KR102626259B1 - 종양 세포에서 RAD51 foci 검출에 기반한 방법 - Google Patents

종양 세포에서 RAD51 foci 검출에 기반한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 샘플을 분리하기 24시간 전에 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않았으며 샘플에 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리되지 않은, 암으로 진단된 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유하는 샘플에서 RAD51 foci의 수준을 기반으로 개체가 항암 치료에 민감성 또는 내성인지를 결정할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

종양 세포에서 RAD51 foci 검출에 기반한 방법
본 발명은 암으로 진단된 개체의 항암 치료 반응을 예측 및 모니터닝하는 방법, 개체 맞춤형 요법 (customized therapy)을 선택하는 방법, 개체를 환자 코호트로 분류하는 방법, 및 개체의 종양이 상동적인 재조합 복구 (HRR) 경로에 의해 DNA 복구 가능한지를 예측하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법들은 샘플을 분석하기 전에 DNA 손상을 유발하는 어떠한 방법에도 샘플을 노출할 필요없이, 개체로부터 유래된 종양 세포를 포함하는 샘플에서 RAD51 foci의 존재를 토대로 한다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에서의 키트의 용도 및 방법에서 언급되는 치료에 사용되는 의약 (medicament)에 관한 것이다.
세포는 세포 대사 및 환경으로부터 유래되는 유전자 독성 스트레스 등의 DNA 손상을 유발하는 다양한 조건들에 끊임없이 노출된다. 복구되지 않는다면 DNA 단일 가닥 절단 (SSB) 및 이중 가닥 절단 (DSB)과 같은 독성 및 돌연변이 유발을 부여하는 상당수의 DNA 병변들이 생길 수 있다. 게놈 온전성을 유지하기 위해, DNA는 여러가지 DNA 복구 경로를 이용해 복구된다. 가장 간단하게는, 절단된 DNA 말단들을 연결하여 SSB를 복구하거나, 또는 각각의 상동적인 DNA 가닥으로부터 주형 재조합 (templating recombination)을 이용해 DSB를 복구한다. 또한, DNA 손상 반응 (DDR) 네트워크 역시 DNA 복구를 위한 얼터너티브 또는 백업 기전 수단을 제공하므로, 유전자 결함만으로 복구 능력을 예측하긴 어렵다.
DNA 복구 유전자에의 결함은 높은 암 감수성과 연관되어 있다. 충분히 연구된 사례는 BRCA 단백질 활성에 결함이 있는 경우이다. BRCA1와 BRCA2 (BRCA1/2) 단백질은 HRR 경로에 의해 DNA DSB를 복구하는데 중요한 역할을 담당한다. BRCA1-PALB2-BRCA2 단백질 복합체는 RAD51을 DNA DSB에 위치시켜, 핵 RAD51 응집체 (즉, foci)를 형성시키고, 가닥 침투 (strand invasion) 및 상동적인 복구를 매개하도록 촉진할 수 있다. 따라서, 종양 세포에서 BRCA1 및 BRCA2의 기능에 문제가 생기면, 유전적으로 유전된 유방암과 연관된 RAD51에 의해 매개되는 DNA DSB의 복구가 생략된다.
항암 요법은 PARP 저해제 (PARPi)에 기반한 요법 등의, DDR에 이러한 결함이 있는 종양 세포를 특이적으로 표적하도록 설계되었다. PARP 단백질은, DNA 복구를 개시하기 위해 SSB를 검출하여 이에 결합함으로써, DNA SSB에 반응하여 활성화된다. 활성화된 PARP는 이후에 다른 DNA 복구 단백질들을 동원하여, DNA 복구를 촉진하게 된다. PARP 저해는 DNA에서 DSB로 변환되는 지속적인 SSB의 증가를 유발한다. BRCA1/2 결핍 세포와 같은 HRR 결함 세포는 PARP 저해에 의해 유발되는 DSB 축적을 복구하지 못하며, 그래서 복제 분기점 (replication fork) 붕괴, 염색체 불안정성 및 세포 사멸이 발생할 수 있다. 따라서, BRCA1 /2 돌연변이 세포는 PARP 저해제에 특히 민감한 것으로 동정되었다. 그러나, BRCA1 /2 돌연변이를 특징으로 하는 암 환자들 모두 PARPi 요법에 반응하지 않으며, 따라서 PARPi 내성으로 간주된다. 환자의 치료를 개선하고 치료제를 투여하기 전 종양의 반응성을 예측하기 위해, 이러한 내성의 기저 기전들이 연구되었다.
예를 들어, BRCA1 /2 복귀 돌연변이 (reversion mutation) 또는 소위 2차성 돌연변이가 HRR 기능 회복 및 PARP 저해에 대해 내성을 유발하는 것으로 입증되어 있다. 마찬가지로, 53BP1의 소실은 BRCA1 결함 종양에서 PARPi에 대해 내성을 유도한다. HRR 결핍 종양을 동정하기 위한 방법이 제안되어 있다. 이러한 방법은 화학요법 후 종양 생검 또는 생체외 방사선 조사된 종양 샘플에서 핵내 RAD51 foci 형성을 분석하는 것으로 구성된다.
그러나, PARPi에 기반한 요법 등의 항암 요법에 내성인 환자와 비-내성인 환자로 환자를 분류하기 위해, HRR-풍부 종양과 결핍 종양을 차별화할 수 있는 대안적이고 보다 간단한 방법이 당해 기술 분야에서 요구되고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는 방법에 관한 것으로,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않았으며, 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮다는 것은, 그 개체가 항암 치료에 반응성인 것으로 예측되는 것을 의미하거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 더 높은 것은, 그 개체가 항암 치료에 비-반응성으로 예측되는 것을 의미한다.
제2 측면에서, 본 발명은 암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법을 선택하는 방법에 관한 것으로서,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하고,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않았으며, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮다는 것은, 선택할 요법이 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하는 것을 의미하거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 더 높은 것은, 선택할 요법이 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하지 않는 것을 의미한다.
제3 측면에서, 본 발명은 암으로 진단된 개체를 환자 코호트로 분류하는 방법에 관한 것으로서,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않았으며, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 상기 기준값보다 낮다면, 환자는 항암 치료에 반응성으로 특정되는 코호트로 분류되거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 상기 기준값보다 높다면, 환자는 항암 치료에 비-반응성으로 특정되는 코호트로 분류된다.
제4 측면에서, 본 발명은 암으로 진단된 개체로부터 유래된 종양이 상동적인 재조합에 의한 DNA 복구 가능 여부를 예측하는 방법에 관한 것으로서,
i) 종양 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 종양은 종양을 분리하기 24시간 전에 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 시술받지 않은 개체로부터 분리된 것이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮은 것은, 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구될 수 있다는 것을 의미하거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 보다 높은 것은, 종양이 상동적인 재조합 매개에 의해 DNA 복구 가능하지 않다는 것을 의미한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 방법에 의해 개체가 의약 (medicament)에 대해 반응자로서 동정된, 개체에서 암 치료에 사용하기 위한 의약에 관한 것이다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에서 정의되는 방법에 의해 치료가 설계된, 개체에서 암 치료 방법에 사용하기 위한 의약에 관한 것이다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면, 제2 측면, 제3 측면 또는 제4 측면 중 어느 하나에 따른 방법에서의, RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
도 1은 환자-유래 종양 이종이식편 (PDX)에서 PARP 저해제 (PARPi) 올라파립의 항-종양 활성을 도시한 것이다. 구체적으로, PDX 6종은 완전 반응 (complete response, CR)을, PDX 2종은 부분 반응 (partial response, PR)을, PDX 2종은 안정적인 질환 (SD) 상태를, 34종은 진행성 질환 (PD)을 나타낸다. 패널은 유방암 (BrC) PDX 모델 39종, 고-등급의 중증 난소암 (HGSOC 또는 OvC) PDX 모델 3종 및 췌장암 (PaC) 유래 PDX 모델 2종으로 구성된다. 워터폴 플롯은 치료 개시시 종양 체적 대비 종양 체적 변화 %를 표시한다. 아래 표는 BRCA1 /2 돌연변이 (gBRCA)의 존재 또는 부재, (유전자 또는 후성유전자 오리진의) 상동적인 재조합 복구 (HRR)의 변형의 존재 또는 부재 및 암 타입/서브타입 등의 각각의 PDX 모델의 특징을 요약 개시한다. 검정색으로 칠해진 사각형은 그 형질에 대한 양성도를 나타낸다. 특히, gBRCA1 /2 돌연변이도 HRR 변형도 PARPi 올라파립에 대한 반응을 예측하지 못하였다. 베이스라인으로부터 20%, -30% 및 -95% 변동은 각각 PD, SD, PR 및 CR의 범위를 표시하기 위해 점선으로 표시된다. 오차 막대는 각각의 종양에서의 SEM이다. gBRCA, germline BRCA1/2 유전자 돌연변이; HRR 변형, BRCA1 /2 이외의 다른 HRR-관련 유전자에 변형이 있는 종양, 및 BRCA1 프로모터에 과메틸화가 존재하는 종양; TNBC, 3중 음성 유방암; ER+ BrC, 에스트로겐 수용체 양성 유방암; HGSOC 또는 OvC, 고-등급의 중증 난소암; PaC, 췌장암; 장기 치료시 올라파립 내성이 되는 PDX 모델은 접미사 OR이 표시된다.
도 2는 무처리 종양에서 세포 증식, DNA 손상 및 RAD51 foci 형성이 검출가능한 수준으로 검출됨을 도시한 것이다. (A) 도 1에 도시된 무처리 (비히클) 및 처리 (올라파립) PDX 종양으로부터 유래된 포르말린-고정된 파라핀 포매 (FFPE) 샘플의 소형 서브세트에서 면역형광에 의해 검출된 γH2AX 및 핵내 RAD51 foci 함유 종양 세포의 %. 본 발명자는 기능성 HRR의 마커로서 RAD51 foci 및 DSB에 의한 DNA 손상 마커로서 γH2AX foci를 정량하였다. 종양을 이의 올라파립 반응, 즉 내성 (PD) 대 민감성 (CR/PR/SD) 종양으로, 임상에 사용되는 임상 이점 비율 (Clinical Benefit Rate)과 비슷한 엔드포인트로서, 분류한다. 예상된 바와 같이, 올라파립은 양쪽 그룹에서 γH2AX foci 형성을 유도한다. RAD51 foci 형성은 올라파립 내성 PDX 모델에서만 유일하게 유의한 수준으로 유도된다. 중요하게도, γH2AX 및 RAD51 foci의 베이스라인 수준이 비히클 -처리 종양에서 검출되며, 이는 기능성 HRR 단백질을 무처리 샘플에서 분석할 수 있다는 생각을 뒷받침해준다. (B) 올라파립 반응에 따라 분류한, S/G2-세포 주기의 마커 (종양 세포가 DNA 합성의 세포 주기에 있음을 표시함)로서 geminin-양성 세포 및 종양의 geminin-양성 세포에서 γH2AX-양성 세포의 정량화. 양쪽 그룹에서 geminin-양성 세포가 비슷한 수준으로 관찰되며, 전체 세포의 20-70% 범위이다. 올라파립 처리는 민감성 종양 및 내성 종양 둘다에서 γH2AX foci 형성을 유의하게 증가시킨다. geminin 수준도 γH2AX foci도 PARPi 내성 종양으로부터 PARPi 민감성 종양을 구분하지 못한다. 패널 A에서와 같이, 무처리 종양은 현저한 수준의 내인성 DNA 손상 (γH2AX foci)을 나타낸다. (C) 지금부터 RAD51 스코어로 지칭되는 핵내 RAD51 foci를 가진 geminin-양성 세포의 정량화는 기능성 HRR을 가진 세포 주기의 S/G2 기인 세포의 비율 추정치를 제공한다. RAD51 foci/geminin-양성 세포 퍼센트는 내성 PDX 모델로부터 올라파립-처리 샘플에서 현저하게 증가된다. 특히, 내성 종양의 RAD51 foci/ geminin -양성 세포 베이스라인은 물론 민감성 종양의 베이스라인 보다 높다. 따라서, 무처리 종양에서 후속적인 분석을 수행한다. (D) 무처리 PARPi 내성 및 민감성 PDX 종양 샘플에서, 정량적인 역전사 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 측정한, RAD51 mRNA 발현 수준. 도 2A 및 2C에 나타낸 PARPi 민감성 종양에서의 RAD51 foci 형성 결여는 RAD51 발현 결핍으로 인한 것이 아니다. 페이어드 t 검사: **, <0.01; ***, <0.001; ****, <0.0001.
도 3은 저수준의 RAD51 foci 형성이 71가지 PDX 모델의 다기관 패널에서 PARPi-민감성과 연관되어 있음을 나타낸 것이다. (A) geminin-양성 세포에서 γH2AX foci 양성 세포의 퍼센트는, PARPi 반응과 독립적으로 모든 종양들에서 DNA 손상이 있다는 것을 보여준다. γH2AX foci의 정량화는, HRR 결여 대신에, DNA 손상 결핍으로 인한 low RAD51 종양의 분류 오류를 방지하는데, 필수적이다. (B) RAD51 foci-양성/γH2AX foci-양성 세포 %는 민감성 종양에서 더 낮은 수준을 나타낸다. (C) 모든 PARPi 민감성 종양이 낮은 RAD51 스코어를 나타냄을 보여주는, RAD51 foci/geminin-양성 세포의 정량화 (RAD51 스코어). (D) PARPi 처리 및 투여량 (1: 올라파립 100mg/kg, 2: 올라파립 50mg/kg, 3: 니라파립 75mg/kg, 4: 니라파립 50mg/kg 및 5: 벨리파립 100mg/kg), PARPi 반응 (검정, CR/PR; 회색, SD; 및 백색, PD), 종양 오리진, BRCA1 또는 BRCA2 유전자에서의 돌연변이 존재, BRCA1의 N-말단 (N-ter) 또는 C-말단 (C-ter) 영역에 대한 anti-BRCA1 항체를 이용해 검출되는 BRCA1 foci의 존재, 및 PALB2에서의 돌연변이 존재 등의, 각 PDX 모델의 여러가지 특징을 요약 개시한 표. 검정 색칠된 사각형은 형질 양성을 표시한다. NA, 데이터 이용가능하지 않음; TNBC, 3중 음성 유방암; ER+ BrC, 에스트로겐 양성 유방 종양; HGSOC 또는 OvC, 고등급의 중증 난소암; gBRCA, germline BRCA1 /2-돌연변이됨.
도 4는 RAD51 스코어가 PARP 저해제에 내성 종양과 민감성 종양을 정확하게 식별함을 보여준다. (A) 도 3C에 나타낸 스코어를 표시한 점 그래프. PARPi -내성 종양은 PARPi -민감성 종양에 비해 RAD51 foci/ geminin -양성 세포의 수준이 현저하게 더 높다. 점선은 수용자-조작 특징 (Receiver-Operating Characteristic, ROC) 곡선에서의 민감도 및 특이도를 최대화하는 우도비 (likelihood ratio)에 기반하여, PARPi 내성인 종양 또는 감수성 종양을 식별하는 컷-오프 (13%)를 표시한다. 특히, 민감성 그룹에서 RAD51 foci 수준이 더 높은 2가지 PDX 모델 (즉, PDX124 및 PDX384)은 PARPi에 대해 SD를 나타내었다. **** p<0.0001, t-검정. (B) 민감도 대 특이도, 및 개별 PDX-유래 종양 값을 토대로 한, PARPi 반응을 예측하기 위한 RAD51 스코어의 성능 측정 (삽입도)을 도시한 ROC 곡선. PPV, 양성 예측치; NPV, 음성 예측치.
도 5는 유방암 환자 코호트에서 RAD51 분석의 임상 검증을 도시한다. (A) geminin-양성 세포에서 RAD51 foci 형성 수준은 올라파립 내성 종양을 가진 환자로부터 민감성 종양을 가진 환자를 구분한다. 데이터는 일차성 PARPi-내성인 환자 (Pt) 2명 (gBRCA1 BrC 환자의 피부 전이로부터 유래된 샘플 1종 및 gBRCA2 BrC 환자의 림프절 전이로부터 유래된 또 다른 샘플) 및 PARPi-민감성 환자 4명 (Pt310pre + gBRCA2 BrC의 간 전이로부터 유래된 샘플, Pt124pre + gBRCA1 BrC의 유방절제술로부터 유래된 샘플, gBRCA1 BrC 환자의 림프절 전이로부터 유래된 샘플, 및 gBRCA1 HGSOC 환자의 복막 이식물로부터 유래된 샘플)의 샘플을 포함한다. 후천적인 내성을 위해, 데이터는 PARPi 진행기에 있는 환자 3명으로부터 수득한 샘플 (Pt310post + gBRCA2 BrC의 간 전이로부터 유래된 샘플, gBRCA1 BrC 환자의 피부 전이로부터 유래된 샘플, 및 gBRCA2 BrC 환자의 피부 전이로부터 유래된 마지막 샘플)을 포함한다. 언페어드 t 검정: ***, <0.001. (B) 유전성 유방암 또는 난소암 환자로부터 유래된 FFPE 종양 샘플에서의 RAD51 foci/geminin 양성도. 아래 표는 각 환자의 여러가지 특징들과 분석한 종양에서의 핵내 BRCA1 foci의 존재 또는 부재를 요약 개시한다. 특히, PALB2-돌연변이 환자로부터 유래된 종양 및 BRCA1 foci가 없는 종양은 RAD51 스코어가 낮았으며, 이는 임상 샘플에서 기능성 HRR 변형 동정에 있어 RAD51의 예측치를 뒷받침해준다. FH, 가족력; *, PALB2 유전자에 병원성 돌연변이가 존재하는 종양. (C) 및 (D) "치료-무경험 (treatment-naive)" 환자 (즉, 항암 치료를 받은 적이 없는 환자) 종양 샘플 및 "이전 치료받은" 종양 샘플에서, RAD51 및 γH2AX foci 형성의 정량화. gBRCA1 /2 환자로부터 유래된 "치료-무경험"의 원발성 유방암 종양 10종, 진단용 생검 (n=6) 또는 수술 종양 (n=4)에서 RAD51 및 γH2AX foci에 대해 점수를 매겼다. DNA 손상제 등의 신보강화학 요법 (neoadjuvant therapy)을 시술 받은 후 수술 생검 (n=3)으로부터 또는 전이성 세팅으로부터 유래된 (n=7), CA1/2 환자로부터의 "이전 치료받은" 원발성 유방 종양 또는 전이성 종양 10종에서, RAD51 및 γH2AX foci에 대해 점수를 매겼다. 전체적으로, 본 발명자들은 BRCA1-돌연변이 종양 10건과 BRCA2-돌연변이 종양 10건을 분석하였다. 이러한 데이터는, RAD51이 치료-무경험 종양 샘플에 유용할 뿐 아니라 화학요법을 받은 환자의 샘플에서도 유용하다는 것을, 검증해준다.
