지발효물 수용성분획 상등액에 포함된 저분자 불순물을 제거하기 위해 에탄올침전법 및 한외여과를 수행하였다. 에탄올침전법은 도라지발효물 수용성분획부피의 4배에 해당하는 에탄올을 첨가하여 고분자성 다당체는 침전으로 분리하고, 침전이 이루어지지 않은 저분자성 불순물은 상등액으로 제거한다. 이때 생성된 침전물을 정제수에 녹인 뒤 만일에 남아있을 잔사를 10,000rpm, 30분간 원심분리를 통해 제거한다. 한외여과는 cut off 크기가 300,000 Da인 한외여과막을 이용하여 저분자성 불순물은 한외여과 통과액으로 제거하고, 고분자성 다당체는 농축한다. 이후 정제수를 가하여 일정한 부피를 유지시키면서 한외여과를 수행하였다. 얻어진 에탄올침전물 용해액 또는 한외여과 농축액을 동결건조하여 다당체분획(PG-F-P) 분말을 수득하였다. 이때 에탄올침전법 또는 한외여과를 하나만 수행할 수 있으나, 바람직하게는 두 가지 방법을 순차적으로 수행하여 순도를 더욱 높이는 것이 바람직하다. 소규모 생산에서는 에탄올침전법 후 한외여과를 수행하는 것이 편하나, 대규모 생산에서는 한외여과 후 에탄올침전법을 수행하는 것이 바람직하다. In addition, ethanol precipitation and ultrafiltration were performed to remove low-molecular-weight impurities contained in the supernatant of the aqueous fraction of fermented bellflower root. In the ethanol precipitation method, ethanol equivalent to 4 times the volume of the water-soluble fraction of the fermented bellflower root is added to separate the high-molecular polysaccharides through precipitation, and the low-molecular-weight impurities that did not precipitate are removed through the supernatant. At this time, the resulting precipitate is dissolved in purified water, and any remaining residue is removed by centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes. Ultrafiltration uses an ultrafiltration membrane with a cut-off size of 300,000 Da to remove low-molecular-weight impurities through the ultrafiltration liquid and concentrate high-molecular-weight polysaccharides. Afterwards, ultrafiltration was performed while maintaining a constant volume by adding purified water. The obtained ethanol precipitate solution or ultrafiltration concentrate was freeze-dried to obtain polysaccharide fraction (PG-F-P) powder. At this time, only ethanol precipitation or ultrafiltration can be performed, but it is preferable to perform both methods sequentially to further increase purity. In small-scale production, it is convenient to perform ethanol precipitation followed by ultrafiltration, but in large-scale production, it is preferable to perform ultrafiltration followed by ethanol precipitation.

조금 더 상세하게는 도라지발효물 수용성분획(PG-F-W) 0.7 L에 주정(95%) 2.8 L를 첨가하고, 냉장(4 ℃)에서 4시간 정치한 뒤 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 그 침전물을 회수한다. 얻어진 침전물을 3차 증류수 0.7 L에 녹이고 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 회수한다. 얻어진 상등액을 cut off 크기가 300,000 Da인 한외여과막에 흘리며 일정량의 통과액 부피만큼 3차증류수를 첨가하며, 한외여과를 진행한다. 이후 통과액에서 색소 등 불순물이 충분히 제거되면 한외여과를 종료하고 그 농축액(retentate)를 얻어 동결건조하여 도라지발효물 다당체분획(PG-F-P) 분말을 수득하였다.In more detail, 2.8 L of alcohol (95%) was added to 0.7 L of the fermented bellflower root soluble fraction (PG-F-W), left in the refrigerator (4°C) for 4 hours, and then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes to remove the precipitate. retrieve. The obtained precipitate was dissolved in 0.7 L of tertiary distilled water and centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes to recover the supernatant. The obtained supernatant is passed through an ultrafiltration membrane with a cut-off size of 300,000 Da, and tertiary distilled water is added for a certain volume of the flow-through liquid, followed by ultrafiltration. Afterwards, when impurities such as pigments were sufficiently removed from the passage liquid, ultrafiltration was completed, and the concentrate (retentate) was obtained and freeze-dried to obtain bellflower fermented polysaccharide fraction (PG-F-P) powder.

실시예 2. 도라지발효분말 정제분획의 체외(in vitro) 효능 평가Example 2. In vitro efficacy evaluation of purified fraction of bellflower root fermented powder

세포배양cell culture

실험에 사용한 RAW264.7, MH-S 세포주는 ATCC (Manassas, VA)에서 구입하였다. DMEM, RPMI1640, IMDM 배지는 웰진(Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 사용하였고, fetal bovine serum (FBS) 및 배지에 첨가하는 항생물질은 모두 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)에서 구입하여 사용하였으며, 5% CO₂를 함유하는 37℃ 포화습도 공기조건에서 배양하였다. RAW264.7 and MH-S cell lines used in the experiment were purchased from ATCC (Manassas, VA). DMEM, RPMI1640, and IMDM media were purchased from Welgene (Gyeongsan, Korea), and fetal bovine serum (FBS) and antibiotics added to the media were all purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). 5% Cultured under saturated humidity air conditions at 37°C containing CO ₂ .

