KR102628772B1 - 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선제 - Google Patents

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Abstract

노화 등에 의한 착상 전기 배아의 질 저하를 개선하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질로 이루어지는 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제에 관한 것이다.

Description

난자, 수정란 또는 배아의 질 개선제 {EGG, FERTILIZED EGG, OR EMBRYO QUALITY IMPROVING AGENT}
본 발명은 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질로 이루어지는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제에 관한 것이다.
일반적으로, 인간의 몸을 구성하는 세포는 성장과 함께 분열·증식을 반복하지만, 그 과정에서 나이 듦(加齡)에 따른 다양한 스트레스에 노출되어 손상이 축적된다. 이는 활성산소의 축적에 의한 산화 손상이나 자외선에 의한 DNA 손상 등이 원인으로 생각되며, 그 결과 미토콘드리아의 기능 저하나 세포 내 대사의 기능부전 등을 초래하여 암화·세포사에 이른다. 이와 같이, 나이를 먹는 것(加齡)과 함께 세포의 질이 저하되는 것은 인간을 비롯하여 수명을 가진 모든 생물에 공통적인 현상이다. 현재, 나이 듦에 따른 세포의 질 저하는 불가피한 것이며, 이를 지연·정지·개선시키기 위한 연구가 광범위하게 이루어지고 있다.
생식의료의 분야에서는, 착상 전기 배아의 나이가 듦에 의한 질의 저하가 주목을 받고 있다. 착상 전기 배아의 질 저하는 착상 부전에 의한 임신율의 저하나 유산율의 증가로 이어진다. 실제로, 연령별 불임증 발병률을 보면, 20대 초반에서는 6%의 불임증이 30대부터 급격하게 증가하고, 40대에서는 64%에 달한다. 또한, 일본에서의 체외 수정 중 55%가 38세 이상의 나이 듦의 증례이다. 젊은 환자의 체외 수정에 의한 임신율은 평균 26%이지만, 나이 듦의 증례에서는 저하되고 38세 이상에서는 불과 6.3%이다.
CXCL5는 케모카인의 일종이며, 호중구의 주화성/활성화에 기여하고, 염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1).
: 일본 특표 2005-527189호 공보
지금까지 나이 듦에 의한 착상 전기 배아의 질의 저하를 개선하고자 하는 시도가 이루어져 왔으나, 유효성이 높은 방법은 개발되지 않았다. 그 결과, 자신의 배아에서의 임신을 포기하고, 젊은 여성으로부터 난자를 제공받아 체외 수정·배아 이식에 의해 임신하는 일이 이루어지고 있다.
이 난자 제공에 의한 임신에서는, 다른 사람의 난자와 남편의 정자를 수정시키고 착상 전기 배아를 자궁에 이식하여 임신시키기 때문에 윤리적인 문제점이 지적되고 있다. 또한, 완전히 비자기(non-self)인 아이를 임신하기 때문에, 모체에 면역 이상이 생겨 임신 합병증이 증가한다는 견해도 있다. 또한, 난자 제공자도 난소 자극을 위한 빈번한 주사나 채란(採卵)과 같은 침습도가 높은 행위를 받을 필요가 있어 안전성의 문제가 지적되고 있다.
한편, 산화 스트레스나 염증 손상을 경감시킬 수 있는 서플리먼트의 섭취에 의한 착상 전기 배아의 질 개선이 시도되어 왔으나, 과학적으로 증명된 높은 효과가 있는 서플리먼트는 발견되지 않았다. 즉, 나이 듦 등에 의한 착상 전기 배아의 질을 개선할 수단이 요구되고 있다.
이들 요구에 부응하기 위해, 본 발명은 나이 듦에 따른 착상 전기 배아의 질 저하를 개선하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토하였다. 그 결과, 케모카인의 일종인 CXCL5가 배아의 노화(加齡)를 유도하는 것을 지견하고, CXCL5로부터의 신호 전달을 저해함으로써 나이를 먹는 것 등에 의한 착상 전기 배아의 질 저하를 개선할 수 있다는 것을 지견하였다. 이와 같은 지견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질로 이루어지는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제.
[2] CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질이 CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하는 물질인, [1]에 기재된 개선제.
[3] CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하는 물질이 항 CXCL5 항체 또는 그 단편, 항 CXCR2 항체 또는 그 단편, 또는 CXCR2 길항제인, [2]에 기재된 개선제.
[4] 난자, 수정란 및/또는 배아의 질이 나이를 먹는 것에 의해 저하된 것인, [1] ~ [3] 중 어느 하나에 기재된 개선제.
[5] [1] ~ [4] 중 어느 하나에 기재된 개선제를 함유하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 배양액.
[6] 대상으로부터 분리한 혈청 중의 CXCL5 농도를 지표로 하여 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 유무를 판단하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 예측 방법.