도 6은, gBRCA-돌연변이된 유방암 환자들로 된 후향성 코호트 (n=19)에서 비-재발 환자보다 질환 재발 환자에서 RAD51 스코어가 더 높다는 것을 보여준다. 환자들 모두 원발성 종양에 대한 근치적 수술 (radical surgery)과, 신보강제 (NeoAdj) 또는 보강제 (Adj) 세팅으로 표준 화합요법 (CTx)을 시술받았다. 치료-무경험 종양으로부터의 진단 생검 또는 외과성 생검에서 RAD51 분석을 수행하였다. 재발군 및 비-재발군은 고전적인 예후 인자들에 대해 균형을 유지하였다. (A) 질환 재발 발생 또는 부재에 의해 분류한 환자들에서 RAD51 스코어를 나타낸 점 그래프. 질환 결과가 양호한 환자 유래 종양 (즉, ≥5년 추적시 재발되지 않음)은 RAD51 foci 수준이 낮았으며, 즉 RAD51 스코어가 3.7% (점선) 미만이다. 질환 경과가 불량한 (즉, 재발된) 환자에서는 가변적인 수준이 나타났으며, 가장 빨리 재발한 환자 (진단 후 11개월)에서 가장 높은 RAD51 스코어가 나타났다 (RAD51 foci/geminin 양성 세포의 53%). 점선은 수용자-조작 특징 (ROC) 곡선에서의 민감도 및 특이도를 최대화하는 우도비 (likelihood ratio)에 기반하여, 재발 환자 유래 종양 또는 비-재발 환자 유래 종양을 식별하는 컷-오프를 표시한다. *, p=0.026, t-검정. (B) 민감도 대 특이도 및 질환 결과를 예측하기 위한 RAD51 스코어의 성능 측정 (삽입도)을 나타낸 ROC 곡선. PPV, 양성 예측치; NPV, 음성 예측치.
도 7은 전립선암 환자 유래 샘플들의 RAD51 스코어를 도시한다 (n=8). 원발성 전립선 절제물 (n=3) 및 간, 골수 및 림프절 전이 생검 등의 전이성 조직 (n=5)에서 RAD51 분석을 성공적으로 수행하였다. 3종의 샘플 (PrC-003, PrC-004 및 PrC-017)은 BRCA2에 게놈 변형 (2종의 생식세포 BRCA2-돌연변이 종양 -gBRCA2- 및 1종의 체세포 BRCA2 소실 -sBRCA2-)과 더불어 RAD51 foci 수준이 낮다. 특히, gBRCA2 돌연변이 환자로부터 유래된 샘플 PrC-021 (*)은 카보플라스틴에 대한 내성이 발현된 후 (치료 후 7개월 경과) 수득된 것이다. 이 샘플에서 높은 RAD51 foci 수준은 이 DNA 손상 약물에 장기 노출로 인해 발생할 가능성이 높은 HRR 결여의 복귀 (reversion)를 시사한다. 즉, RAD51 스코어는 임상에서 HRR 풍부 (n=5) 및 결여 (n=3)에 기반하여 전립선 종양을 분류한다.
도 8은 geminin-양성 세포에서 핵내 foci 개수에 기반한 RAD51 양성도에 대한 최적의 컷-오프를 확립하는 방법을 보여준다. 9개의 대표적인 PDX 모델로부터 유래한 (A) 비히클- 또는 (B) 올라파립-처리 샘플에서 개별 산점도 geminin-양성 세포 (각 모델에서 세포 100주를 정량함)의 RAD51 foci 개수를 나타낸 산점도: 6종 PARPi-내성 (PDX098, PDX060, PDX094, PDX044, PDX102 및 PDX270), 3종 PARPi-민감성 (PDX197, STG201 및 PDX302). 점선은 컷-오프로서 핵 당 RAD51 foci 개수 5개를 표시한다. (C) PARPi-민감성 종양에서, 96-100%의 geminin-양성 세포가 RAD51 foci 0을 나타냄을 보여주는 히스토그램. 대신, PARPi-내성 종양 세포는 geminin-양성 세포 당 RAD51 foci의 빈도를 나타낸 이봉형 (bimodal) 분포를 나타내며, 35-75%의 geminin-양성 세포는 RAD51 foci가 0이고, 2번째로 가장 높은 빈도 피크는 geminin-양성 세포 당 RAD51 foci 5개에서 관찰된다. 이런 의미에서, 무처리 샘플에서 geminin-양성 세포 당 RAD51 foci 개수 증가를 이용한 정확도 및 특이도 분석을 통해, 세포 당 foci 5개인 컷-오프가 가장 정확하고 특이적인 예측을 제공하는 geminin-양성 세포 세포당 가장 높은 RAD51 foci인 것으로, 입증된다: 핵 당 여러가지 컷-오프 foci 1-10개를 이용한 RAD51 스코어의 (D) 포레스트 플롯 (Forest plot) 및 오즈비 분석, 및 (E) 정확도 및 특이도. 이 데이터는, 수개의 컷-오프가 정확한 결과를 제공하며 (본원에 나타낸 데이터들을 모두 수득하기 위해 사용된 컷-오프), 핵 당 foci 5개를 선택하는 것이 가장 높고 (최대 엄격) 여전히 정확도가 우수하다는 것을, 입증해준다.
도 9는 2종의 부가적인 시판 anti-RAD51 항체에 대한 검증과 면역조직화학에 의한 RAD51 분석 개발을 도시한 것이다. (A) 비히클- 및 올라파립-처리된 PDX에서, RAD51에 대한 서로 다른 2종의 시판 항체 (Santa Cruz Biotechnology 8349 및 Abcam 133534)를 이용한 RAD51 스코어 정량. 2종의 항체를 이용한 RAD51 foci 정량에 대한 스피어만 상관 분석 (spearman correlation analysis)은 RAD51 분석의 재현성을 입증해준다. (B-C) 면역형광 분석 (상단 이미지) 및 면역조직화학 분석 (하단 이미지)에 의해, 3번째 anti-RAD51 항체 (Cell Signalling Technology, CST 8875)를 검증한, 대표적인 사진들. 본 발명자들은, (B) HeLa 세포주 (siRNA 대조군에 노출 -좌- 또는 발현의 넉-다운을 위한 siRNA RAD51 -우-) 및 (C) RAD51 foci 형성 수준이 고, 중 (mod) 및 저인 무처리 PDX의 이미지를 도시한다. 이들 결과는 IF 및 IHC 분석과 비슷한 결과를 나타낸다.
도 10은 종양 타입들에서의 RAD51 분석의 실행가능성을 나타낸 것이다. (A) 유방암, 난소암 및 뇌 전이뿐 아니라 (B) 전립선암, 췌장암, 소아 신경모세포종 및 간 전이로부터 유래된 인간 염색 샘플들에 대한 대표적인 이미지를 도시한다. 종양 샘플을 (A) Cell Signalling Technology 사의 anti-RAD51 항체 (CST 8875, 녹색) 및 Geminin (적색), 또는 (B) Abcam 사의 anti-RAD51 항체 (ab-133534, 적색) 및 Geminin (녹색)으로 염색하였다. 또한, DAPI (청색)는 핵 대조염색에 사용하였다. 이들 사진들은, RAD51 분석을 여러가지 종양 타입들에서 수행할 수 있으며, 여러가지 조직들에서 RAD51 foci의 존재 또는 생략을 동정할 수 있음을, 보여준다.
본 발명의 발명자들은, 샘플의 세포가 핵내 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 분석하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법에 노출된 적 없는, 암으로 진단된 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 핵내 RAD51 foci를 가진 세포의 수준 결정이 항암 치료에 대한 개체의 반응과 관련 있다는 것을, 알게 되었다. 이러한 방법은 생체외일 수 있으며, 즉 개체로부터 종양 세포를 분리한 후 생체외 일 수 있으며, 세포 샘플을 이온화 조사 (ionizing irradiation)에 노출하는 것으로 구성된다. 또한, 본 발명자들은, 본 방법이 항암 요법으로 치료받은 또는 치료받지 않은 환자 유래 샘플에서 효과적이라는 것을, 알게 되었다. 화학요법의 투여는, DNA 손상을 유발하는 화학요법의 화합물에 개체 유래 종양 세포를 노출시키고, DNA 손상 회복에 참여하는 단백질들의 후속적인 신속한 (수분내) 동원을 유발한다.
1. 본 발명의 방법
A. 암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는 방법
제1 측면에서, 본 발명은 암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는 방법에 관한 것으로,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮다는 것은, 그 개체가 항암 치료에 반응성으로 예측되는 것을 의미하거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 더 높은 것은, 그 개체가 항암 치료에 비-반응성으로 예측되는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "반응을 예측하는" 또는 "반응을 예측한다"는, 환자가 치료에 대해 반응할 가능성을 의미한다. 본 기술 분야에서 전문가에 의해 이해되는 바와 같이, 이는 바람직한 것은 아니더라도, 예측은 진단 또는 검사할 수 있는 개체들 100%에서 정확하여야 하는 것은 아니다. 그러나, 이러한 표현은, 예측이 통계학적으로 유의한 비율의 환자들에서 정확한 결과를 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 예측이 통계학적으로 유의한 결과를 제공하는지에 대한 확인은 신뢰구간 결정, p 값 결정, 통계학적 t-검정, Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983에 기술된 바와 같은 만-휘트니 검정과 같은, 표준적인 통계 기법을 이용함으로써 수행할 수 있다. 적절한 신뢰구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다. P 값은 바람직하게는, 0.05, 0.001, 0.0005 또는 그 미만이다.
본원에서, 용어 "개체" 또는 "환자"는, 포유류로 분류되는 모든 동물을 지칭하며, 비-제한적으로 가축 및 농장 동물, 영장류 및 인간; 예를 들어, 인간, 인간을 제외한 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류 등을 포함한다. 바람직하게는, 개체는 모든 연령 또는 인종의 남성 또는 여성이다.
본원에서, 용어 "진단된"은, 개체에서 질환의 확인 및/또는 동정, 즉 개체의 질환 상태에 대한 의견, 즉 진단 의견을 의미한다. 이와 같이, 개체를 질환 상태에 따라 분류하기 위한 시도로서 간주할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 암 진단은, 바람직함에도 불구하고, 진단 또는 평가받는 개체들 100%에서 정확하여야 하는 것은 아니다. 그러나, 이 용어는, 이와 같이 동정되는 개체들 중 통계학적으로 유의한 비율이 암을 앓고 있는 것을 의미한다. 개체가 통계학적으로 유의한지는, 다양한 잘 알려진 통계학적 평가 툴, 예를 들어, 신뢰구간 경정, p 값 결정, 스튜던트 t-검정, 만-휘트니 검정 등을 이용해, 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 추가적인 노력없이, 결정할 수 있다. 상세한 내용은 Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983에서 확인한다. 바람직한 신뢰구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. p-값은 바람직하게는, 0.05, 0.01, 0.005 또는 그 이하이다.
용어 "암"은, 다른 조직, 장기 또는 일반적으로 유기체의 원거리 부위로 침입 또는 퍼질 (전이할) 가능성이 있는, 암을 앓고 있는 개체에서 하나 이상의 악성 종양을 형성하는 세포의 비정상적이고, 통제되지 않은 생장 및 증식 (신생물증)을 수반하는 일군의 질환을 지칭하며; 전이는 암 및 암성 종양의 악성을 나타내는 홀마커 중 하나이다. 용어 "암"은, 비-제한적으로, 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 결장직장암, 위/위암, 자궁내막암/자궁암/자궁경부암, 방광암, 두경부암, 백혈병, 심장암, 소장암, 비장암, 신장암, 뇌암, 피부암, 골암, 골수암, 혈액암, 흉선암, 자궁암, 고환암, 간담도계 암 및 간암, 육종, 담관암, 교모세포종, 다발성 골수종, 림프종, 선종, 혈관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배아세포종, 신경교종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종 (hematoma), 간모세포종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 간담도계 암, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종 및 기형종 등을 포함한다. 아울러, 이 용어는 선단흑자성 흑색종 (acrolentiginous melanoma), 이상각화증 선암종, 선낭 암종, 선종, 선육종 (adenosarcoma), 선평편암종 (adenosquamus carcinoma), 성상세포 종양 (astrocytic tumor), 바르콜린샘 암종 (Bartholin gland carcinoma), 기저 세포 암종, 기관지샘 암종, 모세관 유암종 (capillary carcinoid), 암종, 암육종증, 낭샘종, 내배엽동 종양, 자궁내막 과형성증, 자궁내막 기질 육종, 자궁내막양 선암종, 상의 육종, 유잉 육종, 국소 결절성 과형성증, 생식세포종, 글루카곤종, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간 선종, 간 선종증 (adenomastosis), 간세포암, 간담도 암, 인슐린종, 상피내 신생물증, 편평 세포 상피내 신생물증, 침습성 편평-세포 암종, 거대 세포 암종, 평활근육종, 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피 종양, 수모세포종, 수질상피종, 점막표피양 암종, 신경모세포종, 신경상피 선암종, 결정성 흑색종, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 위육종, 폐모세포종, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 장액성 암종 (serous carcinoma), 소구성 암종 (microcytic carcinoma), 연조직 암종, 소마스타틴 분비성 종양, 편평 상피암 (squamous carcinoma), 편평 세포암, 미분화 암종 (undifferentiated carcinoma), 포도막 흑색종, 사마귀양 암종 (verrucous carcinoma), 비포마 (vipoma), 빌름 종양, 뇌내 암, 직장암, 성상세포종, 소구성 암 및 비-소구성 암, 전이성 흑색종, 안드로겐-독립적인 전이성 전립선암, 안드로겐-의존적인 전이성 전립선암 등을 포함한다. 용어 암은 원발성 종양뿐 아니라 전이성 종양을 둘다 포함한다.
본원에서, 용어 "항암 치료"는 암성 세포의 사멸을 유도하기 위해 사용되는 임의 방법에 치료 중인 개체를 노출시키는 것을 포함하는 임의 치료를 지칭한다. 이러한 방법은 화학제의 투여로 한정되지 않으며, 이는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 면역요법 등의 표적 요법 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
용어 "수술"은, 원발성 종양 중 적어도 일부 및/또는 하나 이상의 전이들 중 적어도 일부를 제거하는 대수술 (major surgery)을 의미한다.
본원에서, 용어 "방사선 요법", "방사선치료 (radiotherapy)" 또는 "이온화 조사"는 일반적으로 종양 세포를 제어 또는 사멸하기 위한 암 치료의 일환으로서 이온화 조사를 이용한 요법을 의미하며, 통상적으로 선형가속기에 의해 전달된다. 감마 선, X-선 및 전자기 스펙트럼의 더 높은 자외선 영역이 이온화 조사이고, 가시광선 (거의 모든 타입의 레이저 광 포함), 적외선, 마이크로웨이브 및 라디오 웨이브 등의 UV 대역 아래의 낮은 스펙트럼 영역은 모두 비-이온화 조사로 간주된다. 방사선 요법은, 암이 신체 한 부위에 위치되어 있다면, 다수 타입의 암에 대해 치유 효과를 나타낼 수 있다. 방사선 요법은 세포 증식을 제어하는 능력으로 인해, 통상적으로 암성 종양에 적용된다. 이온화 조사는 암성 조직의 DNA를 손상시켜 세포 사멸을 유도함으로써 작동한다.
본원에서, 용어 "표적 요법"은 모두 빠르게 분열하는 세포를 단순히 방해하기 보다는, 암발생 및 종양 증식에 필요한 특이적인 표적 분자를 방해함으로써, 암 세포의 증식을 차단하는 요법을 의미한다. 대부분의 타겟 요법 물질이 생물약제이므로, 용어 생물 요법은 암 요법 맥락에서 사용되는 경우 때때로 표적 요법과 동의어이다 (화학요법, 즉 세포독성 요법과 구분됨). 그러나, 용법들을 조합할 수도 있다. 표적 요법의 또 다른 형태는 신체의 천연 세포 분해 과정이 세포를 소화하여 이를 신체에서 효율적으로 제거하도록 종양 세포에 결합하는 나노조작된 효소 (nanoengineered enzyme)의 사용을 수반한다. 다수의 표적 요법들이 면역요법의 예들이다.
본원에서, 용어 "면역요법"은 숙주의 면역시스템을 변형하는 접근법 및/또는 암 치료로서 면역 시스템의 구성 성분의 이용으로 구성되는 암 면역요법을 의미한다. 면역요법에 대한 비-제한적인 예로는 비-특이적인 면역 자극제 BCG 및 레바미솔 (levamisole); 사이토카인, 인터페론-α 및 인터루킨-2; 단일클론 항체 anti-PD1, anti-PDL1, anti-CTLA-4, 리툭시맵 (rituximab), 오파투무맵 (ofatumumab), 알렘투주맵 (alemtuzumab), 트라스투주맵 (trastuzumab), 베박시주맵 (bevacizumab), 세투시맵 (cetuximab) 및 파니투무맵 (panitumumab); 방사선 표지된 항체 Y-90 이브리투모맵 (ibritumomab) 티우세탄 (tiuxetan) 및 I-131 토시투모맵 (tositumomab); 면역독소 데니루킨 (denileukin) 디프티톡스 (diftitox) 및 항체 겜투주맵 (gemtuzumab) 오조가미신 (ozogamicin); 공여체 림프구 주입물을 이용한 비-골수파괴성 동종이계 이식체; 및 anti-전립선암 세포성 요법 시풀레우셀-T (sipuleucel-T) 등이 있다. DC 백신, CART-t 세포 또는 NK 요법과 같은 면역요법의 다른 예. 일부 면역요법들은 혈액 또는 종양으로부터 면역 세포를 제거하는 것을 포함하며, 종양에 특이적인 면역 세포를 배양하여, 이를 다시 환자에게 주입하여 종양을 공격하고; 다른 예로, 면역 세포를 종양-특이적인 수용체를 발현하도록 유전자 조작하고, 이를 배양하여 환자에게 다시 주입할 수 있다. 이러한 방식으로 사용할 수 있는 세포 타입은 자연 살상 세포, 림포카인-활성화된 킬러 세포, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포이다.
본원에서, 용어 "화학요법"은, 단독으로 또는 다른 화합물과 조합하여, 암 요법 및/또는 암 치료에 적합한, 화학적 구조에 제한이 없는, 한가지 또는 수종의 항암제의 투여로 이루어지는 임의의 치료를 지칭한다.
본원에서, 표현 "AC"는 화학요법제 2종의 조합으로 구성되는 화학요법을 지칭한다: 아드리아마이신 (adriamycin)/독소루비신 (doxorubicin) 및 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide).
본원에서, 표현 "FEC"는 화학요법제 3종의 조합으로 구성되는 화학요법을 지칭한다: 5 플루오로우라실 (5FU라고도 함), 에피루비신 (epirubicin) 및 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide).
본원에서, 표현 "ECF"는 화학요법제 3종의 조합으로 구성되는 화학요법을 지칭한다: 에피루비신 (epirubicin), 시스플라틴 (cisplatin) 및 플루오로우라실.
