KR102638427B1

KR102638427B1 - Stimuli-Responsive Microcapsule with Enhanced Storage Stability of Active Ingredient Susceptible to Oxidation

Info

Publication number: KR102638427B1
Application number: KR1020210158702A
Authority: KR
Inventors: 최창형; 추진옥; 최윤
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2024-02-20
Also published as: KR20230072201A

Abstract

본 발명은 활성물질을 캡슐화하여 저장하는 마이크로캡슐에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산화되기 쉬운 활성물질을 함유하는 내부 액적이 공극을 갖는 쉘로 둘러싸여 있는 마이크로캡슐에 있어서, 내부 액적과 쉘 사이에 내부 액적과 비혼화성의 중간층이 형성되어 있으며, 상기 중간층에는 산화방지제가 함유되어 있어 상기 활성물질의 저장 안정성이 향상되는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐에 관한 것이다.The present invention relates to a microcapsule that encapsulates and stores an active material. More specifically, it relates to a microcapsule in which an internal liquid droplet containing an active material easily oxidized is surrounded by a shell with pores, wherein an internal liquid is formed between the internal liquid droplet and the shell. The present invention relates to a microcapsule characterized in that an intermediate layer immiscible with an enemy is formed, and the intermediate layer contains an antioxidant, thereby improving the storage stability of the active substance.

Description

Stimuli-Responsive Microcapsule with Enhanced Storage Stability of Active Ingredient Susceptible to Oxidation}

본 발명은 활성물질을 캡슐화하여 외부 자극에 의해 활성물질의 방출을 제어할 수 있는 마이크로캡슐에 관한 것으로, 특히 산화되기 쉬운 활성물질을 장기간 안정하게 저장할 수 있는 마이크로캡슐에 관한 것이다. The present invention relates to a microcapsule that encapsulates an active substance and can control the release of the active substance by external stimulation. In particular, it relates to a microcapsule that can stably store an active substance that is prone to oxidation for a long period of time.

살아있는 세포는 생명을 유지하기 위하여 다양한 생화학 반응을 통해 물질대사를 조절한다. 이러한 세포는 일반적으로 주변 환경으로부터 수성의 내부 물질 및 세포 구성물을 분리하는 세포막으로 둘러싸여 있다. 세포막은 반투과성 및 자극 반응성 특성을 지녀 세포를 주변 환경의 독성물질(toxin)로부터 보호할 뿐만 아니라, 내부 조성을 조절하여 세포 구획 내에서 일련의 생화학 반응을 효과적으로 조정하고 주된 기능을 수행할 수 있도록 한다. 예를 들어, 세포 내 소기관은 호흡이나 광합성 과정에서 활성 산소종(ROS)을 생성하여, 단백질, 지질, 탄수화물 및 DNA에 심각한 손상을 일으켜 세포 구성 요소의 산화 스트레스를 유발할 수 있다. 산화 스트레스에 대응하기 위해, 세포는 아스코르브산염, 글루타티온 및 α-토코페롤과 같은 비효소적 저분자량 대사산물이 세포 보호 메커니즘에서 기능적으로 상호작용하는 고유한 항산화 방어 메커니즘을 갖추고 있다. 실제 세포에서 발생하는 이러한 보완적 상호작용을 세포 모방체로 변환하는 것은, 잠재적으로 반응성이 높은 민감한 항산화제 및 활성성분을 장기간 보유하고 효과적으로 전달할 수 있는 미세담체의 설계로 이어질 수 있지만, 유사한 개념적 아이디어는 아직 제시된 바 없다.Living cells regulate metabolism through various biochemical reactions to maintain life. These cells are usually surrounded by a cell membrane that separates the aqueous internal substances and cellular components from the surrounding environment. The cell membrane has semi-permeable and stimulus-responsive properties, so it not only protects cells from toxins in the surrounding environment, but also regulates its internal composition to effectively coordinate a series of biochemical reactions within the cell compartment and perform its main function. For example, intracellular organelles produce reactive oxygen species (ROS) during respiration or photosynthesis, which can cause serious damage to proteins, lipids, carbohydrates, and DNA, leading to oxidative stress in cellular components. To counter oxidative stress, cells are equipped with unique antioxidant defense mechanisms in which non-enzymatic low molecular weight metabolites such as ascorbate, glutathione and α-tocopherol interact functionally in cytoprotective mechanisms. Translating these complementary interactions that occur in real cells into cell mimics could potentially lead to the design of microcarriers capable of long-term retention and effective delivery of highly reactive and sensitive antioxidants and active ingredients, but similar conceptual ideas It has not been presented yet.

최근 실험 기술의 발전에 따라 살아있는 세포의 필수적인 측면을 모방하는 합성 세포 모델이 제작되고 있다. 특히 다중상의 흐름을 정밀하게 제어할 수 있는 미세유체공학의 발전에 따라 각 구획의 크기나 형태, 조성을 정밀하게 제어한 단분산성 다중 에멀젼 액적을 생산할 수 있게 되었다(등록특허 제10-1466770호, Adv. Mater. 2016, 28, 3340-3344.). 다중 에멀젼은 캡슐화된 물질의 방출을 제어가 가능한 물리/화학적 특성을 갖는 맞춤형 마이크로캡슐로 쉽게 전환할 수 있다. 예를 들어, 외부 연속상으로부터 내부 액적을 분리하는 중간 상을 갖는 이중 에멀젼은 w/o/w 또는 o/w/o 형태의 에멀젼 액적을 활용하여 친수성 또는 소수성 물질을 각각 캡슐화하거나, 혹은 하나의 캡슐 내에 교차 오염없이 소수성 물질과 친수성 물질을 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 더 나아가 외부 자극에 의해 캡슐화된 물질을 방출하는 것이 가능하게 되었다. 그러나 이중 에멀젼에서는 구획 조절과 재료 선택에 존재하는 한계로 인해 생체 적합성, 물질의 장기 보유성 및 자극 반응성과 같은 다양한 요구를 만족시키기에 너무 제한적이다. L.R.Arriaga 등 및 S.-H. KIM 등은 이중 에멀젼을 사용하여 합성 고분자 또는 인지질이 자가 조립에 의해 이중층 구조를 형성하도록 유도하여 폴리머좀 및 리포좀을 생성하였다. 이러한 소포는 세포의 막 구조와 유사하여 세포 내에서 일어나는 복잡한 생화학 반응을 모방할 뿐만 아니라 치료제 및 활성 성분의 효율적인 전달을 위해 널리 활용되어 왔다. 그러나 상대적으로 약한 소수성 상호 작용에 의해 구동되기 때문에, 일반적으로 광중합을 통해 제조되는 마이크로캡슐에 비해 본질적으로 안정적이지 못하다는 단점이 있다. Recent advances in experimental techniques have led to the creation of synthetic cell models that mimic essential aspects of living cells. In particular, with the development of microfluidics, which can precisely control the flow of multiple phases, it has become possible to produce monodisperse multi-emulsion droplets with the size, shape, and composition of each compartment precisely controlled (Patent No. 10-1466770, Adv . Mater. 2016, 28, 3340-3344.). Multiple emulsions can be easily converted into tailored microcapsules with physical/chemical properties that allow controllable release of the encapsulated substances. For example, double emulsions with an intermediate phase that separates the inner droplet from the outer continuous phase utilize emulsion droplets in w/o/w or o/w/o form to encapsulate hydrophilic or hydrophobic substances, respectively, or one It can be used to encapsulate hydrophobic and hydrophilic substances without cross-contamination within the capsule. Furthermore, it became possible to release the encapsulated material upon external stimulation. However, double emulsions are too limited to satisfy various needs such as biocompatibility, long-term retention of materials, and stimulus responsiveness due to the limitations that exist in compartment control and material selection. L.R.Arriaga et al. and S.-H. KIM et al. used a double emulsion to induce synthetic polymers or phospholipids to self-assemble to form a bilayer structure to create polymersomes and liposomes. These vesicles are similar to the membrane structure of cells and have been widely used to not only mimic complex biochemical reactions that occur within cells but also to efficiently deliver therapeutic agents and active ingredients. However, because it is driven by relatively weak hydrophobic interactions, it has the disadvantage of being inherently less stable compared to microcapsules generally manufactured through photopolymerization.

대안적으로, 최근 삼중 에멀젼 액적과 같은 고도의 다중 에멀젼이 이러한 문제를 해소하기 위한 캡슐 주형으로 제안되었다. 본 발명자들은 2021년 2월 3일자로 출원한 특허출원 제10-2021-0015156호에서, 삼중 에멀젼 액적으로부터 형성된 마이크로캡슐에 캡슐 쉘과 내부 액적을 분리하는 추가의 중간층이 존재한다는 것을 이용하여 다양한 물질을 성공적으로 캡슐화하고, 보유는 물론 다양한 자극에 의해 이들의 방출을 스마트하게 제어할 수 있음을 보고하였다. 상기 방법에 의하면 삼중 에멀젼 액적의 중간층을 이용하여 외부 자극이 가해질 때까지 가장 안쪽에 있는 코어-액적에 포함된 물질을 주변 환경으로부터 효과적으로 분리할 수 있지만, 빛, 산소, 습기, 온도를 포함한 산화 환경에 취약한 반응성 물질을 장기간 보유하는 것은 여전히 쉽지 않다. 더욱이, 마이크로캡슐에서 고형화되거나 겔화된 쉘을 제조하기 위해 가장 널리 사용되는 광중합 공정은 종종 반응성이 높고 산화를 촉진하는 자유 라디칼을 생성하여 마이크로캡슐의 제조 과정에서 반응성 물질의 안정성에 영향을 미친다. 따라서, 산화되기 쉬운 활성물질을 장기간 안정적으로 저장하고, 다양한 자극을 통한 방출을 유발시킬 수 있는 마이크로캡슐에 대한 요구가 여전히 남아 있다.Alternatively, highly multiple emulsions, such as triple emulsion droplets, have recently been proposed as capsule templates to overcome this problem. In Patent Application No. 10-2021-0015156 filed on February 3, 2021, the present inventors took advantage of the fact that microcapsules formed from triple emulsion droplets have an additional intermediate layer that separates the capsule shell and the internal droplet to form various substances. were successfully encapsulated and reported that their retention as well as their release can be smartly controlled by various stimuli. According to the above method, by using the middle layer of the triple emulsion droplet, the material contained in the innermost core-droplet can be effectively separated from the surrounding environment until an external stimulus is applied, but the oxidizing environment including light, oxygen, moisture, and temperature It is still not easy to retain vulnerable reactive substances for a long period of time. Moreover, the most widely used photopolymerization process to prepare solidified or gelled shells in microcapsules often generates free radicals that are highly reactive and promote oxidation, affecting the stability of reactive materials during the fabrication process of microcapsules. Therefore, there still remains a need for microcapsules that can stably store active substances that are prone to oxidation for a long period of time and trigger their release through various stimuli.

등록특허 제10-1466770호Registered Patent No. 10-1466770 특허출원 제10-2021-0015156호Patent Application No. 10-2021-0015156

CH Choi 등, Adv. Mater. 2016, 28, 3340-3344.CH Choi et al., Adv. Mater. 2016, 28, 3340-3344. L. R. Arriaga 등, Small 2014, 10, 950.L. R. Arriaga et al., Small 2014, 10, 950. S. -H. KIM 등, Lab Chip 2011, 11, 3162.S.-H. KIM et al., Lab Chip 2011, 11, 3162.

