KR102636435B1 - 칼슘 나노클러스터의 제조방법, 및 이에 따라 제조된 칼슘 나노클러스터를 유효성분으로 포함하는 화장료용 형광 소재 - Google Patents
칼슘 나노클러스터의 제조방법, 및 이에 따라 제조된 칼슘 나노클러스터를 유효성분으로 포함하는 화장료용 형광 소재 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체분자 나노 클러스터의 형광 신호를 이용한 형광 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 나노-바이오 소재 합성을 통해 기존의 유기물 및 반도체 나노입자 기반 형광 물질의 유해성과 낮은 생체 적합성을 획기적으로 극복하여 현저히 개선된 특성을 가지는 화장품 원료로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 칼슘 나노클러스터의 제조방법, 및 이에 따라 제조된 칼슘 나노클러스터를 유효성분으로 포함하는 화장료용 형광 소재에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생체분자를 이용한 형광 나노-바이오 소재 합성에 관한 내용으로 기존의 유기물 및 반도체 나노입자 기반 형광 물질의 환경 규제로 인한 기술적인 한계를 극복할 수 있는 기술이며 향후 화장품 원료를 포함하여 다양한 응용이 가능하다.
기존의 유기물 형광 증백제의 경우 아토피나 접촉성 피부질환을 유발하기 때문에 화장품 원료로 사용할 수 없는 금지성분이었다. 반도체 나노입자 기반의 형광 물질의 경우 합성 과정이 복잡하고, 고온, 고압 및 유해한 화학물질이 필요하고, 제작된 물질은 중금속을 포함하고 있어 독성 및 환경규제로 인해 다양한 응용에 한계가 있다.
이에 대한 대안으로, 생체분자(단백질, 핵산, 다당류)를 이용하여 친환경적인 조건에서 형광 나노-바이오 소재를 제작하고, 이를 바이오 분야에 응용하는 연구가 2000년대 중반부터 활발히 진행되고 있다. 하지만, 이러한 기술은 바이오 센싱/검출 분야에 적용되고 있으며, 화장품 분야에 응용/적용한 사례는 현재까지 보고된 바가 없다.
점차 증가하는 형광 화장품 시장에 발맞춰 기존 유기 형광 소재의 성능은 충족하면서 인체에 유해하지 않고 생체적합성이 우수한 친환경적 형광 소재의 개발이 요구되는 상황이다.
이에, 본 발명에서는 생체분자를 주형으로 제작되는 형광 나노-바이오 소재를 이용하여 화장품을 개발하고자 하며, 감성 차별화를 통해 아름다운 색상을 나타내는 화장품을 개발하고자 하였다. 대표적인 생체분자인 단백질과 금 및 칼슘 금속이온의 상호작용 특성을 이용한 친환경 형광 소재를 개발하였으며, 안정성이 높으며, 세포 독성이 없고, 실제 돼지 피부에 적용하여 형광 화장품 소재로 응용 가능함을 입증하였다. 본 발명은 소재는 형광 화장품 이외에도 형광 인디케이터 소재를 필요로 하는 다양한 분야에 응용이 가능하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 현재 화장품에 주로 사용되는 형광 물질인 형광 증백제가 ⅰ) 인체에 유해한 화학 성분을 포함한다는 점; ⅱ) 쉽게 생분해되지 않아 환경오염을 유발한다는 점; 및 ⅲ)이와 같은 이유로 인허가가 어렵고 규제의 대상이 된다는 문제점을 극복하기 위하여 생체 적합성과 안전성을 가지면서도 친환경적이고, 가격이 저렴하며 대량 생산에 용이한 형광 바이오 소재 및 이를 이용한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (1) 염화칼슘, 혈청 알부민 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 혼합물을 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시키는 단계;를 포함하는 칼슘 나노클러스터의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계의 염화칼슘 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 5 내지 80인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계는 비타민 C를 추가하여 혼합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혼합물의 비타민 C 농도는 5 내지 50 mM일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (2) 단계의 혼합물의 pH는 pH 7 내지 8 범위일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기한 방법에 따라 제조된 칼슘 나노클러스터를 유효성분으로 포함하는 화장료용 형광 소재를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 칼슘 나노클러스터는 파장의 범위가 370 내지 390 nm인 빛에 의해 여기 (excitation)되고, 파장의 범위가 460 내지 480 nm인 파란색 빛을 방출하며, 파장의 범위가 410 내지 430 nm인 빛에 의해 여기 (excitation)되고, 파장의 범위가 490 내지 510 nm인 초록색 빛을 방출하는 것일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (A) 염화칼슘, 혈청 알부민, 비타민 C 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조한 후 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 제조하는 단계; (B) 염화금산(HAuCl4), 혈청 알부민 및 수산화나트륨(NaOH)을 혼합한 혼합물을 제조한 후 상온에서 12 내지 36 시간 동안 반응시켜 금 나노클러스터를 제조하는 단계; 및 (C) 상기 금 나노클러스터 및 상기 칼슘 나노클러스터를 1 : 0.5 내지 20의 부피비로 혼합하는 단계;를 포함하는 화장료용 형광 소재를 이용한 형광색 조절방법을 제공한다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (1) 염화칼슘, 혈청 알부민, 비타민 C 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 혼합물을 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 제조하는 단계;를 포함하는 형광 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (2) 단계 이후에 (3) 염화금산(HAuCl4), 혈청 알부민 및 수산화나트륨(NaOH)을 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; (4) 상기 혼합물을 상온에서 12 내지 36 시간 동안 반응시켜 금 나노클러스터를 제조하는 단계; 및 (5) 상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터를 혼합하는 단계;를 추가하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (3) 단계의 염화금산 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 2 내지 15일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (4) 단계의 혼합물의 pH는 pH 11 내지 14 범위일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (5) 단계의 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터는 1 : 0.5 내지 20의 부피비로 혼합된 것일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기한 방법에 따라 제조된 형광 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 형광 소재는 기존 화장품에 사용되던 유기 형광 물질과 달리 생체분자를 이용하여 친환경적인 조건에서 제작되는 물질로 생체적합성이 우수하고, 인체유해성이 낮으며, 화장품 소재의 개발에 최적의 물질이다.
