ES2975444T3 - Métodos basados en la detección de focos de RAD51 en células tumorales - Google Patents

Métodos basados en la detección de focos de RAD51 en células tumorales Download PDF

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Abstract

La invención proporciona un método que permite determinar si un sujeto diagnosticado con cáncer es sensible o resistente a un tratamiento anticancerígeno, basándose en el nivel de células con focos RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no tiene recibido 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no ha sido tratada con un método que induzca daño al ADN antes de determinar el nivel de células con focos RAD51. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos basados en la detección de focos de RAD51 en células tumorales
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para predecir y monitorizar la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno, para seleccionar una terapia personalizada para el sujeto, para clasificar al sujeto en una cohorte de pacientes y para predecir si el tumor del sujeto es capaz de reparar el ADN por la ruta de reparación por recombinación homóloga (h Rr ). Dichos métodos se basan en la presencia de focos de RAD51 en una muestra que comprende células tumorales del sujeto, sin la necesidad de exponer la muestra a ningún método que induzca daño en el ADN antes del análisis de la muestra. Se refiere además al uso de kits en dichos métodos, y a medicamentos usados en los tratamientos a los que se hace referencia en los métodos.
Antecedentes de la técnica
Las células están constantemente expuestas a una variedad de condiciones que inducen daño en el ADN, incluido estrés genotóxico del metabolismo celular y el medio ambiente. Puede formarse una gran cantidad de lesiones del ADN que confieren toxicidad y mutagénesis si no se reparan, tales como roturas monocatenarias (SSB) y roturas bicatenarias (DSB) del ADN. Para mantener la integridad del genoma, se repara el ADN usando diferentes rutas de reparación del ADN. En los términos más simples, consisten en ligar los extremos rotos del ADN entre sí para reparar las SSB o usar recombinación de moldes de la cadena de ADN homóloga, respectivamente, para reparar las DSB. Adicionalmente, la red de respuesta al daño en el ADN (DDR) también confiere mecanismos alternativos o de respaldo para la reparación del ADN, lo que dificulta predecir la capacidad de reparación de deficiencias genéticas solas.
La deficiencia en genes de reparación del ADN se ha asociado con una alta susceptibilidad al cáncer. Un caso bien estudiado es la deficiencia en la actividad de las proteínas BRCA. Las proteínas BRCA1 y BRCA2 (BRCA1/2) tienen un importante papel en la reparación de las DSB del ADN por la ruta de HRR. El complejo proteico BRCA1-PALB2-BRCA2 facilita la localización de RAD51 en la DSB del a Dn , formando agregados nucleares de RAD51 (es decir, focos) y mediando en la invasión de la cadena y la reparación homóloga. Por lo tanto, una falta de función de BRCA1 y BRCA2 en células tumorales da como resultado una reparación deficiente de las DSB de ADN mediada por RAD51 que se ha asociado con cáncer de mama heredado genéticamente.
Se han diseñado terapias contra el cáncer para que se dirijan específicamente a células tumorales con tales deficiencias en la DDR, tales como las basadas en inhibidores de PARP (PARPi). La proteína PARP se activa en respuesta a SSB del ADN mediante la detección y unión a las SSB para iniciar la reparación del ADN. PARP activada recluta entonces otras proteínas de reparación del ADN para facilitar la reparación del ADN. La inhibición de PARP provoca un aumento de SSB persistentes en el ADN que se convierten en DSB. Células deficientes en HRR, tales como células que carecen de BRCA1/2, no pueden reparar las DSB acumuladas provocadas por la inhibición de PARP, dando como resultado horquillas de replicación colapsadas, inestabilidad cromosómica y muerte celular. Por lo tanto, se identificaron células mutantes paraBRCA1/2como especialmente sensibles a los inhibidores de PARP. Sin embargo, no todos los pacientes con cáncer caracterizados por mutaciones deBRCA1/2responden a la terapia con PARPi y, por lo tanto, se consideran resistentes a PARPi. Los mecanismos subyacentes a dicha resistencia se han estudiado para mejorar el tratamiento de dichos pacientes y para predecir la respuesta tumoral antes de la administración del tratamiento. Varios documentos, tales como los documentos US2013210779, WO2008066624, US2011288080, US2014357659, US2016296633, WO2010082821 y US2017209594, han descrito el uso de estos compuestos para el tratamiento del cáncer.
Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones de reversión deBRCA1/2,o las denominadas mutaciones secundarias, provocan recuperación de la función de HRR y resistencia a la inhibición de PARP. De manera similar, la pérdida de 53BP1 impulsa la resistencia a PARPi en tumores deficientes en BRCA1. Se ha propuesto un método para identificar tumores con HRR deficiente. Dicho método consiste en analizar la formación de focos nucleares de RAD51 en una biopsia tumoral posterior a la quimioterapia o una muestra tumoral irradiadaex vivo.El documento US2013210779 da a conocer un método alternativo para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno midiendo los niveles de CTSL nuclear y 53BP1 nuclear en al menos una célula tumoral.
Sin embargo, existe la necesidad en la técnica de métodos alternativos y más simples que permitan la diferenciación entre tumores competentes y deficientes en HRR para clasificar a los pacientes con y sin resistencia a terapias contra el cáncer, tales como terapias basadas en PARPi.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia indica que se predice que el sujeto responderá al tratamiento anticancerígeno, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia indica que se predice que el sujeto no responderá al tratamiento anticancerígeno.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para seleccionar una terapia personalizada para un sujeto diagnosticado de cáncer, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia indica que la terapia que va a seleccionarse comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia indica que la terapia que va a seleccionarse no comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para clasificar a un sujeto diagnosticado de cáncer en una cohorte de pacientes, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un paciente se clasifica en una cohorte caracterizada por responder a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el<a>D<n>de las células cancerosas si el nivel de células con focos de RAD51 es menor que dicho valor de referencia, o
- un paciente se clasifica en una cohorte caracterizada por no responder a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas si el nivel de células con focos de RAD51 es mayor que dicho valor de referencia.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método para predecir si un tumor de un sujeto diagnosticado de cáncer es capaz de reparar el ADN mediante reparación por recombinación homóloga:
i) determinando el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra tumoral, en donde el tumor se ha aislado de un sujeto que no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento del tumor, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparando el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia es indicativo de que el tumor es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia es indicativo de que el tumor no es capaz de reparar el ADN por recombinación homóloga mediada.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a un medicamento que comprende al menos un agente que induce directamente daño en el ADN o al menos un agente que se dirige a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, que comprende además identificar al sujeto como que responde a dicho medicamento antes del tratamiento por el método como se define en el primer aspecto de la invención.
En un sexto aspecto, no cubierto por la materia objeto de las reivindicaciones, la divulgación se refiere a un medicamento para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el tratamiento se ha diseñado mediante un método como se define en el segundo aspecto de la invención.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a un uso de un kit en un método mencionado en cualquiera del primer, segundo, tercero o cuarto aspecto de la invención, en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la actividad antitumoral del inhibidor de PARP (PARPi) olaparib en xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDX). En particular, 6 PDX presentan una respuesta completa (CR), 2 PDX una respuesta parcial (PR), 2 PDX una enfermedad estable (SD) y 34 una enfermedad progresiva (PD). El panel analiza 39 modelos de PDX de cáncer de mama (BrC), 3 modelos de PDX de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC u OvC) y 2 PDX derivados de cáncer pancreático (PaC). El gráfico de cascada representa el porcentaje de cambio del volumen tumoral en comparación con el volumen tumoral al inicio del tratamiento. La tabla debajo resume las características de cada modelo de PDX, incluida la presencia o no de una mutación deBRCA1/2de la línea germinal (gBRCA), la presencia o no de una alteración de la reparación por recombinación homóloga (HRR) (de origen genético o epigenético) y el tipo/subtipo de cáncer. Los cuadrados rellenos en negro indican positividad para ese rasgo. Cabe destacar que ni las mutaciones degBRCA1/2ni las alteraciones de HRR predijeron la respuesta al PARPi olaparib. El 20 %, -30 % y -95 % de cambio con respecto al valor inicial se marcan con líneas de puntos para indicar el intervalo de PD, SD, PR y CR, respectivamente. Las barras de error indican el EEM de tumores independientes. gBRCA, gen de BRCA1/2 de la línea germinal mutado; alteraciones de HRR, tumores con alteraciones en genes relacionados con HRR distintos deBRCA1/2,y tumores con hipermetilación del promotor de BRCA1; TNBC, cáncer de mama triple negativo; ER+ BrC, cáncer de mama positivo para receptor de estrógenos; HGSOC u OvC, cáncer de ovario seroso de alto grado; PaC, cáncer pancreático; los modelos de PDX que se vuelven resistentes a olaparib tras el tratamiento prolongado se marcan con el sufijo OR.
La figura 2 muestra que los tumores no tratados tienen niveles detectables de proliferación celular, daño en el ADN y formación de focos de RAD51. (A) Porcentaje de células tumorales que contiene focos nucleares de yH2AX y RAD51 detectados por inmunofluorescencia en un pequeño subconjunto de muestras incrustadas en parafina fijadas con formalina (FFPE) de tumores de PDX no tratados (vehículo) y tratados (olaparib) mostrados en la figura 1. Se cuantificaron focos de yH2AX como marcador de daño en el ADN por DSB, y focos de RAD51 como marcador de HRR funcional. Los tumores se clasifican según su respuesta a olaparib, es decir, tumores resistentes (PD) frente a sensibles (CR/PR/SD), como criterio de valoración similar a la tasa de beneficio clínico usada en la práctica clínica. Como se esperaba, olaparib induce la formación de focos de yH2AX en ambos grupos. La formación de focos de RAD51 solo se induce significativamente en los modelos de PDX resistentes a olaparib. De manera importante, se detectan niveles basales de focos de yH2AX y RAD51 en tumores tratados con vehículo, lo que respalda la idea de que pueden evaluarse proteínas HRR funcionales en muestras no tratadas. (B) Cuantificación de células positivas para geminina como marcador del ciclo celular S/G2 (indica que las células tumorales están en el ciclo celular de síntesis de ADN) y células positivas para yH2AX en células positivas para geminina en tumores, clasificados según su respuesta a olaparib. Se observan niveles comparables de células positivas para geminina en ambos grupos, oscilando entre el 20 y el 70 % de las células totales. El tratamiento con olaparib aumenta significativamente la formación de focos de yH2AX tanto en tumores sensibles como resistentes. Ni los niveles de geminina ni los focos de yH2AX distinguen tumores sensibles a PARPi de tumores resistentes a PARPi. Como en el panel A, los tumores no tratados presentan niveles marcados de daño en el ADN endógeno (focos de yH2AX). (C) La cuantificación de células positivas para geminina con focos nucleares de RAD51, a partir de ahora también denominada puntuación de RAD51, proporciona una estimación de la proporción de células en la fase S/G2 del ciclo celular con HRR funcional. El porcentaje de células positivas para geminina/focos de RAD51 aumenta significativamente en muestras tratadas con olaparib de modelos de PDX resistentes. Sorprendentemente, los niveles basales de células positivas para geminina/focos de RAD51 de tumores resistentes están muy por encima del valor basal de tumores sensibles. Por lo tanto, se realizan análisis posteriores en tumores no tratados. (D) Niveles de expresión de ARNm de RAD51 en muestras tumorales de PDX resistentes y sensibles a PARPi no tratadas, medidos por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). La deficiencia en la formación de focos de RAD51 en tumores sensibles a PARPi mostrada en las figuras 2A y 2C no se debe a la falta de expresión de RAD51. Prueba de latpareada: **, <0,01; ***, <0,001; ****, <0,0001.
La figura 3 muestra que la baja formación de focos de RAD51 está asociada con la sensibilidad a PARPi en un panel multicéntrico de 71 modelos de PDX. (A) El porcentaje de células positivas para focos de yH2AX en células positivas para geminina muestra que hay daño en el ADN en todos los tumores independientemente de la respuesta a PARPi. La cuantificación de focos de yH2AX es necesaria para evitar la clasificación errónea de tumores de RAD51 bajo debido a falta de daño en el ADN, en lugar de deficiencia de HRR. (B) El porcentaje de células positivas para focos de RAD51/positivas para focos de yH2AX muestra niveles más bajos en tumores sensibles. (C) Cuantificación de células positivas para geminina/focos de RAD51 (puntuación de RAD51), que muestra que todos los tumores sensibles a PARPi presentan una puntuación baja de RAD51. (D) Tabla que resume las diferentes características de cada modelo de PDX, incluido el tratamiento con PARPi y la dosis (1 para olaparib 100 mg/kg, 2 para olaparib 50 mg/kg, 3 para niraparib 75 mg/kg, 4 para niraparib 50 mg/kg y 5 para veliparib 100 mg/kg), la respuesta a PARPi (negro, CR/PR; gris, SD; y blanco, PD), el tumor de origen, la presencia de mutaciones en los genesBRCA1oBRCA2,la presencia de focos de BRCA1 detectados con un anticuerpo anti-BRCA1 contra la región N-terminal (N-ter) o C-terminal (C-ter) de BRCA1, y la presencia de mutaciones enPALB2.Los cuadrados rellenos en negro indican positividad para ese rasgo. NA, datos no disponibles; TNBC, cáncer de mama triple negativo; ER+ BrC, tumores de mama positivos para receptor de estrógeno; HGSOC u OvC, cáncer de ovario seroso de alto grado; gBRCA,BRCA1/2de línea germinal mutado.
La figura 4 muestra que la puntuación de RAD51 discrimina con precisión los tumores que son resistentes y sensibles a inhibidores de PARP. (A) Gráfico de puntos que representa las puntuaciones mostradas en la figura 3C. Los tumores resistentes a PARPi presentan un nivel significativamente mayor de células positivas para geminina/focos de RAD51 que los tumores sensibles a PARPi. La línea de puntos representa el punto de corte (13 %) que discrimina tumores que son resistentes o sensibles a PARPi, basándose en la razón de probabilidades que maximiza la sensibilidad y especificidad en la curva de características operativas del receptor (ROC). Cabe destacar que los dos modelos de PDX (es decir, PDX124 y PDX384) con niveles más altos de focos de RAD51 en el grupo sensible mostraron una SD a PARPi. **** p<0,0001, prueba de la t. (B) Curva ROC que representa la sensibilidad frente a la especificidad, y medidas de rendimiento (inserto) de la puntuación de RAD51 para predecir la respuesta a PARPi, basándose en valores tumorales derivados de PDX individuales. PPV, valor predictivo positivo; NPV, valor predictivo negativo.
La figura 5 muestra la validación clínica del ensayo de RAD51 en una cohorte de pacientes con cáncer de mama. (A) El nivel de formación de focos de RAD51 en células positivas para geminina discrimina a pacientes cuyos tumores eran sensibles a olaparib de aquellos que eran resistentes. Los datos incluyen muestras de dos pacientes (Pt) con resistencia primaria a PARPi (una muestra de metástasis cutánea de un paciente con BrCgBRCAI,y otra muestra de una metástasis de ganglios linfáticos de un paciente con BrCgBRCA2)y cuatro pacientes sensibles a PARPi (una muestra de una metástasis hepática de Pt310pre con BrCgBRCA2,una muestra de una mastectomía de Pt124pre con BrCgBRCAI,una muestra de metástasis de ganglios linfáticos de un paciente con BrCgBRCAIy otra muestra de un implante peritoneal de un paciente con HGSOCgBRCAI).Para la resistencia adquirida, los datos incluyen muestras obtenidas de tres pacientes en la progresión de PARPi (una muestra de una metástasis hepática de Pt310post con BrCgBRCA2,otra muestra de una metástasis cutánea de un paciente con BrCgBRCAIy una última muestra de una metástasis cutánea de un paciente con BrCgBRCA2).Prueba de la t no pareada: ***, <0,001. (B) positividad para geminina/focos de RAD51 en muestras de tumores FFPE de pacientes con cáncer de mama o de ovario hereditario. El recuadro inferior resume las diferentes características de cada paciente y la presencia o ausencia de focos nucleares de BRCA1 en los tumores analizados. Cabe destacar que tumores de pacientes conPALB2mutado y tumores sin focos de BRCA1 mostraron puntuaciones bajas de RAD51, respaldando el valor predictivo de RAD51 en la identificación de alteraciones funcionales de HRR en muestras clínicas. F<h>, antecedentes familiares; *, tumores con una mutación patógena en el genPALB2.(C) y (D) Cuantificación de la formación de focos de RAD51 y yH2AX en muestras tumorales de pacientes “sin tratamiento previo”, (es decir, en pacientes que nunca han recibido un tratamiento anticancerígeno) y en muestras tumorales “con tratamiento previo”. Diez tumores de mama primarios “sin tratamiento previo” de pacientes congBRCA1/2,o bien de la biopsia de diagnóstico (n = 6) o bien del tumor quirúrgico (n = 4), se puntuaron para los focos de RAD51 y yH2AX. Diez tumores de mama primarios o metastásicos “con tratamiento previo” de pacientes congBRCA1/2,o bien de su muestra quirúrgica después de haber recibido terapia neoadyuvante, incluido un agente que daña el ADN (n = 3) o bien del entorno metastásico (n = 7), se puntuaron para los focos de RAD51 y yH2AX. En total, se analizaron 10 tumores conBRCA1más 10 tumores conBRCA2mutados. Estos datos confirman que RAD51 es evaluable en muestras tumorales sin tratamiento previo, así como en muestras de pacientes que han recibido quimioterapia.