본 발명은 대량 생산에 의해 단분산성으로 제작이 용이하며, 산화되기 쉬운 활성물질을 장기간 안정하게 보관할 수 있는 마이크로캡슐을 제공하는 것을 목적으로 한다. The purpose of the present invention is to provide microcapsules that are easy to manufacture in monodisperse form through mass production and can stably store active substances that are prone to oxidation for a long period of time.

이에 더하여 상기 마이크로캡슐이 외부 자극에 의해 활성물질의 방출을 제어할 수 있으며, 원하는 방출특성을 갖도록 구조가 제어되는 마이크로캡슐을 제공하는 것을 추가의 목적으로 한다. In addition, an additional object is to provide microcapsules that can control the release of active substances by external stimulation and whose structure is controlled to have desired release characteristics.

본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로캡슐을 이용한 화장료 조성물 및 약물전체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition and a complete drug using the microcapsules.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 산화되기 쉬운 활성물질을 함유하는 내부 액적이 공극을 갖는 쉘로 둘러싸여 있는 마이크로캡슐에 있어서, 내부 액적과 쉘 사이에 내부 액적과 비혼화성의 중간층이 형성되어 있으며, 상기 중간층에는 산화방지제가 함유되어 있어 상기 활성물질의 저장 안정성이 향상되는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐에 관한 것이다. The present invention for achieving the above-mentioned object is a microcapsule in which an internal liquid droplet containing an active material that is easily oxidized is surrounded by a shell having pores, and an intermediate layer immiscible with the internal liquid droplet is formed between the internal liquid droplet and the shell, The present invention relates to a microcapsule characterized in that the middle layer contains an antioxidant, thereby improving the storage stability of the active substance.

본 발명의 마이크로캡슐에 의하면, 내부 액적에 함유된 활성물질은 쉘이 공극을 갖는 것에도 불구하고 내부 액적과 비혼화성 중간층이 외부의 산소나 수분과의 접촉을 차단하는 보호막 역할을 하기 때문에 일차적으로 저장성이 향상되는 효과를 나타낸다. 이에 더하여, 중간층에는 산화방지제가 함유되어 있으므로 확산을 통해 소량의 산소나 수분이 혼입된다고 하더라도, 산화방지제가 이를 다시 한번 차단하기 때문에 산화에 취약한 활성물질을 안정하게 장기 보관할 수 있다.According to the microcapsule of the present invention, the active material contained in the internal droplet is primarily absorbed because the internal liquid droplet and the immiscible middle layer serve as a protective film to block contact with external oxygen or moisture, even though the shell has pores. It shows the effect of improving storage. In addition, the middle layer contains antioxidants, so even if a small amount of oxygen or moisture enters through diffusion, the antioxidants once again block this, allowing active substances vulnerable to oxidation to be stored stably for a long period of time.

본 발명자들은 2021년 2월 3일자로 출원된 특허출원 제10-2021-0015156호에서 활성물질을 함유하는 친수성 코어 액적 및 상기 코어 액적의 표층에 형성된 오일층이 하이드로겔 쉘로 캡슐화되어 있는 하이드로겔 마이크로캡슐에 대해 개시하였다. 상기 마이크로캡슐을 이용하면 수용성 활성물질을 하이드로겔 마이크로캡슐에 캡슐할 수 있으며, 3개월 이상 보관 시에도 활성물질의 유출없이 안정한 상태를 유지할 수 있으며, 각종 외부 자극에 반응하여 활성물질을 방출시킬 수 있다. 본 발명은 상기 출원서에 개시된 내용을 모두 포함하며 이를 더욱 발전시킨 것으로, 내부 액적에 함유된 활성물질이 산화되기 쉬운 물질인 경우에는 단순히 물리적으로 공극을 통해 방출되는 것을 방지할 뿐 아니라, 확산에 의해 내부 액적으로 전달되어 산화반응을 야기하는 물질, 예를 들어, 산소, 금속이온 및/또는 수분을 산화방지제를 사용하여 추가로 차단하고자 하는 것이다. In Patent Application No. 10-2021-0015156 filed on February 3, 2021, the present inventors disclosed a hydrogel micro droplet in which a hydrophilic core droplet containing an active material and an oil layer formed on the surface layer of the core droplet are encapsulated in a hydrogel shell. Disclosed about capsules. Using the above microcapsules, water-soluble active substances can be encapsulated in hydrogel microcapsules, and even when stored for more than 3 months, a stable state can be maintained without leakage of the active substance, and the active substance can be released in response to various external stimuli. there is. The present invention includes all of the content disclosed in the above application and is a further development thereof. In the case where the active material contained in the internal droplet is a material that is easily oxidized, it not only physically prevents it from being released through the pores, but also by diffusion. The purpose is to further block substances that are transmitted to the internal droplet and cause an oxidation reaction, such as oxygen, metal ions, and/or moisture, using antioxidants.

본 발명의 마이크로캡슐은 친수성 내부 액적-친유성 보호층-친수성 쉘의 형태이거나, 혹은 친유성 내부 액적-친수성 보호층-친유성 쉘의 형태일 수 있다. 활성물질이 친수성 물질인 경우에는 친수성 내부 액적-친유성 보호층-친수성 쉘 형태의 마이크로캡슐을 사용하여 활성물질을 캡슐화할 수 있으며, 친유성 활성물질은 친유성 내부 액적-친수성 보호층-친유성 쉘로 이루어진 마이크로캡슐을 사용하여 캡슐화할 수 있다.The microcapsule of the present invention may be in the form of a hydrophilic inner droplet-lipophilic protective layer-hydrophilic shell, or in the form of a lipophilic inner droplet-hydrophilic protective layer-hydrophilic shell. If the active material is a hydrophilic material, the active material can be encapsulated using a microcapsule in the form of a hydrophilic shell - hydrophilic inner droplet - lipophilic protective layer - hydrophilic shell. It can be encapsulated using microcapsules consisting of a shell.

본 명세서에서 내부 액적 또는 보호층이 '친수성'이라 함은 물과 C1~C3의 알코올로부터 선택된 하나 이상의 용매와 혼화가능한 것을 의미하며, '친유성'은 C1~C3의 알코올로부터 선택된 하나 이상의 용매와 혼화되지 않는 것을 나타낸다. 또한 상기 쉘이 '친수성' 또는 '친유성'이라 함은 각각 쉘을 형성하는 전구체 용액이 상기 내부 액적 또는 보호층에 대해 정의된 '친수성' 또는 '친유성'을 나타내는 것을 의미한다. 친수성을 나타내는 대표적인 용매는 물과 C1~C3의 알코올 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있으며, 친유성을 나타내는 대표적인 용매는 미네랄 오일, 대두유와 같은 유지뿐 아니라 C5이상의 알칸, 에테르, 에스테르를 예로 들 수 있다.In this specification, 'hydrophilic' means that the internal droplet or protective layer is miscible with water and one or more solvents selected from C1 to C3 alcohols, and 'lipophilic' means miscible with one or more solvents selected from C1 to C3 alcohols. Indicates that it is not miscible. In addition, saying that the shell is 'hydrophilic' or 'lipophilic' means that the precursor solution forming the shell exhibits defined 'hydrophilic' or 'lipophilic' properties with respect to the internal droplet or protective layer, respectively. Representative solvents that exhibit hydrophilicity include water, C1 to C3 alcohols, or mixtures thereof, and representative solvents that exhibit lipophilicity include oils and fats such as mineral oil and soybean oil, as well as alkanes, ethers, and esters of C5 or higher. there is.

특허출원 제10-2021-0015156호에 개시한 바와 같이 중간층 구조를 갖는 본 발명의 마이크로캡슐은 외부 자극에 의해 활성물질의 방출을 제어할 수 있다. 상기 외부 자극은 마이크로캡슐 내부의 중간층 또는 최외곽 쉘을 불안정하게 하여 파열시킬 수 있는 것이라면 어떤 것이든 사용할 수 있으며, 화학물질, 물리적 힘, 삼투압, pH, 온도 또는 빛을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 도 12는 친수성 내부 액적-친유성 보호층-친수성 쉘로 이루어진 마이크로캡슐에서, 외부 자극에 의해 내부 액적에 함유된 물질이 방출되는 예를 보여주는 모식도와 현미경 이미지이다. 예를 들어, 상기 마이크로캡슐을 중간층과 혼화되는 용매에 침지하면, 쉘의 공극을 통해 용매가 마이크로캡슐 내로 들어가 중간층과 혼화됨에 따라 중간층이 제거되므로 공극을 통해 활성물질이 방출되도록 할 수 있다. 혹은, 기계적인 힘을 가하면, 중간층의 연속성이 깨어지면서 내부 액적에 함유된 물질이 방출될 수 있다. 또는, 내부 액적보다 삼투압이 낮은 용매에 침지하면, 삼투압에 의해 용매가 내부 액적으로 침투함에 따라 내부 액적의 압력이 증가하고, 그에 따라 내부 액적에 함유된 물질이 방출될 수 있다. 중간층을 불안정하게 하는 이외에도 쉘을 불안정하게 하여 제거하는 것에 의해서도 활성물질의 방출을 유도할 수 있으며, 이외에도 pH나 온도, 빛에 의해 중간층 또는 쉘을 불안정하게 하는 것에 의해 내부 액적에 함유된 활성물질이 방출되도록 할 수 있다. As disclosed in Patent Application No. 10-2021-0015156, the microcapsule of the present invention having an intermediate layer structure can control the release of the active substance by external stimulation. The external stimulus can be anything that can destabilize and rupture the middle layer or outermost shell inside the microcapsule, and examples include, but are not limited to, chemicals, physical force, osmotic pressure, pH, temperature, or light. That is not the case. Figure 12 is a schematic diagram and microscope image showing an example of a microcapsule composed of a hydrophilic inner droplet, a lipophilic protective layer, and a hydrophilic shell, in which a substance contained in the inner droplet is released by an external stimulus. For example, when the microcapsule is immersed in a solvent miscible with the middle layer, the solvent enters the microcapsule through the pores of the shell and mixes with the middle layer, thereby removing the middle layer, allowing the active material to be released through the pores. Alternatively, when mechanical force is applied, the continuity of the middle layer may be broken and the material contained in the internal droplet may be released. Alternatively, when immersed in a solvent with a lower osmotic pressure than the internal droplet, the pressure of the internal droplet increases as the solvent penetrates into the internal droplet due to osmotic pressure, and thus the substances contained in the internal droplet may be released. In addition to destabilizing the middle layer, the release of the active material can be induced by destabilizing and removing the shell. In addition, the active material contained in the internal droplet can be induced by destabilizing the middle layer or shell by pH, temperature, or light. It can be released.