대식세포주에서의 사이토카인 측정Cytokine measurements in macrophage cell lines

대식세포주인 RAW264.7세포 및 MH-S 세포를 24 웰 플레이트에 2x10⁵개 세포/웰로 접종한 뒤 하룻밤 배양하고, 각 시료를 농도에 맞게 희석하여 처리하였다. 16시간 뒤, 상층액을 회수하고 각각의 사이토카인 분석을 위해 상업적으로 판매되고 있는 ELISA(Enzyme linked immune solvent assay) assay 키트를 사용하여 분석을 수행하였다. Macrophage cell lines RAW264.7 cells and MH-S cells A 24-well plate was inoculated at 2x10 ⁵ cells/well, cultured overnight, and each sample was diluted and processed according to the concentration. 16 hours later, the supernatant was recovered and analyzed using a commercially available ELISA (Enzyme linked immune solvent assay) assay kit for each cytokine analysis.

결과 1. 대식세포주에서 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말의 사이토카인 생성량 측정을 통한 면역활성 유효성분(다당체) 확인Result 1. Confirmation of immune-active active ingredient (polysaccharide) through measurement of cytokine production of bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequential purified fraction powder of PG-F in macrophage cell line.

도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능 및 면역활성 유효성분 확인을 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포 및 폐포 대식세포주인 MH-S 세포에서 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 조사하였다. 사이토카인 분비패턴을 조사한 결과, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말 처리시 LPS와 동일하게 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 분비되고, LPS에 의해 분비되지 않는 사이토카인에 대해서는 동일하게 분비되지 않는 것을 확인하였다. LPS는 TLR4에 의해 인식되는 대표적인 리간드(ligand)로 잘 알려져 있는 바, 이를 통해 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말(고액분리분말, 수용성분획, 다당체분획)은 TLR4에 인식되어 신호를 매개하는 TLR4 agonist의 성분을 함유하고 있다고 유추할 수 있었다.To confirm the innate immune activation efficacy and immune-activating active ingredients of bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequentially purified fractional powders of PG-F (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction), macrophage cell line RAW264.7 cells and alveoli were used. Cytokine secretion ability and secretion pattern were investigated in MH-S cells, a macrophage cell line. As a result of examining the cytokine secretion pattern, when treating bellflower root fermentation powder (PG-F) and purified fraction powder of PG-F, TNF-α, IL-6, IL-10, and IFN-β were secreted in the same way as LPS, and LPS It was confirmed that cytokines not secreted by were not secreted equally. LPS is well known as a representative ligand recognized by TLR4, and through this, bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequentially purified fraction powders (solid-liquid separation powder, water-soluble fraction, polysaccharide fraction) of PG-F are TLR4 It could be inferred that it contains components of the TLR4 agonist that is recognized and mediates signaling.

또한 도라지 원물에서는 사이토카인 분비 효능이 매우 약하거나 거의 나타나지 않으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말에서 원물에 비해 대폭 향상된 사이토카인 분비 효능을 확인하였으며, 특히 유효성분의 농도가 같을 수 있도록 PG-F 대비 회수율을 고려하여 PG-F에 회수율을 곱한 농도로 처리하여 사이토카인 분비능을 확인하였다. PG-F 대비 고획분리분획, 수용성분획, 다당체분획의 회수율은 각각 47%, 31%, 4.7%이다. 그 결과, PG-F의 정제분획분말에서 PG-F와 동일하거나 오히려 높게 나타나 사이토카인 분비 효능은 모두 PG-F 유래의 다당체에 기인한 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.In addition, the cytokine secretion effect is very weak or almost non-existent in the raw bellflower root, but significantly improved cytokine secretion efficacy was confirmed in the bellflower fermented powder produced through the bioconversion process compared to the raw material. In particular, PG was used to ensure that the concentration of the active ingredient was the same. Considering the recovery rate compared to -F, the cytokine secretion ability was confirmed by treating PG-F at a concentration multiplied by the recovery rate. Compared to PG-F, the recovery rates of the high fraction, water-soluble fraction, and polysaccharide fraction were 47%, 31%, and 4.7%, respectively. As a result, the purified fraction powder of PG-F showed the same or even higher levels than PG-F, and it is believed that the cytokine secretion effect is all due to the polysaccharide derived from PG-F. The results are shown in Figures 2 and 3.

또한 4가지의 사이토카인 중 IFN-β는 type Ⅰ interferon으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며 Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로 Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 사이토카인이다. 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리 시 IFN-β의 분비를 유도함에 따라 Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 TLR4 agonist의 Th1 inducer로 판단된다.In addition, among the four cytokines, IFN-β is a type Ⅰ interferon and has antibacterial and antiviral effects. It is a representative cytokine that induces a Th1 immune response by contributing to the differentiation of Th1 cells, while Th2 and Th17 It is a cytokine with an immunomodulatory function that suppresses immune responses. When processing fermented bellflower root powder (PG-F) and purified fractions of PG-F (solid-liquid fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction), it induces the secretion of IFN-β, which can specifically activate the Th1 immune response. It is judged to be a Th1 inducer of TLR4 agonist.

결과 2. B세포주에서 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말의 IgE 생성 억제 효능 평가Result 2. Evaluation of the efficacy of bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequentially purified fractions of PG-F in inhibiting IgE production in B cell lines.

