KR102623934B1 - 자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 - Google Patents
자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract, GSE)을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항균용 조성물은 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 뿐만 아니라, 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)에 대한 항균 효과를 가지는 것으로 실험적으로 확인하였다. 따라서, 본 발명은 MRSA 및 VRSA와 같은 MDR (multidrug-resistant) 세균에 의한 병원내 감염질환의 예방에 활용될 수 있는 자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 뿐만 아니라, 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)에 대한 항균 효과를 가지는, 자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.
항생제의 오남용으로 인해 항생제에 내성이 있는 세균 균주의 수가 계속 증가하고 있다. 이 중, 여러 항생제에 내성이 있는 세균을 다제내성(multidrug-resistant MDR) 세균이라고 한다. 예를 들어, 1960년대 초에 처음 확인된 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)는 메티실린 외에 페니실린 계열과 세팔로스포린 계열의 항생제를 포함한 다른 베타-락탐 항생제에 내성이 있다. MDR 세균은 병원내 감염의 주요 원인이며, MDR 세균에 감염된 환자의 결과는 더 민감한 유기체에 감염된 환자보다 나쁜 경향이 있다. 또한, MRSA와 같은 다제내성 세균에 의한 사망률은 감수성 균주보다 훨씬 높다. 따라서, MDR 세균을 표적으로 삼을 수 있는 새로운 물질을 발견하려는 노력이 점점 더 중요해지고 있다.
MRSA는 환자에 주입된 임플란트(implant), 의료용품 또는 의료기기에 바이오필름(biofilm)을 형성할 수 있는데, 한 번 형성된 바이오필름은 제거가 용이하지 않으므로 패혈증 등의 심각한 병원성 감염을 발생시킬 수 있다. 또한 MRSA는 해당과정을 통하여 당질을 대사하여 유기산을 생산할 수 있다. 이러한 당질대사 과정은 세균의 생존에 필요한 중요한 에너지 획득 기전이다. MRSA가 생산한 유기산은 pH를 하강시켜 바이오필름 형성을 촉진할 수 있는 것으로 알려져 있다.
반코마이신(vancomycin)은 메티실린(methicillin)을 대체하기 위하여 개발된 치료제로써, Streptomyces orientalis에서 분리한 항생물질이 주 소재이며, 현재까지 개발된 항생제 중 가장 강력한 효능을 보유한 항생제이다. 반코마이신은 MRSA가 유일하게 반응하는 항생제이나, 청신경장애, 신장장애, 간장애, 균교대증 및 아나필락시성 쇼크 등의 심각한 부작용이 있는 실정이다. 또한 1996년에 일본에서 반코마이신에도 반응하지 않는 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)가 발견되었다. VRSA는 MRSA와 유사한 특성을 보유하여 바이오필름을 형성하며, 패혈증 등을 발생시킬 수 있음은 물론, 지금까지 개발된 항생제로는 활성 저해가 불가능하다.
즉, MRSA는 다중약물내성을 보이는 특성과 바이오필름을 형성하는 특성을 보유하고 있어 활성 저해가 용이하지 않은 세균이며, VRSA는 지금까지 개발된 어떤 항생제로도 활성 저해가 불가능한 세균이다. 따라서 MRSA와 VRSA의 감염을 치료할 수 있는 새로운 약물의 개발이 속히 촉구되고 있는 실정이다.
항균 효과는 조직 공학등 다양한 분야에서 연구되고 있고, 많은 실험은 항생제-내성 세균을 표적으로 삼을 수 있는 새로운 물질을 식별하기 위해 수행되었다. 최근에는 나노입자(nanoparticles, NPs)를 이용한 항균 활성 실험이 활발히 진행되고 있다. 은, 금 및 ZnO와 같은 나노입자의 항균 효과는 이미 10년 이상 확인되었으며 여전히 활발히 연구되고 있다. 또한, 이러한 나노입자는 VRE(vancomycin-resistant enterococcus) 및 MRSA와 같은 다제내성 세균에 대해서도 항균 효과를 나타내었다. 나노입자 외에도 다제내성 병원체와 싸우기 위해 전통적인 항생제를 대체하는 천연물에 대한 관심이 크게 증가하였다.