본 발명의 마이크로캡슐에는 내부 액적, 중간층 또는 쉘에 외부 자극에 의한 활성물질의 방출 제어가 용이하도록 해당 층에 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 삼투 자극에 반응하기 위해서는, 내부 액적에는 추가로 삼투 물질이 함유되어 있으며, 중간층에는 계면활성제가 포함되어 있는 것이 바람직하다. 내부 액적과 마이크로캡슐이 분산된 분산액 간 삼투압의 차이가 발생하면, 중간층이 반투막으로 작용하여 분산액으로부터 코어 액적으로 용매가 유입된다. 중간층을 통한 용매의 유입은 역 마이셀(reverse micell) 구조나 수화된 계면활성제를 통하여 일어날 수 있다.The microcapsule of the present invention may contain additives in the inner droplet, middle layer, or shell to facilitate control of release of the active substance by external stimulation. For example, in order to respond to osmotic stimulation, it is desirable for the inner droplet to additionally contain an osmotic substance and the middle layer to contain a surfactant. When there is a difference in osmotic pressure between the internal droplet and the dispersion liquid in which the microcapsules are dispersed, the middle layer acts as a semi-permeable membrane, allowing solvent to flow from the dispersion liquid into the core droplet. Inflow of solvent through the middle layer can occur through a reverse micelle structure or hydrated surfactant.

본 발명의 마이크로캡슐은 상기 활성물질의 크기가 쉘의 공극 크기보다 작은 경우에도, 중간층이 공극을 통한 활성물질의 방출을 차단하기 때문에 저장 시에는 공극을 통해 활성물질이 방출되지 않고 장기간 저장이 가능하게 된다. 이후, 외부 자극을 통해 중간층이 불안정해지면(즉, 중간층에 불연속 면이 생기면) 내부 액적에 함유된 활성물질은 공극을 통해 방출된다. 본 발명의 마이크로캡슐은 친수성의 산화되기 쉬운 활성물질의 저장에 특히 유용하다. 통상 생체적합성 고분자는 친수성을 나타내지만 친수성 물질을 캡슐화하기 위해서는 소수성 고분자를 사용할 수 밖에 없던 문제를 간단하게 해소할 수 있다. 본 발명의 마이크로캡슐에 저장되는 활성물질이 쉘의 공극 크기보다 작은 것에 한정되는 것은 아니며, 공극의 크기보다 큰 경우에는 쉘을 불안정하게 하는 것에 의해(즉, 일부 또는 전체를 제거하는 것에 의해) 활성 물질이 방출되도록 할 수 있다.The microcapsules of the present invention can be stored for a long period of time without releasing the active material through the pores because the middle layer blocks the release of the active material through the pores even when the size of the active material is smaller than the pore size of the shell. I do it. Afterwards, when the middle layer becomes unstable through external stimulation (i.e., a discontinuous surface occurs in the middle layer), the active material contained in the internal droplet is released through the pores. The microcapsules of the present invention are particularly useful for storage of hydrophilic, easily oxidized active substances. Normally, biocompatible polymers exhibit hydrophilic properties, but the problem of having to use hydrophobic polymers to encapsulate hydrophilic materials can be easily solved. The active material stored in the microcapsule of the present invention is not limited to those smaller than the pore size of the shell, and if it is larger than the pore size, the active material is activated by destabilizing the shell (i.e., removing part or all of it). substances can be released.

본 발명의 마이크로캡슐의 내부 액적에는 산화되기 쉬운 활성물질이 함유되어 있으나, 그 외에도 다른 유효물질을 함께 함유할 수 있다. 예를 들어, 내부 액적에도 추가의 제2 활성물질을 함유할 수 있으며, 쉘의 공극 크기가 상기 활성물질과 제2 활성물질의 중간이라면 선택적인 방출을 제어할 수도 있다. 또한, 내부 액적 뿐 아니라, 중간층에 내부 액적에 함유된 활성물질과 친수성 또는 친유성이 상이한 제3 활성물질을 추가로 함유할 수도 있다.The internal liquid droplets of the microcapsule of the present invention contain an active substance that is easily oxidized, but may also contain other active substances. For example, the internal droplet may also contain an additional second active material, and selective release may be controlled if the pore size of the shell is intermediate between the active material and the second active material. In addition, in addition to the internal droplets, the intermediate layer may additionally contain a third active material that has a different hydrophilicity or lipophilicity from the active material contained in the internal droplets.

목적하는 활성물질의 방출 양상에 따라 상기 외부 자극은 중간층 또는 쉘을 선택적으로 파열시키는 것과, 이들 모두를 동시에 파열시키는 것을 선택하여 사용할 수 있다.Depending on the release pattern of the desired active material, the external stimulus can be used to selectively rupture the middle layer or the shell, or to rupture both of them simultaneously.

첫 번째의 활성물질의 방출 양상은, 쉘의 공극 크기보다 작은 활성물질만을 선택적으로 방출시키는 것이다. 마이크로캡슐에 중간층만을 선택적으로 파열시키는 외부 자극이 가해지면 중간층이 불안정화면서 내부 액적에 함유되어 있던 활성물질이 하이드로겔 쉘과 직접적으로 접촉하게 된다. 하이드로겔 쉘은 내부 액적과 마찬가지로 친수성을 나타내므로, 내부 액적에 함유되어 있던 활성물질이 쉘과 상호작용 할 수 있다. 이때 활성물질의 크기가 쉘의 공극 크기보다 작다면, 공극을 통하여 활성물질이 방출되게 된다. 따라서 쉘의 형상을 유지하면서 중간층만을 선택적으로 불안정하게 하는 외부 자극을 가하는 것에 의해, 쉘의 공극 크기보다 작은 활성물질만을 선택적으로 방출시키는 것이 가능하다. 중간층만을 선택적으로 불안정하게 하는 외부 자극으로는, 예를 들면 중간층을 용해시킬 수 있는 화학물질에 의한 화학적 자극이나, 액적으로 물이 유입됨에 따라 마이크로캡슐이 팽창하여 중간층을 불안정하게 만드는 삼투 자극을 들 수 있다. 또는 중간층에 계면활성제가 다량 함유되어 있고 중간층의 두께가 매우 얇다면, 온도 자극 역시 중간층을 불안정하게 할 수 있다. 이외에도 중간층을 불안정하게 할 수 있는 것이라면 어떤 자극이라도 적절하게 사용할 수 있을 것이며, 적절한 크기의 공극을 갖는 쉘을 사용하는 것에 의해 특정 크기의 물질을 선택적으로 방출시키는 것이 가능하다.The first release mode of the active material is to selectively release only the active material smaller than the pore size of the shell. When an external stimulus that selectively ruptures only the middle layer is applied to the microcapsule, the middle layer becomes unstable and the active material contained in the internal droplet comes into direct contact with the hydrogel shell. Since the hydrogel shell, like the internal droplet, exhibits hydrophilicity, the active material contained in the internal droplet can interact with the shell. At this time, if the size of the active material is smaller than the pore size of the shell, the active material is released through the pores. Therefore, by applying an external stimulus that selectively destabilizes only the middle layer while maintaining the shape of the shell, it is possible to selectively release only the active material smaller than the pore size of the shell. External stimuli that selectively destabilize only the middle layer include, for example, chemical stimulation caused by chemicals that can dissolve the middle layer, or osmotic stimulation that causes microcapsules to expand as water flows into the droplet, thereby destabilizing the middle layer. You can. Alternatively, if the middle layer contains a large amount of surfactant and the thickness of the middle layer is very thin, temperature stimulation may also destabilize the middle layer. In addition, any stimulus that can destabilize the middle layer can be used appropriately, and it is possible to selectively release materials of a specific size by using a shell with pores of an appropriate size.

두 번째 활성물질의 방출 양상은, 마이크로캡슐 내부에 캡슐화된 모든 활성물질을 동시에 방출시키는 것이다. 이러한 방출 양상은 쉘과 중간층을 함께 파열시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이를 가능하게 하는 외부 자극으로는 쉘의 모듈러스 이상의 힘을 가하는 물리적 자극이나, 삼투 자극을 들 수 있으며, 고온 처리에 의해 내부 압력을 증가시키는 것처럼 쉘과 중간층을 함께 파열시킬 수 있는 것이라면 자극의 종류에 제한되지 않는다.The second release mode of the active substance is to release all active substances encapsulated inside the microcapsule simultaneously. This release pattern can be achieved by rupturing the shell and middle layer together. External stimuli that make this possible include physical stimulation or osmotic stimulation that applies a force greater than the modulus of the shell. If it is something that can rupture the shell and middle layer together, such as increasing the internal pressure by high-temperature treatment, the type of stimulation depends. Not limited.

세 번째 활성물질의 방출 양상은, 크기와 무관하게 활성물질을 서서히 방출하는 것이다. 이는 중간층은 그대로 유지한 채 쉘만을 제거하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 하이드로겔 쉘이 일단 제거되면 초기에는 내부 액적이 중간층으로 둘러싸인 이중 에멀젼의 형상으로 존재한다. 이중 에멀젼은 형상을 유지할 수 있도록 외부로부터 보호해주는 쉘이 존재하지 않기 때문에 그 형상을 오래 유지하기 어려우며, 이 때문에 내부 액적에 함유된 활성물질을 크기와 상관없이 서서히 방출시키게 된다. 이를 위해서 마이크로캡슐을 이루는 쉘을 선택적으로 제거할 수 있도록 자극 감응성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다. 자극 감응성 고분자는 예를 들면, 낮은 pH에서 가수분해되는 pH 감응성 고분자, 특정 파장의 빛에 반응하여 분해되는 광반응성 고분자 등이 있으나 이외에도 초음파 감응성 고분자, 글루코스 감응성 고분자 등 다양한 자극에 반응하는 고분자가 존재하므로, 종래기술을 참작하여 활성물질의 전달에 적합한 것을 선정하여 사용할 수 있다. The third release pattern of the active material is to slowly release the active material regardless of size. This can be achieved by removing only the shell while leaving the middle layer intact. Once the hydrogel shell is removed, the internal droplet initially exists in the form of a double emulsion surrounded by an intermediate layer. Double emulsions are difficult to maintain their shape for a long time because there is no shell that protects them from the outside to maintain the shape, and because of this, the active substances contained in the internal droplets are gradually released regardless of size. For this purpose, it is desirable to use a stimulus-sensitive polymer so that the shell forming the microcapsule can be selectively removed. Stimulus-sensitive polymers include, for example, pH-sensitive polymers that hydrolyze at low pH and photoresponsive polymers that decompose in response to light of a specific wavelength. In addition, there are polymers that respond to various stimuli, such as ultrasound-sensitive polymers and glucose-sensitive polymers. Therefore, taking into account the prior art, one suitable for delivering the active substance can be selected and used.

이외에도, 외부 자극을 단계로 나누어 가하는 것에 의해 활성물질을 순차적으로 방출하도록 할 수도 있다. 즉, A) 중간층을 불안정하게 하는 것에 의해 쉘의 공극 크기보다 작은 활성물질만이 선택적으로 방출되는 단계; B) 쉘을 파열시켜 하이드로겔 쉘의 공극 크기보다 큰 물질이 방출되는 되는 단계;를 포함하여 활성물질이 순차적으로 방출되도록 할 수 있다. 당업자라면 자극의 종류와 강도를 적절히 조합하여 용도에 따라 활성물질을 적절한 순차에 따라 방출할 수 있도록 설계할 수 있을 것이다. In addition, the active substance can be released sequentially by applying external stimulation in stages. That is, A) the step of selectively releasing only the active material smaller than the pore size of the shell by destabilizing the intermediate layer; B) rupturing the shell to release a material larger than the pore size of the hydrogel shell; the active material may be released sequentially. A person skilled in the art would be able to design a method that appropriately combines the type and intensity of stimulation to release the active material in an appropriate sequence according to the intended use.