사람 유래 B세포주인 U266.B1 세포를 이용하여 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 IgE 생성능을 측정하였다. U266.B1 세포를 10 μg/mL의 LPS와 5 μg/mL의 IL-4로 72시간 자극하여 IgE 생성을 유도하였으며, 상기 시료를 함께 처리한 뒤 ELISA 방법을 이용하여 분비된 총 IgE의 양을 측정하였다. 그 결과, 도라지 원물에서는 IgE의 생성 억제 효과가 거의 나타나지 않으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였으며, 또한 PG-F의 정제분획분말에서는 순차적 정제가 진행될수록 IgE 생성 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말은 처리농도에 의존하여 IgE 생성 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. Th1 반응을 활성화시키는 물질의 경우 IgG로의 immunoglobulin isotype switching을 촉진시킨다고 알려져 있어, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말이 갖는 Th1 면역반응 활성화 효과에 의해 IgE 생성 억제 및 IgG 개별형 전환이 효과적으로 유도되어 천식 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 것이라 판단된다. 상기 결과는 도 4에 나타내었다.Using U266.B1 cells, a human-derived B cell line, through treatment of bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) following sequential purification of PG-F. IgE production ability was measured. U266.B1 cells were stimulated with 10 μg/mL of LPS and 5 μg/mL of IL-4 for 72 hours to induce IgE production. The samples were processed together and the total amount of secreted IgE was measured using ELISA. Measured. As a result, although the inhibitory effect of IgE production was almost non-existent in the raw bellflower root, significantly improved inhibitory activity was confirmed in the bellflower fermented powder (PG-F) produced through the bioconversion process compared to the raw material. In addition, the purified fraction of PG-F In the powder, it was confirmed that the IgE production inhibitory activity increased as sequential purification progressed. It was confirmed that the IgE production inhibitory activity of bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequentially purified fraction powders of PG-F increased depending on the treatment concentration. Substances that activate the Th1 response are known to promote immunoglobulin isotype switching to IgG, and the Th1 immune response activation effect of bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequentially purified fractions of PG-F inhibits IgE production and IgG. It is believed that individualized conversion can be effectively induced to effectively prevent and treat asthma disease. The results are shown in Figure 4.

결과 3. 비만세포주에서 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제분획분말의 탈과립 억제 효능 평가Result 3. Evaluation of the degranulation inhibition efficacy of bellflower root fermentation powder (PG-F) and sequentially purified fractions of PG-F in mast cell lines.

Rat 유래 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 탈과립 억제 효과를 측정하였다. RBL-2H3 세포를 10 μM의 A23187로 20분간 자극한 후 방출 과립 내 존재하는 β-hexosaminidase의 활성을 측정하여 탈과립의 정도를 평가하였으며, 대조군 대비 억제율로 환산하여 표기하였다. 그 결과, 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F)에서는 처리농도에 의존하여 탈과립 억제 효과를 확인하였으나 PG-F의 정제분획분말에서는 순차적 정제가 진행될수록 탈과립 억제 효과가 소멸되어 탈과립 억제 효과는 다당체에 기인한 것이 아님을 확인하였다. PG-F-S의 처리에 의해 β-hexosaminidase 활성이 감소함을 확인하여 비만세포에서의 탈과립 억제 효과를 확인하였으므로, 천식 질환을 예방 및 치료할 수 있을 것이라 판단된다. 상기 결과는 도 5에 나타내었다.Inhibition of degranulation in RBL-2H3 cells, a rat-derived mast cell line, by treatment with bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) following sequential purification of PG-F. The effect was measured. After RBL-2H3 cells were stimulated with 10 μM of A23187 for 20 minutes, the degree of degranulation was evaluated by measuring the activity of β-hexosaminidase present in the release granules, which was converted to the inhibition rate compared to the control group and expressed. As a result, the degranulation inhibition effect was confirmed in the bellflower raw material and bellflower root fermentation powder (PG-F) depending on the treatment concentration, but in the purified fraction powder of PG-F, the degranulation inhibition effect disappeared as sequential purification progressed, and the degranulation inhibition effect was confirmed by polysaccharide. It was confirmed that it was not caused by . Since treatment with PG-F-S confirmed a decrease in β-hexosaminidase activity and confirmed an inhibitory effect on degranulation in mast cells, it is believed that asthma disease can be prevented and treated. The results are shown in Figure 5.

실시예 3. 천식 모델에서 도라지발효물 정제분획의 체내(in vivo) 효능 평가Example 3. In vivo efficacy evaluation of purified fractions of bellflower root fermentation in an asthma model

실험동물laboratory animals

실험에 사용한 마우스는 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오 (Seongnam, Korea)에서 구입하였고, 실험에 사용하기 전까지 실내온도를 22±2℃로 유지하면서, 충분한 물과 사료를 공급하여 사육하였다. The mice used in the experiment were 6-week-old female BALB/c mice purchased from Orient Bio (Seongnam, Korea), and were raised with sufficient water and feed while maintaining the room temperature at 22 ± 2°C until used in the experiment. .