본원에서, "항암제"는, 단기간에 불과하더라도, 암과 관련된 증상을 전부 또는 일부 저해하는 등의, 암의 발생 또는 진행을 적어도 부분적으로 저해하는 물질이다. 항암제는 화합물의 투여를 포함하는 전술한 임의 타입의 요법, 즉 호르몬 요법, 표적 요법, 면역요법, 화학요법에 사용되는 것을 포함한다.
항암제에 대한 몇가지 예로는, 비-제한적으로, 액시비신 (Acivicin); 아클라루비신 (Aclarubicin); 아코다졸 하이드로클로라이드 (Acodazole Hydrochloride); 아크로닌 (Acronine); 아도젤레신 (Adozelesin); 알데스루킨 (Aldesleukin); 알트레타민 (Altretamine); 암보마이신 (Ambomycin); 아메탄트론 아세테이트 (Ametantrone Acetate); 아미노글루테티미드 (Aminoglutethimide); 암사크린 (Amsacrine); 아나스트로졸 (Anastrozole); 안트라마이신 (Anthramycin); 아스파라기나제; 아스페르린 (Asperlin); 아자시티딘 (Azacitidine); 아제테파 (Azetepa); 아조토마이신 (Azotomycin); 바티마스타트 (Batimastat); 벤조데파 (Benzodepa); 비칼루타아미드 (Bicalutamide); 비산트렌 하이드로클로라이드 (Bisantrene Hydrochloride); 비스나피드 다이메실레이트 (Bisnafide Dimesylate); 비젤레신 (Bizelesin); 블레오마이신 설페이트 (Bleomycin Sulfate); 보르테조밉 (bortezomib) (VELCADE); 브레퀴나르 소듐 (Brequinar Sodium); 브로피리민 (Bropirimine); 부설판 (Busulfan); 칵티노마이신 (Cactinomycin); 칼루스테론 (Calusterone); 카라세미드 (Caracemide); 카르베티머 (Carbetimer); 카르보플라틴 (Carboplatin) (플라티늄-함유 용법); 카르무스틴 (Carmustine); 카루비신 하이드로클로라이드 (Carubicin Hydrochloride); 카르젤레신 (Carzelesin); 세데핀골 (Cedefingol); 클로람부실 (Chlorambucil); 시롤레마이신 (Cirolemycin); 시스플라틴 (플라티늄-함유 용법); 클라드리빈 (Cladribine); 크리스나톨 메실레이트 (Crisnatol Mesylate); 사이클로포스파미드; 시타라빈 (Cytarabine); 다카르바진 (Dacarbazine); 닥티노마이신 (dactinomycin); 다우노루비신 (Daunorubicin); 데시타빈 (Decitabine); 덱소르마플라틴 (Dexormaplatin); 데자구아닌 (Dezaguanine); 디아지쿠온 (Diaziquone); 도세탁셀 (Docetaxel) (TAXOTERE); 독소루비신; 페길화 리포솜 독소루비신; 드롤록시펜 (Droloxifene); 드로모스타놀론 (Dromostanolone); 두아조마이신 (Duazomycin); 에다트렉세이트 (Edatrexate); 에플오르니틴 (Eflornithine); 엘사미트루신 (Elsamitrucin); 엔로플라틴 (Enloplatin); 엔프로메이트 (Enpromate); 에피프로피딘 (Epipropidine); 에피루비신 (Epirubicin); 에르불로졸 (Erbulozole); 에를로티닙 (erlotinib) (TARCEVA), 에소루비신 (Esorubicin); 에스트라무스틴 (Estramustine); 에타니다졸 (Etanidazole); 에토포시드 (Etoposide); 에토프린 (Etoprine); 파드로졸 (Fadrozole); 파자라빈 (Fazarabine); 펜레티니드 (Fenretinide); 플록스우리딘 (Floxuridine); 플루다라빈 (Fludarabine); 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil); 플루로시타빈 (Flurocitabine); 포스퀴돈 (Fosquidone); 포스트리에신 (Fostriecin); 게피티닙 (Gefitinib) (IRESSA), 겜시타빈 (Gemcitabine); 하이드록시우레아; 이다루비신 (Idarubicin); 이포스파미드 (Ifosfamide); 일모포신 (Ilmofosine); 이마티닙 메실레이트 (Imatinib mesylate) (GLEEVEC); 인터페론 alpha-2a; 인터페론 alpha-2b; 인터페론 alpha-nl; 인터페론 alpha-n3; 인터페론 beta-I a; 인터페론 gamma-I b; 이프로플라틴 (Iproplatin); 이리노테칸 (irinotecan); 란레오티드 (Lanreotide); 레날리도미드 (Lenalidomide) (REVLLMlD, REVIMID); 레트로졸 (Letrozole); 루프롤리드 (Leuprolide); 리아로졸 (Liarozole); 로메트레솔 (Lometrexol); 로무스틴 (Lomustine); 로소잔트론 (Losoxantrone); 마소프로콜 (Masoprocol); 메이탄신 (Maytansine); 메클로레타민 (Mechlorethamine); 메게스트롤 (Megestrol); 멜렌게스트롤 (Melengestrol); 멜팔란 (Melphalan); 메노가릴 (Menogaril); 머캅토퓨린 (Mercaptopurine); 메토트렉세이트 (Methotrexate); 메토프린 (Metoprine); 메투레데파 (Meturedepa); 미틴도미드 (Mitindomide); 미토카르신 (Mitocarcin); 미토크로민 (Mitocromin); 미토길린 (Mitogillin); 미토말신 (Mitomalcin); 미토마이신 (Mitomycin); 미토스페르 (Mitosper); 미토탄 (Mitotane); 미토잔트론 (Mitoxantrone); 미코페놀산; 노코다졸 (Nocodazole); 노갈라마이신 (Nogalamycin); 오르마플라틴 (Ormaplatin); 옥시수란 (Oxisuran); 파클리탁셀 (Paclitaxel); 페메트렉세드 (Pemetrexed) (ALIMTA), 페가스파르가제 (Pegaspargase); 펠리오마이신 (Peliomycin); 펜타무스틴 (Pentamustine); 펜토몬 (Pentomone); 페플로마이신 (Peplomycin); 페르포스파미드 (Perfosfamide); 피포브로만 (Pipobroman); 피포설판 (Piposulfan); 피리트레심 이세티오네이트 (Piritrexim Isethionate); 피로잔트론 (Piroxantrone); 플리카마이신 (Plicamycin); 플로메스탄 (Plomestane); 포르피머 (Porfimer); 포르피로마이신 (Porfiromycin); 프레드니무스틴 (Prednimustine); 프로카르바진 (Procarbazine); 푸로마이신 (Puromycin); 피라조푸린 (Pyrazofurin); 리보프린 (Riboprine); 로글레티미드 (Rogletimide); 사핀골 (Safingol); 세무스틴 (Semustine); 심트라젠 (Simtrazene); 시토글루시드 (Sitogluside); 스파르포세이트 (Sparfosate); 스파르소마이신 (Sparsomycin); 스피로게르마늄 (Spirogermanium); 스피로무스틴 (Spiromustine); 스피로플라틴 (Spiroplatin); 스트렙토니그린 (Streptonigrin); 스트렙토족신 (Streptozocin); 설포페누르 (Sulofenur); 탈리소마이신 (Talisomycin); 탐설로신 (Tamsulosin); 탁솔 (Taxol); 탁소테레 (Taxotere); 테코갈란 (Tecogalan); 테가푸르 (Tegafur); 텔로잔트론 (Teloxantrone); 테모포르핀 (Temoporfin); 테모졸로미드 (Temozolomide) (TEMODAR); 테니포시드 (Teniposide); 테로시론 (Teroxirone); 테스톨락톤 (Testolactone); 탈리도미드 (Thalidomide) (THALOMID) 및 이들의 유도체; 티아미프린 (Thiamiprine); 티오구아닌; 티오테파 (Thiotepa); 티아조푸린 (Tiazofurin); 티라파자민 (Tirapazamine); 토포테칸 (Topotecan); 토레미펜 (Toremifene); 트레스톨론 (Trestolone); 트리시리빈 (Triciribine); 트리메트렉세이트 (Trimetrexate); 트립토렐린 (Triptorelin); 투불로졸 (Tubulozole); 우라실; 머스타르드 (Mustard); 우레데파 (Uredepa); 바프레오티드 (Vapreotide); 베르테포르핀 (Verteporfin); 빈블라스틴 (Vinblastine); 빈크리스틴 (Vincristine); 빈데신 (Vindesine); 빈에피딘 (Vinepidine); 빈글리시네이트 (Vinglycinate); 빈루로신 (Vinleurosine); 비노렐빈 (Vinorelbine); 빈로시딘 (Vinrosidine); 빈졸리딘 (Vinzolidine); 보로졸 (Vorozole); 제니플라틴 (Zeniplatin); 지노스타틴 (Zinostatin); 조루비신 (Zorubicin) 등이 있다.
또한, 항암제는, 비-제한적으로, 티로신 키나제 저해제, CDK 저해제, MAP 키나제 저해제 또는 EGFR 저해제 등의 효소 저해제일 수 있다. 티로신 키나제 저해제는, 비-제한적으로 게니스테인 (Genistein) (4',5,7-트리하이드록시이소플라본), 티르포스틴 (Tyrphostin) 25 (3,4,5-트리하이드록시페닐), 메틸렌-프로판다이니트릴, 허비마이신 A (Herbimycin A), 다이드제인 (Daidzein) (4',7-다이하이드록시이소플라본), AG-126, 트랜스-1-(3'-카르복시-4'-하이드록시페닐)-2-(2",5"-다이하이드록시-페닐)에탄, 또는 HDBA (2-하이드록시 5-(2,5-다이하이드록시벤질아미노)-2-하이드록시벤조산일 수 있다. CDK 저해제는, 비-제한적으로, p21, p27, p57, pl5, pl6, pl8 또는 pl9일 수 있다. MAP 키나제 저해제는, 비-제한적으로, KY12420 (C23H24O8), CNI-1493, PD98059 또는 4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설피닐 페닐)-5-(4-피리딜) lH-이미다졸일 수 있다. EGFR 저해제는, 비-제한적으로, 에를로티닙 (erlotinib) (TARCEVA), 게피티닙 (gefitinib) (IRESSA), WHI- P97 (퀴나졸린 유도체), LFM-A12 (레플루노미드 (leflunomide) 대사산물 유사체), ABX-EGF, 라파티닙 (lapatinib), 카네르티닙 (canertinib), ZD-6474 (ZACTIMA), AEE788 및 AG1458일 수 있다.
아울러, 수종의 항암제는 DNA 손상제로서 분류될 수 있으며, 이러한 것으로는 직접 DNA 손상을 유발하는 물질과 세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질을 타겟팅하여 세포내 DNA 손상된 정도를 증가시킴으로써 간접적으로 DNA 손상을 유발하는 물질을 포함한다. 직접 DNA 손상을 유발하는 물질은, DNA 알킬화제 (예, 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 다카르바진 (dacarbazine), 프로카바진 (procarbazine), 카르무스틴 (carmustine), 로무스틴 (lomustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란 (melphalan), 부설판 (busulfan), 티오테파 (thiotepa)), DNA 알킬화-유사 물질 (예, 카보플라틴 (carboplatin), 시스플라틴 (cisplatin)), DNA 가닥 절단 유도제 (예, 블레오마이신 (bleomycin), 독소루비신, 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 미토마이신 (mitomycin) C), 항-대사산물제 (예, 시타라빈 (cytarabine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 하이드록시우레아, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘 (floxuridine), 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린, 플루다라빈 (fludarabine), 클로로데옥시아데노신), 토포이소머라제 저해제 (예, 에토포시드 (etoposide), 람프토테신 (ramptothecin), 토포테칸 (topotecan), 테니포시드 (teniposide), 미톡산트론 (mitoxantrone)) 또는 에피포도필로톡신일 수 있다.
세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질을 타겟팅하는 물질은 PARP 저해제 (PARPi; 예를 들어, 올라파립, 탈라조파립, 루카파립, 니라파립, 벨리파립, CEP-8983, E7016 및 BGB-290), 항-미소관제 (예, 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine)) 및 안트라사이클린일 수 있다.
본원에서, 용어 "샘플" 또는 "생물 샘플"은 개체로부터 분리된 생물학적 물질을 지칭한다. 생물 샘플은 원하는 단백질 마커를 검출하는데 적합한 임의의 생물 물질을 포함한다. 생물 샘플은 개체의 세포 및/또는 비-세포성 물질을 포함할 수 있다. 생물 샘플은, 예를 들어, 혈액, 타액, 뇌척수액, 뇨, 변, 골수, 유두 흡인물, 고형 종양 생검, 혈장, 혈청, 뇌척수액 (CSF), 변, 볼 또는 볼-인두 스왑, 외과적 시료, 생검으로부터 수득되는 시료 및 파라핀에 포매된 조직 샘플과 같은, 임의의 적합한 조직 또는 생물학적 체액으로부터 분리될 수 있다. 샘플을 분리하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 암 세포, 바람직하게는 유방암, 난소암, 전립선암, 위암, 췌장암, 폐암, 결장직장암, 위암 (stomach/gastric cancer), 자궁내막암/자궁암/자궁경부암, 방광암, 두경부암, 백혈병, 육종, 담관암, 교모세포종, 다발성 골수종, 림프종 세포를 포함한다. 더 바람직하게는, 샘플은 유방암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 위암 세포 또는 췌장암 세포, 보다 더 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포 또는 전립선암 세포, 더더 바람직하게는 유방암 세포를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 종양 조직 샘플 또는 이의 일부이다. 바람직하게는, 종양 조직 샘플은 유방 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 위 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 결장직장 종양, 위 종양, 자궁내막/자궁/자궁경부 종양, 방광 종양, 두경부 종양, 육종 종양, 담관암 종양, 교모세포종 종양, 다발성 골수종 종양, 림프종 종양 조직 또는 이의 일부, 샘플이다. 더 바람직하게는, 샘플은 유방 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 위 종양 및 췌장 종양 조직 또는 이의 일부, 샘플이며; 보다 더 바람직하게, 샘플은 유방 종양, 난소 종양 또는 전립선 종양, 또는 이의 일부, 조직 샘플이며; 더욱 더 바람직하게, 종양 조직 샘플은 유방 종양 조직 또는 이의 일부, 샘플이다.
샘플은 통상적인 방법, 예를 들어 생검에 의해, 관련 의학 분야에서 당업자들에게 잘 알려진 방법을 사용함으로써, 수득할 수 있다. 생검으로부터 샘플을 수득하는 방법은 전체 덩어리 회수 또는 미세해부 또는 그외 당해 기술 분야에 공지된 세포-분리 방법을 포함한다. 종양 세포는 부가적으로 미세 바늘 흡인에 의한 조직학적 방법 (fine needle aspiration cytology)으로 수득할 수 있다. 샘플의 보존 및 취급을 단순화하기 위해, 이는 고정된 조직, 파라핀 포매 조직, 조직학적 슬라이드, 세포 현탁물, 세포 펠렛, 세포 슬라이드, 냉동된 고형 종양 생검 및/또는 1차 냉동 후 급속 냉동이 가능한 초 극저온성 매질에의 침지를 통한 OCT-화합물과 같은 저온 고형화가능한 (cryosolidifiable) 매질에 포매한 것일 수 있다.
본원에서, 표현 "DNA 손상"은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지되어 있다. 이는 DNA 한쪽 또는 양쪽 가닥에의 절단, DNA 백본의 염기 생략 또는 화학적으로 변형된 염기 등의 DNA 화학 구조 변형을 의미한다. DNA 한쪽 가닥 절단은 단일 가닥 절단 (SSB)이라고 하며, DNA 양쪽 가닥 절단은 이중 가닥 절단 (DSB)이라 한다. DNA 손상은 또한 정지된 복제 분기점 (stalled replication fork)에 존재한다. 세포의 DNA 손상 반응 장치에 의해 복구되지 않는다면, DNA 손상은 DNA 손상 축적 및 기능성 게놈 변형 (즉, 게놈 불안정성)을 야기한다. 이러한 DNA 변형은 예를 들어 발생된 세포에 선택 이점 (selective advantage)을 제공하여, 세포가 계속적으로 증식 및 생존하여 종양 세포가 되게 할 수 있다.
본원에서, 표현 "DNA 손상 반응"은 세포의 게놈 온전성을 유지하기 위해 DNA 손상을 모니터링하고 복구하는 세포 경로를 지칭한다. DNA 손상 반응의 타입은 DNA 손상 타입에 따라 결정된다. 일반적인 의미에서, 이는 DNA 손상이 SSB 또는 DSB에 존재하는 지에 따라 결정된다.
본원에서, 표현 "DNA 손상을 유도하는 방법"은 사실상 샘플에서 DNA 손상을 유도하기 위해 사용될 수 있는 임의의 통상적인 방법을 지칭한다. 실제, 임의의 통상적인 방법은 DNA 손상을 유도하기 위해 본 발명의 범위내에서 이용할 수 있다. 예를 들어, DNA 손상을 유도하는 잘 알려진 방법은, 공유 결합을 절단할 수 있는 이온을 생성하는 원자 및 분자로부터 전자를 해리시킬 수 있는 고-에너지 조사 타입인, 이온화 조사이다. 이온화 조사는 DNA 절단, 특히 DSB를 유도함으로써 DNA 구조에 직접 작용한다. 방법의 다른 예는 주로 DSB를 유도하는 산화 스트레스, DNA 병변을 유도하여 이후 SSB 및 DSB를 유도할 수 있는 알킬화제 또는 SSB 및 DSB를 유도할 수 있는 UV 광에 세포를 노출시키는 방법이다.
본원에서, 용어 "RAD51"은 DSB 복구시 DNA의 상동적인 재조합에 주된 역할을 담당하는 효소이다. 단백질 서열은 UniProt (2017년 11월 22일)에 등재 번호 Q06609로 등재되어 있다.
본원에서, 용어 "foci"는 세포 부위에서 특정 단백질이 국소 축적된 것을 지칭한다. "핵 foci"를 지칭하는 경우, 이러한 foci는 세포의 핵 안에 위치한다. 예를 들어, DNA 손상 복구시, DNA 이중 가닥 절단 부위에 형성된 DNA 손상 반응 단백질의 국소적인 축적 또는 변형에 의해 DNA 복구 foci가 생겨난다. foci는 면역염색 또는 형광 단백질 태깅 후 현미경 이미지 관찰을 통해 가시화할 수 있다.