천연물은 오랫동안 치료의 기반으로 사용되어 왔다. 오늘날 시장에 나와 있는 대부분의 약물은 천연-기반 물질 또는 그의 유도체이며, 이는 천연-기반 물질이 합성 화학물질보다 인체에 더 잘 수용되고 더 성공적일 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 천연물, 특히, 식물 추출물에 중점을 두었다.
본 발명에서는 항균 활성이 있는 것으로 알려진 12가지 식물 추출물을 MSSA(methicillin-sensitive staphylococcus aureus)에 대한 디스크 확산 테스트(disk diffusion test)로 분석하였다. 이 스크리닝 테스트에서 자몽씨 추출물(GSE)만이 항균 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 목적은 병원내 감염을 통해 심각한 문제를 일으키는 MRSA 및 VRSA와 같은 MDR 세균에 대한 자몽씨 추출물의 항균 활성을 평가하고 자몽씨 추출물의 항균 효과의 원인(기전)을 규명하는 것이다.
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본 발명자들은 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract, GSE)이 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 및 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)와 같은 MDR (multidrug-resistant) 세균에 대한 항균 효과를 가질 수 있는지 연구하였고, 자몽씨 추출물이 MRSA 뿐만 아니라, VRSA에 대한 항균 효과를 가질 수 있음을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract, GSE)을 유효성분으로 포함하는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 및 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)의 항균용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 포함하는 식품 또는 식품첨가물를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract, GSE)을 유효성분으로 포함하는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 및 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)의 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물은 MRSA 뿐만 아니라, VRSA에 대한 항균 효과를 가지므로, MRSA 및 VRSA와 같은 MDR (multidrug-resistant) 세균에 의한 병원내 감염질환의 예방에 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자몽씨 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있다.
본 발명에서, 상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 C1-C4의 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서, “추출”은 당업계에 공지된 추출, 분리 및 분획하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출, 분리 및 분획하여 수득한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서, “추출물”은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다.
상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용하여 수득될 수 있다.
본 발명에 있어서, 자몽씨 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 자몽씨 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자몽씨 추출물은 50 ~ 80% 폴리올에 용해될 수 있다.
상기 폴리올은 글리세롤(glycerol), 1,3-부틸렌글리콜(butylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 및 솔비톨(sorbitol)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 글리세롤(glycerol)일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자몽씨 추출물은 pH가 1.9 ~ 3.9일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자몽씨 추출물은 미세희석 최소억제농도(microdilution minimum inhibitory concentration, MIC)가 <1/1024일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 MRSA는 S. aureus ATCC33591 또는 S. aureus CCARM3795이고, 상기 VRSA는 S. aureus VRSA48일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 항균용 조성물을 포함하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물은 인체에 무해하여 식품보존제나 식품부패방지제 또는 식품살균제와 같은 식품첨가물로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 항균용 조성물을 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 식품은 통상적인 식품이며, 바람직하기로는 자몽씨 추출물의 우수한 항균 효과를 가지는 기능성 식품으로 예로써, 식중독을 예방할 수 있는 항균력이 우수한 기능성 음료로 활용될 수 있다.
본 발명은 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 뿐만 아니라, 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)에 대한 항균 효과를 가지는, 자몽씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
도 1은 메티실린-민감 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA), 메티실린-내성 S. 아우레우스 (methicillin-resistant S. aureus, MRSA) 및 VRSA에 대한 자몽씨 추출물(GSE) 및 리네졸리드(linezolid, LZD)에 대한 디스크 확산 테스트 및 억제 영역 직경을 나타낸 것이다. 도 1a는 S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 1b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 1c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고, 도 1d는 vancomycin-resistant S. aureus (VRSA48)를 나타낸다. LZD의 농도는 CLSI 가이드라인에 따라 30 μg/디스크 이었다. GSE 및 LZD에 대한 억제 영역의 직경은 평균 ± SD로 표시된다(n=3). CLSI 가이드라인(Staphylococcus spp.의 경우 ≥21 mm)에 따르면 테스트한 모든 세균은 LZD에 감수성을 보였으며, GSE도 테스트한 모든 세균에 대해 항균 효과를 보였다. p 값은 본 도면에서 양측 독립표본 t-검정(two-tailed, unpaired t-test)을 사용하여 평가되었다. **** p < 0.0001.