천식 효능 평가 동물실험Asthma efficacy evaluation animal testing

도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 천식 억제 활성을 평가하기 위하여 ovalbumin과 aluminium hydroxide에 의해 유발된 천식 마우스모델을 제작하였다. 실험군당 10마리의 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 1주일간 순치 후 사용하였으며, 0.2 mL의 PBS에 20 ㎍의 ovalbumin (Sigma, A7641, OVA)과 1 mg의 aluminium hydroxide (Sigma, 239186)를 현탁하여 1주일 간격으로 총 3회 복강주사를 수행하여 OVA에 대한 감작을 유도하였다. 이후 개발소재를 2주간 식이 투여하였으며, 2주간의 투여기간이 끝나기 5일 전 매일 30분씩 1%의 OVA를 흡입하게 하여 천식을 유도하였다. 이후 마우스를 희생하여 염증반응의 지표를 확인하여 호흡기질환 억제 효과를 평가하였다. 상기 천식 마우스모델을 제작하는 스케줄 모식도를 도 6에 나타내었다.To evaluate the asthma-suppressing activity of bellflower raw material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, water-soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained through sequential purification of PG-F, the anti-inflammatory activity of ovalbumin and aluminum hydroxide was evaluated. An asthma mouse model was created. Ten 6-week-old female Balb/c mice per experimental group were used after being conditioned for 1 week. 20 ㎍ ovalbumin (Sigma, A7641, OVA) and 1 mg of aluminum hydroxide (Sigma, 239186) were suspended in 0.2 mL of PBS. Sensitization to OVA was induced by intraperitoneal injection a total of three times at one-week intervals. Afterwards, the developed material was administered dietaryly for 2 weeks, and asthma was induced by inhaling 1% OVA for 30 minutes every day 5 days before the end of the 2-week administration period. Afterwards, mice were sacrificed and indicators of inflammatory response were checked to evaluate the effect of suppressing respiratory diseases. A schematic diagram of the schedule for producing the asthma mouse model is shown in Figure 6.

ELISAELISA

심장에서 채혈한 혈액을 4℃에서 30분 처리하여 혈액응고를 유도한 뒤, 2,000g에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청 내 IL-2, IL-12, IL-10의 양은 ELISA 키트 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다. 기관지를 통해 채취한 BALF(기관지폐포세척액)는 12,000rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. BALF 내 OVA-specific IgE, OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, OVA-specific IgG2a, IL-4, IL-5, IL-13, Eotaxin, VACM-1, LTC4, PGD₂, IL-6, CXCL1, 및 TSLP의 양은 ELISA 키트 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.Blood collected from the heart was treated at 4°C for 30 minutes to induce blood coagulation, and then centrifuged at 2,000g for 30 minutes to separate serum. The amounts of IL-2, IL-12, and IL-10 in the isolated serum were measured using an ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, MN). BALF (bronchoalveolar lavage fluid) collected through the bronchial tubes was centrifuged at 12,000 rpm for 1 minute to recover the supernatant. OVA-specific IgE, OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, OVA-specific IgG2a, IL-4, IL-5, IL-13, Eotaxin, VACM-1, LTC4, PGD ₂ , IL-6, CXCL1 in BALF , and the amount of TSLP was measured using an ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, MN).

결과 1. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 기관지폐포세척액(BALF) 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과 평가Result 1. Evaluation of the effect of suppressing immunoglobulin production in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and serum in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 기관지폐포세척액(BALF)과 혈액을 회수한 후 BALF 내 존재하는 OVA-specific IgE의 양과 혈청 내 존재하는 OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, 및 OVA-specific IgG2의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, 도라지 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. PG-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 PG-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 PG-F를 투여한 경우 immunoglobulin의 억제 효과를 나타내었으며, 또한 PG-F와 정제분획분말별 소재간의 immunoglobulin 생성 억제 활성 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 7에 나타내었다.In an OVA-induced asthma mouse model, bellflower root material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained through sequential purification of PG-F were fed to the mouse model, and then sacrificed and bronchial tubes were sacrificed. After collecting alveolar lavage fluid (BALF) and blood, the amount of OVA-specific IgE in BALF and the amount of OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, and OVA-specific IgG2 in serum were measured. As a result of checking four indicators, only a slight inhibitory effect was found in the raw bellflower material, but significantly improved inhibitory activity was confirmed in the bellflower fermented powder (PG-F) produced through the bioconversion process compared to the raw material. The purified fraction powder of PG-F was administered at a dosage equivalent to 40 mg/kg as PG-F, considering the recovery rate. When 40 mg/kg of PG-F was administered, it showed an inhibitory effect on immunoglobulin, and there was no difference in immunoglobulin production inhibition activity between PG-F and each purified fraction material, so the activity in the asthma mouse model was all PG- It is believed that the effect is due to the polysaccharide derived from F. The results are shown in Figure 7.