본 발명의 조성물은 생체분자를 포함한 제조 방법의 간단한 조절을 통하여 손쉽게 형광 특성의 조절이 가능하기 때문에, 목적에 맞는 형광물질의 생산이 효과적이다. 또한, 기존 유기 형광 물질에 비하여 제조공정이 단순하며, 제조 시간이 짧다.
본 발명의 형광 바이오 소재는 화장품 제작에 적용하여 화장품 시장의 확대에 기여하라 수 있을 것으로 예상되며, 다양한 유해요인과 반응하여 형광 소재의 특성이 변화하는 성질을 바탕으로 외부요인의 검출 및 표지 기능을 지닌 화장품 형광 소재의 개발로 응용이 가능하다.
본 발명의 형광 화장품 소재는 또한 다양한 분야로의 적용이 가능하므로, 신시장 개척, 미약한 국내,외 형광 화장품 분야 및 산업의 발전에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 단백질과 칼슘이온의 상호작용 특성을 이용한 칼슘 나노클러스터 제작 공정의 최적화 결과를 나타낸다. 도 1a는 염화칼슘과 혈청 알부민의 비율 최적화 결과, 도 1b는 비타민 C(아스코르빈산) 농도 최적화 결과를 보여준다. *, **, 및 ***은 대조군(검은색 막대)과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01, 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음(Tukey’s test)을 의미한다.
도 2a는 단백질 기반 칼슘 나노클러스터(1, 2) 및 금 나노클러스터(3)의 형광 신호를 나타낸다. 도 2b는 칼슘 나노클러스터(1, 2) 및 금 나노클러스터(3)의 형광 이미지를 나타낸다. 여기 파장(excitation wavelength)은 각각 300 nm(1, 3) 및 500 nm(2)이다.
도 3은 금 나노클러스와 칼슘 나노클러스터의 혼합 비율에 따른 다양한 색상(1:#=금 나노클러스터:칼슘 나노클러스터)을 나타낸다. 여기 파장(excitation wavelength)은 300 nm이다.
도 4는 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)의 희석 비율에 따른 형광 세기를 보여주는 그림이다. Blue, Green 및 Red의 여기(excitation)/방출(emission) 파장은 360nm/ 470 nm, 450nm/ 500nm, 360 nm/670 nm이다.
도 5는 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)의 온도(A), pH(B) 및 시간(C)에 따른 형광 안정성을 나타낸 그림이다. Blue, Green 및 Red 의 여기(excitation)/방출(emission) 파장은 360nm/470nm, 450nm/ 500nm, 360 nm/670 nm 이다.
도 6은 칼슘 나노클러스터(도 6a)와 금 나노클러스(도 6b)의 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 Toner(A) 및 facial cream(B)과 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)의 혼합 후에 측정한 형광 신호를 나타내는 이미지이다. 여기 파장(excitation wavelength)은 300 nm(Blue, Red) 및 500 nm(Green)이다.
도 8은 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)를 돼지 피부에 적용한 후에 측정한 형광 이미지이다. 여기 파장은 300 nm (Blue, Red) 및 500 nm (Green)이다.
도 2a는 단백질 기반 칼슘 나노클러스터(1, 2) 및 금 나노클러스터(3)의 형광 신호를 나타낸다. 도 2b는 칼슘 나노클러스터(1, 2) 및 금 나노클러스터(3)의 형광 이미지를 나타낸다. 여기 파장(excitation wavelength)은 각각 300 nm(1, 3) 및 500 nm(2)이다.