도 2는 GSE 특성화를 나타낸 것이다. 도 2a는 GSE, 76% G 및 pH 76% G에 대한 pH 값을 나타낸다. 테스트된 화합물의 pH 값은 평균 ± SD(n = 3)로서 막대 그래프로 나타낸다. pH 76% G는 76% G로부터 아세트산(acetic acid)을 이용하여 제조하였으며, GSE의 pH 값과 큰 차이를 보이지 않았다. 도 2b는 GSE의 LC-MS/MS 결과를 나타낸다. 글리세롤과 나린진은 케르세틴과 헤스페리딘에 대한 LC-MS/MS 및 LC-MS로 분석되었다. 케르세틴과 헤스페리딘의 피크가 너무 작기 때문에(그래프에 표시되지 않음), 피크가 점선 상자로 대체되었다. 화살표와 피크 위의 숫자는 체류 시간(retention times)을 나타낸다. p 값은 본 도면에서 Dunnett의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었다. ns은 '중요하지 않음'을 표시한다. **** p < 0.0001.
도 3은 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대해 테스트된 화합물 및 LZD에 대한 디스크 확산 테스트 및 억제 영역 직경을 나타낸 것이다. 도 3a는 S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 3b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 3c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고 도 3d는 VRSA48를 나타낸다. LZD의 농도는 30 μg/디스크 이었다. N.D.는 억제 영역이 확인되지 않았음을 의미한다. GSE 및 LZD에 대한 억제 영역의 직경은 평균 ± SD(n=3)로서 막대 그래프로 표시된다. GSE와 LZD는 도 1과 같이 항균효과를 나타내었으나, 76% G 및 pH 76% G에서는 어떠한 억제 영역도 나타내지 않았다. 이는 글리세롤과 GSE의 pH가 GSE의 항균 효과에 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다. p 값은 본 도면에서 Dunnett의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었다. **** p < 0.0001.
도 4는 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대해 테스트된 화합물 및 항생제에 대한 미세 희석 최소 억제 농도(MIC) 테스트를 나타낸 것이다. 도 4a는 (A) S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 4b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 4c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고, 도 4d는 VRSA48를 나타낸다. P는 항균제가 없는 양성 대조군이고 N은 배지와 DW만 있는 음성 대조군이다. 96-웰 플레이트에서 왼쪽에서 오른쪽으로 테스트된 화합물 농도는 1/2 ~ 1/1024이고, 항생제 농도는 32 ~ 0.06 μg/mL이었다. pH 76% G 및 76% G의 MIC는 빨간색 화살표로 표시되고 항생제에 대한 MIC는 파란색 화살표로 표시된다. MIC 값 <1/1024 또는 >32 μg/mL는 화살표로 표시되지 않는다. 각 세균 균주에 대해 테스트된 화합물 및 항생제의 MIC 값은 96-웰 플레이트의 이미지 옆에 막대 그래프로 표시된다. 막대 그래프에서, 빨간색 화살표로 표시된 왼쪽 y축의 테스트된 화합물 MIC 값과 파란색 화살표로 표시된 오른쪽 y축의 항생제 MIC 값을 판독할 수 있다. MRSA 335591 및 3795는 OXA MIC 값 >32 μg/mL를 나타내어 MRSA로 확인되었으며, VRSA48도 OXA 및 VAN에 대한 >32 μg/mL의 MIC 값을 나타내어 VRSA를 확인했다. GSE는 테스트된 모든 세균에 대해 <1/1024 농도의 MIC 값을 나타내었다. MRSA 33591을 제외한, pH 76% G는 76% G(1/2 농도)보다 낮은 MIC 값(1/4 농도)을 나타내었으나, 여전히 GSE의 항균 효과를 설명하기에는 부족하였다.