La figura 6 muestra que la puntuación de RAD51 es mayor en pacientes con recaída de la enfermedad que en los que no recaen, en una cohorte retrospectiva de pacientes con cáncer de mama congBRCAmutado (n=19). Todos los pacientes recibieron cirugía radical de tumores primarios y quimioterapia convencional (CTx), o bien en el entorno neoadyuvante (NeoAdj) o bien adyuvante (Adj). El ensayo de RAD51 se realizó en biopsias de diagnóstico o muestras quirúrgicas de tumores sin tratamiento previo. Los grupos con recaída y sin recaída se equilibraron para factores de pronóstico clásicos. (A) Gráfico de puntos que muestra la puntuación de RAD51 en pacientes estratificados por la aparición o no de recaída de la enfermedad. Los tumores de pacientes con un buen desenlace de la enfermedad (es decir, sin recaída después de > 5 años de seguimiento) tenían bajos niveles de focos de RAD51, es decir, puntuación de RAD51 por debajo del 3,7 % (línea de puntos). Los pacientes con un mal desenlace de la enfermedad (es decir, recaída) mostraron niveles variables, siendo el paciente con una recaída más temprana (11 meses después del diagnóstico) el que mostraba la puntuación de RAD51 más alta (53 % de células positivas para geminina/focos de RAD51). La línea de puntos representa el punto de corte que discrimina los tumores de pacientes que recayeron o no, basándose en la razón de probabilidades que maximiza la sensibilidad y especificidad en la curva de características operativas del receptor (ROC). *, p=0,026, prueba de lat.(B) Curva ROC de la sensibilidad frente a la especificidad y medidas de rendimiento (inserto) de la puntuación de RAD51 para predecir el desenlace de la enfermedad. PPV, valor predictivo positivo; NPV, valor predictivo negativo.
La figura 7 muestra la puntuación de RAD51 en muestras de pacientes con cáncer de próstata (n = 8). El ensayo de RAD51 se realizó con éxito en prostatectomías primarias (n = 3) y tejidos metastásicos (n = 5), incluidas biopsias metastásicas de hígado, médula ósea y ganglios linfáticos. Tres muestras (PrC-003, PrC-004 y PrC-017) muestran bajos niveles de focos de RAD51, en asociación con alteraciones genómicas enBRCA2(dos tumores conBRCA2de línea germinal mutado -gBRCA2- y una pérdida somática deBRCA2-sBRCA2-). Cabe destacar que la muestra PrC-021 (*), derivada de un paciente con gBRCA2 mutado, se obtuvo después de desarrollar resistencia a carboplatino (siete meses después del tratamiento). Los altos niveles de focos de RAD51 en esta muestra sugieren la reversión de la deficiencia de HRR que probablemente resultó de una larga exposición a este fármaco que daña el ADN. Por lo tanto, la puntuación de RAD51 estratifica los tumores de próstata basándose en la competencia (n = 5) y deficiencia (n = 3) de HRR en la práctica clínica.
La figura 8 muestra cómo se estableció el punto de corte óptimo para la positividad de RAD51 basándose en el número de focos nucleares en células positivas para geminina. Gráficos de dispersión que muestran el número de focos de RAD51 en células positivas para geminina individuales (se cuantificaron 100 células para cada modelo) en (A) muestras tratadas con vehículo o (B) olaparib de nueve modelos de PDX representativos: seis resistentes a PARPi (PDX098, PDX060, PDX094, PDX044, PDX102 y PDX270) y tres sensibles a PARPi (PDX197, STG201 y PDX302). La línea discontinua indica el punto de corte de 5 focos de RAD51 por núcleo. (C) Histograma que revela que, en tumores sensibles a PARPi, el 96-100 % de las células positivas para geminina presentan cero focos de RAD51. En su lugar, las células tumorales resistentes a PARPi presentan una distribución bimodal de las frecuencias de focos de RAD51 por célula positiva para geminina, presentando el 35-75 % de las células positivas para geminina cero focos de RAD51 y el segundo pico de frecuencia más alto encontrado a 5 focos de RAD51 por célula positiva para geminina. En este sentido, el análisis de precisión y especificidad usando números crecientes de focos de RAD51 por célula positiva para geminina en muestras no tratadas demuestra que el punto de corte de 5 focos por célula es el mayor umbral de focos de RAD51 por célula positiva para geminina que proporciona la predicción más precisa y específica: (D) Gráficos de bosque y análisis de la razón de probabilidades (OR) y (E) precisión y especificidad de la puntuación de RAD51 usando diferentes puntos de corte de 1 a 10 focos por núcleo. Estos datos demuestran que varios puntos de corte proporcionan resultados precisos y la elección de 5 focos por núcleo (el punto de corte usado para generar todos los datos presentados en el presente documento) es la más alta (es decir, más rigurosa) y todavía altamente precisa.
La figura 9 muestra la validación de dos anticuerpos anti-RAD51 comerciales adicionales y el desarrollo del ensayo de RAD51 por inmunohistoquímica. (A) Cuantificación de la puntuación de RAD51 con dos anticuerpos comerciales diferentes contra RAD51 (Santa Cruz Biotechnology 8349 y Abcam 133534) en PDX tratados con vehículo y olaparib. El análisis de correlación de Spearman de las cuantificaciones de focos de RAD51 con los dos anticuerpos diferentes demuestra la reproducibilidad del ensayo de RAD51. (B-C) Imágenes representativas que muestran la validación de un tercer anticuerpo anti-RAD51 (Cell Signalling Technology, CST 8875) tanto por ensayo de inmunofluorescencia (imágenes superiores) como por ensayo de inmunohistoquímica (imágenes inferiores). Se muestran imágenes de (B) líneas celulares HeLa (expuestas a control de ARNip - izquierda- o ARNip de RAD51 para atenuar su expresión -derecha-) y (C) PDX no tratados con alta, moderada (mod) y baja formación de focos de RAD51. Estos resultados demuestran resultados comparables tanto con ensayos de IF como de IHC.
La figura 10 muestra la viabilidad del ensayo de RAD51 a través de tipos de tumores. Se muestran imágenes representativas de muestras humanas teñidas de (A) cáncer de mama, cáncer de ovario y metástasis cerebrales, así como de (B) cáncer de próstata, cáncer pancreático, neuroblastoma pediátrico y metástasis hepática. Las muestras tumorales se tiñeron con (A) anticuerpo anti-RAD51 de Cell Signalling Technology (CST 8875, en verde) y geminina (rojo), o (B) anticuerpo anti-RAD51 de Abcam (ab-133534, en rojo) y geminina (verde). Además, se usó DAPI (azul) como contratinción nuclear. Estas imágenes muestran que el ensayo de RAD51 puede realizarse en diferentes tipos de tumores y puede identificar la presencia o ausencia de focos de RAD51 en una variedad de tejidos.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han descubierto que la determinación del nivel de células con focos nucleares RAD51 en una muestra con células tumorales aisladas de un sujeto diagnosticado de cáncer está relacionada con la respuesta del sujeto a un tratamiento anticancerígeno en donde las células de la muestra no se han expuesto a un método que induce daño en el ADN antes del análisis del nivel de células con focos nucleares de RAD51. Dicho método puede serex vivo,es decir, después de aislar las células tumorales del sujeto, y consiste en la exposición de la muestra de células a irradiación ionizante. Adicionalmente, los inventores han descubierto que el método también es eficaz en muestras de pacientes no tratados o tratados con una terapia contra el cáncer. La administración de la quimioterapia conduce a la exposición de las células tumorales del sujeto a los compuestos de la quimioterapia, lo que induce daño en el ADN, y el posterior reclutamiento rápido (en minutos) de proteínas implicadas en la reparación del daño en el ADN.
1.Métodos de la invención
A. Método para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia indica que se predice que el sujeto responderá al tratamiento anticancerígeno, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia, indica que se predice que el sujeto no responderá al tratamiento anticancerígeno.
El término “predecir la respuesta” o “predecir que responde”, como se usa en el presente documento, se refiere a las probabilidades por las cuales un paciente puede responder a un tratamiento. Como entenderán los expertos en el campo, y aunque esto no es preferible, la predicción no tiene que ser correcta para el 100 % de los sujetos que pueden diagnosticarse o evaluarse. Sin embargo, la expresión requiere que la predicción proporcione resultados correctos para una porción estadísticamente significativa de los pacientes. La determinación de si la predicción de la invención proporciona resultados estadísticamente significativos puede llevarse a cabo usando técnicas estadísticas convencionales tales como la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney como se describe en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza adecuados son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %. Los valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,001, 0,0005 o menos.
El término “sujeto” o “paciente”, como se usa en el presente documento, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se restringe a, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos; por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o etnia.
El término “diagnosticado”, como se usa en el presente documento, se refiere a la determinación y/o identificación de una enfermedad en un sujeto, es decir, la opinión alcanzada sobre el estado patológico de un sujeto, es decir, la opinión de diagnóstico. Como tal, también puede considerarse como un intento de clasificar a los individuos dependiendo de su estado patológico. Como entenderán los expertos en la técnica, el diagnóstico de cáncer, aunque se prefiere, no es necesario que sea correcto para el 100 % de los sujetos que van a diagnosticarse o evaluarse. El término, sin embargo, requiere que una porción estadísticamente significativa de los sujetos identificados como tales padezcan cáncer. Si un sujeto es estadísticamente significativo puede determinarse sin más por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,01, 0,005 o inferiores.
El término “cáncer” se refiere a un grupo de enfermedades que implican crecimiento y proliferación anómalos, descontrolados (neoplasia) de células que forman uno o más tumores malignos en el sujeto que padece cáncer, con el potencial de invadir o diseminarse (metastatizarse) a otros tejidos, órganos o, en general, partes distantes del organismo; la metástasis es una de las características distintivas de la neoplasia maligna del cáncer y tumores cancerosos. El término “cáncer” incluye, pero no se restringe a, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de estómago/gástrico, cáncer endometrial/uterino/cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, cáncer de corazón, del intestino delgado, bazo, riñón, cerebro, piel, hueso, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos, sistema hepatobiliar e hígado, sarcoma, colangiocarcinoma, glioblastoma, mieloma múltiple, linfoma, adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioma, hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, cáncer hepatobiliar, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma. Además, este término incluye melanoma acrolentiginoso, adenocarcinoma de queratosis actínica, carcinoma quístico adenoide, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, tumores astrocíticos, carcinoma de glándula de Bartolino, carcinoma de células basales, carcinoma de glándula bronquial, carcinoide capilar, carcinoma, carcinosarcoma, cistadenoma, tumor de seno endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, sarcoma ependimario, sarcoma de Ewing, hiperplasia nodular focal, tumores de células germinales, glucagonoma, hemangioblastoma, hemagioendotelioma, hemagioma, adenoma hepático, adenomastosis hepática, carcinoma hepatocelular, cáncer hepatobiliar, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia intraepitelial de células escamosas, carcinoma invasivo de células escamosas, carcinoma de células grandes, leiomiosarcoma, melanoma, melonoma maligno, tumor mesotelial maligno, medulobastoma, meduloepitelioma, carcinoma mucoepidermoide, neuroblastoma, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, osteosarcoma, adenocarcinoma papilar seroso, tumores hipofisarios, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma seroso, carcinoma microcítico, carcinoma de tejidos blandos, tumor secretor de somatostatina, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma indiferenciado, melanoma uveal, carcinoma verrugoso, vipoma, tumor de Wilm, cáncer intracerebral, cáncer rectal, astrocitoma, cáncer microcítico y cáncer no microcítico, melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico independiente de andrógenos, cáncer de próstata metastásico dependiente de andrógenos. El término cáncer incluye tanto tumores primarios como tumores metastásicos.
El término “tratamiento anticancerígeno”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tratamiento que comprende la exposición del sujeto que está tratándose con cualquier método usado para inducir la muerte de células cancerosas. Dicho método no se limita a la administración de agentes químicos, puede consistir en cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia dirigida que incluye inmunoterapia, o una combinación de las mismas.
El término “cirugía”, cuando se refiere a cáncer, se refiere a una cirugía mayor donde al menos parte del tumor primario y/o al menos parte de al menos una metástasis se extirpa.
El término “terapia de radiación”, “radioterapia” o “radiación ionizante” como se usa en el presente documento, se refiere a una terapia que usa radiación ionizante, generalmente como parte del tratamiento del cáncer para controlar o destruir células tumorales y normalmente se administra mediante un acelerador lineal. Rayos gamma, rayos X y la parte ultravioleta superior del espectro electromagnético son radiación ionizante, mientras que la parte inferior del espectro por debajo del UV, incluida la luz visible (incluidos casi todos los tipos de luz láser), infrarrojos, microondas, y las ondas de radio se consideran todas radiación no ionizante. La radioterapia puede ser curativa en varios tipos de cáncer si se localizan en un área del cuerpo. Se aplica radioterapia comúnmente al tumor canceroso debido a su capacidad para controlar el crecimiento celular. La radiación ionizante funciona dañando el ADN del tejido canceroso, lo que conduce a muerte celular.
El término “terapia dirigida” como se usa en el presente documento se refiere a una terapia que bloquea el crecimiento de células cancerosas al interferir con moléculas dirigidas específicas necesarias para la carcinogénesis y el crecimiento tumoral, en lugar de simplemente interferir con todas las células que se dividen rápidamente. Debido a que la mayoría de los agentes para la terapia dirigida son productos biofarmacéuticos, el término terapia biológica a veces es sinónimo de terapia dirigida cuando se usa en el contexto de la terapia contra el cáncer (y, por lo tanto, se distingue de la quimioterapia, es decir, terapia citotóxica). Sin embargo, las modalidades pueden combinarse. Otra forma de terapia dirigida implica el uso de enzimas nanomodificadas para unirse a una célula tumoral de modo que el proceso de degradación celular natural del cuerpo pueda digerir la célula, eliminándola eficazmente del cuerpo. Muchas terapias dirigidas son ejemplos de inmunoterapia.
El término “ inmunoterapia”, como se usa en el presente documento, se refiere a inmunoterapia contra el cáncer que consiste en enfoques que modifican el sistema inmunitario del huésped, y/o a la utilización de componentes del sistema inmunitario como tratamiento anticancerígeno. Los ejemplos no limitativos de inmunoterapia incluyen los inmunoestimulantes no específicos BCG y levamisol; las citocinas interferón-a e interleucina-2; los anticuerpos monoclonales anti-PD1, anti-PDL1, anti-CTLA-4, rituximab, ofatumumab, alemtuzumab, trastuzumab, bevacizumab, cetuximab y panitumumab; los anticuerpos radiomarcados Y-90 ibritumomab tiuxetan e I-131 tositumomab; la inmunotoxina denileucina diftitox y el anticuerpo gemtuzumab ozogamicina; trasplantes alogénicos no mieloablativos con infusiones de linfocitos del donador; y la terapia basada en células contra el cáncer de próstata sipuleucel-T. Otros ejemplos de inmunoterapias tales como vacunas de DC, células CART-t o terapia NK. Algunas inmunoterapias implican la retirada de células inmunitarias de la sangre o de un tumor y las específicas para el tumor se cultivan y se devuelven al paciente donde atacan al tumor; alternativamente, las células inmunitarias pueden modificarse por ingeniería genética para expresar un receptor específico de tumor, cultivarse y devolverse al paciente. Los tipos de células que pueden usarse de esta manera son células citolíticas naturales, células citolíticas activadas por linfocina, células T citotóxicas y células dendríticas.