[7] 대상으로부터 분리한 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 지표로 하여 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 유무를 판단하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 예측 방법.
[8] CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질에 난자, 수정란 또는 배아를 접촉시키는 공정을 포함하는, 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선 방법.
[9] CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질을 함유하는 배양액 중에서 난자, 수정란 또는 배아를 배양하는 공정을 포함하는, 난자, 수정란 또는 배아의 배양 방법.
본 발명에 의해, CXCL5로부터의 CXCR2를 통한 신호 전달을 저해함으로써 나이 듦 등에 의해 저하된 난자, 수정란 또는 배아의 질을 개선하고, 체외 수정 배아 이식 등에 있어서 임신율·출생률을 높일 수 있다. 또한, 혈액 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 바이오 마커로서 사용함으로써, 난자, 수정란 또는 배아의 노화를 예측할 수 있다.
도 1은 젊은 불임증 환자 및 고령 불임증 환자의 배반포(胚盤胞)의 유전자 발현 비교에 의해 발현 변동이 있었던 유전자의 생물학적 기능 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 CXCL5 중화 항체, CXCR2 길항제 및 이들의 병용에 의해 얻어진 배아의 배반포 도달률의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 CXCL5 중화 항체 및 CXCR2 길항제의 병용에 의해 얻어진 배아의 배이식 결과를 나타내는 도면이다. A는 각 군의 마우스 착상률을 나타낸다. B는 각 군의 마우스의 새끼 획득률을 나타낸다.
도 4는 CXCL5 중화 항체 및 CXCR2 길항제를 각각 단독으로 첨가하여 얻어진 배아의 배아 이식 결과를 나타내는 도면이다. A는 CXCL5 중화 항체 첨가군의 착상률을 나타내는 도면이다. B는 CXCL5 중화 항체 첨가군의 새끼 획득률을 나타내는 도면이다. C는 CXCR2 길항제 첨가군의 착상률을 나타내는 도면이다. D는 CXCR2 길항제 첨가군의 새끼 획득률을 나타내는 도면이다.
도 5는 어린 마우스에 CXCL5를 첨가하여 얻어진 배아의 배반포 도달률의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 어린 마우스에 CXCL5를 첨가하여 얻어진 배아의 배아 이식 결과를 나타내는 도면이다. A는 각 군의 마우스 착상률을 나타낸다. B는 각 군의 마우스의 새끼 획득률을 나타낸다.
도 7은 어린 마우스에 CXCL5를 첨가하여 얻어진 배아에서의 노화 마커의 발현량의 결과를 나타내는 도면이다. A는 p21의 발현량을 나타낸다. B는 p53의 발현량을 나타낸다. C는 PAI-1의 발현량을 나타낸다. D는 IL-6의 발현량을 나타낸다.
도 8은 노화 마우스 및 어린 마우스의 혈청 중 및 난소 중의 CXCL5 농도의 측정 결과를 나타내는 도면이다. A는 혈청 중의 농도를 나타낸다. B는 난소 중의 농도를 나타낸다.
(질 개선제)
본 발명의 한 형태는, CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질로 이루어지는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제(이하, 단순히 "질 개선제"라고 칭하는 경우가 있음)에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질을 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선의 용도로 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한 "난자, 수정란 및 배아의 질 개선"이란 "난자, 수정란 및 배아의 임신 능력의 개선"이라고 바꾸어 말할 수 있다.
후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 나이를 먹는 것 등에 의해 난소 내의 CXCL5 농도가 증가하는 것을 밝혔다. 또한, CXCL5가 난자나 수정란 및 배아 등의 노화를 유도하는 것에 의하여, 얻어지는 배아의 질이 저하되는 것을 지견하였다. 그리고, CXCL5에 의해 저하된 난자, 수정란 또는 배아의 질을 CXCL5로부터의, 케모카인 수용체인 CXCR2를 통한 신호 전달을 저해함으로써 개선할 수 있다는 것을 지견하였다. 이와 같은 지견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제는 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질이며, 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선 작용을 발휘하는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하는 물질 등을 들 수 있다.
CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하는 물질로는 항 CXCL5 항체 또는 그 단편, 항 CXCR2 항체 또는 그 단편, 또는 CXCR2 길항제 등을 들 수 있다. 이들은 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 항 CXCL5 항체, 항 CXCR2 항체 또는 그 단편으로는 예를 들어, CXCL5 또는 CXCR2와 결합함으로써 CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하는 항체(중화 항체) 또는 그 단편을 들 수 있다.
항 CXCL5 항체, 항 CXCR2 항체로는 공지의 것을 사용할 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 항 CXCL5 항체로서 예를 들어, 항-CXCL5 항체(abcam, R and D systems, LifeSpan Biosciences, ThermoFisher SCIENTIFIC) 등을 들 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 항 CXCR2 항체로서 예를 들어, 항-CXCR2 항체(abcam), 인간 CXCR2/IL-8RB Mab(R and D systems), 마우스 모노클로날 CXCR2/IL-8 RB Antibody(Novuss Biologicals), CXCR2/IL8RB 항체(ThermoFisher SCIENTIFIC) 등을 들 수 있다.