도 5는 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대해 나린진을 사용한 미세 희석 MIC 테스트를 나타낸 것이다. 도 5a는 S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 5b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 5c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고, 도 4d는 VRSA48를 나타낸다. P는 항균제가 없는 양성 대조군이고 N은 배지와 DW만 있는 음성 대조군이다. 96-웰 플레이트에서 왼쪽에서 오른쪽으로, GSE 및 pH 76% G(naringin) 농도는 1/2 ~ 1/1024이고, 항생제 농도는 32 ~ 0.06 μg/mL 이었다. pH 76% G(naringin)의 MIC는 빨간색 화살표로 표시되고 항생제 MIC는 파란색 화살표로 표시된다. MIC 값 <1/1024 또는 >32 μg/mL는 화살표로 표시되지 않는다. 각 세균 균주에 대한 GSE, pH 76% G(naringin) 및 항생제에 대한 MIC 값 또한 96-웰 플레이트 이미지 옆에 막대 그래프로 표시된다. 막대 그래프에서, 빨간색 화살표로 표시된 왼쪽 y축을 따라 GSE 및 pH 76% G(나린진)의 MIC 값을 판독할 수 있고, 파란색 화살표로 표시된 오른쪽 y축을 따라 항생제의 MIC 값을 판독할 수 있다. GSE와 항생제는 도 4와 같이 동일한 효과를 나타내었다. pH 76% G(naringin)는 pH 76% G보다 더 나은 효과를 나타내지 않았다. 이는 GSE 내 나린진 이외의 물질이 GSE의 항균 활성에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
도 2는 GSE 특성화를 나타낸 것이다. 도 2a는 GSE, 76% G 및 pH 76% G에 대한 pH 값을 나타낸다. 테스트된 화합물의 pH 값은 평균 ± SD(n = 3)로서 막대 그래프로 나타낸다. pH 76% G는 76% G로부터 아세트산(acetic acid)을 이용하여 제조하였으며, GSE의 pH 값과 큰 차이를 보이지 않았다. 도 2b는 GSE의 LC-MS/MS 결과를 나타낸다. 글리세롤과 나린진은 케르세틴과 헤스페리딘에 대한 LC-MS/MS 및 LC-MS로 분석되었다. 케르세틴과 헤스페리딘의 피크가 너무 작기 때문에(그래프에 표시되지 않음), 피크가 점선 상자로 대체되었다. 화살표와 피크 위의 숫자는 체류 시간(retention times)을 나타낸다. p 값은 본 도면에서 Dunnett의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었다. ns은 '중요하지 않음'을 표시한다. **** p < 0.0001.
도 3은 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대해 테스트된 화합물 및 LZD에 대한 디스크 확산 테스트 및 억제 영역 직경을 나타낸 것이다. 도 3a는 S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 3b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 3c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고 도 3d는 VRSA48를 나타낸다. LZD의 농도는 30 μg/디스크 이었다. N.D.는 억제 영역이 확인되지 않았음을 의미한다. GSE 및 LZD에 대한 억제 영역의 직경은 평균 ± SD(n=3)로서 막대 그래프로 표시된다. GSE와 LZD는 도 1과 같이 항균효과를 나타내었으나, 76% G 및 pH 76% G에서는 어떠한 억제 영역도 나타내지 않았다. 이는 글리세롤과 GSE의 pH가 GSE의 항균 효과에 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다. p 값은 본 도면에서 Dunnett의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었다. **** p < 0.0001.