도 3은 금 나노클러스와 칼슘 나노클러스터의 혼합 비율에 따른 다양한 색상(1:#=금 나노클러스터:칼슘 나노클러스터)을 나타낸다. 여기 파장(excitation wavelength)은 300 nm이다.
도 4는 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)의 희석 비율에 따른 형광 세기를 보여주는 그림이다. Blue, Green 및 Red의 여기(excitation)/방출(emission) 파장은 360nm/ 470 nm, 450nm/ 500nm, 360 nm/670 nm이다.
도 5는 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)의 온도(A), pH(B) 및 시간(C)에 따른 형광 안정성을 나타낸 그림이다. Blue, Green 및 Red 의 여기(excitation)/방출(emission) 파장은 360nm/470nm, 450nm/ 500nm, 360 nm/670 nm 이다.
도 6은 칼슘 나노클러스터(도 6a)와 금 나노클러스(도 6b)의 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 Toner(A) 및 facial cream(B)과 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)의 혼합 후에 측정한 형광 신호를 나타내는 이미지이다. 여기 파장(excitation wavelength)은 300 nm(Blue, Red) 및 500 nm(Green)이다.
도 8은 칼슘 나노클러스터(Blue 및 Green)와 금 나노클러스(Red)를 돼지 피부에 적용한 후에 측정한 형광 이미지이다. 여기 파장은 300 nm (Blue, Red) 및 500 nm (Green)이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서, 칼슘 나노클러스터는 복수 개의 칼슘 원자를 포함한다. 여기서 사용되는 “나노 클러스터”라는 용어는 해당 기술 분야의 통상적 의미를 가지며, 수십 개의 금속 원자를 포함하는 클러스터를 의미한다.
본 발명의 칼슘 나노클러스터는 발광성일 수 있다. 발광성 물질이란 전자기파의 양자를 흡수하여 해당 물질이 여기 상태 구조를 갖도록 할 수 있고, 경우에 따라서는 무해한 비이온화 방사선을 방출하도록 할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 방출된 비이온화 방사선은 발광(luminescence)일 수 있고, 여기서 "발광"이란 자외선 또는 가시적 방사선의 방출로 정의된다. 특정 형태의 발광은 가시적 방사선의 흡수와 방출 사이의 시간 간격이 10-12초 내지 10-7초 범위인 "형광(fluorescence)"을 포함한다. 몇몇 경우에, 광원에 노출되었을 때, 본 발명의 칼슘 나노클러스터는 형광 에너지를 방출할 수 있다. 방출된 형광 에너지는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다.
본 발명은 (1) 염화칼슘, 혈청 알부민 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 혼합물을 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시키는 단계;를 포함하는 칼슘 나노클러스터의 제조방법에 관한 것으로, 염화칼슘과 혈청 알부민을 반응시켜 중성의 반응물을 제조한 점에 특징이 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 칼슘 나노클러스터는 별도의 정제 과정이나 pH 조정 단계를 수행하지 않고도 화장품 제조를 위한 원료로 이용될 수 있다.
먼저, (1) 단계에서는 염화칼슘, 혈청 알부민 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조한다.
본 발명에서, 상기 혈청 알부민은 포유동물 유래의 혈청 알부민일 수 있고, 바람직하게는 소 혈청 알부민일 수 있다.
상기 (1) 단계의 염화칼슘은 5 내지 15 mM, 바람직하게는 7 내지 13 mM, 더욱 바람직하게는 8 내지 12 mM, 더욱 바람직하게는 9 내지 11 mM 농도의 수용액으로 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (1) 단계의 혈청 알부민은 0.1 내지 0.5 mM, 바람직하게는 0.15 내지 0.45 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.4 mM, 더욱 바람직하게는 0.25 내지 0.35 mM, 더욱 바람직하게는 0.3 mM 농도의 수용액으로 이용하는 것이 바람직하다.
상기 염화칼슘 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 5 내지 80, 바람직하게는 100 : 5 내지 70, 더욱 바람직하게는 100 : 5 내지 60, 더욱 바람직하게는 100 : 10 내지 60, 더욱 바람직하게는 100 : 20 내지 50, 더욱 바람직하게는 100 : 20 내지 40일 수 있다.
염화칼슘 및 혈청 알부민의 몰비가 상기 범위일 때, 높은 형광 강도를 나타내는 칼슘 나노클러스터를 제조할 수 있게 된다(도 1a 참조).
상기 염화칼슘에 대한 혈청 알부민의 몰비가 상기 하한치 미만인 경우에는 여분의 염화칼슘이 존재하게 되어 다량의 불순물을 생성하게 되고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 여분의 혈청 알부민이 존재하게 되어 마찬가지로 다량의 불순물을 생성하게 된다.
상기 (1) 단계에서는 상기 혼합물의 제조시 비타민 C를 추가하여 혼합할 수 있다.