항 CXCL5 항체는 CXCL5 또는 그 단편을 항원으로 하여 통상적인 방법에 의해 제작하는 것도 가능하고, 그러한 항체를 본 발명에 사용하는 것도 가능하다.
항 CXCR2 항체는 CXCR2 또는 그 단편을 항원으로 하여 통상적인 방법에 의해 제작하는 것도 가능하고, 그러한 항체를 본 발명에 사용하는 것도 가능하다.
상기 항체는 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 된다. 또한, 완전한 항체 분자여도 되고, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들어 Fab(fragment of antigen binding), F(ab')2, Fab', Fv, scFv(single chain Fv), dsFv(disulfide stabilized Fv), CDR(complementarity determining region) 등이어도 된다. 항체는 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 사용하는 것도 가능하다.
상기 CXCR2 길항제로는 예를 들어, CXCL5와 경쟁하여 CXCR2와 결합함으로써 CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하지만, 그 자신은 CXCR2를 활성화하는 능력을 갖지 않는 물질을 들 수 있다.
CXCR2 길항제로는 공지의 것을 사용할 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 SB225002(TOCRIS) 등을 들 수 있다.
CXCL5와 CXCR2의 상호작용을 저해하는 항체 및 길항제는 CXCL5와 CXCR2의 결합을 항체 및 길항제 비 존재하에서의 결합과 비교하여 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 1% 이하로 저해하는 것인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용하는 항체 및 길항제는 CXCL5와 CXCR2를 사용하여 이들의 결합을 저해하는지의 여부를 지표로 하여 공지의 방법에 의해 선택할 수 있다. CXCL5와 CXCR2의 결합을 저해함으로써 CXCL5로부터의 CXCR2를 통한 신호 전달이 저해되어, 나이를 먹는 것 등에 의해 저하된 난자, 수정란 또는 배아의 질을 개선할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 항체 및 길항제는 CXCL5와 CXCR2를 사용하여 CXCL5로부터의 CXCR2를 통한 신호 전달을 저해하는지의 여부를 지표로 하여 공지의 방법에 의해 선택하는 것도 가능하다.
본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제를 난자, 수정란 또는 배에 접촉시킴으로써 CXCL5로부터의 CXCR2를 통한 신호 전달을 저해하고, CXCL5에 의해 저하된 난자, 수정란 또는 배아의 질을 개선한다. 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제의 난자, 수정란 또는 배아에 대한 접촉 방법으로는 본 발명의 질 개선제를 배양액에 첨가하고, 그 배양액 중에서 난자, 수정란 또는 배아를 배양하는 방법을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 배아의 질 개선에는 본 발명의 질 개선제를 난자 및/또는 수정란에 접촉시켜 난자 및/또는 수정란의 질을 개선함으로써 배아의 질이 개선되는 것, 그리고 본 발명의 질 개선제를 배아에 접촉시켜 배아의 질을 개선하는 것이 포함된다. 마찬가지로, 본 발명에 있어서의 수정란의 질 개선에는 본 발명의 질 개선제를 난자에 접촉시켜 난자의 질을 개선함으로써 수정란의 질이 개선되는 것, 그리고 본 발명의 질 개선제를 수정란에 접촉시켜 수정란의 질을 개선하는 것이 포함된다.
본 발명의 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선 작용은 통상 사용되는 체외 배양계 등에서, 본 발명의 질 개선제 첨가군에서, 질 개선제 비첨가군에 대해 임신·출산에 관련되는 평가 항목, 예를 들어 배반포 도달률, 착상률, 새끼 획득률, 유산율 등 중 어느 하나 또는 그 중 복수의 항목이 개선되는 것에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선제의 적용 대상은 나이를 먹는 것 등에 의해 난자, 수정란 또는 배아의 질이 저하된 대상으로서, 개선이 요구되는 대상이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 나이 듦에 따른 CXCL5의 분비·분비 증가에 의해 난자, 수정란 또는 배아의 질이 저하된 대상, 또한 이러한 난자, 수정란 또는 배아의 질 저하에 의해 임신율·출생률 등이 저하된 대상 등을 들 수 있다. 대상은 포유류이며, 포유류로는 특별히 한정되지 않지만, 인간, 비인간 동물, 예를 들어 돼지류, 소류, 소과(bovid), 말류, 아시아 물소류 등과 같은 고기 및 낙농 생산을 위해서 상업적인 가치를 갖는 동물 등을 포함한다.