도 4는 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대해 테스트된 화합물 및 항생제에 대한 미세 희석 최소 억제 농도(MIC) 테스트를 나타낸 것이다. 도 4a는 (A) S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 4b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 4c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고, 도 4d는 VRSA48를 나타낸다. P는 항균제가 없는 양성 대조군이고 N은 배지와 DW만 있는 음성 대조군이다. 96-웰 플레이트에서 왼쪽에서 오른쪽으로 테스트된 화합물 농도는 1/2 ~ 1/1024이고, 항생제 농도는 32 ~ 0.06 μg/mL이었다. pH 76% G 및 76% G의 MIC는 빨간색 화살표로 표시되고 항생제에 대한 MIC는 파란색 화살표로 표시된다. MIC 값 <1/1024 또는 >32 μg/mL는 화살표로 표시되지 않는다. 각 세균 균주에 대해 테스트된 화합물 및 항생제의 MIC 값은 96-웰 플레이트의 이미지 옆에 막대 그래프로 표시된다. 막대 그래프에서, 빨간색 화살표로 표시된 왼쪽 y축의 테스트된 화합물 MIC 값과 파란색 화살표로 표시된 오른쪽 y축의 항생제 MIC 값을 판독할 수 있다. MRSA 335591 및 3795는 OXA MIC 값 >32 μg/mL를 나타내어 MRSA로 확인되었으며, VRSA48도 OXA 및 VAN에 대한 >32 μg/mL의 MIC 값을 나타내어 VRSA를 확인했다. GSE는 테스트된 모든 세균에 대해 <1/1024 농도의 MIC 값을 나타내었다. MRSA 33591을 제외한, pH 76% G는 76% G(1/2 농도)보다 낮은 MIC 값(1/4 농도)을 나타내었으나, 여전히 GSE의 항균 효과를 설명하기에는 부족하였다.
도 5는 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대해 나린진을 사용한 미세 희석 MIC 테스트를 나타낸 것이다. 도 5a는 S. aureus ATCC 6538 (MSSA)를, 도 5b는 S. aureus ATCC 33591 (MRSA)를, 도 5c는 S. aureus CCARM 3795 (MRSA)를, 그리고, 도 4d는 VRSA48를 나타낸다. P는 항균제가 없는 양성 대조군이고 N은 배지와 DW만 있는 음성 대조군이다. 96-웰 플레이트에서 왼쪽에서 오른쪽으로, GSE 및 pH 76% G(naringin) 농도는 1/2 ~ 1/1024이고, 항생제 농도는 32 ~ 0.06 μg/mL 이었다. pH 76% G(naringin)의 MIC는 빨간색 화살표로 표시되고 항생제 MIC는 파란색 화살표로 표시된다. MIC 값 <1/1024 또는 >32 μg/mL는 화살표로 표시되지 않는다. 각 세균 균주에 대한 GSE, pH 76% G(naringin) 및 항생제에 대한 MIC 값 또한 96-웰 플레이트 이미지 옆에 막대 그래프로 표시된다. 막대 그래프에서, 빨간색 화살표로 표시된 왼쪽 y축을 따라 GSE 및 pH 76% G(나린진)의 MIC 값을 판독할 수 있고, 파란색 화살표로 표시된 오른쪽 y축을 따라 항생제의 MIC 값을 판독할 수 있다. GSE와 항생제는 도 4와 같이 동일한 효과를 나타내었다. pH 76% G(naringin)는 pH 76% G보다 더 나은 효과를 나타내지 않았다. 이는 GSE 내 나린진 이외의 물질이 GSE의 항균 활성에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 세균 균주 및 배양 조건
S. aureus ATCC6538 (MSSA) 및 S. aureus ATCC33591 (MRSA)는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입했다. S. aureus CCARM3795 (MRSA)는 항생제내성균주은행(노원구, 서울, 한국)에서 구입했다.
임상적으로 분리된 VRSA48은 한동대학교 곽진환 교수(포항 북구 HGU, 대한민국)를 통해 한국생명공학연구원(대전, 유성구, KRIBB)에서 제공되었다. -80℃의 냉동고에서 글리세롤 스톡 용액과 함께 보관된 모든 균주는 트립신 소이 한천(tryptic soy agar, TSA, Difco Laboratories, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) 플레이트에 도말하고 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 단일 콜로니를 트립신 소이 브로스(tryptic soy broth, TSB, Difco Laboratories, Sparks, MD, USA)로 옮기고 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 원하는 농도를 얻기 위해, 희석은 디스크 확산 테스트를 위해서는 인산완충식염수(PBS; Gibco, Grand Island, NY, USA)로, 미량 희석 최소 억제 농도(MIC) 테스트를 위해서는 TSB 배지로 이루어졌다.