본 발명의 마이크로캡슐이 친수성 내부 액적-친유성 보호층-친수성 쉘의 형태인 경우에는 상기 내부 액적에 함유될 수 있는 활성물질로는 아스코르브산, 티아민, 리보플라빈, 나이아신, 판토텐산, 피리독신, 바이오틴, 코발라민, 콜린, 리포산, 글루타치온, 요산, 셀레늄, 아황산수소나트륨, 아데노신, 알부틴, 아세틸글루코사민, 병풀, 만니톨, 라이신 아젤레이트, 글루콘산구리, 펩타이드 구리, 갈산, 겐티스산, 4-하이드록시벤조산, 프로토케이트 -레조르실산, 살리실산, 시린산, 바닐산, 갈로탄닌, 엘라지탄닌으로 이루이진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 그의 염을 예로 들 수 있다. 그러나 상기 활성물질이 이에 한정되는 것이 아님은 당연하다. When the microcapsule of the present invention is in the form of a hydrophilic inner droplet-lipophilic protective layer-hydrophilic shell, active substances that can be contained in the inner droplet include ascorbic acid, thiamine, riboflavin, niacin, pantothenic acid, pyridoxine, biotin, and cobalamin. , choline, lipoic acid, glutathione, uric acid, selenium, sodium bisulfite, adenosine, arbutin, acetylglucosamine, centella asiatica, mannitol, lysine azelate, copper gluconate, peptide copper, gallic acid, gentisic acid, 4-hydroxybenzoic acid, proto. Cate - Resorcylic acid, salicylic acid, syric acid, vanillic acid, gallotannin, and ellagitannin can be cited as one or more selected from the group or a salt thereof. However, it is natural that the active material is not limited to this.

본 발명의 마이크로캡슐이 친유성 내부 액적-친수성 보호층-친유성 쉘의 형태인 경우에는 상기 내부 액적에 함유될 수 있는 활성물질로는 비타민 A(예를 들어, 레티놀, 레티날, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티노익산), 프로비타민 A 카로티노이드(예를 들어, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 감마-카로틴, 잔토필 베타-크립토잔틴), 토코페롤, 토코트리에놀, 카로티노이드(예를 들어, 루테인, 제아잔틴과 같은 잔토필, 리코펜, 카로틴), 리포산, 코엔자인 Q10, 리코펜, 루테인, 도데실 갈레이트, 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸화 히드록시아니솔, 옥타데센이산, 하이드록시데칸산, 디에틸헥실 시린길리덴말로네이트, 클로로겐산, t-신남산, 카페인산, p-쿠마르산, 페룰린산, 이소페룰린산, 시나프산, 플라반-3-올(예를 들어, (+)-카테킨, (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨 갈레이트, (-)-에피카테킨 갈레이트, (-)-갈로카테킨, (-)-에피갈로카테킨), 플라본(예를 들어, 아피제닌, 바이칼레인, 바이칼린, 크리신, 크리소크리올, 디오스메틴, 가르데닌 A, 겐관(genkwanin), 루테올, 비텍신, 이소비텍신, 시넨셋, 탄제렛, 우고노사이드), 이소플라본(예를 들어, 바이오카닌 A, 다이드제인, 다이진, 포르모노네틴, 제니스틴, 제니스테인, 글리시테인, 푸에라린), 플라바논(예를 들어, 디히드로미리세틴, 에리오딕티올, 헤스페레틴, 헤스페리딘, 네오헤스페리딘, 리퀴리티게닌, 리퀴리틴, 나린제닌, 나린진, 나리루틴, (+)-탁시폴린), 안토시아니딘(예를 들어, 시아니딘, 델피니딘, 말비딘, 펠라고니딘, 페오니딘, 페투니딘, 프로펠라고니딘), 축합 탄닌(예를 들어, 프로안토시아니딘, 류코안토시아니딘), 쿠마린(예를 들어, 쿠마린, 퓨라노쿠마린, 피라노쿠마린, 이소쿠마린), 스틸벤(예를 들어, 이소라폰티제닌(Isorhapontigenin), 옥시레스베라트롤, 피세이드, 피세아탄놀, 피노스틸벤, 프테로스틸벤, 레스베라트롤), 퀴논(예를 들어, 안트라퀴논, 페난트라퀴논, 나프토퀴논, 벤조퀴논), 리그난(예를 들어, 리그나놀리드, 사이클로리그나롤리드, 비스에폭시리그난, 네오리그난), 커큐미노이드(예를 들어, 커큐민, 진저롤 유도체), 칼콘(예를 들어, 이소리퀴리티게닌, 부테인, 플로레틴)으로 이루이진 군으로부터 선택된 하나 이상을 예로 들 수 있다. 마찬가지로 친유성 활성물질 또한 이에 한정되지 않는다. When the microcapsule of the present invention is in the form of a lipophilic inner droplet, a hydrophilic protective layer, and a lipophilic shell, the active substance that can be contained in the inner droplet is vitamin A (e.g., retinol, retinal, retinyl palmitate). tate, retinyl acetate, retinoic acid), provitamin A carotenoids (e.g. alpha-carotene, beta-carotene, gamma-carotene, xanthophyll beta-cryptoxanthin), tocopherols, tocotrienols, carotenoids (e.g. lutein) , xanthophylls such as zeaxanthin, lycopene, carotene), lipoic acid, coenzyme Q10, lycopene, lutein, dodecyl gallate, butylated hydroxytoluene, butylated hydroxyanisole, octadecendioic acid, hydroxydecanoic acid, Ethylhexyl syringylidenemalonate, chlorogenic acid, t-cinnamic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, isoferulic acid, sinapic acid, flavan-3-ol (e.g. (+)-catechin, (-)-epicatechin, (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-gallocatechin, (-)-epigallocatechin), flavones (e.g. apigenin , baicalein, baicalin, chrysin, chrysocriol, diosmetin, gardenin A, genkwanin, luteol, vitexin, isovitexin, sinenset, tangeret, ugonoside), isoflavone ( For example, biochanin A, daidzein, daizin, formononetin, genistin, genistein, glycitein, puerarin), flavanones (e.g. dihydromyricetin, eriodictyol, hesperetin) tin, hesperidin, neohesperidin, liquiritigenin, liquiritin, naringenin, naringin, narirutin, (+)-taxifolin), anthocyanidins (e.g. cyanidin, delphinidin, malvidin, pella) gonidin, peonidin, petunidin, propelagonidin), condensed tannins (e.g., proanthocyanidins, leucoanthocyanidins), coumarins (e.g., coumarins, furanocoumarins, pyranodines) coumarin, isocoumarin), stilbenes (e.g. isorhapontigenin, oxyresveratrol, piceid, piceatannol, pinostilbene, pterostilbene, resveratrol), quinones (e.g. anthraquinone) , phenanthraquinone, naphthoquinone, benzoquinone), lignans (e.g., lignanolide, cyclolignarolid, bisepoxylignan, neolignan), curcuminoids (e.g., curcumin, gingerol derivatives), Chalcones (e.g., isoliquiritigenin, butein, phloretin) include one or more selected from the iruzin group. Similarly, lipophilic active substances are also not limited to this.

본 발명의 명세서에서 산화방지제로는 내부 액적에 함유된 활성물질의 산화를 방지하는 것으로, 식품, 화장품 또는 약제학적 분야에서 안전성이 확인되어 산화방지제로서 사용이 허용된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 산화방지제로는 토코페롤, 카테킨, 차 추출물, 레시틴과 같은 천연 산화방지제와 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니졸, 터셔리부틸히드로퀴논, 에리쏘르빈산, 이디테이이, 몰식자산프로필, 아스코르빌 파르미테이트 또는 아스코르빌 스테아레이트와 같은 합성산화방지제를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 언급된 친수성 및 친유성 활성물질을 각각 산화방지제로도 사용할 수도 있음은 당연하다. In the specification of the present invention, the antioxidant prevents oxidation of the active substance contained in the internal liquid droplet, and it is preferable to use an antioxidant that has been confirmed safe and permitted for use as an antioxidant in the food, cosmetics, or pharmaceutical fields. Antioxidants include natural antioxidants such as tocopherol, catechin, tea extract, and lecithin, as well as dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, tert-butylhydroquinone, erythorbic acid, edite, propyl gallate, and ascorbyl parmi. Synthetic antioxidants such as tate or ascorbyl stearate may be used, but are not limited thereto. In addition, it is natural that the above-mentioned hydrophilic and lipophilic active substances can also be used as antioxidants, respectively.

본 발명의 마이크로캡슐은 활성물질을 함유하는 내부 액적, 산화방지제를 함유하는 중간층 및 고분자 전구체를 함유하는 쉘로 이루어진 삼중 에멀젼에서 쉘을 구성하는 고분자 전구체를 중합하는 것에 의해 제조될 수 있다. 저장하고자 하는 활성물질의 특성이 친수성인지 친유성인지에 따라 o/w/o/w 또는 w/o/w/o 삼중 에멀젼 시스템을 선택하여 제조할 수 있다. 삼중 에멀젼은 다양한 방법으로 제조될 수 있으나, 미세유체장비를 사용하는 것이 단분산성 삼중 에멀젼을 제조할 수 있고 각 층의 조성 뿐 아니라 두께 역시 유속을 조절하는 것에 의해 정밀하게 제어할 수 있으므로 미세유체장비를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 삼중 에멀젼을 제조하는 미세유체장비는 본 발명자의 등록특허 제10-1466770호를 비롯하여 종래 기술에서 잘 알려져 있으므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. The microcapsules of the present invention can be prepared by polymerizing the polymer precursor constituting the shell in a triple emulsion consisting of an inner droplet containing the active agent, a middle layer containing an antioxidant, and a shell containing the polymer precursor. Depending on whether the active material to be stored is hydrophilic or lipophilic, it can be prepared by selecting an o/w/o/w or w/o/w/o triple emulsion system. Triple emulsions can be produced in a variety of ways, but using microfluidic equipment can produce monodisperse triple emulsions, and not only the composition of each layer but also the thickness can be precisely controlled by controlling the flow rate. It is more preferable to use . Microfluidic equipment for producing triple emulsion is well known in the prior art, including the present inventor's registered patent No. 10-1466770, so detailed description thereof will be omitted.