결과 2. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF(기관지폐포세척액)내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과 Result 2. Effect on total number of immune cells and cell population in BALF (bronchoalveolar lavage fluid) in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포의 수 및 세포(Lymphocyte, Eosinophil, Neutrophil, Macrophage) population에 미치는 효과를 확인하였다. 총 면역세포 수의 경우 도라지 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. PG-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 PG-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 PG-F를 투여한 경우 총 면역세포의 수에서 유의한 억제 효과를 나타내었다. BALF 내 존재하는 세포의 종류를 확인한 결과, PG-F 및 PG-F 정제분획분말별 소재의 투여에 의해 lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage의 유입을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, PG-F와 정제분획분말별 소재간의 BALF 내 면역세포의 침윤 억제 효과에 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 8에 나타내었다.In an OVA-induced asthma mouse model, the raw bellflower root, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, water-soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained by sequential purification of PG-F were fed to the mouse model, and then sacrificed to produce BALF. were recovered to determine the total number of immune cells in BALF and the effect on the cell (Lymphocyte, Eosinophil, Neutrophil, Macrophage) population. In the case of the total number of immune cells, only a slight inhibitory effect was shown in the raw bellflower material, but significantly improved inhibitory activity was confirmed in the bellflower fermented powder (PG-F) produced through the bioconversion process compared to the raw material. The purified fraction powder of PG-F was administered at a dosage equivalent to 40 mg/kg as PG-F, considering the recovery rate. When 40 mg/kg of PG-F was administered, it showed a significant inhibitory effect on the total number of immune cells. As a result of confirming the types of cells present in BALF, it was confirmed that the inflow of lymphocytes, eosinophils, neutrophils, and macrophages was suppressed by the administration of PG-F and PG-F purified fraction powder materials. In addition, since there was no difference in the effect of suppressing the infiltration of immune cells in BALF between PG-F and each purified fraction material, it is believed that the activity in the asthma mouse model is all due to the polysaccharide derived from PG-F. The results are shown in Figure 8.

결과 3. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 폐 조직학적 평가Result 3. Lung histological evaluation in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 및 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인하였다. 희생한 마우스에서 폐 조직을 적출하여 고정 및 탈수 후 파라핀에 embedding하여 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록은 4 μm 두께로 박편하여 슬라이드 글라스 위에 부착하고, hematoxylin과 eosin Y로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. OVA에 의해 천식이 유발됨에 따라 정상 마우스와 비교하여 폐 조직상에서 면역세포의 침윤이 증가한 것을 확인하였고, 도라지 원물의 투여에 의해 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하여 천식에 의한 염증 발생이 완화되어 폐 조직 보호 효과가 있음을 확인하였다. 또한, PG-F와 정제분획분말별 소재간의 폐 조직 내 염증 억제 효과 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 9에 나타내었다.In an asthma mouse model induced by OVA, bellflower root, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, water-soluble fraction, and polysaccharide fraction) obtained through sequential purification of PG-F were fed to the mouse model and then sacrificed. The effect of alleviating inflammation in lung tissue was confirmed. Lung tissue was removed from the sacrificed mouse, fixed, dehydrated, and embedded in paraffin to prepare a paraffin block. The paraffin block was sliced to a thickness of 4 μm, attached to a glass slide, stained with hematoxylin and eosin Y, and observed under a microscope. As asthma was induced by OVA, it was confirmed that the infiltration of immune cells increased in lung tissue compared to normal mice, and only a slight inhibitory effect was observed by the administration of bellflower root material, but fermented bellflower root produced through a bioconversion process Significantly improved inhibitory activity was confirmed in the powder (PG-F) compared to the raw material, confirming that it alleviates inflammation caused by asthma and has a lung tissue protection effect. In addition, since there was no difference in the effect of suppressing inflammation in lung tissue between PG-F and each purified fraction material, it is believed that the activity in the asthma mouse model is all due to the polysaccharide derived from PG-F. The results are shown in Figure 9.

결과 4. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 Th2 사이토카인 조절 효과 조사: 항진된 Th2 면역반응 억제Result 4. Investigation of Th2 cytokine regulation effect in BALF in OVA-induced asthma mouse model: Suppression of enhanced Th2 immune response

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, 및 IL-13)의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, 도라지 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 발효공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. PG-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 PG-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였으며, 40 mg/kg의 PG-F를 투여한 경우 IL-4, IL-5, 및 IL-13의 유의한 억제 효과를 확인하였다. 또한 PG-F와 정제분획분말별 소재간의 Th2 cytokine 생성 억제 활성 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 10에 나타내었다.In an OVA-induced asthma mouse model, the raw bellflower root, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, water-soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained by sequential purification of PG-F were fed to the mouse model, and then sacrificed to produce BALF. After recovery, the amount of Th2 cytokines (IL-4, IL-5, and IL-13) present in BALF was measured. As a result of checking three indicators, only a slight inhibitory effect was found in the raw bellflower material, but significantly improved inhibitory activity was confirmed in the bellflower root powder (PG-F) produced through the fermentation process compared to the raw material. Considering the recovery rate, the purified fraction powder of PG-F was administered at a dose equivalent to 40 mg/kg as PG-F. When 40 mg/kg of PG-F was administered, IL-4, IL-5, and A significant inhibitory effect of IL-13 was confirmed. In addition, since there was no difference in the inhibition activity of Th2 cytokine production between PG-F and each purified fraction material, it is believed that the activity in the asthma mouse model is all due to the polysaccharide derived from PG-F. The results are shown in Figure 10.