본 발명의 (1) 단계에서 비타민 C를 추가하여 혼합하는 경우, 비타민 C를 혼합하지 않는 경우에 비해 현저히 높은 형광 강도를 나타내는 칼슘 나노 클러스터를 제조할 수 있게 된다(도 1b 참조).
상기 혼합물에 함유된 비타민 C의 농도는 5 내지 50 mM, 바람직하게는 10 내지 40 mM, 더욱 바람직하게는 15 내지 40 mM, 더욱 바람직하게는 20 내지 35 mM, 더욱 바람직하게는 20 내지 30 mM일 수 있다.
상기 비타민 C의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 칼슘 나노클러스터 용액에 석출 현상이 일어나 칼슘 나노클러스터가 불안정해지는 문제가 생길 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 비타민 C 농도가 증가함에도 칼슘 나노클러스터의 형광 강도가 더 증가하지는 않으며, pH가 낮아져 산성을 띄게 되는 문제가 있을 수 있다.
그리고, (2) 단계에서는 상기 혼합물을 50 내지 70 ℃, 바람직하게는 50 내지 65 ℃, 더욱 바람직하게는 54 내지 62 ℃에서 10 내지 20 시간, 바람직하게는 12 내지 18 시간, 더욱 바람직하게는 14 내지 16 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 수득한다.
상기 혼합물의 반응 온도가 상기 하한치 미만이거나 상기 상한치를 초과하는 경우에는 칼슘 나노클러스터의 형성이 이루어지지 않을 수 있다.
또한, 상기 혼합물의 반응 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 칼슘 나노클러스터가 형성되지 않을 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 칼슘 나노클러스터의 변성이 일어날 수 있다.
상기 (2) 단계의 혼합물의 pH는 pH 7 내지 8 범위일 수 있다. 상기 혼합물의 pH는 암모니아수와 비타민 C를 이용하여 적절하게 조정될 수 있다.
상기 혼합물의 pH가 상기 하한치 미만이거나 상기 상한치를 초과하는 경우에는 보다 적은 양의 칼슘 나노클러스터가 형성되어 수율이 매우 낮아지게 된다.
상기 방법으로 제조된 본 발명의 칼슘 나노클러스터는 약염기인 암모니아수와 약산인 비타민 C를 이용하여 칼슘염과 혈청 알부민을 반응시켜 수득되는 중성의 반응물로서, 별도의 정제 과정이나 pH 조정 단계를 수행하지 않고도 화장품 제조를 위한 원료로 이용될 수 있어 매우 유용하다.
또한, 본 발명은 상기한 방법에 따라 제조된 칼슘 나노클러스터를 유효성분으로 포함하는 화장료용 형광 소재에 관한 것이다.
상기한 본 발명의 칼슘 나노클러스터는 파장의 범위가 370 내지 390 nm인 빛에 의해 여기 (excitation)되고, 파장의 범위가 460 내지 480 nm인 파란색 빛을 방출할 수 있다.
또한, 본 발명의 칼슘 나노클러스터는 파장의 범위가 410 내지 430 nm인 빛에 의해 여기 (excitation)되고, 파장의 범위가 490 내지 510 nm인 초록색 빛을 방출할 수 있다.
또한, 본 발명은 (A) 염화칼슘, 혈청 알부민, 비타민 C 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조한 후 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 제조하는 단계; (B) 염화금산(HAuCl4), 혈청 알부민 및 수산화나트륨(NaOH)을 혼합한 혼합물을 제조한 후 상온에서 12 내지 36 시간 동안 반응시켜 금 나노클러스터를 제조하는 단계; 및 (C) 상기 금 나노클러스터 및 상기 칼슘 나노클러스터를 1 : 0.5 내지 20의 부피비로 혼합하는 단계;를 포함하는 화장료용 형광 소재를 이용한 형광색 조절방법에 관한 것이다.
본 발명의 “칼슘 나노클러스터” 및 “칼슘 나노클러스터의 제조방법”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
상기 염화금산 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 2 내지 15, 바람직하게는 100 : 3 내지 14, 더욱 바람직하게는 100 : 3 내지 12, 더욱 바람직하게는 100 : 5 내지 10, 더욱 바람직하게는 100 : 6 내지 9, 더욱 바람직하게는 100 : 7 내지 8일 수 있다.
상기 혈청 알부민에 대한 염화금산의 몰비가 상기 하한치 미만이면 혈청 알부민이 잔존하게 되어 다량의 불순물을 생성하게 될 수 있고, 상기 상한치를 초과하면 염화금산이 잔존하게 되어, 마찬가지로 다량의 불순물을 생성하게 된다.
상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터는 1 : 0.5 내지 20의 부피비, 바람직하게는 1 : 1 내지 19의 부피비로 혼합될 수 있다.
상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터의 혼합물은 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비에 따라 금 나노클러스터의 빨간색, 칼슘 나노클러스터의 파란색 또는 녹색 이외의 다양한 색상의 빛을 생성할 수 있다.