쉘을 구성하는 고분자 물질의 중합은 다양한 종래기술의 방법을 이용할 수 있으나, 광중합을 포함한 라디칼 중합은 제외하는 것이 바람직하다. 라디칼 중합을 이용하는 경우, 중합과정에서 생성된 라디칼에 의해 내부 액적에 함유된 활성물질이 쉽게 산화될 수 우려가 있다. 따라서, 상기 중합 방법으로는 열중합, 호스트-게스트 상호작용, 계면복합체, 용매증발, 이온성 겔화 중 사용하는 활성물질의 특성에 따라 안정성에 영향을 주지 않는 범위 내에서 어느 하나의 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 중합 방법에 의해 중합되는 고분자 전구체와, 중합 조건에 따른 공극의 크기를 비롯한 구조에 대해서 역시 많은 연구가 진행되어 종래 기술에서 이미 잘 알려져 있다. 본 발명은 중합에 의해 공극을 갖는 고분자를 형성하는 물질을 이용하는 것으로 구체적인 조성에 의한 특성을 이용하는 것이 아니므로, 고분자 전구체의 종류에 의해 제한되는 것은 아니다. 하기 실시예에서는 알지네이트를 이온성 겔화하여 중합한 것을 예시하였으나, 중합 방법에 따라 적절한 고분자 전구체를 선택하는 것은 당업자에게 용이할 것이다. 이외에도 쉘을 자극 감응성 고분자로 구성하는 것에 의해, 마이크로캡슐이 해당 자극에 감응하도록 할 수 있다. 자극 감응성 고분자의 예로는 친수성 고분자로서, pH 반응성 고분자인 폴리아크릴릭애씨드, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴산), 폴리(비닐 알코올), 알긴산, 열 반응성 고분자인 폴리(N- 이소 프로필 아크릴 아미드), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(3-카프로락톤), 폴리(프로필렌 글리콜), 아가로즈, 젤라틴), 전기 반응성 고분자인 폴리아크릴릭애씨드, 4-하이드록시부틸 아크릴레이트, 폴리(2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산), 키토산)를 예로 들 수 있다. 친유성 고분자로서 자극 반응성 고분자로 폴리젖산(PLA), 폴리락틱코글리콜산(PLGA), 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트(TMPTA), 에톡실화 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트(ETPTA)를 예로 들 수 있다. 각종 자극 감응성 고분자는 이미 많은 분야에서 연구되어 있으며, 본 발명은 자극 감응성 물질 자체가 아닌, 이의 응용에 특징이 있는 것은 아니므로 이에 대한 구체적인 설명은 생략하며 상기 예시된 자극이나 상기 예시된 고분자에 한정되지 않음은 당연하다. Polymerization of the polymer material constituting the shell can be done using various conventional methods, but it is preferable to exclude radical polymerization, including photopolymerization. When radical polymerization is used, there is a risk that the active material contained in the internal liquid droplet may be easily oxidized by radicals generated during the polymerization process. Therefore, the polymerization method may be any one of thermal polymerization, host-guest interaction, interfacial complexation, solvent evaporation, and ionic gelation, depending on the characteristics of the active material used, as long as it does not affect stability. desirable. Much research has been conducted on the polymer precursor polymerized by the above polymerization method and its structure, including the size of pores according to polymerization conditions, and is already well known in the prior art. Since the present invention uses a material that forms a polymer with voids through polymerization and does not utilize properties based on a specific composition, it is not limited by the type of polymer precursor. In the following examples, alginate was polymerized by ionic gelation, but it will be easy for those skilled in the art to select an appropriate polymer precursor according to the polymerization method. In addition, by constructing the shell with a stimulus-sensitive polymer, the microcapsule can be made to respond to the stimulus. Examples of stimulus-sensitive polymers include hydrophilic polymers, such as pH-responsive polymers such as polyacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate, poly(acrylamide), poly(methacrylic acid), poly(vinyl alcohol), alginic acid, and heat-responsive polymers. Poly(N-isopropyl acrylamide), poly(ethylene glycol), poly(3-caprolactone), poly(propylene glycol), agarose, gelatin), electroreactive polymer polyacrylic acid, 4-hydroxy Examples include butyl acrylate, poly(2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid), and chitosan. Examples of lipophilic polymers that are responsive to stimuli include polylactic acid (PLA), polylactic coglycolic acid (PLGA), trimethylolpropane triacrylate (TMPTA), and ethoxylated trimethylolpropane triacrylate (ETPTA). Various stimulus-sensitive polymers have already been studied in many fields, and the present invention is not characterized by the stimulus-sensitive material itself, but rather by its application, so detailed description thereof will be omitted and limited to the stimulus or polymer exemplified above. It is natural that it does not work.

내부 액적이나 중간층, 쉘의 조성이나 각각의 두께와 같은 마이크로캡슐 자체의 특성은 활성물질의 저장 특성 뿐 아니라 활성물질의 방출 양상에도 영향을 미친다. The properties of the microcapsule itself, such as the composition of the inner droplet, middle layer, and shell, or their respective thickness, affect not only the storage characteristics of the active material but also the release pattern of the active material.

저장 특성과 관련하여, 예를 들어, 쉘의 공극율이 작을수록 외부로부터 확산되는 산소나 수분의 양 또한 적기 때문에 저장 특성이 더욱 우수하며, 중간층의 두께가 두꺼울수록 내부 액적에 대한 보호 효과가 우수하므로 저장 특성 역시 우수하다. 중간층의 점도가 높을수록 물질의 확산 속도가 낮아지므로 저장 특성이 우수하다.Regarding storage characteristics, for example, the smaller the porosity of the shell, the less oxygen or moisture diffuses from the outside, so the storage characteristics are better, and the thicker the middle layer is, the better the protection effect for internal droplets is. Storage characteristics are also excellent. The higher the viscosity of the middle layer, the lower the diffusion rate of the material, so the storage characteristics are excellent.

삼투압을 이용한 활성물질의 방출을 예를 들면, 내부 액적에 함유된 삼투 물질의 농도가 삼투압을 직접적으로 결정하므로 삼투 물질의 함유량이 높을수록 활성물질의 방출속도가 빨라진다. 중간층의 조성은 중간층의 두께에 영향을 미친다. 동일한 장비에서 동일한 유속으로 삼중 에멀젼을 제조한다고 하더라도 중간층의 점도가 높으면 중간층의 두께가 두꺼워진다. 중간층의 두께가 두꺼울수록 중간층을 불안정하게 하는 데에는 더 많은 크기의 자극이 필요하며, 활성물질의 방출에 소요되는 시간도 더 길어질 것이라 예측할 수 있다. 삼투 자극에 의해 활성물질이 방출된다면, 중간층에 함유된 계면활성제의 양도 활성물질의 방출속도에 영향을 미칠 수 있다. 계면활성제의 양이 많을수록 내부 액적으로의 물의 유입이 용이하며 따라서 활성물질의 방출이 더 용이하다. 중간층의 두께와 쉘의 두께 역시 활성물질의 방출 특성에 영향을 미친다. 특히 쉘의 두께는 쉘의 모듈러스에 영향을 미치기 때문에 자극에 의해 중간층만이 파열되거나 쉘과 중간층이 함께 파열되도록 할 수 있어 활성물질의 방출 양상 자체를 변화시킬 수 있다. For example, in the release of an active material using osmotic pressure, the concentration of the osmotic material contained in the internal droplet directly determines the osmotic pressure, so the higher the content of the osmotic material, the faster the release rate of the active material. The composition of the middle layer affects the thickness of the middle layer. Even if a triple emulsion is manufactured with the same equipment and at the same flow rate, if the viscosity of the middle layer is high, the thickness of the middle layer becomes thick. It can be predicted that the thicker the middle layer, the more stimulation is needed to destabilize the middle layer, and the longer it takes for the release of the active material. If the active substance is released by osmotic stimulation, the amount of surfactant contained in the middle layer may affect the release rate of the active substance. The greater the amount of surfactant, the easier it is for water to flow into the internal droplet and thus the easier the release of the active material. The thickness of the intermediate layer and the shell also affect the release characteristics of the active material. In particular, because the thickness of the shell affects the modulus of the shell, stimulation can cause only the middle layer to rupture or both the shell and the middle layer to rupture, thereby changing the release pattern of the active material itself.

따라서 본 발명에서는 내부 액적에 함유된 삼투 물질의 농도, 중간층의 두께, 중간층의 조성, 쉘의 조성 또는 쉘의 두께에 의해 활성물질의 방출 특성 및 저장 특성을 제어할 수 있다. 중간층의 두께와 쉘의 두께는 하기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 삼중 에멀젼의 제조 과정에서 각 층을 구성하는 용액의 주입속도를 조절하는 것에 의해 용이하게 제어할 수 있다.Therefore, in the present invention, the release characteristics and storage characteristics of the active material can be controlled by the concentration of the osmotic material contained in the internal droplet, the thickness of the middle layer, the composition of the middle layer, the composition of the shell, or the thickness of the shell. As can be seen in the examples below, the thickness of the middle layer and the shell can be easily controlled by adjusting the injection rate of the solution constituting each layer during the manufacturing process of the triple emulsion.

본 발명의 마이크로캡슐은 산화되기 쉬운 활성물질의 전달체로서, 화장료 조성물, 식품 조성물 및 약물전달체에 유용하게 사용될 수 있다.The microcapsule of the present invention is a carrier for active substances that are easily oxidized, and can be usefully used in cosmetic compositions, food compositions, and drug carriers.

이상과 같이 본 발명의 마이크로캡슐에 의하면 내부 액적에 함유된 산화되기 쉬운 활성물질에 대해 중간층이 외부와의 접촉을 1차적으로 차단하고, 중간층에 함유된 산화방지제가 다시 한번 확산에 의한 산화반응으로부터 활성물질을 보호하기 때문에 활성물질의 저장 안정성을 크게 향상시킬 수 있다.As described above, according to the microcapsule of the present invention, the middle layer primarily blocks external contact with the easily oxidized active material contained in the internal liquid droplet, and the antioxidant contained in the middle layer prevents the oxidation reaction by diffusion once again. Because it protects the active material, the storage stability of the active material can be greatly improved.

또한 상기 마이크로캡슐은 다양한 외부 자극에 반응하여 활성물질을 방출할 수 있도록 할 수 있으므로, 화장료 조성물이나 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있다.In addition, the microcapsules can release active substances in response to various external stimuli, so they can be usefully used as cosmetic compositions or drug delivery vehicles.

이에 더하여, 본 발명의 마이크로캡슐은 마이크로플루이딕스를 이용하여 단분산성으로 대량생산이 가능할 뿐 아니라, 주입속도의 조절에 의해 내부액적, 중간층 및 쉘의 두께를 용이하게 제어할 수 있어 활성물질의 저장 특성 및 방출 특성을 용이하게 제어할 수 있다. In addition, the microcapsules of the present invention can be mass-produced in monodisperse using microfluidics, and the thickness of the inner droplet, middle layer, and shell can be easily controlled by adjusting the injection speed, thereby enabling storage of active substances. Characteristics and emission characteristics can be easily controlled.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 마이크로캡슐의 제조과정을 보여주는 모식도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 마이크로캡슐의 명시야 현미경 이미지 및 입경 분포를 나타내는 그래프.
도 3은 광중합에 의한 마이크로캡슐 제조 시 아스코르브산의 산화를 보여주는 이미지.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 각 유체의 유속에 따른 유체 흐름의 패턴을 보여주는 그래프 및 이미지.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 주입속도의 조절에 의해 마이크로캡슐 쉘의 두께를 조절할 수 있음을 보여주는 그래프 및 이미지.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 알지네이트 하이드로겔 쉘의 형성에 대한 초산과 Ca-EDTA 농도의 영향을 보여주는 그래프 및 이미지.
도 7은 마이크로캡슐에 저장된 L-AA의 저장 안정성 평가 과정을 보여주는 개념도.
도 8은 Fe³⁺환원능 평가에 의한 마이크로캡슐에 저장된 L-AA의 저장 안정성 평가 결과를 보여주는 그래프.
도 9는 온도에 따른 마이크로캡슐의 환원력을 보여주는 그래프.
도 10은 Caco-2 세포에서 세포내 산화 스트레스 모델에 의한 마이크로캡슐에 저장된 L-AA의 저장 안정성 평가 결과를 보여주는 그래프.
도 11은 NIH-3T3 세포에서 세포내 산화 스트레스 모델에 의한 마이크로캡슐에 저장된 L-AA의 저장 안정성 평가 결과를 보여주는 그래프.
도 12는 외부 자극에 의해 내부 액적에 함유된 물질이 방출되는 것을 보여주는 모식도 및 현미경 이미지. 1 is a schematic diagram showing the manufacturing process of microcapsules according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a graph showing a bright field microscope image and particle size distribution of microcapsules obtained by an embodiment of the present invention.
Figure 3 is an image showing the oxidation of ascorbic acid during microcapsule production by photopolymerization.
Figure 4 is a graph and image showing a fluid flow pattern according to the flow rate of each fluid in one embodiment of the present invention.
Figure 5 is a graph and image showing that the thickness of the microcapsule shell can be adjusted by adjusting the injection speed in one embodiment of the present invention.
Figure 6 is a graph and images showing the effect of acetic acid and Ca-EDTA concentration on the formation of an alginate hydrogel shell in one embodiment of the present invention.
Figure 7 is a conceptual diagram showing the storage stability evaluation process of L-AA stored in microcapsules.
Figure 8 is a graph showing the storage stability evaluation results of L-AA stored in microcapsules by evaluating Fe ³⁺ reducing ability.
Figure 9 is a graph showing the reducing power of microcapsules according to temperature.
Figure 10 is a graph showing the storage stability evaluation results of L-AA stored in microcapsules by the intracellular oxidative stress model in Caco-2 cells.
Figure 11 is a graph showing the storage stability evaluation results of L-AA stored in microcapsules by an intracellular oxidative stress model in NIH-3T3 cells.
Figure 12 is a schematic diagram and microscope image showing the release of substances contained in internal droplets by external stimulation.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다. The present invention will be described in more detail below with reference to the attached examples. However, these drawings and examples are merely examples for easily explaining the content and scope of the technical idea of the present invention, and the technical scope of the present invention is not limited or changed thereby. Based on these examples, it will be obvious to those skilled in the art that various modifications and changes are possible within the scope of the technical idea of the present invention.