표현 "기준값"은 환자로부터 수득한 샘플을 이용함으로써 입수한 값/데이터에 대한 기준으로서 사용되는 실험치를 의미한다. 기준값 또는 기준 수준은 절대치, 상대치, 상한 및/또는 하한을 가진 값, 일련의 값들, 평균치 (average value), 중앙값 (median), 중간값 (mean value) 또는 대조군 또는 기준치를 참조하여 표시되는 값일 수 있다. 기준값은, 분석할 샘플의 포함 또는 제외 세트에 기반한, 또는 실험의 환자 대상과 일치하는 생활 연령군으로부터 유래되는 개체 집단에서 수득되는 값 등의, 대표되는 것으로 간주되는 환자군으로부터 수득되는 값을 기반으로 할 수 있다. 대안적으로, 기준값은, 예를 들어, 실험의 환자 개체로부터 유래되는 샘플로부터 수득되지만 이전 시점에 수득한 값과 같이 개별 샘플을 기반으로 할 수 있다.
본 발명의 기준값은 분석 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 참조한다. 본원에서, 표현 "세포의 수준"은 세포의 양을 결정하기 위해 사용되는 절대치 또는 상대치이다. 바람직한 구현예에서, 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준은 하기 측면에서 RAD51 foci를 가진 세포의 상대적인 수준으로서 결정된다:
- 샘플에서 종양 세포의 수,
- 샘플에서 증식 중인 세포의 수,
- 샘플에서 DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 절단을 나타내는 세포의 수, 및
- 샘플에서 DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 절단을 나타내는 증식 중인 세포의 수.
이러한 상대치는 비율로서 또는 퍼센트로서 계산할 수 있다.
RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 샘플내 종양 세포의 수와 연관지어 계산하는 경우, %로서 표현되는 기준값은 적어도 0.1%, 적어도 0.25%, 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%이며, 이때 100은 샘플의 전체 세포를 의미한다. 바람직한 구현예에서, 기준값은 적어도 0.5%, 더 바람직하게는 적어도 1%, 보다 더 바람직하게는 적어도 2%, 가장 바람직하게는 적어도 5%이다.
RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 샘플에서 증식 중인 세포의 수로서 계산하는 경우, %로서 표현되는 기준값은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%이며, 이때 100은 샘플에서 증식 중인 세포의 총량을 의미한다. 바람직한 구현예서, 기준값은 적어도 1%, 더 바람직하게는 적어도 5%, 보다 더 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 11%, 가장 바람직하게는 적어도 20%이다.
본원에서, 표현 "증식 중인 세포(...)"는 샘플에서 세포의 수적 증가를 발생시키는 분열 중인 샘플내 세포를 의미한다. 증식 중인 세포는 세포 분열에 참여하는 단백질의 발현을 확인함으로써 식별한다. 이러한 단백질에 대한 비-제한적인 예는 Geminin, Ki-67, 증식성 세포 핵 항원, Cyclin A2이다.
본원에서, 용어 "geminin "은 세포 주기의 G1 기에는 존재하지 않으며, S, G2 및 M 기에 축적되는 핵 단백질이다. Geminin은, 후기 촉진 복합체 (APC/C)에 의해 분해되는 경우 유사분열의 중기/후기 이행 시점에 감소된다.
본원에서, 용어 "Ki -67", "MKI67 " 또는 "Antigen KI -67"은 세포 주기의 모든 활성 단계 동안 (G1, S, G2 및 유사분열)에 존재하지만, 휴지기 (정지) 세포 (G0)에는 존재하지 않는, Ki-67 핵 단백질이다. Ki-67 단백질의 세포내 함량은 세포 주기의 S기 내내 세포 진행에 따라 크게 증가한다.
본원에서, 용어 "증식성 세포 핵 항원 (proliferating cell nuclear antigen)" 또는 "PCNA "는 진핵생물 세포에서 DNA 중합효소 δ에 대한 지속성 (processivity) 인자로서 작용하며 복제에 필수적인 DNA 클램프인, 그러한 명칭의 단백질을 지칭한다. PCNA는 호모트리머이며, DNA 고리화 (encircling)에 의해 이의 지속성을 달성하며, DNA 복제, DNA 복구, 염색질 리모델링 및 후생유전학에 참여하는 단백질을 동원하기 위한 스캐폴드로서 작용한다. PCNA는 본래 세포 주기의 DNA 합성기 동안 세포의 핵에서 발현되는 항원으로서 동정되었다.
본원에서, 용어 "cyclin A2"는 분열 중인 체세포에서 발현되는 단백질 cyclin A2를 지칭한다. cyclin A2의 수준은 세포 주기의 진행과 엄격하게 동조되어 있다. 후기 G1에서 전사가 개시되며, mid-S에 최대화되어 안정화되며, G2 기에 감소한다.
RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 샘플에서 DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 절단을 나타내는 세포의 수와 관련하여 계산할 경우, %로서 표현되는 기준값은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%이며, 이때 100은 DNA 손상, 바람직하게는 DSB를 나타내는 샘플의 전체 함량을 의미한다. 바람직한 구현예서, 기준값은 적어도 10%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 16%, 보다 더 바람직하게는 적어도 17%, 더 더 바람직하게는 적어도 20%, 더 더 바람직하게는 적어도 30%, 가장 바람직하게는 적어도 50%이다.
본원에서, 표현 "DNA 손상을 나타내는 세포(...)"는 전술한 바와 같은 DNA 손상, 바람직하게는 DSB로 이루어진 손상이 있는 세포를 지칭한다. 이는 DNA 손상 복구, 바람직하게는 DSB의 복구에 관여하는 단백질의 발현, 바람직하게는 핵 foci로서 확인함으로써 샘플에서 식별된다. 이러한 단백질에 대한 비-제한적인 예는 γH2AX, 복제 단백질 A (pRPA), p53 결합 단백질 1 (53BP1), 이중 가닥 절단 복구 단백질 (MRE11)이다.
본원에서, 용어 "γH2AX "는 인산화된 히스톤 H2AX (γH2AX)를 지칭한다. 이는 DSB에 대한 세포 반응의 바이오마커로 사용된다. DSB 형성 후 초기 단계에서, 절단부 주변의 염색질에서 상당히 많은 수의 γH2AX 분자가 동원되어, DNA 복제 및 염색질 리모델링에 관여하는 단백질이 축적된 foci가 형성된다. 이러한 증폭은 γH2AX에 대한 항체를 사용해 개별 DSB를 검출할 수 있다.
용어 "복제 단백질 A", "pRPA " 또는 "RPA "는 진핵생물 세포에서 단일 가닥 DNA (ssDNA)에 결합하는 주 단백질인, 그러한 명칭으로 지칭되는 단백질을 의미한다. DNA 복제시, RPA는 단일 가닥 DNA (ssDNA)가 자체적으로 다시 감기거나 또는 2차 구조를 형성하지 못하도록 방지한다. 이것은 중합효소가 이를 복제하도록 DNA가 감기지 않은 상태로 유지시킨다. RPA는 또한 DSB를 복구하기 위해 상동적인 재조합의 초기 단계시 ssDNA에도 결합한다. DNA 복제에서의 역할과 마찬가지로, RPA의 결합은 ssDNA가 자체 결합 (자기-상보화)하지 못하게 하여, 생성되는 핵단백질 필라멘트에 RAD51 및 이의 보조인자가 결합할 수 있게 해준다. 또한, RPA는 뉴클레오티드 절개 복구 과정 중에 DNA에 결합한다. 이러한 결합은 복구 과정 중에 복구 복합체를 안정화한다. 박테리아 상동체는 단일 가닥 결합 단백질 (SSB)로 지칭된다.
본원에서, 용어 "p53 결합 단백질 1" 또는 "53BP1 "은 DNA 이중 가닥 절단 복구 경로의 선정에 작용하여, 비-상동적인 말단 연결 (NHEJ) 경로를 촉진하고 상동적인 재조합을 제한하는, 단백질이다. 이 단백질은 DNA 손상 후 체크포인트 신호전달 촉진, 손상된 염색질에 DNA 손상 반응 단백질을 동원하기 위한 스캐폴드로서의 작용, 및 이중 가닥 절단 후 말단 절제 (resection) 제한에 의한 NHEJ 경로 촉진 등의, DNA 손상 반응에 여러가지 역할을 담당한다. 이러한 역할들은 또한 V(D)J 재조합, 클래스 스위치 재조합 및 비-보호된 텔로미어에서도 중요하다. 얼터네이티브 스플라이싱에 의해 여러가지 이소형을 코딩하는 복수의 전사 변이체들을 생성한다.
본원에서, 용어 "이중 가닥 절단 복구 단백질" 또는 "MRE11 "은 이중 가닥 절단 (DSB) 복구, DNA 재조합, 텔로미어 온전성 유지 및 감수분열에서 중요한 역할을 담당하는, MRN 복합체의 단백질 파트를 지칭한다. 이 복합체는, MRE11에 의해 제공되는, 단일 가닥 엔도뉴클레아제 활성과 이중 가닥 특이적인 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있다. RAD50은 DNA 말단들에 결합하여 서로 인접하게 고정하기 위해 필요할 수 있다. 이는 재조합 DNA 주형에서 서열 상동성을 가진 짧거나 또는 긴 영역을 검색할 수 있게 해주며, 또한 DNA 리가제의 활성을 자극하거나 및/또는 MRE11의 뉴클레아제 활성을 제한하여 소정의 포인트를 통과하도록 핵산 분해 (nucleolytic degradation)를 방지할 수 있다. 이 복합체는 또한 ATM 키나제의 활성화를 통한 DNA 손상 신호전달에 필요할 수도 있다.
RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 샘플에서 DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 절단을 나타내는 증식 중인 세포의 수와 관련하여 계산할 경우, %로서 표현되는 기준값은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이며, 이때 100은 증식 중이며 또한 DNA 손상, 바람직하게는 DSB를 나타내는 세포의 총량이다. 바람직한 구현예서, 기준값은 적어도 5%, 더 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%, 가장 바람직하게는 적어도 50%이다.
본원에서, 표현 "항암 치료에 반응성인"은, 환자에서 종양의 크기 및/또는 종양의 개수의 감소 또는 안정화 및/또는 전이 과정의 저해로서, 당업자에게 이해되는, 항암 치료에 대해 우호적으로 반응하는 것을 의미한다. 이 경우, 당업자는 또한 환자를 "항암 치료에 민감한" 것으로 지칭할 것이다. 이와는 반대로, 반응이 지정된 바와 같이 우호적이지 않다면, 당업자는 환자를 "항암 치료에 내성"인 것으로 지칭할 것이다. 이러한 반응은 임상적인 효용비 (clinical benefit rate), 전체 생존성, 비-진행성 생존, 무병 생존, 병리학적 완전 반응, 임상적인 완전 반응, 임상적인 완전 관해, 임상적인 부분 관해, 임상적인 안정한 질환, 재발, 비-전이성 생존, 순환성 종양 세포의 감소, 순환성 마커의 반응 및 종양 반응 평가를 위한 RECIST 기준으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기준에 의해 결정할 수 있다. 요법 개시 후 반응을 평가하는 시기는 구체적으로 한정되지 않는다. 즉, 요법에 대한 반응은 1차 요법 개시 후 적어도 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달 또는 11달 경과시, 또는 1차 요법 개시 후 적어도 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 그 이상의 시간 경과시 확인할 수 있다.
또한, 반응을 확인하기 전 환자에게 적용되는 일련의 요법들의 타입과 수 역시 구체적으로 한정되지 않는다. 따라서, 반응은, 외과적 요법, 화학요법 또는 수술과 보강 또는 신보강제 화학요법 또는 임의 타입의 요법과의 병용 등의 제1선 요법으로 환자를 치료한 후, 또는 2 이상의 순차적인 또는 동시적인 일련의 요법으로 환자를 치료한 후, 환자에서 확인할 수 있다.
본원에서, 표현 "임상적인 효용비 (clinical benefit rate)"는, 치료로부터 직접 발생하는 삶의 질의 요소 또는 중요한 증상 한가지 이상에만 개선이 있고 환자의 삶의 질을 구성하는 임의의 다른 요소에는 어떠한 감소도 유발하지 않는, 암 환자의 %를 의미한다. 이러한 개선은 질환의 완전 관해, 부분 관해 또는 안정화로서 이해된다.
본원에서, 표현 "전체 생존성"은 암과 같은 질환의 진단일 또는 치료 개시일로부터, 질환으로 진단된 환자가 여전히 살아있는 기간을 의미한다.
본원에서, 표현 "비-진행성 생존 (progression free survival)"은 암과 같은 질환의 치료 중 및 치료 후 환자가 질병에 걸린 채 살아있지만 악화되지 않는 기간을 의미한다.
본원에서, 표현 "무병 생존 (disease free survival)"은 암에 대한 1차 치료를 종료한 이후에 환자가 암의 어떠한 신호나 증상없이 생존하는 기간을 의미한다.
본원에서, 표현 "병리학적 완전 반응"은 항암 치료제 투여 후 잔류하는 침습성 종양 세포가 없는 것을 의미한다.
본원에서, 표현 "임상적인 완전 관해"는 치료에 반응하여 모든 암의 신호가 없어진 것을 의미한다.
본원에서, 표현 "임상적인 부분 관해"는 치료에 반응하여 체내 종양의 크기 또는 암 범위의 축소를 의미한다.
본원에서, 표현 "임상적인 안정한 질환"은 암이 정도 또는 중증도 측면에서 증가 또는 감소가 없는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "재발"은 치료 후 암이 검출되지 않는 기간을 거친 후 다시 암이 발생하는 것을 의미한다.
본원에서, 표현 "비-전이성 생존"은 암 치료가 끝난 후 환자가 암 전이 신호 또는 증상없이 생존하는 소정의 기간을 의미한다.
본원에서, 표현 "순환성 종양 세포의 감소"는 전이암을 가진 환자의 혈액 또는 림프계내 순환성 종양 세포의 농도 감소를 의미한다. 순환성 종양 세포의 감소는 전이암에 대한 요법의 효능과 관련있다.
본원에서, 표현 "순환성 마커의 반응"은 특정 암에 대한 치료 후 특정 암과 관련된 단백질 또는 핵산의 혈중 또는 림프계내 농도가 달라지는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "RECIST "는 "고형 종양에서 반응 평가 기준 (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors)"이다. 이는 암 환자가 치료에 얼마나 잘 반응하는지를 측정하는 표준 방식이다. 이는 종양 축소, 동일하게 유지 또는 증가를 토대로 한다. RECIST를 사용하기 위해서는, X선, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔 또는 자기 공명 영상 (MRi) 스캔에서 측정할 수 있는 한가지 이상의 종양이 있어야 한다. 환자가 가질 수 있는 반응의 타입은 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 진행성 질환 (PD) 및 안정적인 질환 (SD)이다. 뮤라인 이종이식 모델을 이용한 전임상 실험에서, 본 발명자들은 캘리퍼로 측정한 종양에 RECIST 기준을 적용한다.
B. 암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법을 선택하는 방법
제2 측면에서, 본 발명은 암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법을 선택하는 방법에 관한 것으로,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮다는 것은, 선택할 요법이 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하는 것을 의미하거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 더 높은 것은, 선택할 요법이 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하지 않는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "맞춤형 요법 (customized therapy) 선택" 또는 "개인맞춤형 요법 (personalized therapy) 선택"은 개별 유전자 백그라운드로부터 기원하는 환자의 구체적인 의학적 특징을 기반으로 적절하고 최적인 요법을 선택하는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 특징은 환자의 종양 세포에 특이적이며, 환자로부터 분리된 종양 세포를 포함하는 샘플에서의 RAD51 foci를 가진 세포의 수준으로 구성되며, 이때 개체는 샘플을 분리하기 24시간 전에 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이며, 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없다. RAD51 foci를 가진 세포의 수준과 기준값은 섹션 1-A에 기술된 바와 같이 결정된다.
본 발명의 맥락에서, 선택 요법 또는 비-선택 요법은 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하는 요법이다.
본원에서, 표현 "DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양" 또는 "DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양 세포" 또는 "세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능 소실을 특징으로 하는 종양 세포"는, DNA 손상 반응이 변형된 종양 세포에 의해 형성된 악성 종양을 지칭한다. 이러한 변형은 (종양 세포와 동일한 장기 조직 및 개체로부터 수득한 비-종양 세포와 비교하여) DNA 손상 증가 존재, 종양-특이적인 DNA 복구 결함, 및 손상된 DNA가 딸 세포로 진행되기 전 세포 주기의 중단 또는 정지 실패, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 이러한 임의 변형은 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질의 비정상적인 발현으로부터 발생할 수 있다. 이러한 단백질에 대한 비-제한적인 예는 ATM, ATR, BRCA 1, BRCA2, BP53, P53, CDC25, CHK1, CHK2, NBS, MRE1J, RAD51, PALB2, PARP 또는 이들의 조합이다. 이러한 변형은 암성 또는 악성 종양 세포의 게놈 불안정 특징을 야기한다.
본원에서, 용어 "ATR"은 운동실조 모세혈관확장증 및 RAd3-관련 단백질 (ATR) 또는 FRAP-관련 단백질 1 (FRP1)으로도 알려진 세린/트레오닌-단백질 키나제 ATR을 지칭한다. ATR은 DNA 손상 감지 및 DNA 손상 체크포인트의 활성화에 관여하여, 세포 주기를 정지시키는 세린/트레오닌-특이적인 단백질 키나제이다. ATR은 DNA 손상 검출 및 복구 중에 형성되는 공통된 중간산물인, 지속적인 단일 가닥 DNA에 반응하여 활성화된다. 정지된 복제 분기점에서 단일 가닥 DNA가 뉴클레오티드 절개 복구 및 상동적인 재조합 복구 등의 DNA 복구 경로의 중간산물로서 형성된다. ATR은 ATRIP로 지칭되는 파트너 단백질과 함께 작용하여, RPA로 덮인 단일 가닥 DNA를 인지한다. ATR이 활성화되면, Chk1을 인산화하여, 세포 주기 정지시 최고조에 이르는 신호 전달 케스케이드를 개시한다. ATR은, DNA 손상 체크포인트를 활성화하는 이의 역할과 더불어, 비-교란성 (unperturbed) DNA 복제에 기능하는 것으로 보인다. ATR은 제2 체크포인트-활성화 키나제, ATM과 관련있다.