예를 들면, 상기 혼합물은 여기 파장이 370 내지 390 nm인 경우에 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비가 낮으면 빨간색에 가까운 빛을 방출하고, 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비가 높을수록 파란색에 가까운 빛을 방출하게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비에 따라 진달래색(1 : 1), 연보라색(1 : 5), 보라색(1 : 10), 남보라색(1 : 19) 등 다양한 색상의 빛을 생성할 수 있음을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명은 (1) 염화칼슘, 혈청 알부민, 비타민 C 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 혼합물을 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 제조하는 단계;를 포함하는 형광 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 “칼슘 나노클러스터” 및 “칼슘 나노클러스터의 제조 방법”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 (2) 단계 이후에, (3) 염화금산(HAuCl4), 혈청 알부민 및 수산화나트륨(NaOH)을 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; (4) 상기 혼합물을 상온에서 12 내지 36 시간 동안 반응시켜 금 나노클러스터를 제조하는 단계; 및 (5) 상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터를 혼합하는 단계;를 추가하여 수행할 수 있다.
상기 (3) 단계에서는 염화금산(HAuCl4), 혈청 알부민 및 수산화나트륨(NaOH)을 혼합한 혼합물을 제조한다.
본 발명의 일 실시예에서, 염화금산을 포함하는 용액이 혈청 알부민을 포함하는 용액에 첨가되어 반응 혼합물을 형성할 수 있다. 상기 혈청 알부민의 환원 능력은 수산화나트륨을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 11보다 높게 조절함으로써 활성화될 수 있다. 상기 염화금산을 포함하는 용액에 내포된 금 이온은 환원되어 금 나노클러스터를 형성할 수 있고, 여기서 금 나노클러스터는 혈청 알부민 분자에 의해 안정화된다.
본 발명의 구체예로서, 염화금산 및 혈청 알부민을 포함하는 반응 혼합물이 형성될 수 있다. 이를 위해 혈청 알부민 용액을 염화금산의 용액에 첨가할 수 있고, 또는 염화금산의 용액을 혈청 알부민의 용액에 첨가할 수도 있으며, 염화금산과 혈청 알부민을 고체로서 혼합한 다음, 용매를 첨가할 수도 있다. 상기 용액은 반응을 방해하지 않는 임의의 적합한 용매(예를 들면, 물) 중에서 형성될 수 있다.
상기 (3) 단계의 염화금산은 2 내지 10 mM, 바람직하게는 2 내지 8 mM, 더욱 바람직하게는 2 내지 6 mM, 더욱 바람직하게는 3 내지 5 mM 농도의 용액으로 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (3) 단계의 혈청 알부민은 0.1 내지 0.5 mM, 바람직하게는 0.15 내지 0.45 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.4 mM, 더욱 바람직하게는 0.25 내지 0.35 mM, 더욱 바람직하게는 0.3 mM 농도의 수용액으로 이용하는 것이 바람직하다.
상기 염화금산 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 2 내지 15, 바람직하게는 100 : 3 내지 14, 더욱 바람직하게는 100 : 3 내지 12, 더욱 바람직하게는 100 : 5 내지 10, 더욱 바람직하게는 100 : 6 내지 9, 더욱 바람직하게는 100 : 7 내지 8일 수 있다.
상기 혈청 알부민에 대한 염화금산의 몰비가 상기 하한치 미만이면 혈청 알부민이 잔존하게 되어 다량의 불순물을 생성하게 될 수 있고, 상기 상한치를 초과하면 염화금산이 잔존하게 되어, 마찬가지로 다량의 불순물을 생성하게 된다.
상기 (3) 단계의 혼합물의 pH는 10.5 이상, 바람직하게는 pH 11 이상, 더욱 바람직하게는 pH 11.5 이상, 더욱 바람직하게는 pH 12 이상, 더욱 바람직하게는 pH 13 이상일 수 있다. 구체적으로는, pH 11 내지 14인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 pH 12 내지 14일 수 있다. 상기 혼합물의 pH는 염화나트륨을 이용하여 적절하게 조정될 수 있다.
상기 혼합물의 pH가 상기 하한치 미만인 경우에는 금 나노클러스터가 형성되지 않을 수 있다.
그리고, (4) 단계에서는 상기 혼합물을 상온에서 12 내지 36 시간, 바람직하게는 18 내지 32 시간, 더욱 바람직하게는 20 내지 28 시간 동안 반응시켜 금 나노클러스터를 수득한다.
또한, 상기 혼합물의 반응 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 금 나노클러스터의 형성이 이루어지지 않을 수 있다.
상기와 같이 제조된 금 나노클러스터는 파장의 범위가 370 내지 390 nm인 빛에 의해 여기 (excitation)되고, 파장의 범위가 630 내지 700 nm인 빨간색 빛을 방출할 수 있다.