(배양액)
본 발명의 일 형태는, CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질로 이루어지는 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제를 함유하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 배양액(이하, 단순히 "배양액"이라고 칭하는 경우가 있음)에 관한 것이다. 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 배양액은 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제를 함유하는 것을 특징으로 하고, 난자, 수정란 또는 배아의 배양 중에 나이 듦 등에 따른 CXCL5의 분비·분비 증가에 의해 저하된 난자, 수정란 또는 배아의 질을 개선하기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명의 배양액은 유효 성분으로서 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제를 함유한다면, 그 밖의 성분은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 공지의 난자, 수정란 또는 배아의 배양액에 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제를 첨가하여 본 발명의 배양액을 제조할 수 있다.
체외 수정 등에 사용하는 난자, 수정란 또는 배아의 배양액은 발생 단계 등에 따라 상이한 조성의 배양액을 사용할 수 있다. 종래, 난자, 수정란 또는 배아의 배양에 사용되고 있는 배양액이면 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제를 첨가하여 본 발명의 배양액을 제조할 수 있다. 또한, 수정란을 배양하기 위해서 사용되는 배양액, 그리고 상실기부터 배반포기까지의 배아를 배양하기 위해서 사용되는 배양액에 본 발명의 질 개선제를 첨가한 형태가 바람직하다.
보다 상세하게는, 체외 수정 등에 사용하는 난자, 수정란 또는 배아의 배양액으로는 정자와 난자의 수정 및 수정 후(전핵기)로부터 16세포기까지의 배아를 배양하기 위해서 사용되는 제1 배양액, 상실기부터 배반포기까지의 배아를 배양하기 위해서 사용되는 제2 배양액 등이 사용된다. 제1 배양액과 제2 배양액은 동일한 배양액을 사용해도 된다. 정자의 채취, 난자의 채취에는 제1 배양액을 사용할 수 있다. 이들의 배양액은 시판되고 있고, 시판되는 배양액을 본 발명의 배양액 제조에 사용하는 것도 가능하다. 특별히 제한되지 않지만, 제1 배양액으로는 실험동물용의 배양액 외에, Sydney IVF Fertilization 배지(Cook medical), Sydney IVF Cleavage 배지(Cook medical), Sequential Fert(ORIGIO), Sequential Cleav(ORIGIO), Universal IVF 배지(ORIGIO), G-IVFTM(Vitrolife), G-1TM v5(Vitrolife) 등을 사용할 수 있고, 제2 배양액으로는 실험동물용의 배양액 외에, Sydney IVF Blastosist 배지(Cook medical), Seaquential Blast(ORIGIO), Blastassist 배지(ORIGIO), G-2TM v5(Vitrolife) 등을 사용할 수 있다.
또한, 무기염, 당류, 아미노산류, 세포 보호 물질, 항생 물질, 생리 활성 물질 등을 초순수 또는 증류수 등에 용해하고 조제한 배양액을 사용하여 본 발명의 배양액을 제조하는 것도 가능하다.
배양액에 있어서의 본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제의 함유량은 배양액 중의 농도로서 항체 또는 그 단편이라면 통상 0.01 ~ 100 μg/ml, 바람직하게는 0.1 ~ 10 μg/ml일 수 있다. 길항제라면 통상 1 ~ 100 nM, 바람직하게는 10 ~ 30 nM일 수 있다. 항체 또는 그 단편과 길항제를 병용하는 경우에는 통상 28.6:1 ~ 2857.1:1, 바람직하게는 28.6:1 ~ 1000:1(질량비)일 수 있다.
난자, 수정란 또는 배아의 배양은 본 발명의 배양액을 사용하는 것 이외에는 공지의 배양 방법에 따라 실시할 수 있다. 배양의 조건에 대해 이하에 예시하지만, 그 조건에 한정되지 않고 적용 대상, 필요로 하는 효과 등에 따라 적절히 변경할 수 있다.
배양 온도는 통상 37℃ 이상으로 할 수 있다. 배양 기상은 통상 5% CO2, 95% O2의 기상으로 할 수 있다.
배양 시간은 체외 수정을 위한 난자의 전배양이라면 통상 1시간 ~ 2시간, 수정란이면 통상 5 ~ 72시간, 상실기 이후의 배아이면 통상 72 ~ 144시간으로 할 수 있다.
본 발명의 질 개선제를 난자의 전배양 기간, 수정란의 배양 기간 및 상실기 이후의 배아의 배양 기간 중 적어도 어느 한쪽의 기간에 난자, 수정란 또는 배아와 접촉시킬 수 있다.
복수의 배양 기간에 걸쳐 본 발명의 질 개선제를 난자, 수정란 또는 배아와 접촉시켜도 된다. 본 발명의 질 개선제를 난자, 수정란 또는 배아와 접촉시키는 시간은 각 기간 중의 전부 또는 기간 중의 일부의 기간이어도 된다.