2. 식물 추출물 및 항균제
이미 시중에 나와 있는 비누와 화장품에 사용되고 있고, 현재는 의약용으로는 활용되지 않는 천연 추출물 중에서, 항균 활성이 있고 경제성이 있다고 판단되는 12개의 추출물을 구입하여 사용했다. 대나무 추출물은 KoreaSimilac (경기도 포천)에서 구입했다. 정제 목초액(Refined wood vinegar), 로즈마리(rosemary), 소나무 덴시플로라 잎(Pinus densiflora leaf), 소포라(Sophora), 계피나무 껍질(Cinnamomum cassia bark), 히비스커스 사브다리파 꽃(Hibiscus sabdariffa flower), 카모밀라 레쿠티타 꽃(Chamomilla recutita (Matricaria) flower), 병풀(Centella asiatica), 어성초(Houttuynia cordata) 및 유카(Yucca) 추출물은 HERBFLORA(서울 도봉구)에서 구입했다. 자몽씨 추출물(GSE)은 CANDLEIKEA(서울 중구)에서 구입했다. 대나무, 로즈마리, 소포라, 병풀, 어성초 및 유카 추출물은 열수 추출로 추출했다. 계피나무 껍질, 히비스커스 사브다리파 꽃 및 카모밀라 레쿠티타 꽃 추출물은 저온 추출로 추출했다. 정제 목초액, 소나무 덴시플로라 잎 및 자몽씨 추출물에 대한 추출유형은 회사의 기밀로 인해 미공개한다. 반코마이신(Vancomycin, VAN), 옥사실린(oxacillin, OXA) 및 리네졸리드(linezolid, LZD)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다.
3. pH 측정
자몽씨 추출물(GSE), 76% G(76% 글리세롤) 및 pH 76% G(pH 조정된 76% 글리세롤)의 pH는 pH 미터(inoLab pH 7110, WTW, Weilheim, Germany)로 측정되었다. 76% 글리세롤 용액은 글리세롤(≥99.0%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 증류수(DW)를 첨가하여 제조하였고, 아세트산을 이용하여 76% G로부터 pH 76% G를 제조하였다. 전극을 실온(24℃)에서 각 용액에 담그고 각각의 측정을 3회 반복하여 평균을 냈다.
4. LC-MS 및 LC-MS/MS에 의한 GSE 분석
자몽씨 추출물(GSE)은 연세대학교 공동기기원(YCRF)에서 Ultimate 3000 RS-Q Exactive Orbitrap Plus(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC-MS) 및 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 분석했다.
네거티브 모드 LC 조건의 경우, Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm, 2.1 × 100 mm)이 40℃에서 LC 컬럼으로 사용되었다. 주입 부피는 3 μL였고 런닝타임은 12분이었다. 용매 A, DW 중 6.5 mM 중탄산 암모늄 및 용매 B, 아세토니트릴(ACN) 중 6.5 mM 중탄산 암모늄으로 구성된 이동상은 0.4 mL/min의 유속으로 전달되었다. 다음 선형 구배가 사용되었다: 0분, 0% B; 1분, 10% B; 9분, 100% B; 12분, 10% B. 전자분무 이온화(electrospray ionization, ESI)(음이온화 모드) 조건은 다음과 같다: 모세관 전압은 3.0 kV, S-렌즈 RF 레벨은 45, 모세관 온도는 370℃, 보조 가스 히터 온도는 285℃였다. 외피 및 보조 가스 흐름은 각각 60 및 20이었다.