El término “quimioterapia”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tratamiento que consiste en la administración de uno o varios agentes anticancerígenos, sin limitaciones de estructura química, adecuados para la terapia y/o el tratamiento de un cáncer, solos o en combinación con otros compuestos.
La expresión “AC”, como se usa en el presente documento, se refiere a una quimioterapia que consiste en la combinación de dos fármacos quimioterápicos: adriamicina/doxorubicina y ciclofosfamida.
La expresión “FEC”, como se usa en el presente documento, se refiere a una quimioterapia que consiste en la combinación de tres fármacos quimioterápicos: 5 fluorouracilo (también conocido como 5FU), epirubicina y ciclofosfamida.
La expresión “ECF”, como se usa en el presente documento, se refiere a una quimioterapia que consiste en la combinación de tres fármacos quimioterápicos: epirubicina, cisplatino y fluorouracilo.
Como se usa en el presente documento, un “agente anticancerígeno” es un agente que inhibe al menos parcialmente el desarrollo o la progresión de un cáncer, incluyendo inhibir en su totalidad o en parte los síntomas asociados con el cáncer incluso solo a corto plazo. Los agentes anticancerígenos incluyen aquellos usados en cualquiera de las terapias descritas anteriormente que comprenden la administración de un compuesto, es decir, terapia hormonal, terapia dirigida, inmunoterapia, quimioterapia.
Varios ejemplos de agentes anticancerígenos incluyen, sin limitación, acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; bortezomib (VELCADE); brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetímero; carboplatino (un régimen que contiene platino); carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino (un régimen que contiene platino); cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; daunorubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; diaziquona; docetaxel (TAXOTERE); doxorubicina; doxorubicina liposomal pegilada; droloxifeno; dromostanolona; duazomicina; edatrexato; eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; epirubicina; erbulozol; erlotinib (TARCEVA), esorubicina; estramustina; etanidazol; etopósido; etoprina; fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina; 5-fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina; gefitinib (IRESSA), gemcitabina; hidroxiurea; idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; mesilato de imatinib (GLEEVEC); interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; interferón alfa-n3; interferón beta-Ia; interferón gamma-Ib; iproplatino; irinotecán; lanreotida; lenalidomida (REVLLMID, REVIMID); letrozol; leuprolida; liarozol; lometrexol; lomustina; losoxantrona; masoprocol; maitansina; mecloretamina; megestrol; melengestrol; melfalán; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pemetrexed (ALIMTA), pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; pentomona; peplomicina; perfosfamida; pipobromán; piposulfán; isetionato de piritrexim; piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero; porfiromicina; prednimustina; procarbazina; puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; semustina; simtrazeno; sitoglusida; esparfosato; esparsomicina; espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tamsulosina; taxol; taxotere; tecogalán; tegafur; telexantrona; temoporfina; temozolomida (TEMODAR); tenipósido; teroxirona; testolactona; talidomida (THALOMID) y derivados de la misma; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; topotecán; toremifeno; trestolona; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tubulozol; uracilo; mostaza; uredepa; vapreotida; verteporfina; vinblastina; vincristina; vindesina; vinepidina; vinglicinato; vinleurosina; vinorelbina; vinrosidina; vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; zorubicina.
El agente anticancerígeno también puede ser un inhibidor enzimático que incluye, sin limitación, inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de CDK, un inhibidor de MAP quinasa o un inhibidor de EGFR. El inhibidor de tirosina quinasa puede ser, sin limitación, genisteína (4',5,7-trihidroxiisoflavona), tirfostina 25 (3,4,5-trihidroxifenil),metilen]-propanodinitrilo, herbimicina A, daidzeína (4',7-dihidroxiisoflavona), AG-126, trans-1-(3'-carboxi-4'-hidroxifenil)-2-(2”,5”-dihidroxi-fenil)etano o HDBA ácido (2-hidroxi5-(2,5-dihidroxibencilamino)-2-hidroxibenzoico. El inhibidor de CDK puede ser, sin limitación, p21, p27, p57, p15, p16, p18 o p19. El inhibidor de MAP quinasa puede ser, sin limitación, KY12420 (C23H24O8), CNI-1493, PD98059 o 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1H-imidazol. El inhibidor de EGFR puede ser, sin limitación, erlotinib (TARCeVa ), gefitinib (IRESSA), WHI-P97 (derivado de quinazolina), LFM-A12 (análogo del metabolito de leflunomida), ABX-EGF, lapatinib, canertinib, ZD-6474 (ZACTIMA), AEE788 y AG1458.
Adicionalmente, varios agentes anticancerígenos pueden clasificarse como agentes que dañan el ADN y estos incluyen agentes que inducen directamente daño en el ADN y agentes que inducen indirectamente daño en el ADN al dirigirse a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula dando como resultado un aumento en la cantidad de daño en el ADN en la célula. Los agentes que inducen daño en el ADN directamente pueden ser: agentes alquilantes del ADN (por ejemplo, ciclofosfamida, dacarbazina, procarbazina, carmustina, lomustina, ifosfamida, melfalán, busulfán, tiotepa), agentes similares a alquilantes del ADN (por ejemplo, carboplatino, cisplatino), agentes inductores de roturas de la cadena de ADN (por ejemplo, bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, mitomicina C), agentes antimetabólicos (por ejemplo, citarabina, metotrexato, hidroxiurea, 5-fluorouracilo, floxuridina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, fludarabina, clorodesoxiadenosina), inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, etopósido, ramptotecina, topotecán, tenipósido, mitoxantrona) o epipodofilotoxinas.
Los agentes que se dirigen a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula pueden ser: inhibidores de PARP (PARPi; por ejemplo, olaparib, talazoparib, rucaparib, niraparib, veliparib, CEP-8983, E7016 y BGB-290), agentes antimicrotúbulos (por ejemplo, vincristina, vinblastina) y antraciclinas.
El término “muestra” o “muestra biológica”, como se usa en el presente documento, se refiere a material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica contiene cualquier material biológico adecuado para detectar los marcadores proteicos deseados. La muestra biológica puede comprender material celular y/o no celular del sujeto. La muestra puede aislarse de cualquier tejido o fluido biológico adecuado tal como, por ejemplo, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, médula ósea, un aspirado de pezón, una biopsia de tumor sólido, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), heces, un hisopo bucal o bucal-faríngeo, una muestra quirúrgica, una muestra obtenida de una biopsia y una muestra de tejido incrustada en parafina. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para aislar muestras. En una realización particular, dicha muestra comprende células cancerosas, preferiblemente células de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de estómago/gástrico, cáncer endometrial/uterino/cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, sarcoma, colangiocarcinoma, glioblastoma, mieloma múltiple, linfoma. Más preferiblemente, la muestra comprende células de cáncer de mama, células de cáncer de ovario, células de cáncer de próstata, células de cáncer gástrico o células de cáncer pancreático, incluso más preferiblemente células de cáncer de mama, células de cáncer de ovario o células de cáncer de próstata, aún más preferiblemente células de cáncer de mama. En una realización preferida, es una muestra de tejido tumoral o porción de la misma. Preferiblemente, dicha muestra de tejido tumoral es una muestra de tumor de mama, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor gástrico, tumor pancreático, tumor de pulmón, tumor colorrectal, tumor gástrico/de estómago, tumor endometrial/uterino/cuello uterino, tumor de vejiga, tumor de cabeza y cuello, tumor de sarcoma, tumor de colangiocarcinoma, tumor de glioblastoma, tumor de mieloma múltiple, tejido tumoral de linfoma, o una porción de los mismos. Más preferiblemente, la muestra es una muestra de tejido de tumor de mama, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor gástrico y tumoral pancreático, o una porción de los mismos; incluso más preferiblemente, dicha muestra es una muestra de tejido de tumor de mama, tumor de ovario o tumor de próstata, o una porción de los mismos; aún más preferiblemente dicha muestra de tejido tumoral es una muestra de tejido tumoral de mama, o una porción de la misma.
Dicha muestra puede obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, biopsia, mediante el uso de métodos bien conocidos por los expertos en las técnicas médicas relacionadas. Los métodos para obtener la muestra de la biopsia incluyen el reparto macroscópico de una masa, o microdisección u otros métodos de separación celular conocidos en la técnica. Adicionalmente, pueden obtenerse células tumorales de la citología de aspiración con aguja fina. Con el fin de simplificar la conservación y el manejo de las muestras, pueden ser un tejido fijado, tejido incrustado en parafina, portaobjetos histológicos, suspensión celular, sedimento celular, portaobjetos de células, biopsia de tumor sólido congelado y/o en primer lugar congelado y luego incrustado en un medio criosolidificable, tal como OCT-Compound, a través de inmersión en un medio altamente criogénico que permite una congelación rápida.
La expresión “daño en el ADN” como se usa en el presente documento la conoce bien un experto en el campo. Se refiere a una alteración en la estructura química del ADN, tal como una rotura en una o ambas cadenas de ADN, una base que falta de la estructura principal del ADN o una base químicamente cambiada. Una rotura en una cadena de ADN se conoce como rotura monocatenaria (SSB) y una rotura en ambas cadenas del ADN se conoce como rotura bicatenaria (DSB). El daño en el ADN también puede consistir en una horquilla de replicación estancada. Si no se repara por la maquinaria de respuesta al daño en el ADN de la célula, el daño en el a Dn conduce a la acumulación del daño en el ADN y a alteraciones genómicas funcionales (es decir, inestabilidad genómica). Dicha alteración en el ADN puede proporcionar, por ejemplo, una ventaja selectiva a la célula afectada, de modo que pueda proliferar y sobrevivir continuamente, lo que conduce a la formación de una célula tumoral.
La expresión “respuesta al daño en el ADN”, como se usa en el presente documento, se refiere a rutas celulares que monitorizan y reparan el daño en el ADN para mantener la integridad genómica de la célula. El tipo de respuesta al daño en el ADN depende del tipo de daño en el ADN. En términos generales, depende de si el daño en el ADN consiste en una SSB o en una DSB
La expresión “método que induce daño en el ADN” como se usa en el presente documento se refiere a prácticamente cualquier método convencional que pueda usarse para inducir daño en el ADN en una muestra. Prácticamente puede usarse cualquier método convencional dentro del marco de la invención para inducir daño en el ADN. Por ejemplo, un método bien conocido que induce daño en el ADN es la radiación ionizante, que es un tipo de radiación de alta energía capaz de liberar electrones de átomos y moléculas generando iones que pueden romper enlaces covalentes. La radiación ionizante afecta directamente a la estructura del ADN al inducir roturas del ADN, particularmente, DSB. Otro ejemplo de métodos consiste en exponer las células a estrés oxidativo que induce principalmente DSB, metanosulfonato de metilo que es un agente de alquilación capaz de inducir lesiones del ADN y posteriores SSB y DSB o luz UV que puede inducir SSB y DSB.
El término “RAD51”, como se usa en el presente documento, se refiere a una enzima con un papel importante en la recombinación homóloga del ADN durante la reparación de DSB. La secuencia de la proteína se presenta en UniProt (22 de noviembre de 2017) con el número de registro Q06609.
El término “focos” usado en el presente documento se refiere a acumulaciones locales de proteínas específicas en un sitio de la célula. Cuando se hace referencia a “focos nucleares”, dichos focos se localizan en el núcleo de la célula. Por ejemplo, durante la reparación del daño en el ADN, se forman focos de reparación del ADN por las acumulaciones locales o modificaciones de las proteínas de respuesta al daño en el ADN formadas en los sitios de roturas de la doble cadena del ADN. Los focos pueden visualizar con obtención de imágenes microscópicas después de la inmunotinción o el etiquetado con proteínas fluorescentes.
La expresión “valor de referencia” se refiere a un valor de laboratorio usado como referencia para los valores/datos obtenidos por medio de muestras obtenidas de pacientes. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, una serie de valores, un valor promedio, una mediana, un valor medio o un valor expresado haciendo referencia a un valor de control o de referencia. Un valor de referencia puede basarse en el valor obtenido de un grupo de pacientes considerados representativos, tales como los valores obtenidos en una población de sujetos de un grupo de edad cronológico que coincide con el del paciente objeto del estudio o basado en un conjunto de muestras de inclusión o exclusión de la muestra que va a analizarse. Alternativamente, un valor de referencia puede basarse en una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del paciente objeto del estudio, pero obtenido en un punto anterior en el tiempo.
El valor de referencia de la invención es una referencia para el nivel de células con focos de RAD51 en la muestra analizada. La expresión “nivel de células” como se usa en el presente documento se refiere a un valor absoluto o a un valor relativo usado para determinar la cantidad de células. En una realización preferida, el nivel de células con focos de RAD51 en la muestra se determina como el nivel relativo de células con focos de RAD51 con respecto a:
- el número de células tumorales en la muestra,
- el número de células en la muestra que están proliferando,
- el número de células en la muestra que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias y
- el número de células en la muestra que están proliferando y que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias.
Dicho nivel relativo puede calcularse como una razón o como un porcentaje.
Cuando se calcula el nivel de células con focos de RAD51 con respecto al número de células tumorales en la muestra, el valor de referencia expresado como porcentaje es de al menos el 0,1 %, al menos el 0,25 %, al menos el 0,5 %, al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 11 %, al menos el 12 %, al menos el 13 %, al menos el 14 %, al menos el 15 %, al menos el 16 %, al menos el 17 %, al menos el 18 %, al menos el 19 %, al menos el 20 %, en donde 100 representa la cantidad total de células en la muestra. En una realización preferida, el valor de referencia es de al menos el 0,5 %, más preferiblemente al menos el 1 %, aún más preferiblemente al menos el 2 %, incluso más preferiblemente al menos el 5 %.
Cuando se calcula el nivel de células con focos de RAD51 con respecto al número de células en la muestra que están proliferando, el valor de referencia expresado como porcentaje es de al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 11 %, al menos el 12 %, al menos el 13%, al menos el 14 %, al menos el 15 %, al menos el 16 %, al menos el 17 %, al menos el 18 %, al menos el 19 %, al menos el 20 %, al menos el 21 %, al menos el 22 %, al menos el 23 %, al menos el 24 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, en donde 100 representa la cantidad total de células en la muestra que están proliferando. En una realización preferida, el valor de referencia es de al menos el 1 %, más preferiblemente al menos el 5 %, aún más preferiblemente al menos el 10 %, incluso más preferiblemente al menos el 11 %, incluso más preferiblemente al menos el 20 %.
La expresión “células (...) que están proliferando”, como se usa en el presente documento, se refiere a células en la muestra que están dividiéndose dando lugar a un aumento en el número de células en la muestra. Las células que están proliferando se identifican mediante la determinación de la expresión de proteínas implicadas en la división de células. Ejemplos no limitativos de tales proteínas son: geminina, Ki-67, antígeno nuclear de células en proliferación, ciclina A2.
El término “geminina”, como se usa en el presente documento, es una proteína nuclear que está ausente durante la fase G1 y se acumula a través de la fase S, G2 y fases M del ciclo celular. Los niveles de geminina caen en la transición metafásica/anafásica de la mitosis cuando se degrada por el complejo promotor de la anafase (APC/C).
El término “Ki-67”, “MKI67” o “antígeno KI-67” como se usa en el presente documento se refiere a la proteína nuclear Ki-67 que está presente durante todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y mitosis), pero está ausente en las células en reposo (quiescentes) (G0). El contenido celular de la proteína Ki-67 aumenta notablemente durante la progresión celular a través de la fase S del ciclo celular.
El término “antígeno nuclear de células en proliferación” o “PCNA”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína con dicho nombre, que es una pinza de ADN que actúa como un factor de procesividad para la ADN polimerasa 8 en células eucariotas y es esencial para la replicación. El PCNA es un homotrímero y logra su procesividad rodeando el ADN, donde actúa como armazón para reclutar proteínas implicadas en la replicación del ADN, la reparación del ADN, la remodelación de la cromatina y la epigenética. El PCNA se identificó originalmente como un antígeno que se expresa en los núcleos de las células durante la fase de síntesis de ADN del ciclo celular.
El término “ciclina A2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína ciclina A2 que se expresa en células somáticas en división. Los niveles de ciclina A2 están estrechamente sincronizados con la progresión del ciclo celular. La transcripción se inicia al final de G1, alcanza un pico y una meseta a la mitad de S y disminuye en G2.