본원에서, 용어 "ATM"은 ATM 세린/트레오닌 키나제를 지칭한다. ATM 유전자는 아미노산 3056개로 이루어진 350 kDa 단백질을 코딩한다. ATM은 포스파티딜이노시톨 3-키나제-관련 키나제 (PIKK)의 슈퍼패밀리에 속한다. 단백질 ATM은 DNA 이중 가닥 절단에 의해 동원 및 활성화되는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 이것은 DNA 손상 체크포인트의 활성화를 개시하여, 세포 주기 정지, DNA 복구 또는 세포자살을 유발하는, 수종의 주요 단백질들을 인산화한다. 단백질 3종 MRE11, RAD50 및 NBS1 (효모의 경우 XRS2)으로 구성된 복합체는, 인간에서는 MRN 복합체로 지칭되며, ATM을 이중 가닥 절단 (DSB)로 동원하여, 2개의 말단을 서로 고정한다. ATM은 NBS1 서브유닛과 직접 상호작용하고, 히스톤 변이체 H2AX를 Ser139에서 인산화한다. 이러한 인산화는 BRCT 도메인을 가진 어댑터 단백질에 결합부를 구축한다. 이들 어댑터 단백질은 이후 작동자 단백질 키나제 CHK2 및 종양 억제인자 p53 등의 여러가지 인자들을 동원한다. 작동자 키나제 CHK2가 인산화되며, 따라서 ATM에 의해 활성화된다. 활성화된 CHK2는 포스파타제 CDC25A를 인산화하고, 그러면 곧 이는 분해되어 CDK2-Cyclin을 더 이상 탈인산화하지 못하게 되고, 따라서 세포-주기가 중단된다. DSB가 이러한 신속한 반응 중에 복구되지 못한다면, ATM이 Ser15에서 p53 및 MDM2를 추가적으로 인산화한다. p53은 또한 작동자 키나제 CHK2에 의해서도 인산화된다. 이러한 인산화 이벤트는 p53을 안정화하고 활성화하며, CDK 저해제 p21 등의 다수의 p53 표적 유전자의 후속적인 전사를 유발하게 되고, 따라서 장기간의 세포-주기 정지 또는 심지어 세포자살이 발생한다.
본원에서, 용어 "BRCA1" 및 "BRCA2"는 각각 "유방암 1" 및 "유방암 2"로 지칭되는 단백질이다. 이들 단백질은 "유방암 감수성 단백질"로도 지칭된다. 이들 단백질은 염색체 손상을 복구하는데 관여하며, DNA 이중 가닥 절단을 오류-없이 (error-free) 복구하는데 중요한 역할을 한다. BRCA1 또는 BRCA2 자체가 유방 유래 세포에서의 BRCA 돌연변이에 의해 손상된다면, 손상된 DNA는 적절히 복구되지 않고, 이는 유방암 위험성을 증가시킨다. BRCA1 유전자와 BRCA2 유전자는 구조가 매우 다르지만, 적어도 일부 기능들은 상호 연관되어 있다.
BRCA2는 이중 가닥 절단 복구 및/또는 상동적인 재조합에 관여한다. 이것은 이중 가닥 DNA 상의 ssDNA로 RAD51을 타겟팅함으로써 작용하여, 상동적인 재조합시 가닥 침입을 자극한다. DNA 이중 가닥 절단에 RAD51을 위치시키기 위해서는 BRCA1-PALB2-BRCA2 복합체를 형성하여야 한다.
BRCA1은 이중 가닥 절단 복구, 비-상동적인 말단 연결 및 상동성-특이적인 복구에서 2가지 구분되는 경로에서 역할을 수행하는 것으로 보인다. 즉, BRCA1은 비-상동적인 말단 연결 경로 (Mre11, Rad50, Nbs1 복합체 포함) 및 상동적인 복구 (특히, RAD51 및 BRCA2) 둘다에 관여하는 단백질과 상호작용한다.
본원에서, 용어 "Cdc25"는 Cdc25 포스파타제 (Cdc25A, B 및 C)를 지칭하는 것으로서, 이는 cyclin-의존적인 키나제의 Thr-14 및 Tyr-15에서 저해성 포스페이트를 제거하여, 키나제를 활성화하고 세포 주기 동안의 진행을 구동하는 역할을 담당한다. DNA 복구가 진행 중일 때에는 유사분열이 방지되어야 하며, 따라서 DNA 손상 반응은 세포-주기 체크포인트를 활성화하여 유사분열을 방지한다. 2종의 단백질 키나제, Chk1 및 Cds1이, 유사분열 유도인자 Cdc25를 인산화함으로써 이러한 체크포인트를 구동시키며, 따라서 유사분열로의 진행을 방지한다.
본원에서, 용어 "Chk1"은 "체크포인트 키나제 1"을 지칭하며, 이는 세린/트레오닌-특이적인 단백질 키나제이다. Chk1이 활성화되면 세포 주기 체크포인트, 세포 주기 정지, DNA 복구 및 세포 사멸이 개시되어, 손상된 세포가 세포 주기로 진행되는 것이 방지된다. Chk1은 인산화를 통해 ATR에 의해 조절되며, ATR-Chk1 경로가 형성된다. 이 경로는 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 인지한다. 종종 ssDNA는 복제 효소 헬리카게 및 DNA 중합 효소의 비-커플링에 의한 S 기 동안에 비정상적인 복제 결과일 수 있다. 이러한 ssDNA 구조는 ATR을 유인하며, 궁극적으로 체크포인트 경로를 활성화한다.
그러나, Chk1의 활성화는 ATR에만 의존하지 않으며, DNA 복제에 관여하는 중간 단백질이 종종 요구된다. 복제 단백질 A, Claspin, Tim/Tipin, Rad 17, TopBP1 등의 규제성 단백질이 Chk1 활성화를 촉진하기 위해 관여할 수 있다. Chk1의 최대 상호작용을 유도하기 위해 추가적인 단백질 상호작용이 참여한다. Chk1 활성화는, PKB/AKT, MAPKAPK 및 p90/RSK 등의 다른 단백질 키나제와의 상호작용을 경유하여, ATR-비의존적일 수 있다.
본원에서, 용어 "Chk2"는 "체크포인트 키나제 2"를 지칭한다. Chk2는 세포 분열을 조절한다. DNA에 이중 가닥이 절단되면, Chk2 단백질이 활성화된다. 보다 구체적으로, ATM은 부위 Thr68을 인산화하고, Chk2를 활성화한다. Chk2가 활성화되면, 이는 cyclin-의존적인 키나제 (CDK)의 탈인산화 및 활성화를 담당하는, CDC25 포스파타제 등의 하류 타겟들을 인산화한다. 즉, Chk2에 의한 CDC25 포스파타제의 저해는 Chk1과 마찬가지로 세포가 유사분열로 진입하지 못하게 막는다. 아울러, Chk2 단백질은 p53 (p53) 등의 수종의 기타 단백질들과 상호작용한다. Chk2에 의한 p53의 안정화는 세포 주기를 G1 기에서 정지시킨다. 또한, Chk2는 세포-주기 전사 인자 E2F1 및 세포자살 (프로그래밍된 세포 사멸)에 관여하는 전골수성 백혈병 단백질 (PML)을 인산화하는 것으로 알려져 있다.
본원에서, 용어 "NBS1"은 "네이메헨 절단 증후군 (Nijmegen breakage syndrome)"을 유발하는 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. NBS1은 전형적으로 hMRE11/hRAD50 뉴클레아제와 복합체를 형성하고, DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 상동적으로 재조합 복구하는데 작용한다. NBS1과 ATM, MDC1, γH2AX 및 TopBP1의 상호작용은 DNA 손상 후 DSB 부위들에서 foci 형성 및 ATM/ATR-의존적인 세포 주기 체크포인트의 활성화에 중요하다.
본원에서, 용어 "PALB2"는 "BRCA2의 파트너 및 로컬라이저 (partner and localizer of BRCA2)"를 지칭한다. 이 단백질을 핵 foci에서 BRCA2에 결합하여 공동-위치하며, BRCA2의 안정적인 핵내 위치화 및 축적을 허용할 것으로 보인다. PALB2는 단일 가닥 DNA에 결합하며, 재조합효소 RAD51과 직접 상호작용하여 가닥 침투 (strand invasion)를 자극하는데, 이는 상동적인 재조합에 필수 단계이다.
본원에서, 용어 "PARP"는 "폴리(ADP-리보스) 중합효소"를 지칭한다. PARP 패밀리는 모두 구조가 매우 다른 세포에서 기능하는 17종의 멤버로 구성된다. PARP의 주 역할은 SSB를 검출하고, 주로 BER 경로에서 SSB 복구에 관여하는 효소 장치를 신호전달함으로써 SSB 복구를 개시한다. PARP가 일단 SSB를 검출하면, DNA에 결합하여 구조적인 변화가 수반되며, 다른 DNA-복구 효소에 대한 신호로서 작용하는 폴리머성 아데노신 다이포스페이트 리보스 (폴리(ADP-리보스) 또는 PAR) 체인의 합성이 개시된다. 타겟 효소는 DNA 리가제 III (LigIII), DNA 중합효소 β (polβ), 및 XRCC1 (X-ray cross-complementing gene 1)과 같은 스캐폴딩 단백질을 포함한다. 복구된 후, PAR 체인은 폴리(ADP-리보스)글리코하이드롤라제 (PARG)에 의해 분해된다.
본 발명의 방법에서 나머지 측면들은 전술한 방법에서 기술된 내용을 포함한다.
C. 암 개체의 환자 코호트 분류법
제3 측면에서, 본 발명은 암 개체를 환자 코호트로 분류하는 방법에 관한 것으로,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 적 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 상기 기준값보다 낮다면, 환자는 항암 치료에 반응성으로 특정되는 코호트로 분류되거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 상기 기준값보다 높다면, 환자는 항암 치료에 비-반응성으로 특정되는 코호트로 분류된다.
본원에서, 용어 "코호트" 또는 "환자 코호트"는 공통 질환, 환경적 또는 시간적 영향, 치료 또는 연구 또는 임상 실험에서 진행을 분석하는 기타 형질에 의해 영향을 받은 개체 일군을 지칭한다. 본 발명에서, 모든 코호트의 개체들은 암으로 진단되며, 코호트에 속하는 모든 개체에 공통적인 형질은 (코호트에 따라) 항암 치료에 대한 양성 또는 음성 반응이다. 각 개체의 이러한 반응은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서의 기준값과 비교함으로써 결정되되, 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이고, 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리되지 않은 것이다. 상기한 RAD51 foci를 가진 세포의 수준 및 기준값은 섹션 1-A에 기술된 바와 같이 결정된다.
본 발명의 이러한 방법에 대한 맥락에서 나머지 측면들은 전술한 방법들에서 정의된 의미를 가진다.
D. 개체 유래 종양을 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구 가능한지를 예측하는 방법
제4 측면에서, 본 발명은 개체 유래 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구가능한지를 예측하는 방법에 관한 것으로,
i) 종양 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 종양은, 종양을 분리하기 24시간 전에, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법으로 받지 않은 개체로부터 분리된 것이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮은 것은, 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구될 수 있다는 것을 의미하거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 보다 높은 것은, 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구 가능하지 않다는 것을 의미한다.
본원에서, 표현 "암으로 진단된 개체 유래 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구가능한지를 예측하는"은, 환자 개체 유래 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구가능할 수 있는 가능성을 의미한다. 당해 기술 분야이 전문가가 이해하는 바와 같이, 바람직한 것은 아니더라도, 예측이 분석 개체로부터 유래된 종양의 100%에서 정확하여야 하는 것은 아니다. 그러나, 이러한 표현은, 예측이 환자들 중 통계학적으로 유의한 비율에서 정확한 결과를 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 예측이 통계학적으로 유의한 결과를 제공하는지를 결정하는 것은 신뢰구간 결정, p 값 결정, 스튜던트 t-검정, Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983에 기술된 바와 같은 만-휘트니 검정 등의 표준적인 통계학적 기법을 이용해 수행할 수 있다. 적절한 신뢰구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다. p 값은 바람직하게는, 0.2, 0.1, 0.05이다.
본원에서, 용어 "가능성"은 섹션 1-A에 기술된 바와 같이 이해된다.
본원에서, 표현 "상동적인 재조합 복구" 또는 "HRR"은 원칙적으로 DSB를 복구하기 위해 세포에서 DDR로서 발생하는 상동적인 재조합 프로세스를 지칭한다. 일반적인 의미에서, HRR은 절단을 복구하기 위한 주형으로서 사용되는 동일한 또는 거의 동일한 서열을 필요로 한다. 이러한 복구 과정을 담당하는 효소적 장치는 감수분열 중에 염색체 교차를 담당하는 장치와 거의 동일하다. 이 경로는 (DNA 복제 후 G2에서 이용가능한) 자매 염색분체 또는 상동적인 염색체를 주형으로서 이용해 손상된 염색체를 복구할 수 있다.
따라서, 섹션 D에 기술된 방법은 HRR이 풍부/기능성이거나 또는 결여/비-기능성인 암 환자들을 구분할 수 있다.
본 발명의 본 방법의 정의에서 사용되는 나머지 용어들은 본 발명의 전술한 방법에서 설명되었으며, 본 방법에 동일하게 적용가능하다.
E. 본 발명의 방법에 대한 바람직한 구현예들
바람직한 구현예에서, 본 발명의 이전의 임의 측면들에서 정의된 방법에서, 세포는 핵에서 RAD51 foci를 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상 함유한다면, RAD51 foci를 가진 것으로 정의된다. 보다 바람직한 구현예에서, 세포는 핵에 RAD51 foci를 1개 이상 함유하여야 한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 세포는 핵에 RAD51 foci를 5개 이상 함유하여야 한다.
다른 바람직한 구현예에서, RAD51 foci는 RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 사용하여 면역분석으로 동정한다. 본원에서, 용어 "면역분석"은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용함으로써 용액내 분자의 존재 또는 농도를 측정하는 생화학적 검사를 지칭한다. 면역분석에 의해 검출되는 분자는 흔히 "분석물"로 지칭되며, 다수의 사례들에서, 여러가지 크기 및 타입의 단백질이나, 분석에 적절한 특성을 가진 적절한 항체를 발생시키는 한, 다른 종류의 분자일 수도 있다. 면역분석은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 검출을 허용하기 위해 다양한 여러가지 표지물질을 이용한다. 표지물질은 전형적으로 바람직한 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 화학적으로 연결 또는 접합된다.
면역분석에서 사용하기 위한 일반적인 표지물질은 효소이다. 효소를 사용하는 일반적인 면역분석은 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA) 또는 때때로는 효소 면역분석 (EIA)이다.
면역분석에 표지물질로서 사용되는 효소로는 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP), 알칼라인 포스파타제 (AP) 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 이들 효소는 흔히 특정 시약의 존재시 관찰가능한 색 변화를 발생시키므로 검출가능하다. 일부 경우에, 이들 효소는 빛 또는 화학발광을 발생시키도록 유발하는 시약에 노출된다.
방사성 동위원소를 면역분석 시약에 첨가하여 방사성면역분석 (RIA)을 실행할 수 있다. 결합된 항체-항원 복합체에 의해 방출되는 방사성은 통례적인 방법을 이용해 쉽게 검출할 수 있다.
피코에리트린과 같은 형광원성 리포터 (fluorogenic reporter)들이 다수의 현대 면역분석에 사용된다. 형광원성 리포터를 흔히 사용하는 타입의 면역분석이 단백질 마이크로어레이이다.
표지물질은 일반적으로 면역분석에 사용되지만, 표지물질에 의존하지 않고, 대신 분석의 구성성분을 변형 또는 표지할 필요가 없는 검출 방법을 채택하는 일부 타입의 분석도 있다. 표면 플라스몬 공명은 비-표지된 항체와 항원 간의 결합을 검출할 수 있는 기법의 일 예이다. 이는 입사광에 의해 자극된 네거티브 및 파지티브 유전율 물질 사이의 계면에서의 전도 전자의 공진 (resonant oscillation)으로 구성된다. 또 다른 입증된 표지물질-비사용 면역분석은 항원 결합시 전극의 저항성 변화를 측정하는 것을 포함한다.
당업자는 면역분석 기법의 원리를 이용해 단일 세포 수준에서 대상 단백질의 foci 형성 및/또는 발현을 확인한다. 이러한 확인 가능한 방법들은 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 방법에 대한 비-제한적인 예는 면역조직화학, 면역형광, 면역-전자 현미경 또는 유세포 측정이다.
본원에서, 용어 "면역조직화학"은 전술한 면역분석의 원리를 이용함으로써, 조직 단편의 세포 또는 세포 샘플의 세포에서 항원 (예, 단백질)을 선택적으로 영상화하는 과정을 수반하는 기법을 지칭한다. 분석 세포에 결합된 항체의 가시화는 전자현미경 (EM)과 같은 현미경의 사용을 수반한다. 면역조직화학은 조직 단편, 배양된 세포주 또는 개별 세포에 대해 사용할 수 있으며, 세포내 또는 보다 일반적으로는 세포 샘플에서 단백질, 글리칸 및 생물학적 및 비-생물학적 소형 분자의 분포를 분석하는데 이용할 수 있다.
샘플의 준비는 세포 형태, 조직 아키텍처 및 타겟 에피토프의 항원성을 유지하는데 중요하다. 즉 적절한 조직 수집, 고정 및 단편화 (sectioning)가 필요하다. 파라포름알데하이드 용액이 조직을 고정하기 위해 흔히 사용되지만, 다른 방법도 사용할 수 있다. 이후 조직은 실험 목적 또는 조직 자체에 따라 얇은 조각으로 절단하거나 또는 전체 그대로 사용할 수 있다. 조직 샘플은, 단편화하기 전, 파라핀 왁스 또는 냉동매질 (cryomedia)과 같은 매질에 포매할 수 있다. 단편은 다양한 장치에서, 가장 일반적으로는 마이크로톰 (microtome), 크리오스탯 (cryostat) 또는 컴프레스톰 조직 슬라이서 (compresstome tissue slicer)에서 절단할 수 있다. 시료는 전형적으로 3-5 ㎛ 범위로 절단한다. 그런 후, 단편을 슬라이드 위에 놓고, 농도 증가식 (예를 들어, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%) 알코올 세척을 통해 탈수시키고, 크실렌과 같은 디터전트를 사용해 깨끗하게 한 다음 현미경으로 이미지를 관찰한다. 고정 및 조직 보존 방법에 따라, 파라핀 제거 및 항원 회복 (antigen retrieval) 등의 에피토프를 항체 결합에 이용가능하게 만들기 위한 추가적인 단계들이 샘플에 필요할 수도 있다. 포르말린-고정된 파라핀 포매된 조직의 경우, 대개 항원-회복이 필수적이며, 열 또는 프로테아제로 단편을 전처리하는 것을 포함한다. 이러한 단계들은 타겟 항원의 염색 또는 비-염색 차이를 만들 수 있다.
본원에서, 용어 "면역형광 "은 분석 중인 세포에서 항체의 위치를 가시화하기 위해 주로 형광단을 이용하는 면역조직화학의 특정 예를 의미한다.
본원에서, 용어 "유세포 측정"은 세포를 유체 스트림에 현탁시켜 이를 전자 검출 장치를 통해 통과시킴으로써, 바이오마커 검출, 세포 카운팅, 세포 분류 및 단백질 조작에 사용되는 레이저- 또는 임피던스-기반의, 생물리학적 기법을 지칭한다. 유세포 측정기는 초당 입자 최대 수천개의 물리적 및 화학적 특징들을 동시적으로 다중파라미터 방식으로 분석할 수 있다. 세포는 용액에서 면역염색한 후 유세포 측정으로 분석한다.