5. 시험관 내 연구
5-1. 디스크 확산 테스트
TSA 플레이트에서 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 생장시킨 모든 균주는 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 TSB 배지 3 mL에 별도로 계대 배양했다. 배양된 세균을 PBS로 희석하여 대략 1~2 × 108 CFU(colony forming unit)/mL의 세균 세포 밀도를 얻은 후, 희석된 세균 현탁액을 멸균된 면봉을 사용하여 TSA 플레이트(100 mm × 15 mm)에 도포하였다. 세균 농도는 분광광도계로 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 결정했다. 실제 콜로니 수는 원하는 농도로 희석한 세균 배양액을 103 CFU/mL로 희석한 후 MHA plate에 100 μL를 떨어뜨리고 펼치고 배양하여 확인하였다. 각 배지의 표면을 3-5분 동안 건조시킨 후, 에틸렌 가스로 멸균한 ADVANTEC 종이 디스크(8mm/0.7mm)를 TSA 플레이트에 놓고 집게로 눌러 각 한천 표면과 완전히 접촉되도록 했다. 스크리닝 테스트를 위해, 20 μL의 식물 추출물과 리네졸리드(1.5 mg/mL)를 S. aureus ATCC6538(MSSA)로 펼쳐진 한천 플레이트 위에 있는 종이 디스크 위로 로딩했다. MDR 세균에 대한 GSE의 항균 효과를 확인하기 위해, 20 μL의 GSE 및 리네졸리드(1.5 mg/mL)를 MSSA 및 MDR 세균이 펼쳐진 별도의 한천 플레이트 위에 있는 종이 디스크 위로 로딩했다. 글리세롤 및 pH가 세균 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해, MSSA 또는 MDR 세균이 펼쳐진 플레이트 위에 있는 종이 디스크 위로 20 μL의 GSE, 76% G, pH 76% G 및 리네졸리드(1.5 mg/mL)를 별도로 로딩한 후, 한천 플레이트를 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 배양했다. 배양 후, 억제 영역의 직경은 디스크의 중심을 가로질러 가장자리에서 가장자리까지 측정되었다. 모든 실험은 3회 수행되었다.
5-2. 미세희석 MIC 테스트
GSE, 76% G, pH 76% G, 나린진(naringin, 1.7 mg/mL)이 포함된 pH 76% G 및 항균제의 MIC는 이중 미세희석 브로스 방법(microdilution broth method)을 사용하여 결정되었다. 나린진을 먼저 DMSO에 용해시킨 다음 pH 76% G로 희석하고, 다른 모든 테스트 화합물은 DW로 희석하였다. GSE, 76% G, pH 76% G 및 나린진(1.7 mg/mL)이 포함된 pH 76% G를 희석하여 원액에서 1/512까지 10가지 농도를 산출하고 항균제를 희석하여 64 μg에서 0.125 μg/mL까지 10가지 농도를 산출했다. 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 TSA 플레이트에서 생장한 모든 균주를 18시간 동안 35℃ ± 2℃에서 3 mL의 TSB 배지에 계대 배양했다. 배양된 세균 브로스 현탁액을 TSB 배지로 희석하여 약 1 × 106 CFU/mL의 세균 세포 밀도를 얻었다. 100 마이크로리터의 각각 희석된 세균 현탁액을 100 μL의 연속 희석된 테스트 화합물이 포함된 96-웰 플레이트에 씨딩하여 세균 농도가 5 × 105 CFU/웰이 되도록 했으며, 결과적으로 테스트 화합물도 1/2로 희석되었다. 상기 96-웰 플레이트를 35℃ ± 2℃에서 18시간 동안 배양했다. MIC는 육안으로 볼 때 세균 생장을 완전히 억제하는 가장 낮은 농도로 정의되었다. MIC 테스트는 각 세균에 대한 항생제의 MIC 값을 여러 번 찾아내어 수행하였기 때문에, GSE를 포함한 각각의 MIC 테스트는 하나의 실험으로 완료되었다.