Cuando se calcula el nivel de células con focos de RAD51 con respecto al número de células en la muestra que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias, el valor de referencia expresado como porcentaje es de al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4%, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 11 %, al menos el 12 %, al menos el 13%, al menos el 14 %, al menos el 15 %, al menos el 16 %, al menos el 17 %, al menos el 18 %, al menos el 19 %, al menos el 20 %, al menos el 21 %, al menos el 22 %, al menos el 23 %, al menos el 24 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, en donde 100 representa la cantidad total de células en la muestra que muestran daño en el ADN, preferiblemente DSB. En una realización preferida, el valor de referencia es de al menos el 10 %, incluso más preferiblemente al menos el 16 %, aún más preferiblemente al menos el 17 %, incluso más preferiblemente al menos el 20 %, incluso más preferiblemente al menos el 30 % incluso más preferiblemente al menos el 50 %.
La expresión “células (...) que muestran daño en el ADN” como se usa en el presente documento se refiere a las células que padecen daño en el ADN como se definió anteriormente, que consiste preferiblemente en DSB. Se identifican en la muestra mediante la determinación de la expresión, preferiblemente como focos nucleares, de proteínas implicadas en la reparación del daño en el ADN, preferiblemente en la reparación de DSB. Ejemplos no limitativos de tales proteínas son: yH2AX, proteína de replicación A (pRPA), proteína de unión a p53 1 (53BP1), proteína de reparación de roturas bicatenarias (MRE11).
El término “yH2AX”, como se usa en el presente documento, se refiere a la histona fosforilada H2AX (yH2AX). Se usa como biomarcador de la respuesta celular a DSB. En la fase temprana después de la formación de DSB, se forman grandes cantidades de moléculas de yH2AX en la cromatina alrededor del sitio de rotura, creando un foco donde se acumulan las proteínas implicadas en la reparación del ADN y la remodelación de la cromatina. Esta amplificación hace posible detectar DSB individuales con un anticuerpo frente a yH2AX.
El término “proteína de replicación A”, “pRPA” o “RPA” se refiere a la proteína con dicho nombre, que es la proteína principal que se une al ADN monocatenario (ADNmc) en células eucariotas. Durante la replicación del ADN, RPA evita que el<a>D<n>monocatenario (ADNmc) vuelva a enrollarse sobre sí mismo o forme estructuras secundarias. Esto mantiene el ADN desenrollado para que la polimerasa lo replique. RPA también se une al ADNmc durante la fase inicial de recombinación homóloga para reparar DSB. Al igual que su papel en la replicación del ADN, la unión de RPA evita que el ADNmc se una a sí mismo (autocomplementación) de modo que el filamento de nucleoproteína resultante pueda unirse entonces a RAD51 y sus cofactores. RPA también se une al ADN durante el proceso de reparación por escisión de nucleótidos. Esta unión estabiliza el complejo de reparación durante el proceso de reparación. Un homólogo bacteriano se denomina proteína de unión monocatenaria (SSB).
El término “proteína de unión a p53 1” o “53BP1”, como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que funciona en la elección de la ruta de reparación de roturas bicatenarias del ADN, promoviendo rutas de unión de extremos no homólogos (NHEJ), y recombinación homóloga limitante. Esta proteína desempeña múltiples papeles en la respuesta al daño en el ADN, incluida la promoción de la señalización de puntos de control después del daño en el ADN, actuando como armazón para el reclutamiento de proteínas de respuesta al daño en el ADN a la cromatina dañada, y promoviendo rutas de NHEJ limitando la resección de extremos después de una rotura bicatenaria. Estas funciones también son importantes durante la recombinación V(D)J, recombinación por intercambio de clase y en telómeros no protegidos. El corte y empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcritos que codifican diferentes isoformas.
El término “proteína de reparación de roturas bicatenarias” o “MRE11”, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte proteica del complejo de MRN, que desempeña un papel central en la reparación de roturas bicatenarias (DSB), la recombinación del ADN, el mantenimiento de la integridad de los telómeros y la meiosis. El complejo posee actividad endonucleasa monocatenaria y actividad exonucleasa 3'-5' específica bicatenaria, que se proporcionan por MRE11. Puede requerirse RAD50 para unir los extremos del ADN y mantenerlos en estrecha proximidad. Esto podría facilitar la búsqueda de regiones cortas o largas de homología de secuencia en los moldes de ADN de recombinación, y también puede estimular la actividad de las ADN ligasas y/o restringir la actividad nucleasa de MRE11 para prevenir la degradación nucleolítica más allá de un punto dado. El complejo también puede requerirse para la señalización del daño en el ADN por medio de la activación de la ATM quinasa.
Cuando se calcula el nivel de células con focos de RAD51 con respecto al número de células en la muestra que están proliferando y que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias, el valor de referencia expresado como porcentaje es de al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4%, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 11 %, al menos el 12 %, al menos el 13%, al menos el 14 %, al menos el 15 %, al menos el 16 %, al menos el 17 %, al menos el 18 %, al menos el 19 %, al menos el 20 %, al menos el 21%, al menos el 22 %, al menos el 23 %, al menos el 24 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, en donde 100 representa la cantidad total de células que están proliferando y que también muestran daño en el ADN, preferiblemente DSB. En una realización preferida, el valor de referencia es de al menos el 5 %, más preferiblemente al menos el 10 %, incluso más preferiblemente es de al menos el 20 %, incluso más preferiblemente al menos el 30 %, aún incluso más preferiblemente al menos el 50 %.
La expresión “respuesta al tratamiento anticancerígeno” como se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta favorable al tratamiento anticancerígeno, que un experto en la técnica entiende como la estabilización o reducción del tamaño del/de los tumor(es) y/o del número de tumores en el paciente y/o la inhibición de un proceso metastásico. En este caso, un experto en la técnica también se referiría al paciente como “sensible al tratamiento anticancerígeno”. Por el contrario, si la respuesta no es favorable como se acaba de indicar, un experto en la técnica también se referiría al paciente como “resistente al tratamiento anticancerígeno”. Dicha respuesta puede determinarse mediante al menos un criterio seleccionado del grupo que consiste en la tasa de beneficio clínico, supervivencia global, supervivencia libre de progresión, supervivencia libre de enfermedad, respuesta patológica completa, remisión clínica completa, remisión clínica parcial, enfermedad clínica estable, recurrencia, supervivencia sin metástasis, disminución de las células tumorales circulantes, respuesta de marcadores circulantes y criterios RECIST para la evaluación de la respuesta tumoral. El momento después del inicio de la terapia en el que se evalúa la respuesta no está particularmente limitado. Por lo tanto, la respuesta a la terapia puede determinarse al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 89, 10 u 11 meses después del inicio de la primera terapia o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años después del inicio de la primera terapia.
Además, el tipo y número de líneas de terapias aplicadas al paciente antes de la determinación de la respuesta tampoco está particularmente limitado. Por lo tanto, la respuesta puede determinarse en pacientes después de que el paciente se haya tratado con una primera línea de terapia que incluye terapia quirúrgica, quimioterapia o cirugía en combinación con quimioterapia adyuvante o neoadyuvante o cualquier tipo de terapia, o después de que el paciente se haya tratado con dos o más líneas secuenciales o simultáneas de terapia.
La expresión “tasa de beneficio clínico”, como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de pacientes con cáncer que han mostrado una mejora en al menos un síntoma o elemento importante de la calidad de vida que resulta directamente de un tratamiento, sin ninguna disminución en ningún otro elemento de la calidad de vida del paciente. Dicha mejora se entiende como una remisión completa, remisión parcial o una estabilización de la enfermedad.
La expresión “supervivencia global”, como se usa en el presente documento, se refiere al período de tiempo desde o bien la fecha del diagnóstico o bien el inicio del tratamiento para una enfermedad, tal como cáncer, en que los pacientes diagnosticados de la enfermedad siguen vivos.
La expresión “supervivencia libre de progresión”, como se usa en el presente documento, se refiere al período de tiempo durante y después del tratamiento de una enfermedad, tal como cáncer, que un paciente vive con la enfermedad pero no empeora.
La expresión “supervivencia libre de enfermedad”, como se usa en el presente documento, se refiere al período de tiempo después de que finalice el tratamiento primario para un cáncer que el paciente sobrevive sin ningún signo o síntoma de ese cáncer.
La expresión “respuesta patológica completa”, como se usa en el presente documento se refiere a la ausencia de células tumorales invasivas residuales después de la administración de un tratamiento anticancerígeno.
La expresión “remisión clínica completa”, como se usa en el presente documento, se refiere a la desaparición de todos los signos de cáncer en respuesta al tratamiento.
La expresión “remisión clínica parcial”, como se usa en el presente documento, se refiere a una disminución en el tamaño de un tumor, o en la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento.
La expresión “enfermedad clínica estable”, como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer que no disminuye ni aumenta en extensión o gravedad.
El término “recurrencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a la aparición del cáncer después del tratamiento y después de un período de tiempo durante el cual no se detectó el cáncer.
La expresión “supervivencia sin metástasis”, como se usa en el presente documento, se refiere al período de tiempo después de que finalice el tratamiento para un cáncer que el paciente sobrevive sin ningún signo o síntoma de metástasis de cáncer.
La expresión “disminución en células tumorales circulantes”, como se usa en el presente documento, se refiere a una disminución en la concentración de células tumorales circulantes en la sangre o en la linfa de un paciente con cáncer metastásico. Una disminución en las células tumorales circulantes está asociada con la eficacia de una terapia contra el cáncer metastásico.
La expresión “respuesta de marcadores circulantes”, como se usa en el presente documento, se refiere a la variación en la concentración en sangre o en la linfa de proteínas o ácidos nucleicos asociados con un cáncer específico después del tratamiento contra dicho cáncer específico.
El término “RECIST”, como se usa en el presente documento, se refiere a los “Criterios de evaluación de la respuesta en tumores sólidos”. Es una forma convencional de medir cómo de bien un paciente con cáncer responde al tratamiento. Se basa en si los tumores se contraen, permanecen igual o se hacen más grandes. Para usar RECIST, debe haber al menos un tumor que pueda medirse con rayos X, exploraciones de tomografía computarizada (TC) o exploraciones de obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI). Los tipos de respuesta que puede tener un paciente son una respuesta completa (CR), una respuesta parcial (PR), enfermedad progresiva (PD) y enfermedad estable (SD). En los estudios preclínicos con modelos de xenoinjerto murino, se aplican los criterios RECIST en tumores medidos con un calibrador.
B. Método para seleccionar una terapia personalizada para un sujeto diagnosticado de cáncer
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para seleccionar una terapia personalizada para un sujeto diagnosticado de cáncer, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia,
en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia indica que la terapia que va a seleccionarse comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia indica que la terapia que va a seleccionarse no comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas.
El término “seleccionar una terapia adaptada” o “seleccionar una terapia personalizada”, como se usa en el presente documento, se refiere a seleccionar terapias apropiadas y óptimas basándose en las características médicas específicas de un paciente, resultante de sus antecedentes genéticos personales. En el contexto de la presente invención, dicha característica es específica de las células tumorales del paciente, y consiste en el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que comprende células tumorales aisladas del paciente, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51. Dicho nivel de células con focos de RAD51 y valor de referencia se determinan como se indica en la sección 1-A.
En el contexto de la presente invención, la terapia que va a seleccionarse o no es una terapia que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas.
La expresión “tumores con deficiencias de la respuesta al daño en el ADN” o “células tumorales con deficiencias de la respuesta al daño en el ADN”, o “células tumorales caracterizadas por una pérdida de función de al menos una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula”, como se usa en el presente documento, se refiere a tumores malignos formados por células tumorales en donde la respuesta al daño en el ADN está alterada. Dicha alteración puede consistir en la presencia de un aumento del daño en el ADN (en comparación con las células no tumorales obtenidas del mismo tejido del órgano y del sujeto que las células tumorales), defectos de la reparación del ADN específicos de tumor y una incapacidad para detener o parar el ciclo celular antes de que el ADN dañado se transmita a las células hijas, o en una combinación de los mismos. Cualquiera de estas alteraciones puede resultar de la expresión anómala de una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN. Ejemplos no limitativos de dichas proteínas son ATM, ATR, BRCA1, BRCA2, BP53, P53, CDC25, CHK1, CHK2, NBS, MRE1J, RAD51, PALB2, PARP o una combinación de las mismas. Dichas alteraciones conducen a la inestabilidad genómica característica de las células tumorales cancerosas o malignas.
El término “ATR”, como se usa en el presente documento, se refiere a la serina/treonina-proteína quinasa ATR también conocida como proteína relacionada con ataxia telangiectasia y Rad3 (ATR) o proteína relacionada con FRAP 1 (FRP1). La ATR es una proteína quinasa específica de serina/treonina que participa en la detección del daño en el ADN y la activación del punto de control del daño en el ADN, lo que conduce a la detención del ciclo celular. La ATR se activa en respuesta al ADN monocatenario persistente, que es un producto intermedio común formado durante la detección y reparación de daños en el ADN. Se produce ADN monocatenario en horquillas de replicación estancadas y como producto intermedio en las rutas de reparación del ADN, tales como la reparación por escisión de nucleótidos y la reparación por recombinación homóloga. ATR funciona con una proteína asociada denominada ATRIP reconociendo el ADN monocatenario recubierto con RPA. Una vez que se activa la ATR, fosforila Chk1, iniciando una cascada de transducción de señales que culmina en la detención del ciclo celular. Además de su papel en la activación del punto de control del daño en el ADN, se cree que la ATR funciona en la replicación del<a>D<n>no perturbada. La ATR está relacionada con una segunda quinasa activadora de puntos de control, ATM.
El término “ATM”, como se usa en el presente documento, se refiere a ATM serina/treonina quinasa. El gen de ATM codifica una proteína de 350 kDa que consiste en 3056 aminoácidos. ATM pertenece a la superfamilia de quinasas relacionadas con fosfatidilinositol 3-quinasa (PIKK). La proteína ATM es una serina/treonina proteína quinasa que se recluta y se activa por roturas bicatenarias del ADN. Fosforila varias proteínas clave que inician la activación del punto de control de daño en el ADN, lo que conduce a la detención del ciclo celular, la reparación del ADN o la apoptosis. Un complejo de las tres proteínas MRE11, RAD50 y NBS1 (XRS2 en levadura), denominado complejo MRN en seres humanos, recluta ATM a roturas bicatenarias (DSB) y mantiene juntos los dos extremos. La ATM interactúa directamente con la subunidad NBS1 y fosforila la variante de histona H2AX en Ser139. Esta fosforilación genera sitios de unión para proteínas adaptadoras con un dominio BRCT. Estas proteínas adaptadoras reclutan entonces diferentes factores que incluyen la proteína quinasa efectora CHK2 y el supresor tumoral p53. La quinasa efectora CHK2 se fosforila y, por lo tanto, se activa por ATM. CHK2 activada fosforila la fosfatasa CDC25A, que se degrada posteriormente y ya no puede desfosforilar CDK2-ciclina, dando como resultado la detención del ciclo celular. Si la DSB no puede repararse durante esta respuesta rápida, ATM fosforila MDM2 y p53 en Ser15. p53 también se fosforila por la quinasa efectora CHK2. Estos eventos de fosforilación conducen a la estabilización y activación de p53 y la posterior transcripción de numerosos genes diana de p53, incluido el inhibidor de CDK p21, lo que conduce a la detención del ciclo celular a largo plazo o incluso a la apoptosis.
Los términos “BRCA1” y “BRCA2”, como se usan en el presente documento, se refieren a las proteínas denominadas “cáncer de mama 1” y “cáncer de mama 2” respectivamente. También se denominan “proteínas de susceptibilidad al cáncer de mama”. Están implicadas en la reparación del daño cromosómico con un papel importante en la reparación libre de errores de roturas bicatenarias del ADN. Si BRCA1 o BRCA2 está dañada en sí misma por una mutación deBRCAen las células de la mama, el ADN dañado no se repara correctamente, y esto aumenta el riesgo de cáncer de mama. Aunque las estructuras de los genesBRCA1yBRCA2son muy diferentes, al menos algunas funciones están interrelacionadas.
BRCA2 participa en la reparación de roturas bicatenarias y/o la recombinación homóloga. Actúa dirigiendo RAD51 a ADNmc sobre ADN bicatenario, lo que estimula la invasión de la cadena durante la recombinación homóloga. La localización de RAD51 en la rotura bicatenaria del ADN requiere la formación del complejo BRCA1-PALB2-BRCA2.