본 발명의 난자, 수정란 및/또는 배아의 배양액은 나이를 먹는 것 등에 의해 저하된 난자, 수정란 또는 배아의 질의 개선 및 질이 저하된 난자, 수정란 또는 배아에 의한 체외 수정·현미 수정 성공률의 저하 개선 등을 필요로 하는 포유류의 난자, 수정란 및 배아를 대상으로 하며, 특별히 한정되지 않는다. 포유류로는 특별히 한정되지 않지만, 인간, 비인간 동물, 예를 들어 돼지류, 소류, 소과, 말류, 아시아물소류 등을 포함한다.
(노화의 예측 방법)
본 발명의 일 형태는, 대상으로부터 분리한 혈청 중의 CXCL5 농도를 지표로 하여 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 유무를 판단하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일 형태는, 대상으로부터 분리한 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 지표로 하여 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 유무를 판단하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 예측 방법(이하, 이들을 단순히 "노화의 예측 방법"이라고 칭하는 경우가 있음)에 관한 것이다.
후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 난소 내의 CXCL5 농도와 혈청 중의 CXCL5 농도의 정도가 서로 관련이 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 난소 내의 CXCL5 농도를 지표로 하는 것 외에, 혈청 중의 CXCL5 농도를 지표로 함으로써 난소 내의 CXCL5 농도 및 CXCL5에 의한 난자, 수정란 또는 배아가 노화의 유도를 받고 있는지의 여부를 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서, 검체로서 사용되는 혈액으로는 혈청을 들 수 있고, 혈청은 대상으로부터 채취한 혈액을 통상적인 방법에 따라 처리함으로써 적절하게 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 검체로서 사용되는 난소 조직으로는 난소 조직 자체, 난소 조직 조제물, 난소 조직 유래 성분(난소 세포, 난포액, 과립막 세포 등) 등을 들 수 있고, 이들은 대상으로부터 채취한 난소 조직을 통상적인 방법에 따라 처리함으로써 적절하게 얻을 수 있다.
난소 조직 중의 CXCL5 농도로는 CXCL5 단백질 농도에 한정되지 않고, CXCL5 발현에 관련하는 물질의 농도 등이어도 된다. 여기에서 발현이란, CXCL5의 유전자의 전사 또는 그 유전자의 전사 산물로부터의 번역을 의미한다.
혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 측정하는 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 면역 화학적 방법, HPLC법 등의 각종 크로마토그래피법 등을 들 수 있다. 관련하는 물질이 핵산인 경우에는, CXCL5 농도를 측정하는 방법으로는 RT-PCR법 등의 PCR법 등을 들 수 있다. 간편성 등의 점으로부터, CXCL5를 인식하는 항체를 사용하는 면역화학적 방법에 의해 측정하는 것이 바람직하다.
혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도 측정에 사용되는 면역 화학적 방법으로는 특별히 제한은 없고, 공지의 방법, 예를 들어 효소 면역 측정법(EIA법), 라텍스 응집법, 면역 크로마토법, 방사 면역 측정법(RIA법), 형광 면역 측정법(FIA법), 발광 면역 측정법, 스핀 면역 측정법, 항원 항체 복합체 형성에 따른 탁도를 측정하는 비탁법, 항체 고상막 전극을 이용하여 항원과의 결합에 의한 전위 변화를 검출하는 효소 센서 전극법, 면역 전기 영동법, 웨스턴 블롯법 등을 들 수 있다. 간편성 등의 점으로부터, EIA법, 라텍스 응집법 또는 면역 크로마토법에 의해 측정 하는 것이 바람직하다.
EIA법에는 효소 표지 항원과 검체 중의 항원을 경쟁시키는 경쟁법과 경쟁시키지 않는 비경쟁법이 있으며, 이 중 2종류의 항체를 사용하는 비경쟁법인 샌드위치 효소 결합 면역 고상 측정법(샌드위치 ELISA법)이 조작의 간편성 등의 점에서 바람직하다.
혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 지표로 할 때, 예를 들어 대상과 동종의 대조(예를 들어, 정상인 대상, 어린 대상 등)의 혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 또는 그 농도를 기준으로 하여 컷오프 값으로서 설정한다. 컷오프 값은 대조의 혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도나 그 농도를 기준으로 한 값으로서, 검체, 필요로 하는 효과 등에 따라 통상적인 방법에 기초하여 적절하게 설정할 수 있다.
그 컷오프 값 또는 이미 설정된 컷오프 값보다도 대상으로부터 분리한 혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도가 높은 경우, 난자, 수정란 또는 배아가 노화하고 있다고 판단하고, 대상으로부터 분리한 혈청 또는 난소 조직 속의 CXCL5 농도가 컷오프 값와 동일하거나 또는 낮은 경우, 난자, 수정란 또는 배가 노화하지 않았다고 판단하여 노화를 예측할 수 있다. 또한, 대상으로부터 분리한 혈청 또는 난소 조직 중의 CXCL5 농도를 컷오프 값와 비교함으로써 노화의 정도를 예측할 수 있다.