[실시예][Example]

실시예 1 : 삼중 에멀젼 형성을 위한 미세유체장비의 제조Example 1: Preparation of microfluidic equipment for triple emulsion formation

삼중 에멀젼 형성을 위한 미세유체장비는 Adv. Mater. 2016, 28, 3340-3344에 기재된 방법을 수정하여 제조하였다. The microfluidic equipment for triple emulsion formation is described in Adv. Mater. It was prepared by modifying the method described in 2016, 28, 3340-3344.

구체적으로, 외경이 1 mm이고, 내경이 580 ㎛인 유리 모세관(W.P.I)을 일말단의 내경이 100 ㎛인 테이퍼 형상이 되도록 한쪽 끝을 가공하여 주입용 모세관을 제조하였다. 내벽을 소수성으로 표면개질하기 위하여, 가공된 모세관을 트리클로로(옥타데실)실란(Sigma-Aldrich)에 10분간 침지한 후, 에탄올로 세척하였다.Specifically, a capillary for injection was manufactured by processing one end of a glass capillary (W.P.I.) with an outer diameter of 1 mm and an inner diameter of 580 ㎛ into a tapered shape with an inner diameter of 100 ㎛. In order to surface modify the inner wall to make it hydrophobic, the processed capillary was immersed in trichloro(octadecyl)silane (Sigma-Aldrich) for 10 minutes and then washed with ethanol.

이와 별도로 주입구로 두 가지의 비혼화성 액체를 각각 주입할 수 있도록 일말단의 외경이 20 ㎛가 되도록 테이퍼 형상을 형성한 작은 모세관을 제조하였다.Separately, a small capillary tube was manufactured with a tapered shape such that the outer diameter of one end was 20 ㎛ so that two types of immiscible liquids could be injected through the injection port.

수집용 모세관은 일말단의 내경이 350 ㎛인 테이퍼 형상으로 제조하였으며, 주입용 모세관과 동일한 방법에 의해 내벽을 소수성으로 표면개질하였다. The collection capillary was manufactured in a tapered shape with an inner diameter of 350 ㎛ at one end, and the inner wall was surface modified to be hydrophobic using the same method as the injection capillary.

주입용 모세관을 주입용 모세관의 외경보다 내부넓이가 조금 큰 1.05 mm인 사각 모세관(A.I.T)에 삽입하고, 주입용 모세관의 내부에 상기 작은 모세관을 삽입하였다. 사각 모세관의 타단측으로 테이퍼 형상의 수집용 모세관을 삽입하였다. 조립된 모세관들은 5 min epoxy(Devcon)을 사용하여 고정하였다.The injection capillary was inserted into a 1.05 mm square capillary (A.I.T) whose inner width is slightly larger than the outer diameter of the injection capillary, and the small capillary was inserted into the inside of the injection capillary. A tapered collection capillary was inserted into the other end of the square capillary. The assembled capillaries were fixed using 5 min epoxy (Devcon).

실시예 2 : 활성물질을 함유한 마이크로캡슐의 제조Example 2: Preparation of microcapsules containing active substances

살아있는 세포의 항산화 방어 메커니즘을 모방하여, 마이크로캡슐에서 산화되기 쉬운 활성물질을 자극 반응성 마이크로캡슐 내에 안정하게 저장할 수 있음을 확인하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 미세유체장비를 사용하여 모델 활성물질로 안정성이 낮은 것으로 알려진 L-아스코르브산(L-AA)을 수성 내부 액적(Q_IA)에 함유하고, L-AA에 대한 항산화 보호 효능을 나타낼 수 있는 α-토코페롤(α-T)이 함유된 오일 상이 내부 액적을 둘러싼 중간층(Q_IO)을 구성하며, 하이드로겔을 형성할 수 있는 알지네이트 수용액이 중간층을 둘러싼 최외곽 쉘(Q_M)을 이루는 삼중 에멀젼(w/o/w/o)을 제조하였다. 삼중 에멀젼은 추후 마이크로캡슐의 생성을 위한 주형으로 작용한다.By mimicking the antioxidant defense mechanism of living cells, it was confirmed that active substances that are prone to oxidation in microcapsules can be safely stored in stimulus-responsive microcapsules. To this end, using the microfluidic device prepared in Example 1, L-ascorbic acid (L-AA), which is known to have low stability as a model active material, was contained in an aqueous internal droplet (Q _IA ), and L-AA was added to the aqueous inner droplet (Q IA). The oil phase containing α-tocopherol (α-T), which can exhibit anti-oxidant protection effects, constitutes the middle layer (Q _IO ) surrounding the inner droplet, and the alginate aqueous solution, which can form hydrogel, forms the outermost shell surrounding the middle layer. A triple emulsion (w/o/w/o) forming (Q _M ) was prepared. The triple emulsion acts as a template for the subsequent creation of microcapsules.

도 1은 상기 방법에 의한 마이크로캡슐의 제조과정을 보여주는 모식도로, 도 1을 참조하여 구체적으로 마이크로캡슐의 제조방법을 설명한다.Figure 1 is a schematic diagram showing the manufacturing process of microcapsules by the above method, and the manufacturing method of microcapsules will be described in detail with reference to Figure 1.

작은 모세관에는 L-AA과 산화환원 지시약인 erioglaucine disodium salt을 포함하는 수용액을 주입하였다. 수용액은 L-AA의 초기 안정성을 확보하기 위하여 pH를 3으로 조절하였으며, L-AA이 산화되면 지시약의 색은 파란색에서 무색으로 변하므로 산화환원 지시약의 색 변화에 의해 삼중 에멀젼의 제조 과정에서 L-AA의 활성이 유지되는 지를 육안으로 확인할 수 있다. 주입용 모세관으로는 0.052 wt%의 α-T를 함유하는 해바라기유를, 사각 모세관과 주입용 모세관의 사이에는 15~30mM Ca-EDTA(calcium disodium EDTA)를 함유하는 2 wt% 알지네이트 수용액을 각각 주입하였다. 사각 모세관과 수집용 모세관의 사이로는 2 wt%의 Span 80을 포함하는 미네랄 오일을 공급하여 삼중 에멀젼이 생성되도록 하였다. 삼중 에멀젼의 제조 시, 각 용액의 주입 속도는 시린지 펌프(Legato100, KD Scientific)를 사용하여 정밀하게 제어하였으며, 에멀젼 액적의 생성을 고속 카메라(MINI UX 50)가 장착된 역상 형광 현미경(Eclipse Ti2, Nikon)으로 관측하였다. An aqueous solution containing L-AA and erioglaucine disodium salt, a redox indicator, was injected into the small capillary. The pH of the aqueous solution was adjusted to 3 to ensure the initial stability of L-AA. When L-AA is oxidized, the color of the indicator changes from blue to colorless, so the color of the redox indicator changes L-AA during the production of triple emulsion. -You can visually check whether the activity of AA is maintained. Sunflower oil containing 0.052 wt% of α-T was injected into the injection capillary, and a 2 wt% alginate aqueous solution containing 15 to 30mM Ca-EDTA (calcium disodium EDTA) was injected between the square capillary and the injection capillary. did. Mineral oil containing 2 wt% of Span 80 was supplied between the square capillary and the collection capillary to create a triple emulsion. During the preparation of the triple emulsion, the injection speed of each solution was precisely controlled using a syringe pump (Legato100, KD Scientific), and the generation of emulsion droplets was monitored under an inverted fluorescence microscope (Eclipse Ti2, Eclipse Ti2) equipped with a high-speed camera (MINI UX 50). Observed with Nikon).

삼중 에멀젼이 안정적으로 형성되는 것이 확인되면, 추가의 사각 모세관으로 흘려보내면서, 해당 사각 모세관에 0.5~2% 초산을 함유하는 미네랄 오일을 2,000 ul/hr 속도로 주입하였다. 오일에 함유된 초산은 쉘 내부로 확산되어 Ca-EDTA를 해리시켜 칼슘이온이 방출되도록 함에 따라, 이온성 겔화에 의해 알지네이트 하이드로겔 쉘이 형성되도록 하여 마이크로캡슐을 제조하였다. 제조된 마이크로캡슐은 pH 6.86의 완충액에 분산시켜 미네랄 오일 층을 분리시키고, 별도의 세척과정 없이 수득하였다. 생성된 하이드로겔 마이크로캡슐의 현미경 이미지는 CCD 카메라(sCMOS Zyla, Andor)가 장착된 역상 형광 현미경(Eclipse Ti2, Nikon)으로 관측하였으며, ImageJ(National Institute oc Health) 및 NIS Elements(Nikon) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 이미지를 분석하였다. Once it was confirmed that the triple emulsion was stably formed, it flowed into an additional square capillary, and mineral oil containing 0.5-2% acetic acid was injected into the square capillary at a rate of 2,000 ul/hr. Acetic acid contained in the oil diffused into the shell and dissociated Ca-EDTA to release calcium ions, forming an alginate hydrogel shell through ionic gelation to prepare microcapsules. The prepared microcapsules were dispersed in a buffer solution of pH 6.86 to separate the mineral oil layer, and were obtained without a separate washing process. Microscopic images of the resulting hydrogel microcapsules were observed with an inverted fluorescence microscope (Eclipse Ti2, Nikon) equipped with a CCD camera (sCMOS Zyla, Andor), using ImageJ (National Institute oc Health) and NIS Elements (Nikon) software programs. Images were analyzed using .