BRCA1 parece desempeñar un papel en dos rutas distintas para la reparación de roturas bicatenarias, unión de extremos no homólogos y reparación dirigida por homología. Por lo tanto, BRCA1 interactúa con proteínas implicadas tanto en la ruta de unión de extremos no homólogos (incluido el complejo Mre11, Rad50, Nbs1) como en la reparación homóloga (RAD51 y BRCA2, entre otros).
El término “Cdc25”, como se usa en el presente documento, se refiere a las fosfatasas Cdc25 (Cdc25A, B y C), que son responsables de eliminar los fosfatos inhibidores de Thr-14 y Tyr-15 en las quinasas dependientes de ciclina, lo que activa las quinasas y conduce la progresión a través del ciclo celular. Mientras la reparación del ADN está en marcha, debe impedirse la mitosis y, por lo tanto, la respuesta al daño en el ADN activa un punto de control del ciclo celular para impedir las mitosis. Dos proteína quinasas, Chk1 y Cds1, pueden hacer cumplir este punto de control fosforilando el inductor mitótico Cdc25 impidiendo así la entrada en la mitosis.
El término “Chk1”, como se usa en el presente documento, se refiere a la “quinasa 1 de punto de control”, que es una proteína quinasa específica de serina/treonina. La activación de Chk1 da como resultado el inicio de puntos de control del ciclo celular, la detención del ciclo celular, la reparación del ADN y la muerte celular para impedir que las células dañadas progresen a través del ciclo celular. Chk1 está regulada por ATR a través de fosforilación, formando la ruta ATR-Chk1. Esta ruta reconoce el ADN monocatenario (ADNmc). A menudo, el ADNmc puede ser el resultado de una replicación anómala durante la fase S a través del desacoplamiento de las enzimas de replicación helicasa y ADN polimerasa. Estas estructuras de ADNmc atraen la ATR y finalmente activan la ruta del punto de control.
Sin embargo, la activación de Chk1 no depende únicamente de ATR, a menudo son necesarias proteínas intermedias implicadas en la replicación del ADN. Proteínas reguladoras tales como la proteína de replicación A, claspina, Tim/tipina, Rad 17, TopBP1 pueden estar implicadas para facilitar la activación de Chk1. Están implicadas interacciones proteicas adicionales para inducir la fosforilación máxima de Chk1. La activación de Chk1 también puede ser independiente de ATR a través de interacciones con otras proteínas quinasas tales como PKB/AKT, MAPKAPK y p90/RSK.
El término “Chk2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la “quinasa 2 de punto de control”. Chk2 regula la división celular. Cuando el ADN experimenta una rotura bicatenaria, se activa la proteína Chk2. Más específicamente, ATM fosforila el sitio Thr68 y activa Chk2. Una vez activada, Chk2 fosforila dianas aguas abajo, incluidas fosfatasas CDC25, responsables de desfosforilar y activar quinasas dependientes de ciclina (CDK). Por lo tanto, la inhibición por Chk2 de las fosfatasas CDC25 impide la entrada de la célula en la mitosis, de manera similar a Chk1. Además, la proteína Chk2 interactúa con varias otras proteínas, incluidas p53 (p53). La estabilización de p53 por Chk2 conduce a la detención del ciclo celular en la fase G1. Además, se sabe que Chk2 fosforila el factor de transcripción del ciclo celular E2F1 y la proteína de leucemia promielocítica (PML) implicada en la apoptosis (muerte celular programada).
El término “NBS1”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína codificada por el gen que provoca el “síndrome de rotura de Nijmegen”. NBS1 forma normalmente un complejo con la nucleasa hMRE11/hRAD50 y funciona en la reparación por recombinación homóloga para roturas bicatenarias del ADN (DSB). Las interacciones de NBS1 con ATM, MDC1, yH2AX y TopBP1 son importantes para la formación de focos en los sitios de DSB y la activación del punto de control del ciclo celular dependiente de ATM/ATR después del daño en el ADN.
El término “PALB2”, como se usa en el presente documento, se refiere al “compañero y localizador de BRCA2”. Esta proteína se une y se colocaliza con BRCA2 en focos nucleares y probablemente permite la localización intranuclear estable y la acumulación de BRCA2. PALB2 se une al ADN monocatenario e interactúa directamente con la recombinasa RAD51 estimulando la invasión de la cadena, que es una etapa vital de la recombinación homóloga.
El término “PARP”, como se usa en el presente documento, se refiere a la “poli (ADP-ribosa) polimerasa”. La familia de PARP comprende 17 miembros, todos ellos tienen estructuras y funciones muy diferentes en la célula. El papel principal de PARP es detectar SSB e iniciar la reparación de SSB mediante la señalización de la maquinaria enzimática implicada en dicha reparación de SSB, principalmente en la ruta de BER. Una vez que PARP detecta una SSB, se une al ADN, experimenta un cambio estructural y comienza la síntesis de una adenosina difosfato ribosa polimérica (poli(ADP-ribosa) o PAR), que actúa como señal para las otras enzimas de reparación del ADN. Las enzimas diana incluyen ADN ligasa III (LigIII), ADN polimerasa beta (polp) y proteínas de andamiaje tales como el gen 1 de complementación cruzada de rayos X (XRCC1). Después de la reparación, las cadenas de PAR se degradan por medio de la poli(ADP-ribosa) glicohidrolasa (PARG).
El resto de términos en el contexto del presente método de la invención tienen el significado definido para el método anterior.
C. Método para clasificar a un sujeto con cáncer en una cohorte de pacientes
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para clasificar a un sujeto con cáncer en una cohorte de pacientes, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un paciente se clasifica en una cohorte caracterizada por responder a un tratamiento anticancerígeno si el nivel de células con focos de RAD51 es menor que dicho valor de referencia, o
- un paciente se clasifica en una cohorte caracterizada por no responder a un tratamiento anticancerígeno si el nivel de células con focos de RAD51 es mayor que dicho valor de referencia. El tratamiento anticancerígeno en este aspecto comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas.
El término “cohorte” o “cohorte de pacientes”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de sujetos afectados por enfermedades comunes, influencias ambientales o temporales, tratamientos, u otros rasgos cuyo progreso se evalúa en una investigación o estudio clínico. En la presente invención, los sujetos de todas las cohortes se diagnostican de cáncer, y el rasgo común para todos los sujetos dentro de una cohorte es la respuesta positiva o negativa (dependiendo de la cohorte) a un tratamiento anticancerígeno. Dicha respuesta de cada sujeto se determina comparando el nivel de células con focos de RAD51 con un valor de referencia en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51. Dicho nivel de células con focos de RAD51 y valor de referencia se determinan como se indica en la sección 1-A.
El resto de términos en el contexto del presente método de la invención también tienen el significado definido para los métodos anteriores.
D. Método para predecir si un tumor de un sujeto es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método para predecir si un tumor de un sujeto es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra tumoral, en donde el tumor se ha aislado de un sujeto que no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento del tumor, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia es indicativo de que el tumor es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia es indicativo de que el tumor no es capaz de reparar el ADN por recombinación homóloga.
La expresión “predecir si un tumor de un sujeto diagnosticado de cáncer es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga”, como se usa en el presente documento, se refiere a las probabilidades por las cuales un tumor de un paciente sujeto puede ser capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga. Como entenderán los expertos en el campo, y aunque esto no es preferible, la predicción no tiene que ser correcta para el 100 % de los tumores de los sujetos analizados. Sin embargo, la expresión requiere que la predicción proporcione resultados correctos para una porción estadísticamente significativa de los pacientes. La determinación de si la predicción de la invención proporciona resultados estadísticamente significativos puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas estadísticas convencionales tales como la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney como se describe en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Intervalos de confianza adecuados son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %. Valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05.
El término “probabilidad”, como se usa en el presente documento, se entiende como se indica en la sección 1-A.
La expresión “reparación por recombinación homóloga”, o “HRR”, como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso de recombinación homóloga que se produce como DDR en una célula para reparar principalmente las DSB. En términos generales, la HRR requiere la presencia de una secuencia idéntica o casi idéntica para usarse como molde para la reparación de la rotura. La maquinaria enzimática responsable de este proceso de reparación es casi idéntica a la maquinaria responsable del cruce cromosómico durante la meiosis. Esta ruta permite reparar un cromosoma dañado usando una cromátida hermana (disponible en G2 después de la replicación del a Dn ) o un cromosoma homólogo como molde.
Por lo tanto, el método divulgado en esta sección D permite distinguir entre pacientes con cánceres en donde la HRR es competente/funcional o deficiente/no funcional.
El resto de términos usados en la definición del presente método de la invención se han explicado con respecto a los métodos anteriores de la invención y son igualmente aplicables al presente método.
E. Realizaciones preferidas de los métodos de la invención
En una realización preferida, en el método definido en cualquiera de los aspectos previos de la invención, se define que una célula tiene focos de RAD51 si contiene al menos uno, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20 focos de RAD51 en el núcleo. En una realización más preferida, dicha célula debe contener al menos 1 foco de RAD51 en el núcleo. En una realización incluso más preferida, dicha célula debe contener al menos 5 focos de RAD51 en el núcleo.
En otra realización preferida, los focos de RAD51 se identifican con un inmunoensayo usando un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51. El término “ inmunoensayo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una prueba bioquímica que mide la presencia o concentración de una molécula en una disolución mediante el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. La molécula detectada por el inmunoensayo a menudo se denomina “analito” y en muchos casos es una proteína, aunque pueden ser otras clases de moléculas, de diferentes tamaños y tipos, siempre que se desarrollen los anticuerpos adecuados que tienen las propiedades adecuadas para el ensayo. Los inmunoensayos emplean una variedad de marcadores diferentes para permitir la detección de anticuerpos o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. Los marcadores están normalmente unidos o conjugados químicamente con el anticuerpo deseado o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los marcadores comunes para su uso en inmunoensayos son enzimas. Los inmunoensayos comunes que emplean enzimas son ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), o a veces inmunoensayos enzimáticos (EIA).
Las enzimas usadas en inmunoensayos como marcadores incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa. Estas enzimas permiten la detección a menudo porque producen un cambio de color observable en presencia de ciertos reactivos. En algunos casos, estas enzimas se exponen a reactivos que hacen que produzcan luz o quimioluminiscencia.
Los isótopos radiactivos pueden incorporarse en reactivos de inmunoensayo para producir un radioinmunoensayo (RIA). La radiactividad emitida por complejos anticuerpo-antígeno unidos puede detectarse fácilmente usando métodos convencionales.
Se usan indicadores fluorogénicos como ficoeritrina en varios inmunoensayos modernos. Las micromatrices de proteínas son un tipo de inmunoensayo que a menudo emplea indicadores fluorogénicos.
Aunque se emplean generalmente marcadores en inmunoensayos, hay un cierto tipo de ensayos que no se basan en marcadores, sino que en su lugar emplean métodos de detección que no requieren la modificación o el marcaje de los componentes del ensayo. La resonancia de plasmón superficial es un ejemplo de técnica que puede detectar la unión entre un anticuerpo no marcado y antígenos. Consiste en la oscilación resonante de electrones de conducción en la interfaz entre material de permitividad negativa y positiva estimulado por luz incidente. Otro inmunoensayo sin marcador demostrado implica medir el cambio en la resistencia en un electrodo a medida que el antígeno se une al mismo.
Dichos principios de las técnicas de inmunoensayo los utiliza un experto en la técnica para determinar la expresión y/o la formación de focos de la proteína de interés a un nivel de célula individual. Un experto en la técnica conoce métodos que permiten dicha determinación. Ejemplos no limitativos de tales métodos son inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, microscopía inmunoelectrónica o citometría de flujo.
El término “ inmunohistoquímica”, como se usa en el presente documento, se refiere a una técnica que implica el proceso de obtención selectiva de imágenes de antígenos (por ejemplo, proteínas) en células de una sección de tejido, o de una muestra de células, aprovechando el principio de los inmunoensayos descritos anteriormente. La visualización de los anticuerpos unidos a las células analizadas implica el uso de un microscopio tal como un microscopio electrónico (EM). Puede usarse inmunohistoquímica en secciones de tejido, líneas celulares cultivadas o células individuales, y puede usarse para analizar la distribución de proteínas, glicanos y moléculas biológicas y no biológicas pequeñas dentro de las células o más generalmente dentro de la muestra de células.
La preparación de la muestra es crítica para mantener la morfología celular, la arquitectura tisular y la antigenicidad de epítopos diana. Esto requiere una apropiada recogida, fijación y seccionamiento del tejido. A menudo se usa una disolución de paraformaldehído para fijar el tejido, pero pueden usarse otros métodos. El tejido puede entonces cortarse o usarse en su totalidad, dependiendo del propósito del experimento o del propio tejido. Antes del seccionamiento, la muestra de tejido puede incrustarse en un medio, como cera de parafina o criomedio. Las secciones pueden cortarse en una variedad de instrumentos, lo más comúnmente un microtomo, criostato o cortadora de tejido Compresstome. Las muestras se cortan normalmente en un intervalo de 3 |im-50 |im. Los cortes se montan entonces en portaobjetos, se deshidratan usando lavados con alcohol de concentraciones crecientes (por ejemplo, el 50 %, 75%, 90 %, 95 %, 100 %), y se aclaran usando un detergente como xileno antes de obtener imágenes bajo un microscopio. Dependiendo del método de fijación y conservación del tejido, la muestra puede requerir etapas adicionales para hacer que los epítopos estén disponibles para la unión de anticuerpos, incluidas desparafinación y recuperación de antígenos. Para tejidos incrustados en parafina fijados con formalina, a menudo es necesaria la recuperación de antígenos, e implica tratar previamente las secciones con calor o proteasa. Estas etapas pueden hacer la diferencia entre la tinción de los antígenos diana o ausencia de tinción.
El término “inmunofluorescencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a un ejemplo específico de inmunohistoquímica que hace uso principalmente de fluoróforos para visualizar la ubicación de los anticuerpos en las células que están analizándose.
El término “citometría de flujo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una tecnología biofísica basada en láser o basada en impedancia empleada en la detección de biomarcadores, el recuento celular, la clasificación celular y la ingeniería de proteínas, suspendiendo células en una corriente de fluido y haciéndolas pasar a través de un aparato de detección electrónico. Un citómetro de flujo permite el análisis multiparamétrico simultáneo de las características físicas y químicas de hasta miles de partículas por segundo. Las células se someten a inmunotinción en disolución, y luego se analizan por citometría de flujo.
El término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, “porción de unión a antígeno”) o cadenas individuales de los mismos. Un “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente, porque se unen al mismo epítopo del antígeno, en donde el epítopo es la parte de un antígeno que reconoce el anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se derivan de células inmunitarias idénticas que son todos clones de una célula parental única. Por el contrario, los anticuerpos policlonales se unen a múltiples epítopos del mismo antígeno y habitualmente se producen por diferentes linajes de células B.
El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo”), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, TNFa, IL-12). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Wardet al.,(1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH o VL; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite producirse como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse por ejemplo, Birdet al.(1988) Science 242:423-426; y Hustonet al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos monocatenarios estén englobados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se examinan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. En una realización de la invención, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fab, un Fd, un Fd', un Fv de cadena sencilla (scFv), un scFva y un anticuerpo de dominio (dAb).
Los términos “nivel de células”, así como “valor de referencia”, se definieron en la sección 1-A. Las diferentes formas de determinar el “nivel de células con focos de RAD51” también se determinaron en la sección 1A.
Con respecto a la determinación del nivel de células con focos de RAD51 con respecto al número de células en la muestra que están proliferando, en una realización preferida, se determina el número de células en la muestra que están proliferando determinando la expresión de una proteína seleccionada de la lista que consiste en geminina, KI-67, antígeno nuclear de células en proliferación, ciclina A2. En otra realización preferida, la determinación de la expresión de la proteína seleccionada se lleva a cabo mediante un inmunoensayo con un anticuerpo específico para la proteína seleccionada. Preferiblemente, las células que se consideran que están en proliferación muestran expresión nuclear de la proteína seleccionada, en donde “expresión nuclear” se refiere a la expresión de la proteína localizada en el núcleo de la célula. En una realización preferida, se define que la célula tiene expresión nuclear de una proteína cuando la expresión de la proteína en el núcleo es mayor que en el citoplasma. En una realización más preferida, la proteína seleccionada es geminina.