결과 5. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 혈청 내 Th1 사이토카인 조절 효과 조사: 저하된 Th1 면역반응 회복 Result 5. Investigation of the effect of regulating Th1 cytokines in serum in OVA-induced asthma mouse model: recovery of decreased Th1 immune response

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 사이토카인(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, 도라지 원물에서 약간의 회복 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 회복 효과를 확인하였다. PG-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 PG-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 PG-F를 투여한 경우 IL-2, IL-12, 및 IL-10의 유의한 회복 효과를 확인하였다. 또한 PG-F와 정제분획분말별 소재간의 Th1 cytokines 및 IL-10 생성 회복 효과 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 앞선 결과와 함께 PG-F 투여에 의해 Th2 cytokines의 발현은 억제시키고 Th1 cytokines의 발현은 회복시키는 효과가 있음을 확인하여 해당 소재가 Th1/Th2 면역반응 조절효과가 있음을 확인하였다. 상기 결과는 도 11에 나타내었다. In an OVA-induced asthma mouse model, bellflower root, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained through sequential purification of PG-F were fed to the mouse model, and then sacrificed to obtain blood. After recovery, the amounts of Th1 cytokines (IL-2, IL-12) and IL-10 present in serum were measured. As a result of checking three indicators, only a slight recovery effect was found in the raw bellflower material, but a significantly improved recovery effect was confirmed in the bellflower fermented powder (PG-F) produced through the bioconversion process compared to the raw material. The purified fraction powder of PG-F was administered at a dosage equivalent to 40 mg/kg as PG-F, considering the recovery rate. When 40 mg/kg of PG-F was administered, significant recovery effects on IL-2, IL-12, and IL-10 were confirmed. In addition, since there was no difference in the recovery effect of Th1 cytokines and IL-10 production between PG-F and the purified fraction material, it is believed that the activity in the asthma mouse model is all due to the polysaccharide derived from PG-F. In conjunction with the previous results, it was confirmed that PG-F administration had the effect of suppressing the expression of Th2 cytokines and restoring the expression of Th1 cytokines, confirming that the material had a Th1/Th2 immune response regulating effect. The results are shown in Figure 11.

결과 6. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효능 조사 Result 6. Investigation of efficacy of inhibiting production of inflammatory mediators in BALF in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 기관지폐포세척액(BALF)을 회수한 후 BALF 내 존재하는 Eotaxin, VCAM-1, LTC4, 및 PGD₂의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, 도라지 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. PG-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 PG-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 PG-F를 투여한 경우 Eotaxin, VCAM-1, LTC4, 및 PGD₂의 유의한 억제 효과를 확인하였다. 또한 PG-F와 정제분획분말별 소재간의 BALF 내 염증매개물질의 생성 억제 효과 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 12에 나타내었다.In an OVA-induced asthma mouse model, bellflower root material, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained through sequential purification of PG-F were fed to the mouse model, and then sacrificed and bronchial tubes were sacrificed. After collecting alveolar lavage fluid (BALF), the amounts of Eotaxin, VCAM-1, LTC4, and PGD ₂ present in BALF were measured. As a result of checking four indicators, only a slight inhibitory effect was found in the raw bellflower material, but significantly improved inhibitory activity was confirmed in the bellflower fermented powder (PG-F) produced through the bioconversion process compared to the raw material. The purified fraction powder of PG-F was administered at a dosage equivalent to 40 mg/kg as PG-F, considering the recovery rate. When 40 mg/kg of PG-F was administered, significant inhibitory effects on Eotaxin, VCAM-1, LTC4, and PGD ₂ were confirmed. In addition, since there was no difference in the effect of suppressing the production of inflammatory mediators in BALF between PG-F and each purified fraction material, it is believed that the activity in the asthma mouse model is all due to the polysaccharide derived from PG-F. The results are shown in Figure 12.

결과 7. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효능 조사 Result 7. Investigation of efficacy of inhibiting inflammatory cytokine and chemokine production in BALF in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 도라지 원물, 도라지발효분말(PG-F) 및 PG-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TNF-α, IL-1β, IL-6, CXCL1의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, 도라지 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 도라지발효분말(PG-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. PG-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 PG-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 PG-F를 투여한 경우 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 CXCL1의 유의한 억제 효과를 확인하였다. 또한 PG-F와 정제분획분말별 소재간의 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성 억제 활성 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 PG-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 13에 나타내었다.In an OVA-induced asthma mouse model, the raw bellflower root, bellflower root fermentation powder (PG-F), and purified fraction powder (solid-liquid separation fraction, water-soluble fraction, polysaccharide fraction) obtained by sequential purification of PG-F were fed to the mouse model, and then sacrificed to produce BALF. After recovery, the amounts of TNF-α, IL-1β, IL-6, and CXCL1 present in BALF were measured. As a result of checking four indicators, only a slight inhibitory effect was found in the raw bellflower material, but significantly improved inhibitory activity was confirmed in the bellflower fermented powder (PG-F) produced through the bioconversion process compared to the raw material. The purified fraction powder of PG-F was administered at a dosage equivalent to 40 mg/kg as PG-F, considering the recovery rate. When 40 mg/kg of PG-F was administered, significant inhibitory effects on TNF-α, IL-1β, IL-6, and CXCL1 were confirmed. In addition, since there was no difference in the activity of suppressing the production of inflammatory cytokines and chemokines between PG-F and each purified fraction, it is believed that the activity in the asthma mouse model is all due to the polysaccharide derived from PG-F. The results are shown in Figure 13.