본 발명의 노화 예측 방법의 적용 대상은 포유류이며, 특별히 한정되지 않는다. 포유류로는 특별히 한정되지 않지만, 인간, 비인간 동물, 예를 들어 돼지류, 소류, 소과, 말류, 아시아물소류 등을 포함한다.
(질 개선 방법 및 배양 방법)
그리고 본 발명은 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질에 난자, 수정란 또는 배아를 접촉시키는 공정을 포함하는, 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질에 난자, 수정란 또는 배아를 접촉시키는 공정을 포함하는, 난자, 수정란 또는 배아의 질을 개선하고 임신율·출산율을 높이는 방법을 포함한다. 접촉 방법 등에 대해서는 전술한 항의 내용을 참조할 수 있다.
그리고 본 발명은 CXCL5로부터의 신호 전달을 저해하는 물질을 함유하는 배양액 중에서 난자, 수정란 또는 배아를 배양하는 공정을 포함하는, 난자, 수정란 또는 배아의 배양 방법을 포함한다. 배양의 조건 등에 대해서는, 전술한 항의 내용을 참조할 수 있다.
[실시예]
이하에 실시예를 들어 본 발명의 상세한 사항을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
착상 전기 배아를 젊은 불임증 환자의 것과 39세 이상의 고령 불임증 환자의 것으로 유전자 발현 프로파일을 비교하고, 발현에 차이가 인정되는 유전자를 망라적으로 해석하였다. 그 중에서, 분비 인자이면서 고령의 환자에서 고 발현되는 것을 탐색하여, 나이를 먹는 것에 의한 배아의 질 저하에 관여하는 후보 인자로 하였다. 구체적으로는, 이하와 같이 실험을 수행하였다.
젊은 환자와 고령 환자의 배반포의 유전자 발현을 DNA 마이크로 어레이에 의해 망라적으로 비교한 결과, 발현량에 5배 이상의 차이가 있는 발현 변동 유전자는 3789개였다. 이들 유전자의 생물학적 기능 해석을 실시한 결과, 대사나 세포 주기 등에 관한 유전자가 나이를 먹는 것에 의해 영향을 받고 있었다(도 1).
발현 변동 유전자 중에서, 분비 인자이면서 고령의 환자에서 고 발현되는 것을 추출하고, 노화 환자의 배반포에 있어서 젊은 환자와 비교하여 202.8배 높은 발현량을 나타내는 CXCL5를 최종 후보 인자로 하였다.
<실시예 2>
실시예 1에서 얻어진 후보 인자 CXCL5에 대해, 노화 마우스 배아의 체외 배양계에서, 그 중화 항체나 특이적 수용체의 길항제 첨가에 의해 나이를 먹는 것에 의해 저하된 배아의 질이 개선되는지의 여부에 대해 조사하였다. 42주령의 노화 마우스로부터 배란된 성숙 난자를 회수하여 체외 수정을 실시하고, 얻어진 수정란(zygote)에 대해 후보 인자의 중화 항체나 특이적 수용체의 길항제를 첨가한 배양액을 사용하여 체외 배양을 실시하고, 배아 발육능을 검증하기 위해 배반포 도달률을 구하였다. 또한, 얻어진 배반포를 거짓임신 마우스에 배아 이식하고, 착상률, 새끼 획득률을 조사하여 배아의 질을 추가로 평가하였다. 구체적으로는 이하와 같이 실험을 실시하였다.
(실험동물)
ICR 암컷 마우스(일본 쿠레아, Tokyo, Japan)를 실험동물로서 사용하였다. 마우스는 실온 22℃, 습도 55%, 12시간마다 명암 환경하에서 사육되었다. 마우스 사료는 MF컨트롤 사료(오리엔탈 효모, Tokyo, Japan) 마우스 한 마리당 하루 6 g을 주었다. 수분은 수시로 자유롭게 섭취할 수 있는 상태로 하였다. 어린 마우스로서 3주령의 마우스를, 노화 마우스로서 42주령의 마우스를 사용하였다. 각 군은 5마리로 하였다.
모든 마우스의 취급이나 사육에 관해서는 성마리안나 의과대학의 실험동물 시설의 기준에 준하였다.