상기 (5) 단계에서는 상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터를 혼합한다.
상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터는 1 : 0.5 내지 20의 부피비, 바람직하게는 1 : 1 내지 19의 부피비로 혼합될 수 있다.
상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터의 혼합물은 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비에 따라 다양한 색상의 빛을 생성할 수 있다.
예를 들면, 상기 혼합물은 여기 파장이 370 내지 390 nm인 경우에 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비가 낮으면 빨간색에 가까운 빛을 방출하고, 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비가 높을수록 파란색에 가까운 빛을 방출하게 된다.
본 발명의 일 실시예에서 제조된 칼슘 나노클러스터 및 금 나노클러스터를 희석하여 형광 신호를 측정한 결과, 약 1000배 희석한 후에도 상기 나노클러스터들의 형광 신호가 관측되는 것을 확인하였다. 이에 따라, 극소량의 나노클러스터만으로도 형광 화장품의 제조가 가능함을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 방법에 따라 제조된 형광 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제조되는 “칼슘 나노클러스터” 및 “금 나노클러스터”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 형광 화장료 조성물은 독성이 없고, 소량의 칼슘 나노클러스터 및 금 나노클러스터를 포함하여도 형광 특성을 나타내며, 상기 칼슘 나노클러스터 및 금 나노클러스터는 온도, pH 및 시간의 변화에도 안정성을 유지하고, 돼지와 같은 동물의 피부에 적용한 결과 우수한 형광 특성을 유지함을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
본 발명의 실시예에서는 단백질(소 혈청 알부민; BSA, bovine serum albumin)과 염화금산 및 염화칼슘 각각의 상호작용 특성을 기반으로 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터를 제작하고, 제작된 물질의 형광 특성을 분석하였다. 본 발명에서 개발한 형광 나노물질은 제작 과정에서 유기용매나 독성이 있는 화학물질이 필요하지 않고 단백질, 금 이온, 칼슘 이온의 변화를 통해 상대적으로 간단한 방법으로 쉽게 다양한 색상을 방출하는 형광 나노 클러스터를 제작할 수 있다. 금 나노클러스터의 경우 선행 연구를 통하여 다양한 연구가 진행된 것을 확인할 수 있었으며, 상대적으로 연구가 덜 진행된 칼슘 나노클러스터의 경우 최적의 합성 조건을 찾았다(도 1a 및 도 1b).
실시예 1: 칼슘 나노클러스터의 제조 및 최적의 합성 조건
1-1: 칼슘 나노클러스터의 제조
염화칼슘(CaCl2) 수용액(10 mM, 140 ㎕)를 강하게 교반하는 가운데 소 혈청 알부민(BSA) 수용액(0.3 mM, 1260 ㎕)을 혼합하였다. 이때, 염화칼슘 및 BSA의 몰비는 100 : 27이었다. 2분이 경과된 후, 비타민 C(500 mM, 60 ㎕) 및 암모니아수 (27 %(v/v), 6 ㎕)를 첨가하고, 혼합물을 58 ℃에서 15 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 수득하였다. 상기 반응에 첨가된 원료들의 초기농도, 부피 및 최종농도를 하기 표 1에 구체적으로 나타내었다.
| 구분 | 초기농도 | 부피 | 최종농도 |
| 염화칼슘 | 10 mM | 140 ㎕ | 1 mM |
| BSA | 0.3 mM | 1260 ㎕ | 0.27 mM |
| 비타민 C | 500 mM | 60 ㎕ | 21 mM |
| 암모니아수 | 27 %(v/v) | 6 ㎕ | 0.1 %(v/v) |
1-2: 최적의 합성 조건
상기 1-1에 있어서, 염화칼슘 및 BSA의 몰비를 달리하는 것을 제외하고는 1-1과 동일한 방법으로 칼슘 나노클러스터를 제조하였다. 상기 제조된 각각의 칼슘 나노클러스터의 형광 강도를 측정하여, 도 1 A에 나타내었다. 이때, 칼슘 나노클러스터의 형광 강도는 microplate reader를 이용하여, 380 nm 여기파장 및 470 nm 방출파장으로 파란색 형광을 측정하고, 420 nm 여기파장 및 500 nm 방출파장으로 초록색 형광을 측정하였다.
도 1a를 살펴보면, 염화칼슘 및 BSA를 100 : 27 이상의 몰비로 혼합한 경우의 형광 강도가 염화칼슘 및 BSA를 100 : 3의 몰비, 100 : 9의 몰비, 및 100 : 12의 몰비로 혼합한 경우에 비해 유의적으로 강한 것으로 나타났고, 100 : 39의 몰비 및 100 : 57의 몰비로 혼합한 경우에는 100 : 27의 몰비로 혼합한 경우와 유의차가 없는 것으로 나타났다. 이에 따라, 이후의 연구에서는 경제성 측면을 고려하여 염화칼슘 및 BSA를 100 : 27의 몰비로 혼합한 것을 최적의 비율로 정하였다.