Con respecto a la determinación del nivel de células con focos de RAD51 con respecto al número de células en la muestra que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas bicatenarias, en una realización preferida, se determina el número de células en la muestra que muestran roturas bicatenarias determinando la expresión nuclear, preferiblemente la presencia de focos nucleares, de una proteína seleccionada de la lista que consiste en yH2AX, proteína de replicación A (pRPA), proteína de unión a p53 1 (53BP1), proteína de reparación de roturas bicatenarias (MRE11). En otra realización preferida, se define que la célula tiene expresión nuclear de una proteína cuando la expresión de la proteína en el núcleo es mayor que en el citoplasma. En otra realización preferida, se define que las células tienen focos nucleares de la proteína seleccionada si contienen al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20 focos de dicha proteína en el núcleo. En una realización más preferida, se define que la célula tiene focos nucleares de la proteína seleccionada si contiene al menos 1 foco de dicha proteína en el núcleo. La determinación de la presencia de expresión nuclear, o focos nucleares, de la proteína seleccionada se lleva a cabo mediante un inmunoensayo con un anticuerpo específico para la proteína seleccionada, que es preferiblemente yH2AX. En una realización preferida, la determinación del número de células en la muestra que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas bicatenarias, se determina determinando el número de células con focos nucleares de yH2AX, en donde se define que una célula tiene focos nucleares de yH2AX si contiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20 focos de yH2AX en el núcleo.
En una realización preferida, el número de células en la muestra que están proliferando se determina determinando la expresión de una proteína seleccionada de la lista que consiste en geminina, KI-67, antígeno nuclear de células en proliferación, ciclina A2, y/o en donde el número de células en la muestra que muestran roturas de ADN bicatenarias está determinado por la expresión en el núcleo de una proteína seleccionada de la lista que consiste en yH2AX, proteína de replicación A (pRPA), proteína de unión a p53 1 (53BP1), proteína de reparación de roturas bicatenarias (MRE11). En una realización preferida, el número de células en la muestra que están proliferando se determina determinando la expresión de geminina, y en donde el número de células en la muestra que muestran roturas de ADN bicatenarias está determinado por la expresión en el núcleo de yH2AX.
Los términos “ inmunoensayo” y métodos para detectar la proteína a un solo nivel ya se definieron anteriormente, así como el término “anticuerpo” como se usa en el presente documento.
En una realización preferida, la muestra de cualquiera de los métodos descritos hasta ahora se aisló de la sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, médula ósea, un aspirado de pezón o una biopsia de tumor sólido. En una realización aún más preferida, la muestra de los métodos descritos hasta ahora se aisló de una biopsia de tumor sólido.
En otra realización particular, la muestra de cualquiera de los métodos descritos hasta ahora se proporciona como un tejido fijado, tejido incrustado en parafina, tejido incrustado en parafina fijado con formalina (FFPE), portaobjetos histológico, suspensión celular, sedimento celular, portaobjetos de células y/o biopsia de tumor sólido congelado. En una realización preferida, la muestra es un tejido fijado, en donde la fijación se llevó a cabo con formalina, aldehídos, alcoholes, agentes oxidantes, mercurial, picratos o con efecto de protección de disolvente orgánico mediado por tampón HEPES-ácido glutámico (HOPE®).
En otra realización, la respuesta del sujeto al que se hace referencia en el método “para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno” puede determinarse mediante al menos un criterio seleccionado del grupo que consiste en la tasa de beneficio clínico, supervivencia global, supervivencia libre de progresión, supervivencia libre de enfermedad, respuesta patológica completa, remisión clínica completa, remisión clínica parcial, enfermedad clínica estable, recurrencia, supervivencia sin metástasis, disminución de las células tumorales circulantes, respuesta de marcadores circulantes y criterios RECIST para la evaluación de la respuesta tumoral. Estos criterios diferentes se definieron en la sección 1-A.
El tratamiento anticancerígeno al que se hace referencia en cualquiera de los métodos anteriores de la invención comprende al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas. La expresión “método que induce daño en el ADN” se definió en la sección 1A. Ejemplos no limitativos de métodos que inducen daño en el<a>D<n>son radiación ionizante, luz UV o quimioterapia con agentes que inducen directamente daño en el ADN tales como los enumerados en la sección 1A como “agentes que inducen directamente daño en el ADN”. La expresión “agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN” como se usa en el presente documento se refiere a agentes que se dirigen a al menos una proteína implicada en dicho proceso en la célula. Ejemplos no limitativos de dichas proteínas son ATM/ATR, BRCA 1 / 2, BP53, P53, CDC25, CHK1/2, NBS, MRE1J, RAD51, PALB2, PARP o una combinación de las mismas. Anteriormente se enumeraron ejemplos no limitativos de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN en la sección 1-A como “agentes que se dirigen a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula”. Preferiblemente, el agente que se dirige al tratamiento anticancerígeno se selecciona del grupo de inhibidores de PARP (incluidos, pero sin limitación, olaparib, veliparib, talazoparib, rucaparib, niraparib, CEP-8983, E7016 y BGB-290). En una realización preferida, el agente que se dirige a la respuesta al daño en el ADN es un inhibidor de PARP. El término “PARPi” o “inhibidores de PARP”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de inhibidores farmacológicos de la enzima poli ADP ribosa polimerasa (PARP). Se desarrollan para múltiples indicaciones, especialmente para el tratamiento del cáncer. PARP1 es una proteína que es importante para reparar roturas monocatenarias en el ADN. Si tales SSB persisten sin reparar hasta que se replica el ADN (que debe preceder a la división celular), entonces la replicación en sí misma puede hacer que se formen DSB. Por lo tanto, en términos generales, el mecanismo de acción de los fármacos que inhiben PARP1 es provocar la formación de múltiples DSB, de modo que, en tumores con mutaciones en proteínas implicadas en la reparación de DSB, tales como BRCA1, BRCA2 o PALB2, estas roturas bicatenarias no pueden repararse de manera eficiente, lo que conduce a la muerte de las células. Ejemplos no limitativos de PARPi son, como se indica en la sección 1A, olaparib, veliparib, talazoparib, rucaparib, niraparib, CEP-8983, E7016 y BGB-290.
En otra realización preferida, la muestra a la que se hace referencia en cualquiera de los métodos anteriores comprende células tumorales caracterizadas por una pérdida de función de al menos una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula con deficiencias en la respuesta al daño en el ADN. La expresión “células tumorales caracterizadas por una pérdida de función de al menos una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula” se definió en la sección 1-A. Preferiblemente, la al menos una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN se selecciona del grupo que consiste en BRCA1, BRCA2 y/o PALB2. Incluso más preferiblemente, dicha al menos una proteína es BRCA1 y/o BRCA2.
En una realización particular, el cáncer diagnosticado al sujeto se selecciona de la lista que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de estómago/gástrico, cáncer endometrial/uterino/cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, sarcoma, colangiocarcinoma, glioblastoma, mieloma múltiple, linfoma. Más preferiblemente, el cáncer diagnosticado al paciente se selecciona de la lista que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de próstata, incluso preferiblemente es un cáncer de mama o un cáncer de ovario, aún más preferiblemente es un cáncer de mama.
Con respecto al tratamiento recibido por el sujeto antes del aislamiento de la muestra en cualquiera de los aspectos de la invención, preferiblemente el sujeto no ha recibido en ningún momento, preferiblemente dentro de las últimas 168 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 72 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 48 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 36 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 24 horas, incluso más preferiblemente a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina. En otra realización preferida, el sujeto no ha recibido una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, pero dentro de las últimas 23 horas, preferiblemente las últimas 22 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 21 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 20 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 15 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 10 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 5 horas, e incluso más preferiblemente dentro de las últimas 2 horas, aún incluso más preferiblemente dentro de la última hora antes del aislamiento de la muestra.
En una realización preferida, el sujeto del que se ha aislado la muestra no ha recibido quimioterapia en ningún momento, preferiblemente dentro de las últimas 168 horas, preferiblemente dentro de las últimas 72 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 48 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 36 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 24 horas, incluso más preferiblemente a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra. En otra realización preferida, el sujeto no ha recibido ninguna quimioterapia a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, pero dentro de las últimas 23 horas, preferiblemente las últimas 22 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 21 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 20 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 15 horas, incluso aún más preferiblemente dentro de las últimas 10 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 5 horas, e incluso más preferiblemente dentro de las últimas 2 horas, aún incluso más preferiblemente dentro de la última hora antes del aislamiento de la muestra.
En una realización más preferida, el sujeto no ha recibido ningún tratamiento anticancerígeno en ningún momento, preferiblemente dentro de las últimas 168 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 72 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 48 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 36 horas, aún incluso más preferiblemente dentro de las 24 horas, incluso más preferiblemente a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra. En aún una realización más preferida, el sujeto no ha recibido ningún tratamiento anticancerígeno en ningún momento antes del aislamiento de la muestra.
En otra realización particular, el sujeto del que se aísla la muestra ha recibido un tratamiento anticancerígeno en cualquier momento en un período anterior al aislamiento de la muestra, preferiblemente dentro de las últimas 168 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 72 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 48 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 36 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 24 horas antes del aislamiento de la muestra. Si se administra a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, preferiblemente dentro de las últimas 24 horas antes del aislamiento de la muestra, dicho tratamiento anticancerígeno es diferente de una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina. En otra realización, si se administra dentro de las últimas 36 horas, más preferiblemente dentro de las últimas 48 horas, incluso más preferiblemente dentro de las últimas 72 horas, aún más preferiblemente dentro de las últimas 168 horas, incluso más preferiblemente en cualquier momento antes del aislamiento de la muestra, dicho tratamiento anticancerígeno es diferente de una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina. Preferiblemente, el tratamiento de cualquiera de las situaciones descritas en el presente párrafo es el tratamiento anticancerígeno cuya respuesta se determina en el método “para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno”.
En una realización particular, no cubierta por la materia objeto de las reivindicaciones, la divulgación se refiere a un método para determinar el mantenimiento o cese de un tratamiento anticancerígeno en un sujeto diagnosticado de cáncer que se trata con un tratamiento anticancerígeno, que comprende:
i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en quimioterapia AC, quimioterapia FEC, quimioterapia con ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
- un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia, entonces debe mantenerse el tratamiento anticancerígeno, o
- un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia indica que el tratamiento anticancerígeno debe cesar.
Los términos usados en el presente método de la invención se han explicado con respecto a los métodos anteriores de la invención y son igualmente aplicables al presente método.
2. Usos terapéuticos de la invención
En un quinto aspecto, la invención se refiere a un medicamento que comprende al menos un agente que induce directamente daño en el ADN o al menos un agente que se dirige a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN seleccionada del grupo que consiste en: un inhibidor de PARP (PARPi), tal como olaparib, talazoparib, rucaparib, niraparib, veliparib, CEP-8983, E7016 y BGB-290, un agente antimicrotúbulos tal como vincristina o vinblastina, y una antraciclina para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, que comprende además identificar al sujeto como que responde a dicho medicamento antes del tratamiento mediante el método para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno según la presente invención.
En un sexto aspecto no cubierto por la materia objeto de las reivindicaciones, la divulgación se refiere a un medicamento para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde el tratamiento se ha diseñado mediante un método para seleccionar una terapia personalizada para un sujeto diagnosticado de cáncer según la presente invención.
El término “medicamento”, como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, preferiblemente un agente anticancerígeno, más preferiblemente un agente que daña el ADN. El medicamento también comprende al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida, el medicamento comprende más de un agente en donde cada agente está en su correspondiente cantidad terapéuticamente eficaz, preferiblemente al menos uno de estos agentes es un agente anticancerígeno, y más preferiblemente al menos uno de estos agentes es un agente que daña el ADN. En otra realización preferida, el medicamento consiste en el agente en su correspondiente cantidad terapéuticamente eficaz, preferiblemente el agente anticancerígeno en su correspondiente cantidad terapéuticamente eficaz, más preferiblemente el agente que daña el ADN en su correspondiente cantidad terapéuticamente eficaz. En este caso, el agente ya comprende al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad suficiente del agente para proporcionar el efecto deseado y generalmente se determinará por, entre otras causas, las características del propio compuesto y el efecto terapéutico que va a lograrse. También dependerá del sujeto que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad cancerosa padecida por dicho sujeto, la forma de dosificación elegida, la vía de administración, etc.
Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos para cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos para su uso según la invención pertenece a la experiencia común de los expertos en la técnica. En general, la dosificación necesaria para proporcionar un tratamiento eficaz, que puede ajustar un experto en la técnica, variará dependiendo de la edad, salud, estado físico, sexo, dieta, peso, grado de alteración de la ruta molecular a la que se dirige, frecuencia de tratamiento, naturaleza y estado de la enfermedad cancerosa, naturaleza y extensión del cáncer, estado médico del sujeto, vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como actividad, eficacia, perfil farmacocinético y toxicológico del agente particular usado, si se usa un sistema de administración de fármacos, y si el agente se administra como parte de una combinación de fármacos.
La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” o “portador farmacéuticamente aceptable” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier compuesto o combinación de compuestos que es esencialmente no tóxico para el sujeto a la dosificación y concentración empleadas, y es compatible con los otros componentes de un medicamento. Por lo tanto, un excipiente es una sustancia inactiva formulada junto con el principio activo (es decir, el agente, preferiblemente el agente anticancerígeno, incluso más preferiblemente el agente que daña el ADN tal como un PARPi) de un medicamento con el fin de aumentar el volumen de las composiciones que contienen dichos principios activos. El aumento de volumen permite la dispensación conveniente y precisa de un principio activo cuando se produce una forma de dosificación. Los excipientes también pueden servir para diversos fines de potenciación terapéutica, tales como facilitar la absorción o solubilidad del principio activo, u otras consideraciones farmacocinéticas. Los excipientes también pueden ser útiles en el proceso de fabricación, para ayudar en la manipulación de la sustancia activa en cuestión, tal como facilitando la fluidez del polvo o las propiedades antiadherentes, además de ayudar a la estabilidadin vitro,tal como la prevención de la desnaturalización durante la vida útil esperada. La selección de excipientes apropiados depende de la vía de administración y la forma de dosificación, así como el principio activo y otros factores. Un excipiente puede ser un sólido no tóxico, carga semisólida o líquida, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo convencional. Los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de excipientes o portadores incluyen agua, disoluciones salinas (soluciones salinas), alcohol, dextrosa, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Realizaciones preferidas de los usos terapéuticos de la divulgación
En un caso preferido, el medicamento comprende un agente anticancerígeno, más preferiblemente un agente que daña el ADN. En una realización más preferida, el medicamento comprende un agente inhibidor de PARp , preferiblemente seleccionado de la lista que consiste en olaparib, veliparib, talazoparib, rucaparib, niraparib, CEP-8983, E7016 y BGB-290. En una realización aún más preferida, el PARPi es olaparib, veliparib o niraparib, preferiblemente olaparib.
En otra realización particular, el medicamento es para uso en un tratamiento que consiste en inmunoterapia.
En una realización particular, el medicamento es para su uso en un tratamiento, en donde el tratamiento, además de la administración del medicamento, comprende inmunoterapia, quimioterapia, radioterapia o una combinación de las mismas y en donde el sujeto se ha identificado como que responde a dicho medicamento mediante un método “para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno”.
En otro caso particular, no cubierto por la materia objeto de las reivindicaciones, el medicamento es para su uso en un tratamiento, en donde el tratamiento, además de la administración del medicamento, comprende inmunoterapia, quimioterapia, radioterapia o una combinación de las mismas y en donde el tratamiento se ha diseñado mediante un método “para seleccionar una terapia personalizada para un sujeto diagnosticado de cáncer”.
Los términos usados en el contexto de los medicamentos para uso de la invención tienen el mismo significado definido para los métodos de la invención.
3. Uso de un kit
En un séptimo aspecto, la invención se refiere al uso de un kit en el método “para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno”, como se reivindica, en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
En un octavo aspecto, la invención se refiere al uso de un kit en el método “para seleccionar una terapia para un sujeto diagnosticado de cáncer”, como se reivindica, en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
En un noveno aspecto, la invención se refiere al uso de un kit en el método “para clasificar a un sujeto con cáncer en una cohorte de pacientes”, como se reivindica, en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
En un décimo aspecto, la invención se refiere al uso de un kit en el método “para predecir si un tumor de un sujeto es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga”, como se reivindica, en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
En un undécimo aspecto, la invención se refiere al uso de un kit en cualquiera de los métodos de la invención, como se reivindica, el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
En el contexto de la presente invención, “kit” se entiende como un producto que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los diferentes usos de la invención envasados para permitir su transporte y almacenamiento. Adicionalmente, los kits usados en la invención pueden contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que están en el kit. Dichas instrucciones pueden estar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones susceptibles de leerse o entenderse, tales como, por ejemplo, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas), o medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM, DVD), o materiales de audio. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de internet que proporcionan dicha instrucción.