(체외 수정 및 배아 배양)
3주령 및 42주령을 지난 마우스는 질 도말법에 의해 성주기를 확인하였다. 발정 전기의 타이밍에 고나도트로핀(ASKA Pharmaceutical. Co., Tokyo, Japan) 10 IU를 복강 내 투여하였다. 투여 후 15시간에 난자 난구세포 복합체(COC : Cumulus Oocyte Complex)를 난관 내로부터 회수하고, 100 μl TYH 배지(LSI Medience corporation, Tokyo, Japan) 내에서 30분간 전 배양하였다. 그 사이에 ICR 수컷 마우스(10-12주령)에 소무노펜틸 마취약(교리츠제약, Tokyo, Japan)으로 전신 마취를 실시하고, 정소 상체 꼬리 부분을 적출하였다. 정소 상체 꼬리 부분의 일부를 절개하여 내부의 정자를 밀어내어 회수하였다. 회수한 정자 덩어리를 400 μl TYH 배지가 들어있는 1.5 mL 마이크로 튜브에 가라앉혀 CO2 배양기 내에서 10분간 스윔 업( swim up) 하였다(37℃, 5% CO2, 95% in air). 스윔 업 후의 정자를 COC가 들어있는 100 μl TYH 배지에 최종 농도 2~3 × 105/ml가 되도록 첨가하고, CO2 배양기(37℃, 5% CO2, 95% in air) 내에서 5-6시간 배양하였다. 배양 후의 난자는 30 μl KSOM 배지(Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 내에서 정자의 제거를 수행하고, 이때에 2 세포기 배아의 수를 산출하였다. 그 후, 어린 마우스 대조, 노화 마우스 대조에 대해서는 다른 30 μl KSOM 배지로 옮겨 CO2 배양기 내에서 4일간 배양하였다. 약제 처리군에 대해서는, 각각 최종 농도 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml의 CXCL5 중화 항체(ab135203, abcam)를 첨가한 30 μl KSOM 배지, 최종 농도 10 nM, 30 nM의 CXCR2 길항제(2725, TOCRIS)를 첨가한 30 ml KSOM 배지, 그리고 CXCL5 중화 항체 및 CXCR2 길항제를 첨가한 30 μl KSOM 배지로 옮기고, CO2 배양기 내에서 4일간 배양하였다. 배반포 도달률은 배반포 수/2세포기 배아 수로 산출하였다.
노화 마우스의 수정란에 CXCL5의 중화 항체 및 특이적 수용체의 길항제를 상이한 농도로 첨가한 결과, 배반포 도달률은 대조군과 약제 처리군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(도 2).
(배아 이식 및 제왕 절개)
4일간의 배양 후, 배반포기 배아에 도달한 배아를 배아 이식하였다. 수여(수여) 마우스는 6-10주령의 ICR 암컷 마우스로, 채란일의 전날에 정관 결찰된 ICR 수컷 마우스와 교배시켜 다음날 질전(膣栓)을 확인할 수 있던 개체를 사용하였다. 소무노펜틸 마취약으로 전신 마취를 실시하고, 후배부 절개에 의해 자궁을 노출시켰다. 자궁을 핀셋으로 고정하고, 30G의 주사 바늘(Dentronics, Tokyo, Japan)로 난관 접합부에 구멍을 뚫어 배반포를 흡인한 유리 캐필러리를 삽입하여 자궁 내부에 배아를 이식하였다. 이식 후, 자궁을 신중하게 체내에 돌려놓고, 후복막 및 피부를 봉합하였다. 이식에 즈음해서는, 각 군의 마우스로부터 얻어진 배반포를 개체마다 각각 수여 마우스에 이식하였다. 채란 다음날을 1일째로 하여 19일째에 제왕 절개를 실시하였다. 수여 마우스를 안락사시켜 개복, 자궁을 적출하여 태자(胎仔)를 꺼냈다. 착상률은 착상흔(着床痕)의 수/배아 이식 수, 새끼 획득률은 새끼의 수/착상흔의 수로 산출하였다.
대조군과 약제 처리군의 배반포를 거짓임신 마우스에 이식한 결과, 착상률이 중화 항체 + 길항제 첨가군에서 현저하게 개선되었다(One-way ANNOVA followed by Tukey-Kramer test, *P<0.05 vs. 대조군, 도 3). 중화 항체(10 μg/ml) + 길항제(10 nM) 첨가군에서 노화 대조와의 사이에 유의차를 보였다. 새끼 획득률은 중화 항체(10 μg/ml) + 길항제(10 nM) 첨가군에서 유의하게 상승하였다(도 3).
중화 항체(10 μg/ml) 단독 첨가군, 길항제(10 nM) 단독 첨가군에서도 약제 처리군에서 착상률, 새끼 획득률 모두 높은 경향을 나타내었다(도 4).
<실시예 3>
또한, 어린 마우스 배아의 체외 배양계에 있어서, 그 후보 인자의 첨가에 의해 배반포 도달률, 착상률, 새끼 획득률에 변화가 있는지의 여부에 대해 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 검토하였다. 또한, 노화 마커인 p16, p21, p53, PAI-1, IL-6의 배아에 있어서의 발현을 측정하여 세포 노화가 유도되는지의 여부에 대해 조사하였다. 구체적으로는 이하와 같이 실험을 실시하였다.