또한, 상기 1-1에 있어서 비타민 C의 첨가 농도를 달리하는 것을 제외하고는 1-1과 동일한 방법으로 칼슘 나노클러스터를 제조하였다.
상기 제조된 각각의 칼슘 나노클러스터의 형광 강도를 측정하여, 도 1B에 나타내었다. 구체적으로, 비타민 C의 농도가 각각 7 mM, 14 mM, 21 mM, 28 mM 및 35 mM인 반응물의 형광 강도를 각각 측정하여 도 1B에 나타내었다.
도 1b를 살펴보면, 비타민 C의 농도가 21 mM인 경우에 형광 강도가 가장 높게 나타났고, 28 mM, 35 mM인 경우에는 형광 강도가 오히려 낮아지는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 비타민 C의 농도가 21 mM인 것을 최적 조건으로 정하였다.
1-3: 형광 방출 확인
상기 제조된 단백질 기반 칼슘 나노클러스터는 pH 7 에서 360 nm의 여기를 받아 470 nm에서 형광을 방출하는 파란색 빛을 내는 것을 확인하였다. 또한, 450 nm의 여기를 받아 500 nm에서 형광을 방출하는 초록색 빛을 내는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 2: 금 나노클러스터의 제조
염화금산 수용액(4 mM, 4 ml) 및 BSA 수용액 (0.3 mM, 4 ml)을 혼합하여 교반한 후, pH를 11 이상으로 조정하였다. 이때, 상기 염화금산 및 BSA의 몰비는 100 : 7.5였다. 그리고 상기 혼합물을 37 ℃에서 24시간 동안 진탕배양기를 이용하여 반응시킴으로써 금 나노클러스터를 수득하였다. 이때, 금 나노클러스터의 형광 강도는 microplate reader를 이용하여, 360 nm 여기 파장, 670 nm 방출파장으로 측정하였다.
| 구분 | 초기농도 | 부피 | 최종농도 |
| 염화금산 | 4 mM | 4 ml | 2 mM |
| BSA | 0.3 mM | 4 ml | 0.15 mM |
상기 제조된 단백질 기반 금 나노클러스터는 pH 11.5 이상의 조건에서 360 nm의 여기(excitation)를 받아 670 nm에서 형광을 방출(emission)하는 빨간색 빛을 내는 것을 확인하였다(도 2).
시험예 1 : 다양한 색상의 생성
상기 실시예 1의 칼슘 나노클러스터(파랑, 녹색)와 실시예 2의 금 나노클러스터(빨강)의 혼합을 통해서 파랑, 녹색, 빨강 이외에도 다양한 색상의 빛을 생성할 수 있는지 확인하고자 하였다.
그 결과, 금 나노클러스터에 대한 칼슘 나노클러스터의 혼합비에 따라 진달래색(1 : 1), 연보라색(1 : 5), 보라색(1 : 10), 남보라색(1 : 19) 등 다양한 색상의 빛을 생성할 수 있음을 확인하였다(도 3).
시험예 2: 희석 후의 형광 신호 확인
상기 실시예 1의 칼슘 나노클러스터(파랑, 녹색)와 실시예 2의 금 나노클러스터(빨강)의 희석에 따른 형광 신호를 측정한 결과(도 4), 각각 대략 1000배 희석 후에도 제작된 형광 나노클러스터의 신호가 관측 가능함을 확인하였다. 이에 따라, 향후 화장품 소재 응용을 위해서 소량의 나노클러스터만으로도 형광 화장품의 제작이 가능함을 확인하였다.
시험예 3: 안정성 시험
상기 실시예 1의 칼슘 나노클러스터(파랑, 녹색)와 실시예 2의 금 나노클러스터(빨강)의 온도, pH, 및 시간 경과에 따른 안정성을 확인하여 도 5에 나타내었다.
구체적으로, 상기 나노클러스터들에 대하여 도 5(A)는 온도(4, 25, 40℃)에서 2시간 반응시켰을 때의 온도에 따른 형광 안정성을 나타내는 그래프이고, 도 5(B)는 pH 4, 7, 10에서 2시간 반응시켰을 때의 pH에 따른 형광 안정성을 나타내는 그래프이며, 도 5(C)는 각각 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28일 (25℃, pH 7)동안 반응시켰을 때의 시간 경과에 따른 형광 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 칼슘 나노클러스터 및 금 나노클러스터는 온도, pH 및 시간에 대해서 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다.
시험예 4: 생체 적합성 확인 - 독성 실험
상기 실시예 1의 칼슘 나노클러스터(파랑, 녹색)와 실시예 2의 금 나노클러스터(빨강)의 생체적합성을 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 사람 각질형성세포주인 HaCaT 세포주를 배양액 내에서 배양하되, 배양액 내에 다양한 농도의 칼슘 나노클러스터 또는 금 나노클러스터를 첨가하여 배양함으로써 HaCaT 세포에 대한 생체적합성을 MTT assay를 통해 평가하였다.