도 2는 상기 방법에 의해 얻어진 마이크로캡슐의 명시야 현미경 이미지 및 입경 분포를 나타내는 그래프로, 단분산성의 마이크로캡슐이 형성되었음을 보여준다. 또한 내부 액적이 선명한 파란색을 나타내는 것으로부터, 마이크로캡슐 제조과정에서 아스코르브산이 안정하게 유지되었음을 확인할 수 있다.Figure 2 is a graph showing a bright field microscope image and particle size distribution of microcapsules obtained by the above method, showing that monodisperse microcapsules were formed. In addition, since the internal droplet shows a clear blue color, it can be confirmed that ascorbic acid was kept stable during the microcapsule manufacturing process.

반면, 삼중 에멀젼의 최외곽 쉘을 광개시제인 Darocur 1173이 첨가된 PEG 용액으로 형성하고, UV를 조사하여 광중합하는 것에 의해 마이크로캡슐을 제조한 경우에는 도 3에서 확인할 수 있듯이 내부 액적의 색이 흐려져 아스코르브산의 산화반응이 진행된 것을 시사하였다. 도 3의 하단은 아스코르브산을 함유하지 않은 삼중 에멀젼 액적을 광중합한 것으로, 최외곽 쉘의 광개시제나 광조사 자체가 색상 변화를 야기한 것은 아님을 의미한다. On the other hand, when the outermost shell of the triple emulsion was formed with a PEG solution to which Darocur 1173, a photoinitiator, was added, and the microcapsules were manufactured by photopolymerization by UV irradiation, the color of the inner droplet became blurred, as can be seen in Figure 3, and ascorbic acid appeared. This indicated that the acid oxidation reaction had progressed. The bottom of Figure 3 shows a photopolymerization of a triple emulsion droplet that does not contain ascorbic acid, meaning that neither the photoinitiator of the outermost shell nor the light irradiation itself caused the color change.

도 4는 삼중 에멀젼 형성에 사용된 각 유체의 주입 속도를 조절하는 것에 의해 안정적인 삼중 에멀젼을 형성할 수 있음을 보여주는 것으로, 유속에 따라 흐름 패턴이 젯팅(×), 불균일(△), 삼중 에멀젼(●) 및 분리된 흐름(□)으로 나누어 짐을 보여준다. Q_M는 알지네이트 수용액의 주입속도를 나타내며, Q_I는 코어를 형성하는 아스코르브산 수용액(Q_IA)과 오일층을 형성하는 오일상(Q_IO)의 주입속도의 합, 즉, Q_I=Q_IA+Q_IO을 나타낸다. Figure 4 shows that a stable triple emulsion can be formed by controlling the injection speed of each fluid used to form the triple emulsion. Depending on the flow rate, the flow pattern is jetting (×), heterogeneous (△), and triple emulsion ( ●) and separate flows (□) to show the load. Q _M represents the injection speed of the alginate aqueous solution, and Q _I is the sum of the injection speeds of the ascorbic acid aqueous solution (Q _IA ) forming the core and the oil phase (Q _IO ) forming the oil layer, that is, Q _I = Q _IA +Q stands for _IO .

도 5는 전체 유속의 합을 일정하게 유지한 채, Q_M와 Q_I의 비율을 변화시켜 제조한 마이크로캡슐의 현미경 이미지이다. 도 5는 주입속도의 조절에 의해 하이드로겔 쉘의 두께를 조절할 수 있음을 보여준다.Figure 5 is a microscope image of a microcapsule manufactured by changing the ratio of Q _M and Q _I while keeping the sum of the total flow rates constant. Figure 5 shows that the thickness of the hydrogel shell can be adjusted by controlling the injection speed.

도 6은 상기 마이크로캡슐의 제조 조건에서 알지네이트 하이드로겔 쉘의 형성이 초산 및 Ca-EDTA의 농도에 영향을 받는 것을 보여주는 그래프이다. 도 6에서 ●은 하이드로겔이 정상적으로 형성되는 구간을 나타내며, △는 하이드로겔이 부분적으로 형성되는 구간을, ×는 하이드로겔이 형성되지 않는 구간을 나타낸다. 초산의 농도가 너무 낮거나, Ca-EDTA의 농도가 너무 낮은 경우 하이드로겔이 효과적으로 형성되지 못하는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, Ca-EDTA의 농도는 5mM, 초산의 농도는 0.5 vol% 이상인 경우 겔화가 유도되며, 농도가 증가됨에 따라 겔 형성이 효과적으로 진행되었다. Figure 6 is a graph showing that the formation of the alginate hydrogel shell is affected by the concentration of acetic acid and Ca-EDTA under the microcapsule manufacturing conditions. In Figure 6, ● represents the section in which the hydrogel is normally formed, △ represents the section in which the hydrogel is partially formed, and × represents the section in which the hydrogel is not formed. It can be seen that if the concentration of acetic acid is too low or the concentration of Ca-EDTA is too low, the hydrogel cannot be formed effectively. Specifically, gelation was induced when the concentration of Ca-EDTA was 5mM and the concentration of acetic acid was 0.5 vol% or more, and as the concentration increased, gel formation proceeded effectively.

실시예 3 : 활성물질의 저장 안정성 평가Example 3: Evaluation of storage stability of active substances

(1) Fe(1)Fe ³⁺³⁺ 환원능 평가에 의한 L-AA의 저장 안정성 평가 Storage stability evaluation of L-AA by reducing ability evaluation

알지네이트 하이드로겔의 공극 크기는 5 nm이고 L-AA의 수력학적인 직경은 0.3 nm로 알려져 있으므로, 삼투 자극에 의해 중간층인 오일층이 불안정화되면 내부 액적에 함유된 L-AA를 하이드로겔 쉘 밖으로 방출시킬 수 있다. 이를 이용하면, 시간 간격에 따라 캡슐화된 L-AA의 활성을 측정할 수 있다. 이를 이용하여 하이드로겔 마이크로캡슐에서 아스코르브산의 저장 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 2의 방법에 따라 마이크로캡슐을 제조하였다. 해바라기유는 그 자체에 항산화작용을 나타내는 성분들을 포함하고 있어 결과의 분석이 복잡할 수 있으므로 명료한 해석을 위하여, 중간층을 형성하는 오일로는 도데칸을 사용하였다. 제조된 마이크로캡슐 50 mg을 상온에서 1% 아스크로브산을 함유하는 내부 액적의 오스몰농도에 해당하는 14% 수크로오스 용액(430 mOsmol/kg) 용액 1 mL에 저장하였다. 소정의 시간이 경과하면, 마이크로캡슐을 1 mL DI 수로 옮겨 삼투압에 의해 L-AA가 마이크로캡슐의 쉘 밖으로 방출되도록 하였다. 이후 마이크로캡슐을 제거한 용액에 Fe³⁺와 1,10-phenanthroline를 포함하는 수용액(0.2%(w/v) 1,10-phenanthroline monohydrate, 0.16%(w/v) ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate, 2%(v/v) 1 M hydrochloric acid을 포함한 DI수) 0.8 mL를 첨가하였다. L-AA는 Fe³⁺를 Fe²⁺로 환원시키며, 이후 1,10-phenoanthroline과의 착물을 형성하여 붉은 오렌지색을 나타내므로 510 nm에서의 흡광도를 측정하는 것에 의해 L-AA의 활성도를 측정할 수 있다(도 7). Since the pore size of alginate hydrogel is 5 nm and the hydrodynamic diameter of L-AA is known to be 0.3 nm, when the oil layer, which is the middle layer, is destabilized by osmotic stimulation, L-AA contained in the internal droplet is released out of the hydrogel shell. You can do it. Using this, the activity of encapsulated L-AA can be measured over time intervals. In order to evaluate the storage stability of ascorbic acid in hydrogel microcapsules, microcapsules were prepared according to the method of Example 2. Since sunflower oil itself contains ingredients that exhibit antioxidant properties, the analysis of the results may be complicated, so for clear interpretation, dodecane was used as the oil that forms the middle layer. 50 mg of the prepared microcapsules were stored in 1 mL of a 14% sucrose solution (430 mOsmol/kg) corresponding to the osmolality of the internal droplet containing 1% ascorbic acid at room temperature. After a predetermined time had elapsed, the microcapsules were transferred to 1 mL DI water so that L-AA was released out of the shell of the microcapsules by osmotic pressure. Afterwards, the solution from which the microcapsules were removed was added to an aqueous solution containing Fe ³⁺ and 1,10-phenanthroline (0.2% (w/v) 1,10-phenanthroline monohydrate, 0.16% (w/v) ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate, 0.8 mL of DI water containing 2% (v/v) 1 M hydrochloric acid) Added. L-AA reduces Fe ³⁺ to Fe ²⁺ and then forms a complex with 1,10-phenoanthroline, giving a reddish-orange color. Therefore, the activity of L-AA can be measured by measuring the absorbance at 510 nm. (Figure 7).

도 8의 A는 그 결과를 보여주는 것으로, 오일층에 α-T를 함유하는 경우에는 4주 후에도 L-AA의 활성이 유지되었으며, 오히려 초기 활성보다 약간 증가한 값을 나타내었다. 이는 마이크로캡슐 제조 전 시약 보관 과정에서 일부 산화된 L-AA가 α-T에 의해 다시 환원되었을 가능성을 시사한다. 반면, 오일층에 α-T가 함유되지 않은 경우에는 4주 후 L-AA의 활성이 초기 활성의 94.6±4.25%로 약간 감소한 경향을 나타내었다. 마이크로캡슐 구조 자체가 L-AA의 활성 유지에 유리한 작용을 하는 것을 확인하기 위하여, 추가로 벌크 상태에서의 저장 안정성을 측정하였다. 벌크 시험은, 시험관 내에 마이크로캡슐과 동일한 농도의 L-AA 수용액을 담고, 그 위에 α-T이 함유되거나 함유되지 않은 도데칸 층을 형성시킨 후 저장하면서 L-AA의 활성을 측정하였다. 벌크 상태에서는 마이크로캡슐에 비해 L-AA의 활성 저하가 더 현저하였으며, 오일층에 α-T가 함유되어 있지 않은 경우 L-AA의 활성이 더 빠르게 감소하였다.Figure 8A shows the results. In the case where α-T was contained in the oil layer, the activity of L-AA was maintained even after 4 weeks, and showed a slightly increased value compared to the initial activity. This suggests that some oxidized L-AA may have been reduced again by α-T during the reagent storage process prior to microcapsule manufacturing. On the other hand, when the oil layer did not contain α-T, the activity of L-AA showed a slight decrease to 94.6 ± 4.25% of the initial activity after 4 weeks. In order to confirm that the microcapsule structure itself has a beneficial effect on maintaining the activity of L-AA, storage stability in the bulk state was additionally measured. In the bulk test, the activity of L-AA was measured by placing an aqueous solution of L-AA at the same concentration as the microcapsule in a test tube, forming a dodecane layer containing or not containing α-T on it, and then storing it. In the bulk state, the decrease in the activity of L-AA was more significant compared to the microcapsule, and when the oil layer did not contain α-T, the activity of L-AA decreased more rapidly.