결과 8. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효능 조사 Result 8. Investigation of efficacy of suppressing immunoglobulin production in BALF and serum in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF와 혈액을 회수한 후 BALF 내 존재하는 OVA-specific IgE의 양과 혈청 내 존재하는 OVA-specific IgG, IgG1, IgG2a의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 immunoglobulin 생성 억제 활성이 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 OVA-specific IgE와 OVA-specific IgG, IgG1, IgG2a에 있어서 각각 75%, 75%, 81%, 58%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 14에 나타내었다.In order to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, BALF and blood were recovered by feeding the diet with different doses of fermented bellflower root solid-liquid fraction powder (PG-F-S) and then sacrificing the BALF. The amount of OVA-specific IgE present in the blood and the amount of OVA-specific IgG, IgG1, and IgG2a present in the serum were measured. As a result of checking four indicators, it was confirmed that there was a tendency to increase compared to normal mice due to OVA induction, and as the dose of PG-F-S increased, the immunoglobulin production inhibitory activity was confirmed to increase in a concentration (dose)-dependent manner, and the maximum When the administered dose of 75.2 mg/kg of PG-F-S (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, OVA-specific IgE, OVA-specific IgG, IgG1, and IgG2a increased by 75%, 75%, and 81%, respectively. %, showing an inhibitory effect of 58%. The results are shown in Figure 14.

결과 9. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과 조사 Result 9. Investigation of effects on total number of immune cells and cell population in BALF in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포의 수 및 세포(lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage) population에 미치는 효과를 확인하였다. 총 면역세포의 수의 경우 OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여농도가 증가함에 따라 BALF 내 총 면역세포의 수가 감소하여 침윤 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. BALF 내 존재하는 세포의 종류를 확인한 결과, PG-F-S의 투여에 의해 농도(투여량) 의존적으로 lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage의 침윤을 억제시키는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여하였을 때 lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage에 있어서 각각 59%, 63%, 52%, 32%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 15에 나타내었다.In order to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, BALF was recovered by sacrificing the diet with different doses of fermented bellflower root solid-liquid fraction powder (PG-F-S), and total immunity in BALF was determined. The effect on the number of cells and the cell (lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage) population was confirmed. It was confirmed that the total number of immune cells tended to increase compared to normal mice due to OVA induction, and as the administered concentration of PG-F-S increased, the total number of immune cells in BALF decreased, thereby increasing the infiltration inhibition activity. As a result of confirming the type of cells present in BALF, it was confirmed that the administration of PG-F-S inhibited the infiltration of lymphocytes, eosinophils, neutrophils, and macrophages in a concentration (dose) dependent manner, and the maximum administered dose of 75.2 mg/kg was confirmed. When PG-F-S (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, it showed an inhibitory effect of 59%, 63%, 52%, and 32% on lymphocytes, eosinophils, neutrophils, and macrophages, respectively. The results are shown in Figure 15.

결과 10. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 폐 조직학적 평가Result 10. Lung histological evaluation in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인하였다. 희생한 마우스에서 폐 조직을 적출하여 고정 및 탈수 후 파라핀에 embedding하여 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록은 4 μm 두께로 박편하여 슬라이드 글라스 위에 부착하고, hematoxylin과 eosin Y로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. OVA에 의해 천식이 유발됨에 따라 정상 마우스와 비교하여 폐 조직상에서 면역세포의 침윤이 증가한 것을 확인하였고, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 농도(투여량) 의존적으로 폐 조직 내 면역세포의 침윤 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 도 16에 나타내었다.In order to confirm concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, the mice were fed with different doses of fermented bellflower root solid-liquid fraction powder (PG-F-S) and then sacrificed to confirm the effect of alleviating inflammation in lung tissue. did. Lung tissue was removed from the sacrificed mouse, fixed, dehydrated, and embedded in paraffin to prepare a paraffin block. The paraffin block was sliced to a thickness of 4 μm, attached to a glass slide, stained with hematoxylin and eosin Y, and observed under a microscope. As asthma was induced by OVA, it was confirmed that the infiltration of immune cells in the lung tissue increased compared to normal mice, and as the dose of PG-F-S increased, the infiltration of immune cells in the lung tissue was suppressed in a concentration (dose)-dependent manner. It was confirmed that activity increased. The results are shown in Figure 16.

결과 11. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 Th2 사이토카인 생성 억제 효과 조사Result 11. Investigation of the effect of suppressing Th2 cytokine production in BALF in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 cytokines (IL-4, IL-5, 및 IL-13)의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 Th2 cytokines 생성 억제 활성이 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 IL-4, IL-5, 및 IL-13에 있어서 각각 74%, 62%, 70%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 17에 나타내었다.In order to confirm the concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, different doses of fermented bellflower root solid-liquid fraction powder (PG-F-S) were fed at different doses, then sacrificed to recover BALF, and the presence in BALF was determined. The amount of Th2 cytokines (IL-4, IL-5, and IL-13) was measured. As a result of checking the three indicators, it was confirmed that there was a tendency to increase compared to normal mice due to OVA induction, and as the dose of PG-F-S increased, the inhibitory activity of Th2 cytokines production was confirmed to increase in a concentration (dose)-dependent manner. When the maximum administered dose of 75.2 mg/kg of PG-F-S (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, IL-4, IL-5, and IL-13 were 74%, 62%, and 70%, respectively. It showed an inhibitory effect of %. The results are shown in Figure 17.