본원에서, 용어 "항체"는 항체 전체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역") 또는 단쇄를 포함한다. "항체"는 이황화결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 중(H)쇄와 2개 이상의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질 또는 이의 항원 결합 영역을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부로 구성된다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄 불변부는 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역들은 상보성 결정 영역 (CDR)로 지칭되는 과변이 영역들로 더욱 세분할 수 있는데, 과변이 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역들 사이에 분포되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 CDR 3개와 FR 4개로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역글로불린이 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역 시스템의 다양한 세포들 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
항체는 단일클론 또는 다클론 항체일 수 있다. 단일클론 항체는 항원의 동일한 에피토프에 결합하고 에피토프가 항체에 의해 인지되는 항원의 일부라는 점에서, 1가 친화성을 가진다. 단일클론 항체는 모두 고유한 모 세포의 클론인 동일한 면역 세포들로부터 유래된다. 이와는 대조적으로, 다클론 항체는 동일 항원의 복수의 에피토프에 결합하며, 일반적으로 여러가지 B 세포 계통들에 의해 생산된다.
본원에서, 항원의 "항원-결합 영역" (또는 간단하게 "항체 영역")이라는 용어는 항원 (예, TNFα, IL-12)에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 하나 이상의 항체 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 입증되어 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합성 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 Fab 단편 2개가 연결된 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 싱글 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 등이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 개별 유전자들에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역들이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 체인으로서 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법으로 연결될 수 있다 (단쇄 Fv (scFv)라함; 예, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득하며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체 단편은 Fab, Fd, Fd', 단쇄 Fv (scFv), scFva 및 도메인 항체 (dAb)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "세포 수준" 및 "기준값"은 섹션 1-A에서 정의된다. "RAD51 foci를 가진 세포의 수준"을 결정하기 위한 여러가지 방법들 역시 섹션 1A에서 확인된다.
샘플에서 증식 중인 세포의 수와 관련하여 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 경우, 바람직한 구현예에서, 샘플에서 증식 중인 세포의 수는 Geminin, KI-67, 증식성 세포 핵 항원, Cyclin A2로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 발현을 측정함으로써 결정한다. 다른 바람직한 구현예에서, 선택 단백질의 발현 결정은 선택 단백질에 특이적인 항체를 이용한 면역분석에 의해 수행된다. 바람직하게는, 증식 중인 것으로 간주되는 세포는 선택 단백질의 핵 발현을 나타내며, 이때 "핵 발현"은 세포 핵 안에 위치한 단백질의 발현을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 핵내 단백질의 발현이 세포질내에서보다 높을 경우, 세포는 단백질이 핵내에서 발현되는 것으로 정의된다. 더 바람직한 구현예에서, 선택 단백질은 Geminin이다.
샘플에서 DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 절단을 나타내는 세포의 수와 관련하여 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 경우, 바람직한 구현예에서, 샘플에서 이중 가닥 절단을 나타내는 세포의 수는 γH2AX, 복제 단백질 A (pRPA), p53 결합 단백질 1 (53BP1), 이중 가닥 절단 복구 단백질 (MRE11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 핵내 발현, 바람직하게는 핵내 foci 존재를 확인함으로써, 결정된다. 다른 바람직한 구현예에서, 핵 안에서 단백질의 발현이 세포질에서의 발현보다 높을 경우, 세포는 단백질이 핵에서 발현되는 것으로 정의된다. 다른 바람직한 구현예에서, 세포의 핵 안에 상기한 단백질의 foci가 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상 존재한다면, 그 세포는 핵내 선택 단백질의 foci를 가지는 것으로 정의된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포가 핵내 상기한 단백질의 foci를 1개 이상 가진다면, 그 세포는 핵내 선택 단백질의 foci를 가진 것으로 정의된다. 선택 단백질의 핵내 발현 또는 핵 foci의 존재 결정은 선택 단백질, 바람직하게는 γH2AX에 특이적인 항체를 이용한 면역분석에 의해 수행된다. 바람직한 구현예에서, DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 절단을 나타내는 샘플내 세포 수 결정은, 핵내 γH2AX foci를 가진 세포 수를 확인함으로써 결정되며, 이때 세포가 핵내 γH2AX foci를 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상 가진다면, 그 세포는 핵내 γH2AX foci를 가진 것으로 정의된다.
용어 "면역분석" 및 단일 수준에서 단백질을 검출하는 방법은 이미 상기에서 그리고 본원의 용어 "항체"에서 정의되어 있다.
바람직한 구현예에서, 지금까지 본원에 기술된 임의 방법의 샘플은 혈액, 타액, 뇌척수액, 뇨, 변, 골수, 유두 흡인물 또는 고형 종양 생검으로부터 분리된다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 지금까지 기술된 방법의 샘플은 고형 종양 생검으로부터 분리된다.
다른 특정 구현예에서, 지금까지 언급된 임의 방법의 샘플은 고정된 조직, 파라핀 포매 조직, 포르말린-고정된 파라핀 포매 조직 (FFPE), 조직학적 슬라이드, 세포 현탁물, 세포 펠렛, 세포 슬라이드 및/또는 고형 종양의 냉동 생검으로서 제공된다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 포르말린, 알데하이드, 알코올, 산화제, 수은, 피크레이트 또는 HEPES-글루탐산 완충제 조절된 유기 용매 보호 효과 (HEPES-Glutamic Acid Buffer Mediated Organic Solvent Protection Effect)(HOPE®)를 사용해 고정하는, 고정된 조직이다.
다른 구현예에서, "암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한" 방법에서 언급되는 개체의 반응은 임상 효용비, 전체 생존성, 비-진행성 생존성, 무병 생존성, 병리학적 완전 반응, 임상적인 완전 관해, 임상적인 부분 관해, 임상적으로 안정한 질환, 재발, 비-전이성 생존, 순환성 종양 세포의 감소, 순환성 마커의 반응 및 종양 반응 평가에 대한 RECIST 기준으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기준에 의해 결정할 수 있다. 이러한 여러가지 기준은 섹션 1-A에서 정의된다.
"암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한" 방법 및/또는 "암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법을 선택하기 위한" 방법에서 언급되는 항암 치료는, 바람직하게는 수술을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 전술한 임의 방법에서 언급되는 항암 치료는 DNA 손상을 유발하는 한가지 이상의 방법 및/또는 암 세포의 DNA 손상 반응을 표적하는 물질 또는 물질들의 조합을 포함한다. 표현 "DNA 손상을 유발하는 방법"은 섹션 1A에서 정의된다. DNA 손상을 유발하는 방법에 대한 비-제한적인 예는 이온화 조사, UV 광 또는 "DNA 손상을 직접 유발하는 물질"로서 섹션 1A에 열거된 물질 등의 DNA 손상을 직접 유발하는 물질을 이용한 화학요법이다. 본원에서, 표현 "DNA 손상 반응을 표적하는 물질"은 세포에서 이러한 과정에 관여하는 하나 이상의 단백질을 표적하는 물질을 지칭한다. 이러한 단백질에 대한 비-제한적인 예는 ATM/ATR, BRCA 1/2, BP53, P53, CDC25, CHK1/2, NBS, MRE1J, RAD51, PALB2, PARP 또는 이들의 조합이다. DNA 손상 반응을 표적하는 물질에 대한 비-제한적인 예는 "세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 단백질을 표적하는 물질"로서 섹션 1-A에서 앞서 열거하였다. 바람직하게는, 항암 치료를 표적으로 하는 물질은 PARP 저해제 (비-제한적인 예로, 올라파립, 벨리파립, 칼라조파립, 루카파립, 니라파립, CEP-8983, E7016 및 BGB-290) 군으로부터 선택된다. 본원에서, 용어 "PARPi" 또는 "PARP 저해제"는 효소 폴리 ADP 리보스 중합효소 (PARP)의 약리학적 저해제 일군을 지칭한다. 이들 물질은 복수의 적응증, 특히 암 치료용으로 개발되었다. PARP1은 DNA에서 단일 가닥 절단을 복구하는데 중요한 단백질이다. DNA가 복제될 때까지 (세포 분열을 선행하여야 하는) SSB가 복구되지 않고 유지된다면, 복제 자체가 DSB를 형성되게 할 수 있다. 따라서, 일반적인 의미에서, PARP1을 저해하는 약물의 작용 기전은 복수의 DSB를 형성시키고, 그래서 BRCA1, BRCA2 또는 PALB2와 같이 DSB 복구에 관여하는 단백질에 돌연변이가 있는 종양에서, 이러한 이중 가닥 절단을 효과적으로 복구할 수 없게 되어 세포 사멸이 발생하는 것이다. PARPi에 대한 비-제한적인 예는 섹션 1A에 기술된 바와 같이, 올라파립, 벨리파립, 탈라조파립, 루카파립, 니라파립, CEP-8983, E7016 및 BGB-290이다.
다른 바람직한 구현예에서, 전술한 임의 방법에서 언급되는 샘플은 DNA 손상 반응에 결함이 있는 세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능 감소가 특징적인 종양 세포를 포함한다. 표현 "세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능 감소가 특징적인 종양 세포"는 섹션 1-A에 정의되어 있다. 바람직하게는, DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질은 BRCA1, BRCA2 및/또는 PALB2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 하나 이상의 단백질은 BRCA1 및/또는 BRCA2이다.
특정 구현예에서, 개체에서 진단되는 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 결장직장암, 위/위암, 자궁내막암/자궁암/자궁경부암, 방광암, 두경부암, 백혈병, 육종, 담관암, 교모세포종, 다발성 골수종, 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 환자에서 진단되는 암은 유방암, 난소암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 더 바람직하게는 유방암 또는 난소암이고, 가장 바람직하게는 유방암이다.
본 발명의 임의 측면에서 샘플 분리 전 개체가 인지하는 치료와 관련하여, 바람직하게는, 개체는 임의 시기에, 바람직하게는 샘플을 분리하기 직전 168시간 동안, 직전 72시간 동안, 직전 48시간 동안, 직전 36시간 동안, 직전 24시간 동안, 24시간 전에, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이다. 다른 바람직한 구현예에서, 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전에, 그러나 직전 23시간 동안, 바람직하게는 직전 22시간 동안, 더 바람직하게는 직전 21시간 동안, 보다 더 바람직하게는 직전 20시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 15시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 10시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 5시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 2시간 동안, 가장 바람직하게는 직전 1시간 동안 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않는다.
바람직한 구현예에서, 샘플이 분리되는 개체는, 샘플 분리하기 전, 임의 시점에, 바람직하게는 분리 직전 168시간 동안, 바람직하게는 직전 72시간 동안, 더 바람직하게는 직전 48시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 36시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 24시간 동안, 가장 바람직하게는 샘플 분리하기 24시간 전에 어떠한 화학요법도 받지 않는다. 더 바람직하게는, 개체는, 샘플 분리하기 24시간 전에, 그러나 샘플 분리하기 직전 23시간 동안, 바람직하게는 직전 22시간 동안, 더 바람직하게는 직전 21시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 20시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 15시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 10시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 5시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 2시간 동안, 가장 바람직하게는 직전 1시간 동안, 어떠한 화학요법도 받지 않는다.
더 바람직한 구현예에서, 개체는, 임의 시점에, 바람직하게는 샘플을 분리하기 직전 168시간 동안, 더 바람직하게는 직전 72시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 48시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 36시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 24시간 동안, 가장 바람직하게는 샘플 분리하기 24시간 전에, 어떠한 항암 치료도 받지 않는다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 개체는 샘플을 분리하기 전 임의 시점에 어떠한 항암 치료도 받지 않는다.
다른 특정 구현예에서, 샘플이 분리되는 개체는 샘플 분리하기 전 소정의 기간 동안 임의 시점에, 바람직하게는 샘플을 분리하기 전 마지막 168시간 동안, 더 바람직하게는 마지막 72시간 동안, 더더 바람직하게는 마지막 48시간 동안, 더더 바람직하게는 마지막 36시간 동안, 가장 바람직하게는 마지막 24시간 동안, 항암 치료를 받은 개체이다. 샘플을 분리하기 24시간 전에, 바람직하게는 샘플을 분리하기 전 마지막 24시간 동안 투여하는 경우, 항암 치료는 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법과는 다른 것이다. 다른 구현예에서, 샘플을 분리하기 직전 36시간 동안, 바람직하게는 직전 48시간 동안, 더 바람직하게는 직전 72시간 동안, 더더 바람직하게는 직전 168시간 동안, 가장 바람직하게는 샘플 분리하기 전 임의 시점에 투여된다면, 항암 치료는 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법과 다른 것이다. 바람직하게는, 본 단락에 기술된 임의 상황의 치료는 "암으로 진단된 개체의 항암 치료 반응을 예측하는" 방법에서 결정되는 항암 치료 반응이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 항암 치료 중인 암으로 진단된 개체에서 항암 치료의 유지 또는 중단을 결정하는 방법에 관한 것으로,
i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮다는 것은, 그 항암 치료를 유지하여야 한다는 의미이거나, 또는
- RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 더 높은 것은, 항암 치료를 중단하여야 한다는 의미이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 용어들은 본 발명의 전술한 방법들에서 설명되며, 본 방법에 동일하게 적용가능하다.
2. 발명의 치료학적 용도
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는 방법에 의해 의약에 반응자로서 식별된 개체에서 암 치료에 사용하기 위한 의약에 관한 것이다.
제6 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법을 선택하는 방법에 의해 치료를 설계하는, 개체에서 암 치료에 사용하기 위한 의약에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "의약"은 물질, 바람직하게는 항암제, 더 바람직하게는 DNA 손상제를 치료학적 유효량으로 포함하는 조성물을 지칭한다. 또한, 의약은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 의약은, 각각의 물질이 각각의 대응되는 치료학적 유효량으로 존재하고; 바람직하게는 하나 이상의 물질이 항암제이고; 더 바람직하게는 하나 이상의 물질이 DNA 손상제인, 2 이상의 물질을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 의약은 해당 치료학적 유효량으로 존재하는 물질, 바람직하게는 해당 치료학적 유효량으로 존재하는 항암제, 더 바람직하게는 해당 치료학적 유효량으로 존재하는 DNA 손상제로 구성된다. 이 경우, 물질은 이미 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
본원에서, 용어 "치료학적 유효량"은 원하는 효과를 제공하기 위한 물질의 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 특히 화합물 자체의 특징 및 달성할 치료학적 효과에 의해 결정될 것이다. 또한, 이는 치료할 개체, 개체가 앓는 암 질환의 중증도, 선택된 투약 형태, 투여 경로 등에 따라 결정될 것이다.
개별 요건들이 다양하더라도, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물의 치료학적 유효량에 대한 최적의 범위를 결정하는 것은 당해 기술 분야의 전문가들의 일반적인 경험에 속한다. 보통, 당해 기술 분야의 전문가에 의해 조정될 수 있는, 효과적인 치료를 제공하기 위해 필요한 투여량은, 연령, 건강, 피트니스, 성별, 식이, 체중, 표적 분자 경로의 변형 정도, 암 질환의 치료 빈도, 특성 및 상태, 암의 특성 및 범위, 개체의 의학적인 상태, 투여 경로, 사용하는 특정 물질의 활성, 효능, 약동학 및 독성 프로파일과 같은 약리학적 고려사항, 전신 약물 전달 이용 여부, 및 물질이 약물 조합의 일부로서 사용되는지의 여부에 따라 결정될 것이다.
본원에서, 표현 "약제학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 개체에 기본적으로 무독성이며 의약의 다른 구성 성분과 혼용가능한, 임의의 화합물 또는 화합물 조합을 지칭한다. 즉, 부형제는, 활성 성분을 함유한 벌킹-업 조성물을 제조할 목적으로 의약의 활성 성분 (즉, 물질, 바람직하게는 항암제, 더 바람직하게는 PARPi와 같은 DNA 손상제)과 함께 제형화되는 불활성 물질이다. 벌킹 업은 투약 형태를 생산할 때 활성 성분을 편리하고 정확하게 배분할 수 있게 해준다. 또한, 부형제는, 활성 성분의 흡수 또는 용해성 개선, 또는 기타 약동학적 고려사항 등의 다양한 여러가지 치료학적 강화 목적을 제공할 수 있다. 또한, 부형제는, 예상되는 유통 기간 (shelf life) 동안 변성 방지와 같은 시험관내 안정성을 도울 뿐 아니라, 분말 유동성 또는 비-점성 특성과 같이 고려되는 활성 물질의 취급을 돕기 위해, 제조 공정에 유용할 수 있다. 적절한 부형제의 선택은 투여 경로 및 투약 형태뿐 아니라 활성 성분 및 기타 요소에 따라 결정된다. 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐 물질 또는 임의의 통상적인 타입의 제형 보조제일 수 있다. 예시적인, 비-제한적인, 부형제 또는 담체의 예로는 물, 염 (식염수) 용액, 알코올, 덱스트로스, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산의 모노글리세라이드 및 다이글리세라이드, 지방산 에스테르 페트로에트랄 (petroetral), 하이드록시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등이 있다.
본 발명의 치료학적 용도에 대한 바람직한 구현예들
바람직한 구현예에서, 의약은 항암제, 더 바람직하게는 DNA 손상제를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 의약은 PARP 저해제 물질, 바람직하게는 올라파립, 벨리파립, 탈라조파립, 루카파립, 니라파립, CEP-8983, E7016 및 BGB-290로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, PARPi는 올라파립, 벨리파립 또는 니라파립이고, 바람직하게는 올라파립이다.
다른 특정 구현예에서, 의약은 면역요법을 구성하는 치료에 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 의약은, 의약 투여와 더불어, 면역요법, 화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 치료에 사용하기 위한 것으로, 개체는 "암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는" 방법에 의해 의약에 대해 반응자로 동정된 개체이다.
다른 특정 구현예에서, 의약은, 의약의 투여와 더불어, 면역요법, 화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하는 치료에 사용하기 위한 것이며, 치료는 "암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법을 선택하는" 방법에 의해 설계된다.
본 발명의 의약 맥락에서 사용되는 용어들은 본 발명의 방법들에서 정의된 바와 동일한 의미를 가진다.
3. 키트의 사용
제7 측면에서, 본 발명은, "암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는" 방법에서, RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
제8 측면에서, 본 발명은, "암으로 진단된 개체에 대해 요법을 선택하는" 방법에서, RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
제9 측면에서, 본 발명은, "암 환자를 환자 코호트로 분류하는" 방법에서, RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
제10 측면에서, 본 발명은, "개체 유래 종양의 상동적인 재조합에 의한 DNA 복구 가능성을 예측하는" 방법에서, RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
제11 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 임의 방법에서, RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, "키트"는 운반 및 보관할 수 있도록 포장된 본 발명의 여러가지 용도를 수행하는데 필요한 여러가지 시약들을 함유한 제품으로서 이해된다. 또한, 본 발명에서 사용되는 키트는 키트에 존재하는 여러가지 구성성분들의 동시적인, 순차적인 또는 개별 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 설명서는, 예를 들어, 전자 보관 매체 (예, 자기 디스크, 테이프) 또는 광학 매체 (예, CD-ROM, DVD) 또는 오디오 재료와 같이, 판독 또는 이해하는데 용이한 설명을 저장할 수 있는 전자 지원 (electronic support) 형태 또는 인쇄된 물건의 형태로 존재할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 매체는 이러한 설명을 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 전술한 임의 용도에서 언급되는 키트는, 그 발현으로 샘플내 세포가 증식 중인지를 결정하는, 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 더 포함한다. 바람직하게는, 항체는 Geminin, KI-67, 증식성 세포 핵 항원, Cyclin A2로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 특이적으로 인지할 수 있다. 더 바람직하게는, 단백질은 Geminin이다.