구체적으로, HaCaT 세포를 ATCC (Manassas, VA, USA)으로부터 입수하였고, HaCaT (1×103 cells/well)을 96-well-cell-culture plate에 high-glucose (4.5g/L) with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin DMEM 배양액으로 37 ℃와 5% CO2와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 칼슘 나노클러스터들을 각 농도별로 투여한 후 다시 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 각 well에 MTT (0.5 mg/mL)를 투여하고 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였으며, 20% SDS solution을 첨가한 뒤 하루 동안 배양하였다. 이후, microplate reader를 이용하여 595 nm의 파장에서 흡광을 측정함으로써 독성 실험을 완료하였다.
그 결과, 본 발명의 실시예에 따른 칼슘 나노클러스터 및 금 나노클러스터는 모두 세포에 독성이 없음을 확인하였다(도 6).
시험예 5: 화장품과 혼합한 후의 형광 신호 확인
상기 실시예 1의 칼슘 나노클러스터(파랑, 녹색)와 실시예 2의 금 나노클러스터(빨강)와 토너(toner) 및 페이셜 크림 등의 화장품과 혼합 후 안정한 형광 신호를 생성하는지 확인하고자 하였다.
토너 및 페이셜 크림은 나노클러스터와 1:1 비율로 혼합하였다. 구체적으로, 토너 1 ml (또는 페이셜 크림 1 g)과 클러스터 1 ml를 혼합하였다. 혼합은 교반기를 통해 진행하였으며, 혼합 용액 중에서 300 ㎕만 채취하여 커버 글라스에 도포한 후 365 nm의 파장을 쬐어 형광을 촬영하였다.
그 결과, 본 발명의 실시예에 따른 칼슘 나노클러스터 및 금 나노클러스터는 화장품 성분에 의해서 저해를 받지 않고 안정한 형광 신호를 생성하는 것을 확인하였다(도 7).
시험예 6: 돼지 피부에 적용한 후의 형광 특성 확인
상기 실시예 1의 칼슘 나노클러스터(파랑, 녹색)와 실시예 2의 금 나노클러스터(빨강)를 돼지 피부에 적용한 후의 형광 특성을 유지하는지를 확인하고자 하였다.
돼지피부는 지역 식료품점에서 입수하였으며, 시험된 돼지 피부의 면적은 약 6.25 ㎠로 맞추어 사용하였다. 돼지 피부에 도포한 시료의 용량은 약 500 ㎕이고, 365 nm의 파장을 쬐어 시료를 도포한 돼지피부에서 나오는 형광을 촬영하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 돼지 피부에 적용 후에도 우수한 형광 특성을 유지함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (14)
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- (1) 염화칼슘, 혈청 알부민, 비타민 C 및 암모니아수를 혼합한 혼합물을 제조하는 단계; 및
(2) 상기 혼합물을 50 내지 70 ℃에서 10 내지 20 시간 동안 반응시켜 칼슘 나노클러스터를 제조하는 단계;를 포함하되,
상기 (1) 단계의 염화칼슘 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 20 내지 40이고,
상기 (1) 단계의 비타민 C의 농도는 5 내지 50 mM이며,
상기 (2) 단계의 혼합물의 pH는 pH 7 내지 8 범위인 것을 특징으로 하는 형광 화장료 조성물의 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 (2) 단계 이후에
(3) 염화금산(HAuCl4), 혈청 알부민 및 수산화나트륨(NaOH)을 혼합한 혼합물을 제조하는 단계;
(4) 상기 혼합물을 상온에서 12 내지 36 시간 동안 반응시켜 금 나노클러스터를 제조하는 단계; 및
(5) 상기 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터를 혼합하는 단계;를 추가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 형광 화장료 조성물의 제조방법. - 제10항에 있어서,
(3) 단계의 염화금산 및 혈청 알부민의 몰비는 100 : 2 내지 15인 것을 특징으로 하는 형광 화장료 조성물의 제조방법. - 제10항에 있어서,
(4) 단계의 혼합물의 pH는 pH 11 내지 14 범위인 것을 특징으로 하는 형광 화장료 조성물의 제조방법. - 제10항에 있어서,
(5) 단계의 금 나노클러스터 및 칼슘 나노클러스터는 1 : 0.5 내지 20의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 형광 화장료 조성물의 제조방법. - 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따라 제조된 형광 화장료 조성물.
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| J. of Materials Chemistry B, 2020, 8, pp5729-5744(2020.05.18.)* |
| New Journal of Chemistry, 45(3), pp. 1278-1285 |
| The Journal of Physical Chemistry C, 115(22), pp. 10955-10963 |
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