En una realización preferida, el kit al que se hace referencia en cualquiera de los usos anteriores comprende además un anticuerpo capaz de reconocer específicamente una proteína cuya expresión determina si una célula en una muestra está proliferando. Preferiblemente, dicho anticuerpo es capaz de reconocer específicamente una proteína seleccionada de la lista que consiste en geminina, KI-67, antígeno nuclear de células en proliferación, ciclina A2. Más preferiblemente, la proteína es geminina.
En otra realización preferida, el kit al que se hace referencia en cualquiera de los usos anteriores comprende además un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la presencia de una proteína específica en el núcleo, preferiblemente la presencia de focos nucleares de dicha proteína, en donde dicha presencia en una célula indica que la célula comprende daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias. Preferiblemente, dicho anticuerpo es capaz de reconocer específicamente una proteína seleccionada de la lista que consiste en yH2AX, proteína de replicación A (pRPA), proteína de unión a p53 1 (53BP1), proteína de reparación de roturas bicatenarias (MRE11). Más preferiblemente, el anticuerpo es capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX.
En una realización preferida, el kit al que se hace referencia en cualquiera de los usos indicados en los párrafos primero, segundo, tercero y cuarto de esta sección 3, comprende además un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
En otra realización preferida, cualquiera de los anticuerpos a los que se hace referencia en esta sección 3 comprende cada uno al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 100 % de la cantidad total de reactivos que forman los kits usados en la invención.
Los términos usados en el contexto de los usos de la invención tienen el mismo significado definido para los métodos y medicamentos para el uso de la invención.
Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden ser limitativos de la presente invención.
Ejemplos
Materiales y métodos
Diseño del estudio
Con el fin de identificar nuevos biomarcadores de eficacia de PARPi, se recogieron prospectivamente muestras tumorales de pacientes diagnosticados de carcinoma de mama (BC) o cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) y se generó una colección de modelos de PDX. Se evaluó su sensibilidad a PARPi, y se analizó la funcionalidad de la ruta de HRR y se comparó entre las muestras de PDX sensibles a PARPi frente a resistentes a PARPi para encontrar una prueba funcional que se correlacione con la respuesta. La prueba funcional también se exploró en una colección de PDX independiente. Se empleó un análisis exploratorio en muestras clínicas, que incluía pacientes con mutaciones de la línea germinal enBRCA1, BRCA2oPALB2,para explorar el posible interés clínico de la prueba funcional.
Modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)
Se recogieron prospectivamente muestras tumorales recientes de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado o de mama para su implantación en ratones desnudos bajo protocolos aprobados por la junta de revisión institucional (IRB) deI Vall Hebron, el Institut Curie o Institut Paoli-Calmettes. Los experimentos se realizaron siguiendo la directiva de cuidado de animales de la Unión Europea (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del Instituto de Investigación Vall d'Hebron (Barcelona, España) o por el Comité Ético de Experimentación Animal CEEA-51 (Evry, Francia). Se obtuvieron tumores humanos primarios o metastásicos recientes de pacientes en el momento de la cirugía o la biopsia y se implantaron inmediatamente en la almohadilla de grasa mamaria (muestras de cirugía) o el flanco inferior (muestras metastásicas) de ratones HsdCpb:NMRI-Foxn1nu atímicos hembra de 6 semanas de edad (Harlan Laboratories). Los animales se complementaron continuamente con 17b-estradiol 1 |iM (Sigma-Aldrich) en su agua potable. Tras el crecimiento de los tumores injertados, el modelo se perpetuó mediante trasplante en serie en el flanco inferior. En cada pase, se tomaron muestras congeladas inmediatamente incrustadas en parafina y fijadas con formalina (FFPE) para estudios histológicos y de genotipado.
Análisis de los genes BRCA1/2 y PALB2
Se extrajo ADN de muestras tumorales de PDX o sangre periférica del paciente y se realizó secuenciación de última generación de los genesBRCA1, BRCA2yPALB2.
Experimentos in vivo de sensibilidad de PDX a PARPi
Para evaluar la sensibilidad a la inhibición de PARP, se distribuyeron equitativamente ratones portadores de tumores en grupos de tratamiento de 5 a 10 ratones con tumores que oscilaban entre 70 y 300 mm3 Se administraron olaparib 50 mg/kg o 100 mg/kg, niraparib 75 mg/kg o 50 mg/kg, o Veliparib 100 mg/kg por sonda nasogástrica (p. o.) diariamente (en DMSO al 10% v/v/Kleptose al 10 % p/v [HP-p-CD]). Se midió el crecimiento tumoral con un calibrador cada dos semanas desde el primer día de tratamiento hasta el día 21 y cada 7-10 días en el entorno de resistencia adquirida. Para generar modelos de PDX con resistencia adquirida a PARPi, el tratamiento con olaparib se mantuvo durante hasta 150 días en tumores sensibles a olaparib hasta que los tumores individuales volvieron a crecer. En todos los experimentos, se registró el peso del ratón dos veces a la semana. El volumen tumoral se calculó como V = 4rc/3/Lxl2, siendo “L” el diámetro más grande y “l” el más pequeño. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 1500 mm3 o en caso de pérdida de peso grave, según las directrices institucionales. La actividad antitumoral se determinó comparando el volumen tumoral a los 21 días con su valor inicial: % de cambio del volumen tumoral = (V21días - Vinicial)/Vinicial x100. Para PDX sensible a olaparib, la mejor respuesta se definió como el valor mínimo del % de cambio del volumen tumoral sostenido durante al menos 10 días. Para clasificar la respuesta antitumoral, se siguieron los criterios de criterios de evaluación de la respuesta en tumores sólidos (RECIST) sobre el % de cambio del volumen tumoral: CR (respuesta completa), mejor respuesta <-95 %; PR (respuesta parcial), -95<mejor respuesta<-30 %; SD (enfermedad estable), -30%<mejor respuesta<+20%, PD (enfermedad progresiva), mejor respuesta >+20 %.
Inmunofluorescencia
Se usaron los siguientes anticuerpos primarios para la inmunofluorescencia: de conejo anti-RAD51 (Santa Cruz Biotechnology H-92, dilución 1:250), anticuerpo de conejo anti-RAD51 de Cell Signaling Technologies (CST n.° 8875, dilución 1:25 de una solución madre de 83 |ig/ml), anticuerpo de conejo anti-RAD51 de Abcam (ab-133534, dilución 1:1000), de ratón anti-geminina (NovoCastra NCL-L, 1:100 en muestras de PDX, 1:60 en muestras de pacientes), de conejo anti-geminina (ProteinTech 10802-1-AP, 1:400), de ratón anti-BRCA1 (Santa Cruz Biotechnology D-9, 1:50 para C-term; o Abcam MS110, 1:200 para N-term) y de ratón anti-yH2AX (Millipore JBW301, 1:200). Los anticuerpos secundarios usados fueron: anticuerpo de cabra anti-conejo Alexa fluor 568 (Invitrogen; 1:500), anticuerpo de cabra anti-ratón Alexa fluor 488 (Invitrogen; 1:500), anticuerpo de cabra anti-ratón Alexa fluor 568 (Invitrogen; 1:500) y anticuerpo de cabra anti-conejo Alexa fluor 488 (Invitrogen; 1:500).
Se desparafinaron secciones de tejido delgadas con xileno y se hidrataron con concentraciones decrecientes de etanol. Para la recuperación de antígenos diana, las secciones se sometieron a microondas durante 4 minutos a 110 °C en tampón de recuperación de antígenos DAKO pH 9,0. Las secciones se enfriaron en agua destilada durante 5 minutos, después se permeabilizaron con tampón de lavado DAKO (contiene Tween 20) durante 5 minutos, seguido de incubación en tampón de bloqueo (tampón de lavado DAKO con albúmina sérica bovina al 1 %) durante 5 minutos. Los anticuerpos primarios se diluyeron en diluyente de anticuerpos DAKO y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las secciones se lavaron durante 5 minutos en tampón de lavado DAKO seguido de 5 minutos en tampón de bloqueo. Los anticuerpos secundarios se diluyeron en tampón de bloqueo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se repitió el lavado de 2 etapas seguido de 5 minutos de incubación en agua destilada. Se realizó deshidratación con concentraciones crecientes de etanol. Las secciones se montaron con reactivo antidesvanecimiento DAPI ProLong Gold y se almacenaron a -20 °C. Se adquirieron imágenes de inmunofluorescencia con un aumento de 600x usando el microscopio Olympus DP72 y se generaron imágenes usando el software CellSens Entry.
Se cuantificó RAD51 puntuando: a) el porcentaje de células tumorales con focos nucleares RAD51, b) el porcentaje de células positivas para focos de yH2AX con focos de RAD51, o c) el porcentaje de células positivas para geminina con focos de RAD51, como se indica en las figuras. La puntuación se realizó a ciegas en imágenes de vida. Óptimamente, se analizaron cien células positivas para geminina o focos de yH2AX de al menos 3 áreas diferentes y representativas de cada muestra. Cuando estaban disponibles, se estudiaron 3 réplicas biológicas de cada modelo de PDX (tanto tratado con vehículo como con olaparib).
Inmunohistoquímica
La tinción de IHC de RAD51 y geminina en tejido de xenoinjerto tumoral (PDX) derivado del paciente también se desarrolló en la plataforma Ventana Ultra Discovery. Se desparafinaron secciones delgadas de tejidos FFPE usando EZ Prep (Ventana) y luego se recuperaron los antígenos usando la disolución Cell Conditioning 1 (CC1) (Ventana) a 98 °C durante 32 minutos. Los portaobjetos se bloquearon durante 32 minutos a 36 °C usando el reactivo de bloqueo de Mouse on Mouse (M.O.M) (Vector Laboratories) diluido en diluyente de anticuerpos SignalStain (Cell Signaling Technology), y después se bloquearon durante 4 minutos con inhibidor Discovery (Roche). Los portaobjetos se incubaron durante 32 minutos a 36 °C con un cóctel de anticuerpos anti-RAD51 (CST n.° 8875 a 6,6 |ig/ml) y antigeminina (Leica Geminin-NCL-L, dilución 1:10) en el diluyente de anticuerpos Ventana con Caesin (Roche). La detección se llevó a cabo usando anticuerpo UltraMap anti-Rb HRP durante 16 minutos (Roche), UltraMap anti-Ms AP (Roche) durante 12 minutos y luego los kits Purple y Yellow (Roche) cada uno durante 32 minutos. Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina durante 4 minutos. Los portaobjetos se lavaron luego en agua jabonosa, se enjuagaron y se secaron durante 30 minutos a 60 °C, antes de sumergirse en xileno y cubrirse con cubreobjetos. Las etapas de lavado se automatizaron y se realizaron usando tampón de reacción 1x (Roche). Todos los portaobjetos se escanearon usando un escáner Zeiss Axio Z1 con un objetivo de 40x y un mínimo de 4 pilas Z.
Análisis de la expresión de ARNm de RAD51
Se extrajo ARN de muestras de PDX (15-30 mg) usando el kit PerfectPure RNA Tissue (5 Prime). La pureza y la integridad se evaluaron mediante el sistema de bioanalizador Agilent 2100 y se obtuvo ADNc usando el kit de reactivo PrimeScript RT (Takara).
Se realizó RT-PCR cuantitativa en un sistema de PCR rápida en tiempo real 7900HT (Applied Biosystems) usando la mezcla maestra universal TaqMan II (Applied Biosystems) y cebadores específicos humanos prediseñados y sondas TaqMan (Hs99999908_m1 paraGUSB,Hs99999903_m1 paraACTBy Hs00153418_m1 paraRAD51).Se usó el método de CT comparativo para el análisis de datos, en el que se aplicaron algoritmos de geNorm para seleccionar los genes constitutivos más establemente expresados(GUSByACTb )y se calcularon las medias geométricas para obtener valores de CT normalizados.
Cohorte de pacientes
La cohorte consistió en pacientes con cáncer de mama y ovario del Hospital Universitario Vall d'Hebron, con material FFPE representativo de la enfermedad y formulario de consentimiento informado firmado aprobado por la IRB. El análisis de inmunofluorescencia y la cuantificación de focos de RAD51 se realizaron como se describe para muestras tumorales de PDX FFPE.
Análisis estadístico
Todas las pruebas estadísticas se realizaron con GraphPad Prism versión 7.0. Se calculó la prueba de la t pareada o no pareada (dos colas) y se proporcionaron los valores de p. Las barras de error representan el EEM de al menos tres réplicas biológicas, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1. La actividad antitumoral de olaparib en PDX identifica un subconjunto de tumores sensibles a PARpi que presentan alteraciones relacionadas con HRR.
Se evaluó la actividad antitumoral del PARPi olaparib en 39 modelos de PDX de cáncer de mama (BrC), 3 modelos de PDX de cáncer de ovario (HGSOC/OvC) y 2 PDX de cáncer de páncreas (PaC) (figura 1). Para este propósito, se recogieron muestras tumorales recientes de pacientes con BrC, HGSOC o PaC, y se implantaron en ratones desnudos para generar modelos experimentales de PDX. El tratamiento con olaparib mostró actividad antitumoral en diez modelos de PDX tal como se evaluó por RECIST: respuesta completa (CR, n=6), respuesta parcial (PR, n=2) y enfermedad estable (SD, n=2). Todos estos PDX sensibles a PARPi portaban mutaciones del gengBRCA1/2o alteraciones funcionales en la ruta de reparación por recombinación homóloga (HRR), incluidas mutaciones en PALB2 o hipermetilación del promotor deBRCA1.Los 34 modelos de PDX restantes, que se derivaban de pacientes conBRCAmutado yBRCAde tipo silvestre, fueron resistentes a olaparib (PD, enfermedad progresiva). Esta cohorte de PDX se usó para estudiar mecanismos clínicamente relevantes de sensibilidad a PARPi y resistencia adquiridain vivo.
Ejemplo 2: Los tumores no tratados tienen niveles detectables de proliferación celular, daño en el ADN y formación de focos de RAD51.
Se investigó adicionalmente el estado funcional de HRR en tumores incrustados en parafina fijados con formalina (FFPE) de la cohorte de PDX anterior. Los tumores se clasificaron según su respuesta a olaparib, es decir, resistente (PD) frente a sensible (CR/PR/SD), como un criterio de valoración similar a la tasa de beneficio clínico usada en la práctica clínica. Específicamente, en un subconjunto de muestras FFPE de tumores de PDX no tratados (vehículo) y tratados (olaparib), se puntuó el porcentaje de células tumorales con focos nucleares de yH2AX o RAD51 detectados por inmunofluorescencia (figura 2A). Se usaron focos de yH2AX como marcador de daño de ADN bicatenario y focos de RAD51 como marcador de HRR. Como se esperaba, el tratamiento con olaparib aumentó la formación de focos de yH2AX en todos los tumores. Las muestras no tratadas ya tenían niveles de daño en el ADN basales detectables. Se detectaron focos de RAD51 claramente en modelos resistentes y aumentaron con el tratamiento con olaparib. En tumores sensibles a olaparib, los focos de RAD51 fueron muy bajos o indetectables a pesar de la formación de focos de yH2AX.
A continuación, se evaluó el porcentaje de células positivas para focos de geminina y yH2AX (figura 2B). Se usó geminina como marcador de la fase S/G2 del ciclo celular y, por lo tanto, de la proliferación celular. Se observaron niveles comparables de proliferación celular en todos los grupos. El tratamiento con olaparib aumentó la formación de focos de yH2AX tanto en tumores sensibles como resistentes.
El porcentaje de células positivas para RAD51 en células positivas para geminina, a partir de ahora también denominada puntuación de RAD51, se determinó entonces en células de muestras de PDX no tratadas (vehículo) y tratadas (olaparib) (figura 2C). Las tendencias entre las muestras no tratadas y tratadas fueron comparables, por lo tanto, se realizaron estudios y análisis posteriores en el primer grupo, es decir, muestras de individuos no tratados.