실시예 2에 기재된 방법에 기초하여, 어린 마우스에 대해 체외 수정 및 배아 배양을 실시하였다. 단, 대조군에 대해서는 30 μl KSOM 배지, 약제 처리군에 대해서는 최종 농도 1,000 nM의 열변성(95℃, 5분간) CXCL5(ab9803, abcam), 각각 최종 농도 100 nM, 300 nM, 1,000 nM의 CXCL5를 첨가한 30 μl KSOM 배지로 옮겨 CO2 배양기 내에서 4일간 배양하였다. 그 후, 배반포 도달률을 산출하였다.
어린 마우스의 수정란에 CXCL5 및 열변성 CXCL5를 첨가하여 배양한 결과, 배반포 도달률은 비첨가 대조군과의 사이에 유의한 차이는 보이지 않았다(도 5).
실시예 2에 기재된 방법에 기초하여 대조군과 약제 처리군의 배반포를 거짓임신 마우스에 이식하였다. 그 후 착상률 및 새끼 획득률을 산출하였다.
CXCL5 및 열변성 CXCL5를 첨가하여 얻어진 배반포를 거짓임신 마우스에 이식한 결과, CXCL5 첨가군에서 착상률이 저하되었다(One-way ANNOVA followed by Tukey-Kramer test, *P<0.05 vs. 대조군, 도 6). CXCL5 1,000 nM 첨가군에서, 비첨가 대조군과의 사이에 유의한 차이를 보였다. 새끼 획득률은 대조군과의 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(One-way ANNOVA followed by Tukey-Kramer test, *P<0.05 vs 대조군, 도 6). 또한, 열변성 CXCL5 첨가군은 착상률, 새끼 획득률 모두 대조군과의 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다.
CXCL5를 첨가한 배아(n=30)에 있어서의 노화 마커(p16, p21, p53, PAI-1, IL-6)의 발현량을 실시간 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. p16은 발현량에 차이를 보이지 않았지만, p21, p53, PAI-1, IL-6에서는 유의한 발현 증가를 보였다(T-test, *P<0.05 vs 대조군, 도 7).
<실시예 4>
어린 마우스 및 노화 마우스에 있어서의 후보 인자의 혈청 중 및 난소 조직에 있어서의 농도를 측정하여 후보 인자가 배아의 노화를 예측 가능한 바이오 마커로서 유용한지의 여부를 평가하였다. 구체적으로는 이하와 같이 실험을 실시하였다.
실시예 2에 있어서의 체외 수정 전에, 어린 마우스 및 노화 마우스에 대해 각각 혈청 및 난소 조직을 채취하였다. 혈청 속 및 난소 중의 CXCL5의 농도를 ELISA를 사용하여 측정하였다. 노화 마우스의 혈청 중 및 난소 중의 CXCL5의 농도는 어린 마우스와 비교하여 유의하게 높은 값을 나타내었다(T-test, *P<0.05 vs 대조군, 도 8). 또한, 혈청 중 CXCL5의 농도 경향은 난소 중 CXCL5의 농도 경향과 서로 관련이 있고, 혈청 중 CXCL5의 농도로부터 난소 중 CXCL5의 농도를 예측할 수 있다는 것을 알았다.
노화된 배아에서의 CXCL5-CXCR2 신호의 억제는 나이를 먹는 것에 의해 저하된 난자, 수정란, 배아의 질을 개선하여 체외 수정 배아 이식 등에 있어서 임신율·출생률을 높이는 작용을 갖는 것이 밝혀졌다. 또한, CXCL5는 배아의 노화를 유도하고, 그 혈청 중 농도는 난자, 수정란, 배아의 노화 마커로서 유용하다는 것을 보여주었다.
본 발명은 의약품, 의료기기, 연구용 시약 등에 적용 가능하다.

Claims (7)

  1. 항 CXCL5 항체 또는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, 또는 SB225002인 CXCR2 길항제를 포함하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제로서,
    난자, 수정란 및/또는 배아의 질이 나이를 먹는 것(加齡)에 의해 저하된 것인, 개선제.
  2. 제1항에 있어서,
    난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선이, 난자, 수정란 및/또는 배아의 임신하는 능력의 개선인 것인, 개선제.
  3. 제1항에 기재된 개선제를 함유하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선용 배양액.
  4. 대상으로부터 분리한 혈청 중의 CXCL5 농도를 지표로 하여 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 유무를 판단하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 예측 방법.
  5. 대상으로부터 분리한 난소 조직 속의 CXCL5 농도를 지표로 하여, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 유무를 판단하는, 난자, 수정란 및/또는 배아의 노화 예측 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제는 인간용인 것인, 개선제.
  7. 제1항에 있어서,
    난자, 수정란 및/또는 배아의 질 개선제는 배반포 도달률, 착상률, 새끼 획득률, 또는 임신율·출산율의 개선용인 것인, 개선제.
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