다른 바람직한 구현예에서, 전술한 임의 용도에서 언급되는 키트는, 핵내 특이적인 단백질의 존재, 바람직하게는 단백질의 핵 foci의 존재를 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 더 포함하며, 여기서 세포 안에서의 그 존재는 세포가 DNA 손상, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 절단을 포함하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 항체는 γH2AX, 복제 단백질 A (pRPA), p53 결합 단백질 1 (53BP1), 이중 가닥 절단 복구 단백질 (MRE11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 특이적으로 인지할 수 있다. 더 바람직하게는, 항체는 γH2AX 단백질을 특이적으로 인지할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 섹션 3의 제1, 제2, 제3 및 제4 측면에서 언급된 임의 용도로 기술된 키트는, Geminin 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체, 및 γH2AX 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체, 또는 이들의 조합을 더 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 섹션 3에 언급된 임의 항체는 각각 본 발명에서 사용되는 키트를 구성하는 시약들의 총량의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%로 포함한다.
본 발명의 용도의 맥락에서 사용되는 용어들은 본 발명의 방법 및 의약에서 정의되는 바와 동일한 의미를 가진다.
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아래 실시예 및 도면은 예로서 제공되며, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
실험 설계
새로운 바이오마커로서 PARPi 효과를 확인하기 위해, 유방암 (BC) 또는 고-등급 점액성 난소암 (HGSOC)으로 진단된 환자로부터 종양 샘플을 전향적으로 수집하고, PDX 모델 콜렉션을 구축하였다. PARPi에 대한 민감성을 평가하고, HRR 경로의 기능성을 분석하였으며, PARPi-민감성 대 PARPi-내성 PDX 샘플과 비교하여 반응과 연관된 기능 검사를 탐색하였다. 기능 검사는 또한 독립적인 PDX 콜렉션에서 조사하였다. BRCA1, BRCA2 또는 PALB2에 생식세포 돌연변이가 존재하는 환자를 포함하여, 임상 샘플에서의 탐구 분석을 통해, 기능 검사의 잠재적인 임상적인 관심을 조사하였다.
환자-유래 이종이식 ( PDX ) 모델
유방암 또는 고-등급의 장액성 난소암을 가진 환자로부터 수득한 신선한 종양 샘플을 발 드 헤브론의 생명윤리위원회 (IRB), Institut Curie 또는 Institut Paoli-Calmettes로부터 승인받은 프로토콜에 따라 누드 마우스에 이식하기 위해 전향적으로 수집하였다. 실험은 유럽연합의 동물 관리 지침 (2010/63/EU)에 따라 수행하였으며, 발 드 헤브론 연구소의 동물실험 윤리 위원회 (스페인, 바로셀로나) 또는 동물 실험 윤리 위원회 CEEA-51 (프랑스, 에브리)로부터 승인받았다. 신선한 원발성 또는 전이성 인간 종양을 수술 또는 생검시 환자로부터 수득하고, 이를 6주령의 암컷 무-흉선 HsdCpb:NMRI-Foxn1nu 마우스 (Harlan Laboratories)의 유방 지방 패드 (수술 샘플) 또는 좌측 옆구리 (진이성 샘플)에 즉시 이식하였다. 동물에 1 μM 17b-에스트라디올 (Sigma-Aldrich)을 음용수에 첨가하여 계속 보충 공급하였다. 이식한 종양이 생착되면, 아랫쪽 옆구리에 연속 이식에 의해 모델을 영구화하였다. 각각의 페세지 (passage)에서, 급냉 및 포르말린-고정된 파라핀 포매 (FFPE) 샘플을 유전자형 및 조직학적 실험을 위해 수집하였다.
BRCA1 /2 및 PALB2 유전자 분석
PDX 종양 샘플 또는 환자 말초혈로부터 DNA를 추출하고, BRCA1, BRCA2 및 PALB2 유전자의 차세대 서열분석을 수행하였다.
생체내 PARPi에 대한 PDX 민감성 실험
PARP 저해에 대한 민감성을 평가하기 위해, 종양을 가진 마우스를 5-10마리씩 처치군으로 균등하게 할당하였으며, 종양의 크기는 70 - 300 mm3 범위였다. 올라파립 50 mg/kg 또는 100 mg/kg, 니라파립 75 mg/kg 또는 50 mg/kg, 또는 벨리파립 100 mg/kg을 (10%v/v DMSO / 10%w/v Kleptose [HP-β-CD]에 용해하여) 매일 위관영양 (p.o.)으로 투여하였다. 후천적인 내성 세팅에서 첫날부터 21일까지 7-10일마다 격주로 캘리퍼를 사용해 종양의 증식을 측정하였다. PARPi에 대해 내성을 획득한 PDX 모델을 구축하기 위해, 각각의 종양이 다시 생장할 때까지 올라파립-민감성 종양에서 최대 150일간 올라파린 처치를 유지하였다. 모든 실험들에서, 매주 2회씩 마우스의 체중을 기록하였다. 종양 체적은 V = 4π/3/Lxl2로 계산하였으며, 여기서 "L"은 최장 직경이고, "l"은 최소 직경이다. 종양의 크기가 1500 mm3에 도달하거나 또는 체중 감소가 심각한 경우에는, 위원회의 지침에 따라, 마우스를 안락사하였다. 21일째 종양의 체적으로 이의 베이스라인과 비교해 항종양 활성을 결정하였다: 종양 체적 변화% = (V21일 -V초기)/V초기 x 100. 올라파립-민감성 PDX의 경우, 최상의 반응은 종양 체적 변화%의 최소값이 적어도 10일간 유지되는 것으로 정의하였다. 항종양 반응을 분류하기 위해, 종양 체적 변화 %에 대한 고형 종양에서의 반응 평가 기준 (RECIST)은 다음과 같다: CR (완전 반응), 최상의 반응 <-95%; PR (부분 반응), -95<최상의 반응<-30%; SD (안정적인 질환),-30% < 최상의 반응 < +20%, PD (진행성 질환), 최상의 반응>+20%.
면역형광
면역형광에 다음과 같은 1차 항체를 사용하였다: 토끼 anti-RAD51 (Santa Cruz Biotechnology H-92, 희석율 1:250), Cell Signalling Technologies 사의 토끼 anti-RAD51 Ab (CST #8875, 83 ㎍/ml 원액으로부터 희석율 1:25), Abcam 사의 토끼 anti-RAD51 Ab (ab-133534, 희석율 1:1000), 마우스 anti-Geminin (NovoCastra NCL-L, PDX 샘플의 경우 1:100, 환자 샘플의 경우 1:60), 토끼 anti-Geminin (ProteinTech 10802-1-AP, 1:400), 마우스 anti-BRCA1 (Santa Cruz Biotechnology D-9, C-말단의 경우 1:50; 또는 Abcam MS110, N-말단의 경우 1:200), 및 마우스 anti-γH2AX (Millipore JBW301, 1:200). 사용한 2차 항체는 다음과 같다: 염소 anti-토끼 Alexa fluor 568 (Invitrogen; 1:500), 염소 anti-마우스 Alexa fluor 488 (Invitrogen; 1:500), 염소 anti-마우스 Alexa fluor 568 (Invitrogen; 1:500) 및 염소 anti-토끼 Alexa fluor 488 (Invitrogen; 1:500).
얇은 조직 단편에서 크실렌을 사용해 파라핀을 제거하고, 에탄올 시리즈를 농도를 낮추면서 처리하여 수화시켰다. 타겟 항원 회복을 위해, 단편에 DAKO Antigen Retrieval Buffer pH 9.0에서 4분간 110℃에서 마이크로웨이브를 조사하였다. 단편을 5분간 증류수에서 냉각시킨 다음 DAKO 세척 완충액 (+Tween 20)으로 5분간 처리하여 투과화하고, 차단 완충액 (DAKO 세척 완충액 + 1% 소 혈청 알부민)에서 5분간 인큐베이션하였다. 1차 항체를 DAKO 항체 희석액으로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단편을 DAKO 세척 완충액으로 5분간 세척한 다음 차단 완충액으로 5분간 세척하였다. 2차 항체를 차단 완충액으로 희석하여, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 2-단계 세척을 반복한 다음 증류수에서 5분간 인큐베이션하였다. 에탄올의 농도를 증가시키면서 처리하여 탈수시켰다. 단편에 DAPI ProLong Gold 안티-페이딩 시약 (antifading reagent)을 탑재하여, -20℃에서 보관하였다. Olympus DP72 현미경을 사용해 600x 배율로 면역형광 이미지를 획득하였으며, 이미지는 CellSens Entry 소프트웨어를 사용해 생성하였다.
RAD51은 도에 나타낸 바와 같이 스코어를 매겨 정량하였다: a) 핵내 RAD51 foci를 가진 종양 세포의 %, b) RAD51 foci를 가진 γH2AX foci 양성 세포의 %, 또는 c) RAD51 foci를 가진 geminin 양성 세포의 %. 스코어 결정은 생물체 이미지 (life image)에 대해 맹검으로 수행하였다. 최적으로는, 각 샘플의 3개 이상의 서로 다른 대표적인 영역으로부터 geminin 또는 γH2AX foci-양성 세포 100주를 분석하였다. 이용가능한 경우에는, 각 PDX 모델의 (비히클- 및 올라파립-처치한) 생물학적 레플리케이트 3개를 조사하였다.
면역조직화학
환자-유래 이종이식 (PDX) 조직에서 RAD51 및 Geminin의 IHC 염색을 또한 Ventana Ultra Discovery 플랫폼에서 현상하였다. 얇은 FFPE 조직 절편에서 EZ Prep (Ventana)를 사용해 파라핀을 제거하고, 세포 컨디셔닝 1 (CC1) 용액 (Ventana)을 98℃에서 32분간 사용해 항원을 회복시켰다. SignalStain 항체 희석제 (Cell Signaling Technology)로 희석한 마우스 온 마우스 (M.O.M) 차단 시약 (Vector Laboratories)의 차단 시약으로 36℃에서 32분간 슬라이드를 차단 처리한 다음 4분간 Discovery Inhibitor (Roche)로 차단 처리하였다. Ventana Antibody 희석제 + Caesin (Roche) 중의 anti-RAD51 (CST #8875, 6.6 ㎍/ml) 및 anti-Geminin (Leica Geminin-NCL-L, 희석율 1:10) 항체 칵테일과 함께 슬라이드를 36℃에서 32분간 인큐베이션하였다. UltraMap anti-Rb HRP를 사용해 16분간, UltraMap anti-Ms AP (Roche)를 사용해 12분간, 그런 후 Purple 및 Yellow 키트 (Roche)를 각각 32분간 사용해 검출하였다. 핵은 헤마톡실린으로 4분간 대조 염색하였다. 그 후, 슬라이드를 비눗물로 세척하고, 헹군 다음 60℃에서 건조한 후, 크실렌에 침지하고 커버슬립을 덮었다. 세척 단계는 1x 반응 완충액 (Roche)을 사용해 자동화된 방식으로 수행하였다. 슬라이드 모두 40x 대물렌즈 및 최소 4 Z-스택으로 Zeiss Axio Z1 스캐너에서 스캔하였다.
RAD51 mRNA 발현 분석
PerfectPure RNA 조직 키트 (5 Prime)를 사용해 PDX 샘플 (15-30 mg)로부터 RNA를 추출하였다. 순도 및 온전성을 Agilent 2100 Bioanalyzer 시스템에 의해 분석하고, PrimeScript RT 시약 키트 (Takara)를 사용해 cDNA를 수득하였다.
정량적인 RT-PCR을, 7900HT 신속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)에서, TaqMan 유니버셜 마스터 믹스 II (Applied Biosystems) 및 미리 설계된 인간 특이적인 프라이머 및 TaqMan 프로브 (GUSB의 경우 Hs99999908_m1, ACTB의 경우 Hs99999903_m1, RAD51의 경우 Hs00153418_m1)를 사용해, 수행하였다. CT 비교 방법 (comparative CT method)을 데이터 분석에 사용하고, geNorm 알고리즘을 적용해 가장 안정적으로 발현되는 하우스키핑 유전자 (GUSB 및 ACTB)를 선택하고, 표준화된 CT 값을 수득하기 위해 기하 평균을 계산하였다.
환자 코호트
코호트는 발 드 헤브론 대학 병원의 유방암 및 난소암 환자들로 구성되며, 질환의 대표적인 FFPE 재료를 사용하며, IRB-승인된 고지에 입각한 동의 서식에 사인을 받았다. 면역형광 분석 및 RAD51 foci 정량을 FFPE PDX 종양 샘플에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
통계학적 분석
모든 통계학적 검정은 GraphPad Prism version 7.0으로 수행하였다. 페이어드 또는 언페이어드 t 검정 (양측 (two-tail))을 계산하였으며, p 값을 구하였다. 오차 막대는 달리 언급되지 않은 한 3개 이상의 생물학적 레플리케이트들의 SEM이다.
실시예 1. PDX에서 올라파립의 항종양 활성은 HRR -관련 변형이 존재하는 PARPi-민감성 종양의 서브세트를 식별한다.
PARPi 올라파립의 항종양 활성을 유방암 (BrC) PDX 모델 39종, 난소암 (HGSOC/OvC) PDX 모델 3종 및 췌장암 (PaC) PDX 모델 2종에서 조사하였다 (도 1). 이를 위해, BrC, HGSOC 또는 PaC 환자들로부터 신선한 종양 샘플을 수집하고, 이를 누드 마우스에 이식하여 실험용 PDX 모델을 구축하였다. 올라파립 처리시, RECIST에 의한 평가에 따라 PDX 모델 10종에서 항종양 활성이 확인되었다: 완전 반응 (CR, n=6), 부분 반응 (PR, n=2), 및 질환 안정화 (SD, n=2). 이들 PARPi 민감성 PDX 모두, BRCA1 프로모터의 과메틸화 또는 PALB2에서의 돌연변이 등의, 상동적인 재조합 복구 (HRR) 경로에 기능성 변이 또는 gBRCA1 /2 유전자 변이를 가지고 있었다. 나머지 34종의 PDX 모델들은, BRCA 돌연변이 및 BRCA 야생형 환자로부터 유래된 것으로, 올라파립-내성 (PD, 진행성 질환)을 나타내었다. 이들 PDX 코호트를 사용해 PARPi 내성 및 획득-내성의 임상적으로 적절한 기전들을 생체내에서 연구하였다.
실시예 2: 무처리 종양에는 세포 증식, DNA 손상 및 RAD51 foci 형성이 검 출가능한 수준으로 존재한다.
HRR의 기능적인 상태를 전술한 PDX 코호트로부터 수득한 포르말린-고정된 파라핀-포매 (FFPE) 종양에서 추가적으로 조사하였다. 종양을 올라파립 반응, 즉 내성 (PD) 대 민감성 (CR/PR/SD)에 따라 임상에서 사용되는 임상 효용비와 비슷한 엔드포인트로서 분류하였다. 구체적으로, 무처리 (비히클) 및 처리 (알라파립) PDX 종양으로부터 유래된 FFPE 샘플의 서브세트에서, 면역형광에 의해 검출되는 γH2AX 또는 핵내 RAD51 foci를 가진 종양 세포의 %를 평가하였다 (도 2A). γH2AX foci는 이중 가닥 DNA 손상 마커로 사용하였고, RAD51 foci는 HRR의 마커로서 사용하였다. 예상한 바와 같이, 올라파립 처리는 모든 종양 세포에서 γH2AX foci 형성을 증가시켰다. 무처리 샘플에는 이미 검출가능한 베이스라인의 DNA 손상 수준으로 존재하였다. RAD51 foci는 내성 모델에서 뚜렷하게 검출되었으며, 올라파립 처리에 따라 증가하였다. 올라파립-민감성 종양의 경우, γH2AX foci 형성에도 불구하고, RAD51 foci는 매우 적거나 또는 검출가능하지 않았다.
이후, geminin 및 γH2AX foci 양성 세포의 %를 평가하였다 (도 2B). Geminin은 세포 주기의 S/G2 기 마커로서, 즉 세포 증식의 마커로서 사용하였다. 모든 그룹들에서 비슷한 수준의 세포 증식이 관찰되었다. 올라파립 처리는 민감성 종양 및 내성 종양 둘다에서 γH2AX foci 형성을 증가시켰다.
geminin 양성 세포에서 RAD51 양성 세포의 %는, 이제 RAD51 스코어로 지칭하며, 이를 무처리 (비히클) 및 처리 (올라파립) PDX 샘플의 샘플 둘다에서 특정하였다 (도 2C). 무처리 샘플 및 처리 샘플 간의 경향성은 비슷하였으며, 따라서 후속적인 연구 및 분석을 전자, 즉 무처리 개체의 샘플에서 수행하였다.
민감성 종양에서 RAD51 foci 형성 감소는 RAD51의 발현 감소 결과가 아니라 (도 2D), RAD51 단백질의 국지화 (즉, 복구할 DNA에 RAD51 탑재) 감소로 인한 것이며, 즉 HRR 경로의 기능부전이 원인이다.
아울러, 이들 데이터는, RAD51 분석을 통해 식별된 핵내 RAD51 foci를 가진 종양 세포의 %가 낮은 것은 PARPi 민감성과 연관되어 있으며, 핵내 RAD51 foci를 가진 종양 세포의 %가 높은 것은 PDX 코호트에서의 PARPi 내성과 연관되어 있음을, 보여준다.
실시예 3: PDX 모델 71종으로 구성된 다기관 패널에서 낮은 수준의 핵내 RAD51 foci 형성은 PARPi-민감성 PDX 종양을 식별한다.
VHIO의 PDX (n=44, 도 1)와 XenTech의 PDX (n=27)로 구성된 다기관 패널을 이용해, RAD51 분석을 개발하고, 전임상으로 검증하였다. Geminin 양성 세포에서 γH2AX foci 양성 세포의 %를 평가하였다 (도 3A). 그 결과, PARPi 반응과 무관하게, 모든 종양들에서 DNA 손상이 발생하였다. 그러나, γH2AX foci 양성 세포 또는 geminin 양성 세포에서는 RAD51 foci 양성 세포의 %가 PARPi 반응성과 연관성이 존재하였다 (도 3B-D). 실제, PARPi 민감성 PDX로부터 유래된 종양들 모두, PARPi 내성 PDX와 비교해, geminin 양성 세포 중 RAD51 foci 양성 세포인 %가 더 낮았다. PARPi 민감성을 나타내는 대부분의 샘플이 BRCA1 /2 또는 PALB2 유전자에 돌연변이가 존재하였으며 (민감성 모델 17종 중 돌연변이된 것 n=12), 7종에서는 BRCA1 foci 형성이 관찰되지 않았다 (도 3D). 이러한 결과는, 특히, 비-배타적으로, DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질에 일부 타입의 결함이 존재하는 종양에서, 기능성 HRR 및 PARPi 반응의 예측 바이오마커로서의 RAD51 분석의 잠재성을 뒷받침해준다.