La reducción de la formación de focos de RAD51 en tumores sensibles no fue el resultado de la disminución de la expresión de RAD51 (figura 2D), sino que más bien sugería una localización reducida de proteínas RAD51 (es decir, carga de RAD51 en el ADN que iba a repararse) y, por lo tanto, una ruta de HRR disfuncional.
En conjunto, estos datos muestran que el bajo porcentaje de células tumorales con focos nucleares de RAD51 identificados por el ensayo de RAD51 está asociado con la sensibilidad a PARPi, y ese alto porcentaje de células tumorales con focos nucleares de RAD51 está asociado con resistencia a PARPi en la cohorte de PDX.
Ejemplo 3: Una baja formación de focos nucleares de RAD51 identifica tumores de PDX sensibles a PARPi en un panel multicéntrico de 71 modelos de PDX.
Se usó un panel multicéntrico con PDX de VHIO (n = 44, figura 1) y PDX de XenTech (n = 27) para desarrollar y validar preclínicamente el ensayo de RAD51. Se evaluó el porcentaje de células positivas para focos de yH2AX en células positivas para geminina (figura 3A). Los resultados mostraron que se produce daño en el ADN en todos los tumores independientemente de la respuesta a PARPi. Sin embargo, el porcentaje de células positivas para focos de RAD51 en células positivas para focos de yH2AX o en células positivas para geminina se correlacionó con la respuesta a PARPi (figura 3B-D). De hecho, todos los tumores de PDX sensibles a PARPi mostraron un menor porcentaje de células positivas para focos de RAD51 dentro de células positivas para geminina en comparación con PDX resistente a PARPi. La mayoría de las muestras que muestran sensibilidad a PARPi portaban mutaciones en los genesBRCA1/2oPALB2(n = 12 mutados de 17 modelos sensibles) y siete no mostraron formación de focos de BRCA1 (figura 3D). Estos resultados apoyan el potencial del ensayo de RAD51 como biomarcador predictivo de la respuesta a PARPi y HRR funcional, especialmente, pero no exclusivamente, en tumores con algún tipo de deficiencia en al menos una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN.
Ejemplo 4: La evaluación de la formación de focos de RAD51 se asocia con precisión con la respuesta a PARPi.
Para confirmar adicionalmente que la puntuación de RAD51 se asocia con la respuesta a PARPi, se analizaron los resultados de la figura 3C con una curva de característica operativas del receptor (ROC) (figuras 4A y B). En esta cohorte de PDX, los resultados muestran que la puntuación de RAD51 discrimina con un 100%de sensibilidad y un 100 % de especificidad tumores que son sensibles frente a resistentes al tratamiento con PARPi.
Ejemplo 5: La puntuación de RAD51 predice la respuesta a PARPi en muestras clínicas no tratadas.
Adicionalmente, se llevó a cabo una validación clínica de la precisión de la puntuación de RAD51 para discriminar pacientes con tumores sensibles frente a resistentes a PARPi. Los datos resultan de muestras, incluidas metástasis de piel, hígado, peritoneales y de ganglios linfáticos, de pacientes con BrC o HGSOCgBRCAIogBRCA2.Se muestran datos de dos pacientes con resistencia primaria a PARPi, cuatro pacientes sensibles a PARPi y tres pacientes con progresión de PARPi (figura 5A). Estos resultados muestran que la determinación del porcentaje de células con focos nucleares de RAD51 se asocia con precisión con la respuesta a PARPi, y apoya su posible uso en la práctica clínica.
A continuación, se extendió la validación clínica en 24 muestras de un total de 21 pacientes sin mutaciones degBRCA(la figura 5B). Puesto que se sabe bien que PALB2 es esencial para HRR, se enriqueció la cohorte de pacientes con 12 tumores de pacientes que albergaban mutaciones de la línea germinal enPALB2 (gPALB2).Quince de 24 muestras tumorales mostraron baja positividad de RAD51 (< 6%), incluidas doce muestras tumoralesgPALB2.Curiosamente, los tres tumores con RAD51 bajo que carecían de mutaciones degPALB2mostraron falta de focos nucleares de BRCA1 por inmunofluorescencia, lo que sugiere que la hipermetilación del promotor deBRCA1podría ser la causa de la deficiencia de HRR. Por lo tanto, estos resultados confirman que el ensayo de RAD51 identifica tumores deficientes en HRR que pueden beneficiarse de la terapia con PARPi más allá de los cánceres relacionados con BRCA.
Finalmente, se midió la formación de focos de RAD51 (figura 5C) y focos de yH2AX (figura 5D) en 20 muestras de tumorgBRCA(n=10BRCA1y n=10BRCA2mutados), incluidos 10 tumores de cáncer de mama primarios sin tratamiento previo (es decir, de pacientes que nunca han recibido un tratamiento anticancerígeno) y 10 tumores de pacientes que recibieron tratamiento previo en el entorno temprano/metastásico. Cabe destacar que se detectó daño en el ADN endógeno en todos los tumores, incluidos cánceres de mama primarios sin tratamiento previo. Además, la positividad de RAD51/geminina oscila entre el 0-58 % en muestras sin tratamiento previo, un intervalo que es similar para tumores de pacientes que han recibido quimioterapia. Por lo tanto, esta prueba es altamente sensible y confirma la viabilidad de detectar focos de RAD51 en muestras sin tratamiento previo, lo que sugiere que puede estar presente la recuperación de HRR en el momento del diagnóstico.
Ejemplo 6: La puntuación de RAD51 es mayor en la enfermedad con recaída que en pacientes con cáncer de mama congBRCAmutado sin recaída.
Se exploró el posible valor predictivo de la puntuación de RAD51 para anticipar el desenlace de la enfermedad a largo plazo. Para este fin, se realizó el ensayo de RAD51 en tumores primarios no tratados de una cohorte retrospectiva de 19 pacientes con BrC congBRCAmutado. La información clínica de los pacientes se proporciona en la tabla 1.
Tabla 1: Información clínica de los pacientes analizados en el presente ejemplo, que resume el estado de BRCA, subtipo tumoral, estadio de TNM, recaída de la enfermedad y terapia contra el cáncer para esta cohorte de pacientes. Subtipo tumoral: lumA, luminal A; lumB, luminal B; lum, luminal (no especificado). Tipo de tratamiento: PTX, paclitaxel; CP, ciclofosfamida; AC, doxorubicina+CP; L-DOX, doxorubicina liposomal; CB, carboplatino; DTX, docetaxel; ERI, eribulina; ET, epirubicina+DTX; CPC, capecitabina; TC, DTX+CP; TAC, DTX+doxorrubicina+CP; desconocido, quimioterapia estándar desconocida debido a información no disponible en los registros clínicos.
Todos los pacientes recibieron cirugía radical de tumores de mama y quimioterapia estándar, o bien en el entorno neoadyuvante o bien adyuvante. Todos los pacientes que no recayeron (después de > 5 años de seguimiento) mostraron bajas puntuaciones de RAD51. Por el contrario, el nivel de formación de focos de RAD51 fue mayor en tumores de pacientes que presentaban un mal desenlace de la enfermedad, es decir, con recaída (figura 6A). Los grupos con recaída y sin recaída se equilibraron para factores de pronóstico clásicos y se discriminaron mediante la puntuación de RAD51 con un 100 % de sensibilidad y un 80 % de especificidad (figura 6B). Por lo tanto, el ensayo de RAD51 predice la respuesta clínica después de la terapia anticancerígena estándar.
Ejemplo 7: La puntuación RAD51 identifica un subconjunto de cánceres de próstata con alteraciones de HRR.
El ensayo de RAD51 se realizó con éxito en cánceres de próstata (Pr) y metástasis derivadas (figura 7). Se detectaron bajos niveles de focos de RAD51 en tres muestras que portaban una alteración genómica o somática enBRCA2.Cabe destacar que la muestra PrC-021, derivada de un paciente congBRCA2mutado, se obtuvo después de desarrollar resistencia a la quimioterapia estándar carboplatino. Los altos niveles de focos de RAD51 en esta muestra sugieren la reversión de la deficiencia de HRR que probablemente resultó de una exposición prolongada (en particular, siete meses) a este fármaco que daña el ADN. Otras cuatro muestras BRCA de tipo silvestre mostraron una puntuación alta de RAD51. Por lo tanto, la puntuación de RAD51 estratifica los tumores de próstata basándose en la competencia y deficiencia de HRR. Estos datos apoyan el uso de PARPi en pacientes con cáncer de próstata con una baja puntuación de RAD51.
Ejemplo 8: El punto de corte óptimo para la positividad de RAD51 se basa en el número de focos nucleares en células positivas para geminina.
Todos los resultados anteriores se obtuvieron considerando un punto de corte para la positividad de RAD51 de al menos 5 focos de RAD51 por célula positiva para geminina. Este parámetro se obtuvo a partir de un análisis en profundidad de la cuantificación absoluta de focos de RAD51 en nueve modelos representativos de PDX (seis resistentes a PARPi y tres sensibles a PARPi) como se muestra en las figuras 8A-B. Los análisis de cuantificación revelaron que, en tumores deficientes en HRR, la mayoría de las células positivas para geminina tienen cero focos de RAD51, mientras que las células con HRR competente presentan una distribución bimodal del número de focos de RAD51 con el pico más alto a 5 focos por célula (figura 8C). Con respecto a la predicción de la respuesta a PARPi, se analizó el impacto del uso de diferentes umbrales en muestras no tratadas y se demostró que los puntos de corte de 1 a 5 focos por célula proporcionan las predicciones más precisas y específicas (figuras 8D-E). En general, se decidió usar un punto de corte de 5 focos/célula por ser el umbral más alto (es decir, más riguroso) y todavía altamente preciso para las muestras analizadas.
Ejemplo 9: El ensayo de RAD51 es reproducible usando otros anticuerpos comerciales anti-RAD51 y otros ensayos de base inmunitaria.
Se validaron los hallazgos previos cuantificando la puntuación de RAD51 con otro anticuerpo comercial contra RAD51 tanto en PDX tumoral tratado con vehículo como con PARPi (figura 9A). También se observaron resultados similares con un tercer anticuerpo anti-RAD51 sometido a prueba en líneas celulares competentes/deficientes en RAD51 (figura 9B) y en PDX representativo (figura 9C). Además, se desarrolló un ensayo de inmunohistoquímica para cuantificar la puntuación de RAD51 y se obtuvieron resultados comparables en comparación con el ensayo de inmunofluorescencia usado previamente (figuras 9B-C).
Ejemplo 10: El ensayo de RAD51 es viable en múltiples tipos de tumores.
Hasta ahora, se han proporcionado pruebas de que el ensayo de RAD51 funciona en una variedad de subtipos de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata y sitios metastásicos, incluidos piel, ganglios linfáticos y médula ósea (figuras 1-7). Finalmente, también se sometió a prueba el rendimiento del ensayo de RAD51 en otros tipos de tumores, incluidos neuroblastoma pediátrico, metástasis cerebrales y hepáticas. De hecho, se encontraron muestras positivas para focos de RAD51 y muestras negativas para focos de Ra d 51 de una variedad de tipos de tumores, lo que sugiere el posible uso expandido del ensayo de RAD51 en los tumores.
En resumen, estos resultados demuestran que la puntuación de RAD51 es un biomarcador robusto y altamente preciso de la funcionalidad de HRR y la respuesta a terapias contra el cáncer en distintos tipos de tumores.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Método para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado de cáncer a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas, que comprende:
    i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
    ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
    - un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia indica que se predice que el sujeto responderá al tratamiento anticancerígeno, o
    - un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia, indica que se predice que el sujeto no responderá al tratamiento anticancerígeno.
    Método para seleccionar una terapia personalizada para un sujeto diagnosticado de cáncer, que comprende: i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
    ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
    - un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia indica que la terapia que va a seleccionarse comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas, o - un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia indica que la terapia que va a seleccionarse no comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas. Método para clasificar a un sujeto diagnosticado de cáncer en una cohorte de pacientes, que comprende: i) determinar el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra que contiene células tumorales aisladas de dicho sujeto, en donde el sujeto no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
    ii) comparar el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
    - un paciente se clasifica en una cohorte caracterizada por responder a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas si el nivel de células con focos de RAD51 es menor que dicho valor de referencia, o
    - un paciente se clasifica en una cohorte caracterizada por no responder a un tratamiento anticancerígeno que comprende el uso de al menos un método que induce daño en el ADN y/o un agente o una combinación de agentes que se dirigen a la respuesta al daño en el ADN de las células cancerosas si el nivel de células con focos de RAD51 es mayor que dicho valor de referencia.
    Método para predecir si un tumor de un sujeto diagnosticado de cáncer es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga:
    i) determinando el nivel de células con focos de RAD51 en una muestra tumoral, en donde el tumor se ha aislado de un sujeto que no ha recibido, a las 24 horas antes del aislamiento del tumor, una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina, y en donde la muestra no se ha tratado con un método que induce daño en el ADN antes de determinar el nivel de células con focos de RAD51, y
    ii) comparando el nivel obtenido en la etapa i) con un valor de referencia, en donde:
    - un nivel de células con focos de RAD51 inferior a dicho valor de referencia es indicativo de que el tumor es capaz de reparar el ADN mediante recombinación homóloga, o
    - un nivel de células con focos de RAD51 igual o superior a dicho valor de referencia es indicativo de que el tumor no es capaz de reparar el ADN por recombinación homóloga.
    5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el nivel de células con focos de RAD51 en la muestra se determina como el nivel relativo de células con focos de RAD51 con respecto a:
    - el número de células tumorales en la muestra,
    - el número de células en la muestra que están proliferando,
    - el número de células en la muestra que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias y
    - el número de células en la muestra que están proliferando y que muestran daño en el ADN, preferiblemente roturas de ADN bicatenarias.
    6. Método según la reivindicación 5, en donde el número de células en la muestra que están proliferando se determina determinando la expresión de una proteína seleccionada de la lista que consiste en geminina, KI-67, antígeno nuclear de células en proliferación, ciclina A2, y/o en donde el número de células en la muestra que muestran roturas de ADN bicatenarias está determinado por la expresión en el núcleo de una proteína seleccionada de la lista que consiste en yH2AX, proteína de replicación A (pRPA), proteína de unión a p53 1 (53BP1), proteína de reparación de roturas bicatenarias (MRE11).
    7. Método según la reivindicación 6, en donde el número de células en la muestra que están proliferando se determina determinando la expresión de geminina, y en donde el número de células en la muestra que muestran roturas de ADN bicatenarias está determinado por la expresión en el núcleo de yH2AX.
    8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 7, en donde el agente que se dirige a la respuesta al daño en el ADN es un inhibidor de PARP.
    9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células tumorales se caracterizan por una pérdida de función de al menos una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN de la célula, en donde dicha proteína se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en BRCA1, BRCA2 y/o PALB2.
    10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto del que se ha aislado la muestra no ha recibido ningún tratamiento anticancerígeno antes de aislar la muestra.
    11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el sujeto del que se ha aislado la muestra ha recibido un tratamiento anticancerígeno antes del aislamiento de la muestra, en donde el tratamiento anticancerígeno es diferente de una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en AC, FEC, ECF y navelbina/epirubicina si el paciente ha recibido el tratamiento anticancerígeno a las 24 horas antes del aislamiento de la muestra, preferiblemente, en donde el tratamiento anticancerígeno que el sujeto ha recibido es el tratamiento anticancerígeno cuya respuesta se determina en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 a 10.
    12. Medicamento que comprende al menos un agente que induce directamente daño en el ADN o al menos un agente que se dirige a una proteína implicada en la respuesta al daño en el ADN seleccionada del grupo que consiste en: un inhibidor de PARP (PARPi), tal como olaparib, talazoparib, rucaparib, niraparib, veliparib, CEP-8983, E7016 y BGB-290, un agente antimicrotúbulos tal como vincristina o vinblastina, y una antraciclina para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, que comprende además identificar al sujeto como que responde a dicho medicamento antes del tratamiento por el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 11 en la medida en que dependen de la reivindicación 1.
    13. Medicamento para su uso según la reivindicación 12, en donde el medicamento comprende un agente inhibidor de PARP, y se selecciona preferiblemente de la lista que consiste en olaparib, veliparib, niraparib, talazoparib, rucaparib, CEP-8983, e 7016 y BGB-290.
    14. Uso de un kit en el método al que se hace referencia en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51, o en donde el kit comprende un anticuerpo que es capaz de reconocer específicamente la proteína RAD51 y además comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína geminina, y un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la proteína yH2AX o una combinación de los mismos.
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