도 8의 B는 마이크로캡슐에서 중간층에 함유된 α-T와 내부 액적에 함유된 L-AA의 몰 비율이 L-AA의 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프로, 이를 위하여 L-AA의 농도는 일정하게 유지하면서 중간층에 함유된 α-T의 농도를 조절하였다. 도 8의 B로부터 α-T의 함량이 높을수록 L-AA의 저장안정성이 우수한 것을 확인할 수 있으나, 1:100의 비율로 함유된 경우에도 4주 후 L-AA의 활성이 초기 상태로 유지되어 우수한 저장성을 나타내었다. 이후 실시예에서는 별도의 언급이 없는 한, α-T : L-AA의 몰비를 1:1로 고정하였다.Figure 8B is a graph showing the effect of the molar ratio of α-T contained in the middle layer and L-AA contained in the internal droplet on the activity of L-AA in the microcapsule. For this, the concentration of L-AA is constant. The concentration of α-T contained in the middle layer was adjusted while maintaining the concentration. From Figure 8B, it can be seen that the higher the α-T content, the better the storage stability of L-AA. However, even when contained at a ratio of 1:100, the activity of L-AA is maintained at the initial state after 4 weeks. It showed excellent storage properties. In subsequent examples, unless otherwise specified, the molar ratio of α-T:L-AA was fixed at 1:1.

온도에 따른 마이크로캡슐의 환원 능력을 확인하기 위하여 중간층에 α-T를 함유한 마이크로 캡슐과 α-T가 없는 마이크로캡슐을 30℃에서 보관한 후 다시 냉각시켜 L-AA 활성의 변화를 관측하고 그 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9에서 확인할 수 있듯이, 마이크로캡슐의 온도를 30℃로 승온시키면, α-T의 존재와 무관하게 내부액적에 함유된 L-AA의 활성이 저하되었다. 그러나 보관 온도가 다시 10℃로 냉각되면, α-T를 포함하는 마이크로캡슐에서는 L-AA의 활성이 빠르게 회복되는 반면 α-T가 존재하지 않는 마이크로캡슐에서는 L-AA의 활성이 추가로 감소하였다. 이는 산화된 L-AA가 α-T와의 상호작용에 의해 다시 활성이 회복되며, 활성의 회복속도가 저장에 따른 산화속도보다 빠르기 때문이라고 생각된다. 즉, 본 발명의 마이크로캡슐에서는 고온 등의 영향으로 산화되어 활성이 저하된 L-AA가 저온의 보관조건에서 α-T에 의해 다시 활성이 회복되는 것을 확인할 수 있다.To check the reducing ability of microcapsules according to temperature, microcapsules containing α-T in the middle layer and microcapsules without α-T were stored at 30°C and cooled again to observe changes in L-AA activity. The results are shown in Figure 9. As can be seen in Figure 9, when the temperature of the microcapsule was raised to 30°C, the activity of L-AA contained in the internal droplet decreased regardless of the presence of α-T. However, when the storage temperature was cooled back to 10°C, the activity of L-AA quickly recovered in the microcapsules containing α-T, while the activity of L-AA further decreased in the microcapsules without α-T. . This is thought to be because the oxidized L-AA regains its activity by interacting with α-T, and the recovery rate of activity is faster than the oxidation rate due to storage. That is, in the microcapsules of the present invention, it can be confirmed that L-AA, whose activity has been reduced due to oxidation due to the effects of high temperature, etc., is restored again by α-T under low temperature storage conditions.

(2) 세포 내 산화 스트레스 모델에서의 L-AA의 활성 평가(2) Evaluation of the activity of L-AA in an intracellular oxidative stress model

마우스 섬유아세포 NIH-3T3 세포 및 인간 장 상피세포 Caco-2에서 과산화수소(H₂O₂)에 의한 산화 스트레스 모델을 사용하여 마이크로캡슐에서 L-AA의 저장 안정성을 평가하였다. 마이크로캡슐은 도데칸을 오일로 사용하여 중간층을 형성하였으며, 중간층에 α-T를 포함한 것(w/ α-T)과 포함하지 않은 것(w/o α-T) 두 가지에 대해 각각 (1)과 마찬가지로 저장일로부터 4주간 각각 1주일 간격으로 마이크로캡슐로부터 방출된 L-AA를 수집하여 시험에 사용하였다. 벌크 시험은 바이알에 추가의 오일층이 없는 상태에서 L-AA 수용액을 보관하며 사용하였다. The storage stability of L-AA in microcapsules was evaluated using an oxidative stress model induced by hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) in mouse fibroblast NIH-3T3 cells and human intestinal epithelial cells Caco-2. The microcapsules used dodecane as an oil to form an intermediate layer, and the intermediate layer contained (w/ α-T) and did not (w/o α-T) α-T (1). ), the L-AA released from the microcapsules was collected at weekly intervals for 4 weeks from the date of storage and used for testing. The bulk test was used by storing the L-AA aqueous solution in the vial without an additional oil layer.

인간 장 상피세포 Caco-2 세포 및 마우스 배아 섬유아세포 NIH-3T3 세포를 ATCC(Americal Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였으며, 10% FBS 및 항생제(10 units/mL 페니실린 G 및 10 ㎍/mL 스트렙토마이신)가 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 37℃ 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 실험을 위해서, 세포를 배양 플레이트에 1×10⁵ 세포/cm²의 농도로 접종하고, 포화(confluent)된 상태까지 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 모든 보충제나 시약들을 포함하는 무혈청-DMEM 배지에서 유지시켰다.Human intestinal epithelial Caco-2 cells and mouse embryonic fibroblast NIH-3T3 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) and incubated with 10% FBS and antibiotics (10 units/mL penicillin G and 10 μg /mL streptomycin) was used and cultured at 37°C and 5% CO ₂ using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) supplemented with streptomycin. For the experiment, cells were inoculated into culture plates at a concentration of 1×10 ⁵ cells/cm ² and cultured until confluent. Afterwards, cells were washed twice with PBS and maintained in serum-free-DMEM medium containing all supplements or reagents.

세포 내 활성 산소종(ROS) 수준을 평가하기 위하여, 세포에 H₂O₂100 μM을 가하고 30분 후, ROS 지시제인 CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 10 mM로 처리하였다. 냉각된 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후 세포를 긁어내었다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트에 로딩하고, luminometer fluorescent microplate reader(SPARK, Seestrasse, , Switzerland)를 사용하여 485 nm 및 535 nm를 각각 여기 및 발광 파장으로 하여 측정하였다. 도 10과 도 11은 각각 Caco-2 및 NIH-3T3 세포에서 H₂O₂처리에 의해 유발된 ROS 측정 결과를 나타내는 그래프 및 세포 내부에 잔류하는 ROS를 보여주는 형광 현미경 이미지이다. To evaluate intracellular reactive oxygen species (ROS) levels, 100 μM of H ₂ O ₂ was added to the cells, and 30 minutes later, cells were treated with 10 mM of the ROS indicator CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). . After washing with cooled phosphate-buffered saline (PBS), the cells were scraped. 100 ㎕ of cell suspension was loaded into a 96-well plate, and a luminometer fluorescent microplate reader (SPARK, Seestrasse, , Switzerland) was used to measure 485 nm and 535 nm as the excitation and emission wavelengths, respectively. Figures 10 and 11 are graphs showing the results of measuring ROS induced by H ₂ O ₂ treatment in Caco-2 and NIH-3T3 cells, respectively, and fluorescence microscope images showing ROS remaining inside the cells.

도 10과 도 11의 A의 그래프에서, Caco-2 및 NIH-3T3 세포에 H₂O₂를 처리하면 ROS의 생성이 크게 증가하며, 모든 종류의 L-AA의 처리는 ROS의 증가를 억제할 수 있음을 보여준다. 그러나, 벌크로 저장된 L-AA는 1주 후까지만 ROS 억제 효능을 나타내었으며, 2주 후부터는 L-AA를 처리하지 않은 대조군과 유사한 정도의 ROS 수준을 나타내어 저장에 따라 L-AA의 항산화 활성이 소실되었음을 나타내었다. α-T를 함유하지 않은 마이크로캡슐에 저장되었던 L-AA는 저장 2주 후까지는 안정된 활성을 나타내었으나, 3주 후부터는 항산화 효능이 감소함을 나타내었다. 반면, α-T를 함유하는 마이크로캡슐에 저장된 L-AA는 3주까지는 활성이 유지되는 것을 나타내며, 4주 후에도 활성이 다소 감소하기는 하였으나, 여전히 항산화 활성을 나타내었다. 따라서 중간층을 갖는 마이크로캡슐의 구조 뿐 아니라, 중간층에 함유된 α-T 역시 L-AA의 저장 안정성에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.In the graphs of Figures 10 and 11A, treatment of Caco-2 and NIH-3T3 cells with H ₂ O ₂ significantly increases the production of ROS, and treatment with all types of L-AA inhibits the increase of ROS. It shows that it can be done. However, L-AA stored in bulk showed ROS inhibitory effect only after 1 week, and after 2 weeks, the ROS level was similar to that of the control group that was not treated with L-AA, showing that the antioxidant activity of L-AA was lost with storage. It was indicated that it was done. L-AA stored in microcapsules that did not contain α-T showed stable activity until 2 weeks after storage, but its antioxidant efficacy decreased after 3 weeks. On the other hand, L-AA stored in microcapsules containing α-T maintained its activity for up to 3 weeks, and although its activity decreased somewhat after 4 weeks, it still showed antioxidant activity. Therefore, it was confirmed that not only the structure of the microcapsule with a middle layer, but also the α-T contained in the middle layer affects the storage stability of L-AA.

도 10과 도 11에 도시된 형광 이미지 역시, 중간층에 α-T를 함유하는 경우 세포 내에서 ROS 지시제인 형광성 CM-H2DCFDA에 의한 형광이 거의 관측되지 않아 중간층에 함유된 α-T가 L-AA의 저장성에 현저한 영향을 미치는 것을 보여준다.The fluorescence images shown in Figures 10 and 11 also show that when α-T is contained in the middle layer, little fluorescence is observed by the fluorescent CM-H2DCFDA, a ROS indicator, within the cell, indicating that α-T contained in the middle layer is L-AA. It shows that it has a significant effect on the storage properties.

Claims

In the microcapsule, wherein the internal droplet containing an active material susceptible to oxidation is surrounded by an alginate hydrogel shell having pores,
The size of the active material is smaller than the pore size of the shell,
A continuous oil layer is formed between the hydrophilic inner droplet and the shell.
The oil layer contains antioxidants, which improves the storage stability of the active material.
A microcapsule characterized in that it releases the active substance by discontinuing the oil layer in response to one or more external stimuli selected from chemicals, physical forces, osmotic pressure, pH, temperature and light.

In claim 1,
A microcapsule, characterized in that it additionally contains at least one active material whose size is larger than the pore size of the shell.

In claim 2,
A) selectively releasing only active substances smaller than the pore size of the hydrogel shell by destabilizing the oil layer;
B) rupturing the hydrogel shell to release a material larger than the pore size of the hydrogel shell;
Microcapsules capable of sequentially releasing active substances, including:

The method according to any one of claims 1 to 3,
The microcapsule is a microcapsule characterized in that the alginate hydrogel shell of the triple emulsion is manufactured by ionic gelation.

The method according to any one of claims 1 to 3,
Hydrogel microcapsules, characterized in that the release characteristics and storage characteristics of the active substance are controlled by the concentration of the osmotic substance contained in the internal droplet, the thickness of the middle layer, the composition of the middle layer, the composition of the shell, or the thickness of the shell.

A cosmetic composition comprising the microcapsule according to any one of claims 1 to 3.

A drug delivery system consisting of microcapsules according to any one of claims 1 to 3.

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