실시예 4: RAD51 foci 형성 평가는 PARPi 반응과 밀접하게 연관되어 있다.
RAD51 스코어가 PARPi 반응과 연관성이 있음을 추가로 검증하기 위해, 도 3C의 결과를 수신자 조작 특징 (ROC) 곡선으로 분석하였다 (도 4A 및 B). 본 PDX 코호트에서, 그 결과, RAD51 스코어가 PARPi 처리에 대한 민감성 대 내성인 종양을 100% 민감도 및 100% 특이도로 식별하는 것으로, 확인되었다.
실시예 5: RAD51 스코어는 무처리 임상 샘플에서 PARPi 반응을 예측한다.
또한, PARPi 민감도 대 내성 종양을 가진 환자를 식별하는 RAD51 스코어의 정확성을 임상적으로 검증하였다. gBRCA1 또는 gBRCA2 BrC 또는 HGSOC 환자의, 피부, 간, 복막 및 림프절 전이 등의 샘플로부터 수득한 데이터 결과. 일차성 PARPi-내성인 환자 2명, PARPi-민감성 환자 4명, 및 PARPi 진행성 (progression) 환자 3명의 데이터를 도시한다 (도 5A). 이들 결과는, 핵내 RAD51 foci가 존재하는 세포의 % 결정이 PARPi 반응과 정확하게 연관성이 있다는 것을, 보여주며, 이는 임상에서의 이의 잠재성을 뒷받침해준다.
다음으로, gBRCA 돌연변이가 없는 환자 총 21명으로부터 유래한 샘플 24종에서의 임상 검증으로 확대하였다 (도 5B). PALB2가 HRR에 필수적인 것으로 잘 알려져 있어, 본 발명자들은 PALB2 (gPALB2)에 생식계열 돌연변이를 가지고 있는 환자로부터 수득한 종양 12종으로 환자 코호트를 강화하였다. 종양 샘플 24종 중, gPALB2 종양 샘플 12종 모두를 포함한, 15건에서 낮은 RAD51 양성도 (≤6%)가 관찰되었다. 흥미롭게도, gPALB2 돌연변이 결핍된 RAD51 수준이 낮은 종양 3종에서는 면역형광 분석에 의해 핵내 BRCA1 foci가 결핍된 것으로 관찰되었으며, 이는 BRCA1 프로모터 과메틸화가 HRR-결핍의 원인일 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 이들 결과는, RAD51 분석으로 BRCA-관련 암 이외의 PARPi 요법이 유용할 수 있는 HRR-결함 종양을 식별할 수 있다는 것을, 검증해준다.
마지막으로, 본 발명자들은, 치료-무경험 원발성 유방암 종양 10종 (즉, 항암 치료를 받은 적 없는 환자로부터 유래) 및 초기/전이성 세팅에서 이전 치료를 받은 환자의 종양 10종을 비롯한 gBRCA 종양 샘플 20건 (n=10 BRCA1 및 n=10 BRCA2 돌연변이)에서, RAD51 foci (도 5C) 및 γH2AX foci (도 5D) 형성을 측정하였다. 특히, 치료-무경험 원발성 유방암 등의 모든 종양들에서 내인성 손상이 검출되었다. 또한, RAD51/geminin 양성도는 치료 음성 샘플에서 0-58% 범위였으며, 이는 화학요법을 받은 적 있는 환자의 종양에서와 비슷하였다. 즉, 본 검사는 민감도가 높으며, 치료-무경험 샘플에서 RAD51 foci를 검출할 가능성을 검증해주며, 즉 진단시 HRR 회복이 존재할 수 있다는 것을 시사해준다.
실시예 6: RAD51 스코어는 비-재발성 g BRCA -돌연변이 유방암 환자에 비해 재발성 질환에서 더 높다.
본 발명자들은, 장기간 질환 결과를 예측하기 위해 RAD51 스코어의 잠재적인 예측 가치를 조사하였다. 이를 위해, gBRCA-돌연변이된 BrC 환자 19명으로 구성된 후향적 코호트로부터 유래된 무처리 원발성 종양에서 RAD51 분석을 수행하였다. 환자의 임상 정보는 표 1에 나타낸다.
환자 생식계열 BRCA 1/2 종양 서브타입 TNM 병기 질병 재발 항암 요법
NeoAdj CTx 수술 Adj CTx
BrC-001 1 TNBC T3N1M0 O PTX+CB->AC O
BrC-002 1 TNBC T4N2M0 O O TC
BrC-003 2 lum T2N1M0 O O AC->PTX
BrC-004 1 TNBC T2N0M0 O ERI O AC
BrC-005 2 lumB T2N0M0 O AC->PTX O
BrC-006 1 TNBC T2N1M0 O AC->DTX O
BrC-007 2 TNBC T2N1M0 O O TAC
BrC-008 1 TNBC T2N0M0 O O EC->PTX
BrC-009 1 TNBC T2N0M0 O O DTX
BrC-010 2 lum T2N1M0 O O ET->CPC
BrC-011 2 lumB T2N1M0 X O TAC
BrC-012 2 lumB T1N2M0 X O unk (표준)
BrC-013 1 lumB T3N1M0 X L-DOX+CP->PTX O
BrC-014 1 TNBC T2N1M0 X O AC->PTX
BrC-015 1 TNBC T2N1M0 X O unk (표준)
BrC-016 2 lumA T3N2M0 X O AC->DTX
BrC-017 2 lumB T1N1M0 X O AC->PTX
BrC-018 1 TNBC T3N1M0 X AC->PTX O
BrC-019 1 lumB T3N0M0 X O AC->PTX
표 1: 환자 코호트에 대한 BRCA 상태, 종양 서브타입, TNM 병기, 질환 재발 및 항암 요법을 요약한 본 실시예에서 분석한 환자의 임상 정보. 종양 서브타입: lumA, luminal A; lumB, luminal B; lum, luminal (불특정). 치료 타입: PTX, 파클리탁셀; CP, 사이클로포스파미드; AC, 독소루비신+CP; L-DOX, 리포솜 독소루비신; CB, 카보플라틴; DTX, 도세탁셀; ERI, 에리불린; ET, 에피루비신 +DTX; CPC, 카페시타빈; TC, DTX+CP; TAC, DTX+독소루비신+CP; unk, 임상 기록에서 정보 미입수로 인한 미정의 표준 화학요법.
환자들 모두 유방 종양에 대한 근치 수술과 표준 화학요법을 신보강제 또는 보강제 세팅으로 시술받았다. (추적 ≥5년) 재발되지 않은 환자들은 모두 RAD51 스코어가 낮았다. 이와는 대조적으로, 질환 예후가 좋지 않은, 즉 재발 환자의 종양에서는 RAD51 foci 형성 수준이 더 높았다 (도 6A). 재발 그룹과 비-재발 그룹은 고전적인 예후 인자에 대해서는 균형을 유지하였지만, RAD51 스코어에 의해 민감도 100% 및 특이도 80%로 구분되었다 (도 6B). 즉, RAD51 분석은 표준 항암 요법 후 임상 반응을 예측한다.
실시예 7: RAD51 스코어는 HRR 변형이 존재하는 전립선암의 서브세트를 식별한다.
전립선암 (Pr) 및 전이를 대상으로 RAD51 분석을 성공적으로 수행하였다 도 7). BRCA2에 게놈 또는 체세포 변형을 가진 샘플 3종에서는 RAD51 foci가 낮은 수준으로 검출되었다. 특히, gBRCA2-돌연변이 환자로부터 유래되는 샘플 PrC-021을, 표준적인 화학요법 카보플라틴에 대한 내성 발생 후 수득하였다. 이 샘플에서 높은 RAD51 foci 수준은, 이러한 DNA 손상 약물에 장기간 (특히 7개월) 노출로 인한 것일 수 있는 HRR 결함의 복귀를 시사한다. 다른 BRCA 야생형 샘플 4종도 높은 RAD51 스코어를 나타내었다. 즉, RAD51 스코어는 HRR 풍부 및 결핍을 토대로 전립선암을 분류한다. 이러한 데이터는, RAD51 스코어 낮은 전립선암 환자에서 PARPi의 사용을 뒷받침해준다.
실시예 8: RAD51 양성도 대한 최적의 컷- 오프는 geminin -양성 세포에서 핵 내 foci 개수를 토대로 한다.
전술한 결과들 모두 geminin-양성 세포 당 RAD51 foci 개수 5개 이상을 RAD51 양성도 컷-오프로 간주하여, 수득한 것이다. 이 파라미터는 도 8A-B에 나타낸 바와 같이, 대표적인 PDX 9종 (PARPi-내성 모델 6종 및 PARPi-민감성 모델 3종)에서 RAD51 foci 절대값을 심층 분석하여 수득한 것이다. 정량 분석을 통해, HRR-결핍 종양에서, 대부분의 geminin-양성 세포에는 RAD51 foci가 0개인 반면, HRR-풍부 세포에서는 RAD51 foci 개수가 2봉형으로 분포하는 것으로 나타났으며, 최고 피크는 세포 당 foci 5개였다 (도 8C). PARPi 반응 예측과 관련하여, 본 발명자들은 무처리 샘플에서 여러가지 역치 사용의 영향을 분석하였으며, 세포 당 foci 1-5개의 컷오프가 가장 정확하고 특이적인 예측을 제공함을 확인하였다 (도 8D-E). 요컨대, 최대 (즉, 가장 엄격) 수준으로는 컷오프로서 5개 foci/세포를 사용하기로 결정하였으며, 분석한 샘플들에서 여전히 높은 정확도 역치가 유지되었다.
실시예 9: RAD51 분석은 다른 시판 anti- RAD51 항체 및 다른 면역-기반의 분석을 이용해 재현가능하다.
본 발명자들은, 비히클- 및 PARPi-처리 종양 PDX에서 RAD51에 대한 다른 시판 항체를 사용해 RAD51 스코어를 결정하여, 이전의 결과를 검증하였다 (도 9A). RAD51 풍부/결핍 세포주 (도 9B) 및 대표적인 PDX (도 9C)에서, 3차 anti-RAD51 검사 항체를 사용하여 비슷한 결과를 관찰하였다. 또한, 본 발명자들은 RAD51 스코어를 정량하기 위한 면역조직화학 분석을 개발하였으며, 기존에 사용된 면역형광 분석과 비슷한 결과가 수득되었다(도 9B-C).
실시예 10: RAD51 분석은 복수의 종양 타입들에서 실행가능하다 .
지금까지, 본 발명자들은, RAD51 분석이 다양한 유방암 서브타입, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 피부, 림프절 및 골수 등의 전이 부위에서 잘 작동하다는 증거를 제시하였다 (도 1-7). 마지막으로, 본 발명자들은 소아 신경모세포종, 뇌 및 간 전이 등의 다른 종양 타입에서 RAD51 분석의 성능도 조사하였다. 실제, 본 발명자들은 다양한 종앙 타입들에서 RAD51 foci 양성 샘플과 RAD51 foci 음성 샘플을 검출하였으며, 이는 RAD51 분석을 다양한 종양들에서 확대 사용가능하다는 것을 시사해준다.
요컨대, 이들 결과는, RAD51 스코어가 별개의 종양 타입들에서 HRR 기능성 및 항암 요법에 대한 반응을 표시하는 확실하고 매우 정확한 바이오마커임을, 입증해준다.

Claims (38)

  1. 암으로 진단된 개체의 항암 치료에 대한 반응을 예측하는 방법으로서,
    i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계; 및
    ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈 (navelbine)/에피루비신 (epirubicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않으며, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮은 것은, 상기 개체가 항암 치료에 반응할 것으로 예측된다는 것을 의미하거나, 또는
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 높은 것은, 상기 개체가 항암 치료에 반응하지 않을 것으로 예측된다는 것을 의미하며,
    상기 항암 치료가 암 세포의 DNA 손상 반응을 표적으로 하는 물질 또는 물질들의 조합 및/또는 DNA 손상을 유발하는 하나 이상의 방법의 사용을 포함하는, 방법.
  2. 암으로 진단된 개체에 대해 맞춤형 요법 (customized therapy)을 선택하는 방법으로서,
    i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계; 및
    ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않으며, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮은 것은, 선택할 요법이 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하는 것을 의미하거나, 또는
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 높은 것은, 선택할 요법이 DNA 손상 반응에 결함이 있는 종양을 치료하는데 특이적인 물질을 포함하지 않는 것을 의미하며,
    상기 요법이 암 세포의 DNA 손상 반응을 표적으로 하는 물질 또는 물질들의 조합 및/또는 DNA 손상을 유발하는 하나 이상의 방법의 사용을 포함하는, 방법.
  3. 암으로 진단된 개체를 환자 코호트로 분류하는 방법으로서,
    i) 상기 개체로부터 분리된 종양 세포를 함유한 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계; 및
    ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 개체는, 샘플을 분리하기 24시간 전, AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않으며, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 상기 기준값보다 낮다면, 환자는 항암 치료에 반응성으로 특정되는 코호트로 분류되거나, 또는
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 상기 기준값보다 높다면, 환자는 항암 치료에 비-반응성으로 특정되는 코호트로 분류되며,
    상기 항암 치료가 암 세포의 DNA 손상 반응을 표적으로 하는 물질 또는 물질들의 조합 및/또는 DNA 손상을 유발하는 하나 이상의 방법의 사용을 포함하는, 방법.
  4. 암으로 진단된 개체로부터 유래된 종양의 상동적인 재조합에 의한 DNA 복구 가능성을 예측하는 방법으로서,
    i) 종양 샘플에서 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하는 단계; 및
    ii) 단계 i)에서 수득한 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 종양은 종양 분리 24시간 전에 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법을 받지 않은 개체로부터 분리된 것이고, 상기 샘플은 RAD51 foci를 가진 세포의 수준을 확인하기 전에 DNA 손상을 유도하는 방법으로 처리된 바 없으며,
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값보다 낮은 것은, 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구될 수 있음을 의미하거나, 또는
    - RAD51 foci를 가진 세포의 수준이 기준값과 동일하거나 또는 보다 높은 것은, 종양이 상동적인 재조합에 의해 DNA 복구 가능하지 않다는 것을 의미하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플내 RAD51 foci를 가진 세포의 수준은,
    - 샘플에서 종양 세포의 수,
    - 샘플에서 증식 중인 세포의 수,
    - 샘플에서 DNA 손상을 나타내는 세포의 수, 및
    - 샘플에서 DNA 손상을 나타내는 증식 중인 세포의 수 측면에서, RAD51 foci를 가진 세포의 상대적인 수준으로서 결정되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 DNA 손상이 이중 가닥 DNA 절단인, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 샘플에서 증식 중인 세포의 수는 Geminin, KI-67, 증식성 세포 핵 항원 (Proliferating cell nuclear antigen), Cyclin A2로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 발현을 확인함으로써 결정되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    선택되는 단백질이 Geminin인, 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    샘플에서 이중 가닥 DNA 절단을 나타내는 세포의 수는 γH2AX, 복제 단백질 A (pRPA), p53 결합 단백질 1 (53BP1), 이중 가닥 절단 복구 단백질 (MRE11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 핵내 발현에 의해 결정되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    선택되는 단백질이 γH2AX인, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액, 타액, 뇌척수액, 뇨, 변, 골수, 유두 흡인물 또는 고형 종양 생검으로부터 분리되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 고정된 조직, 파라핀 포매 조직, 조직학적 슬라이드 (histological slide), 세포 현탁물, 세포 펠렛, 세포 슬라이드 (cell slide) 및/또는 고형 종양의 냉동 생검으로서 제공되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    RAD51 foci의 확인, 증식 세포의 마커 확인 및/또는 이중 가닥 DNA 절단을 나타내는 세포 마커의 확인이 면역형광 또는 면역조직화학에 의해 결정되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 손상 반응을 표적으로 하는 물질이 PARP 저해제인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 손상 반응을 표적으로 하는 물질이 화학요법 및 방사선요법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 세포는 세포의 DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능 감소 (loss of function)를 특징으로 하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    DNA 손상 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질이 BRCA1, BRCA2 및/또는 PALB2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에서 진단된 암이 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 결장직장암, 위암 (stomach/gastric cancer), 자궁내막암/자궁암/자궁경부암, 방광암, 두경부암, 육종, 담관암, 교모세포종, 백혈병, 다발성 골수종, 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 분리되는 개체는 샘플 분리하기 전에 어떠한 항암 치료도 받지 않은 개체인, 방법.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 분리되는 개체는 샘플 분리 전 항암 치료를 받은 적이 있으며,
    환자가 샘플 분리하기 24시간 전에 항암 치료를 받았다면, 항암 치료는 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법과는 다른 항암 치료인, 방법.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 분리되는 개체는 샘플 분리 전 항암 치료를 받은 적이 있으며,
    환자가 샘플 분리하기 24시간 전에 항암 치료를 받았다면, 항암 치료는 AC, FEC, ECF 및 나벨빈/에피루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법과는 다른 항암 치료이고,
    상기 항암 치료는, 제1항에 따른 방법에서 그에 따른 반응이 결정되는 항암 치료인, 방법.
  22. 개체에서 암 치료에 사용하기 위한 의약(medicament)으로서, 상기 개체는 제1항에 따른 방법에 의해 개체가 상기 의약에 대해 반응자로서 동정된, 의약.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 의약이 PARP 저해제 물질을 포함하는, 의약.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 PARP 저해제 물질이 올라파립 (olaparib), 벨리파립 (veliparib), 탈라조파립 (talazoparib), 루카파립 (rucaparib), 니라파립 (niraparib), CEP-8983, E7016 및 BGB-290로 이루어진 군으로부터 선택되는, 의약.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료가, 상기 의약의 투여와 더불어, 수술, 면역요법, 화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 개체가 제1항에 따른 방법에 의해 상기 의약에 대해 반응자로서 동정된, 의약.
  26. 개체에서 암 치료 방법에 사용하기 위한 의약으로서, 상기 치료는 제2항에 따른 방법에 의해 선택된 것인, 의약.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 의약이 PARP 저해제 물질을 포함하는, 의약.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 PARP 저해제 물질이 올라파립 (olaparib), 벨리파립 (veliparib), 탈라조파립 (talazoparib), 루카파립 (rucaparib), 니라파립 (niraparib), CEP-8983, E7016 및 BGB-290로 이루어진 군으로부터 선택되는, 의약.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료가, 상기 의약의 투여와 더불어, 수술, 면역요법, 화학요법, 방사선요법 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 치료가 제2항에 따른 방법에 의해 설계된, 의약.
  30. RAD51 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 포함하는 키트로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한, 키트.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 키트가 Geminin 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체 및 γH2AX 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 키트.
  32. 삭제
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