결과 12. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 Serum 내 Th1 사이토카인 및 IL-10 생성 회복 효과 조사Result 12. Investigation of the recovery effect of Th1 cytokine and IL-10 production in serum in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 cytokines (IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 감소하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 Th1 cytokines 및 IL-10 생성 회복 효과가 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 IL-2, IL-12, 및 IL-10에 있어서 각각 85%, 62%, 96%의 회복 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 18에 나타내었다.In order to confirm the concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, the presence of bellflower root fermented product solid-liquid fraction powder (PG-F-S) in different doses was fed, sacrificed, and blood was recovered, then present in the serum. The amounts of Th1 cytokines (IL-2, IL-12) and IL-10 were measured. As a result of checking three indicators, it was confirmed that there was a tendency to decrease compared to normal mice due to OVA induction, and as the dose of PG-F-S increased, the recovery effect of Th1 cytokines and IL-10 production increased in a concentration (dose) dependent manner. It was confirmed that when the maximum administered dose of 75.2 mg/kg of PG-F-S (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, IL-2, IL-12, and IL-10 decreased by 85%, respectively. It showed recovery effects of 62% and 96%. The results are shown in Figure 18.

결과 13. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 TSLP 생성 억제 효과 조사Result 13. Investigation of the effect of inhibiting TSLP production in BALF in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TSLP의 양을 측정하였다. 그 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 TSLP 생성 억제 활성이 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 TSLP의 생성에 있어서 96%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 19에 나타내었다.In order to confirm the concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, different doses of fermented bellflower root solid-liquid fraction powder (PG-F-S) were fed at different doses, then sacrificed to recover BALF, and the presence in BALF was determined. The amount of TSLP was measured. As a result, it was confirmed that there was a tendency to increase compared to normal mice due to OVA induction, and that the inhibitory activity of TSLP production increased in a concentration (dose)-dependent manner as the dose of PG-F-S increased, and the maximum administered dose of 75.2 mg was confirmed. When /kg of PG-F-S (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, a 96% inhibitory effect was shown on the production of TSLP. The results are shown in Figure 19.

결과 14. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효과 조사Result 14. Investigation of the effect of suppressing the production of inflammatory mediators in BALF in an OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD₂의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 BALF 내 염증매개물질의 생성 억제 효과가 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD₂에 있어서 각각 80%, 84%, 80%, 91%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 20에 나타내었다.In order to confirm the concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, the presence of bellflower root fermented solid-liquid fraction powder (PG-FS) in different doses was fed to the mouse model, then sacrificed, and BALF was recovered. The amounts of Eotaxin, VCAM-1, LTC4, and PGD ₂ were measured. As a result of checking four indicators, it was confirmed that they tend to increase compared to normal mice due to OVA induction, and as the dose of PG-FS increases, the effect of suppressing the production of inflammatory mediators in BALF increases in a concentration (dose) dependent manner. It was confirmed that when the maximum dose of 75.2 mg/kg of PG-FS (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, the reductions in Eotaxin, VCAM-1, LTC4, and PGD ₂ were 80% and 84%, respectively. , showed an inhibitory effect of 80% and 91%. The results are shown in Figure 20.

결과 15. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효능 조사Result 15. Investigation of efficacy of inhibiting inflammatory cytokine and chemokine production in BALF in OVA-induced asthma mouse model

OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 도라지발효물 고액분리분획분말(PG-F-S)의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TNF-α, IL-1β, IL-6, CXCL1의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, PG-F-S의 투여량이 증가함에 따라 BALF 내 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성 억제 효과가 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 75.2 mg/kg의 PG-F-S(PG-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 TNF-α, IL-1β, IL-6, CXCL1에 있어서 각각 94%, 97%, 98%, 90%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 21에 나타내었다.In order to confirm the concentration (dose) dependence in an asthma mouse model induced by OVA, different doses of fermented bellflower root solid-liquid fraction powder (PG-F-S) were fed at different doses, then sacrificed to recover BALF, and the presence in BALF was determined. The amounts of TNF-α, IL-1β, IL-6, and CXCL1 were measured. As a result of checking four indicators, it was confirmed that they tend to increase compared to normal mice due to OVA induction, and as the dose of PG-F-S increases, the effect of suppressing the production of inflammatory cytokines and chemokines in BALF increases in a concentration (dose) dependent manner. An increase was confirmed, and when the maximum dose of 75.2 mg/kg of PG-F-S (equivalent to 160 mg/kg as PG-F) was administered, the It showed inhibitory effects of 94%, 97%, 98%, and 90%. The results are shown in Figure 21.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

delete

(a) converting bellflower into liquid culture medium;
(b) performing a biotransformation fermentation process of inoculating basidiomycete hyphae into the liquid bellflower medium converted into the culture medium in step (a) and culturing and fermenting;
(c) performing a bioconversion enzyme treatment process of treating the fermented product produced by the bioconversion fermentation process of step (b) with a cellulolytic enzyme;
(d) removing insoluble residues from the enzyme product produced by the bioconversion enzyme treatment process in step (c);
(e) removing fat globules from the filtrate or supernatant from which the insoluble residue of step (d) has been removed; and,
(f) removing low-molecular-weight impurities of 300,000 da or less from the fat globule removal solution of step (e).

According to clause 9,
The step (d) is to obtain a solid-liquid separation fraction (PG-FS).

According to clause 9,
The preparation method of step (e) is to obtain a water-soluble fraction (PG-FW).

According to clause 9,
A manufacturing method in which fat globules are removed in step (e) using an organic solvent.

According to clause 9,
The step (f) is to obtain a polysaccharide fraction (PG-FP).

According to clause 9,
The removal of fat globules in step (e) involves using one or more organic solvents selected from the group consisting of hexane, ethyl acetate, chloroform, and dichloromethane. Phosphorus, manufacturing method.