6. 통계 분석
모든 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 각 실험에서 n은 반복 시도 횟수이다. 통계적 유의성은 두 그룹 간의 차이에 대한 독립표본 양측 t-검정과 두 그룹 이상의 차이에 대한 일원 분산 분석 및 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 결정되었다. GraphPad Prism 8 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하였다.
실험 결과
1. 디스크 확산 테스트에서 GSE의 항균 효과
시판되는 식물 추출물 중 항균 효과가 있는 것으로 알려진 추출물 12종을 구입하여 MSSA ATCC6538에 대하여 디스크 확산 테스트를 통해 12종 추출물의 항균 활성을 분석하였다. 디스크 확산 테스트는 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 기술한 표준 방법으로 많은 화합물의 항균 활성을 빠르고 쉽게 평가할 수 있는 실험방법으로 알려져 있다. 추출물이 항균작용을 하면 추출물을 떨어뜨린 종이 디스크 주위에 억제 영역(inhibition zone)가 형성된다. 매우 효과적인 항균제는 세균 생장 없이 넓은 고리를 생성하는 반면, 효과가 없는 항균제는 주변 세균 농도의 변화를 나타내지 않는다. GSE를 제외한 다른 식물 추출물은 디스크 확산 테스트에서 MSSA에 대한 항균 효과를 나타내지 않았다. 따라서, 후속 실험에서는 GSE만 사용되었다. GSE는 MDR 세균(MRSA 및 VRSA) 및 MSSA에 대해서 억제 영역을 나타내었다(도 1). MSSA, MRSA 33591, MRSA 3795 및 VRSA48에 대한 GSE의 억제 영역은 각각 18.3 ± 0.6 mm, 16.8 ± 0.6 mm, 18.8 ± 0.3 mm 및 16.4 ± 0.4 mm 로 나타났다(n = 3). VRSA48을 사용한 실험에서는 GSE 종이 디스크를 둘러싸는 두 개의 원이 관찰되었다. 하나는 작은 원(실제 억제 영역)이었고 다른 하나는 더 큰 원(박테리아 생장의 불완전한 억제 영역)이었다. 따라서 더 작은 원이 억제 영역으로 측정되었다. GSE는 테스트한 모든 세균에 대해 항균 효과를 나타냈다. MSSA, MRSA 33591, MRSA 3795 및 VRSA48에 대한, 대조군으로 사용된 LZD의 억제 영역은, 각각 28.8 ± 0.3 mm, 29.3 ± 0.6 mm, 24.6 ± 0.5 mm, 및 25.7 ± 0.4 mm로 나타났다(n= 3). 이러한 직경 값은 막대 그래프로 표시되었다. CLSI 가이드라인(Staphylococcus spp.의 경우 ≥21mm)에 따라 테스트된 모든 세균은 LZD에 감수성이 있었다. GSE의 억제 영역은 LZD보다 작았지만 GSE의 항균효과는 디스크 확산 테스트를 통해 확인하였다. 다음 실험에서는 GSE가 용해된 용매 또는 GSE 자체의 산성 특성으로 인해 GSE의 항균 효과가 발생할 수 있으므로 GSE의 용매의 pH 및 백분율을 측정하였다.
2. GSE 특성화
GSE 용액의 pH 또는 용매는 세균 생장에 영향을 미칠 수 있으므로 GSE의 pH 및 용매 백분율은 pH 미터(inoLab pH 7110, Germany)와 LC-MS/MS 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 각각 측정되었다. 글리세롤은 정량적으로 분석되었다. 이는 CANDLEIKEA(서울)로부터 자몽씨 추출물(GSE)이 페놀 화합물을 얻는데 매우 효과적인 글리세롤에 용해되었다는 정보를 입수했기 때문이다. GSE의 pH는 2.90 ± 0.04(n =3)이고 GSE 추출물은 76% 글리세롤에 용해되었음을 확인하였다(도 2). 이러한 결과를 바탕으로 76% 글리세롤(종이 전체에 걸쳐 포함됨, 이하, 76% G로 표기함)을 제조하고, 76% G로부터 초산을 사용하여 pH 조정된 76% 글리세롤(종이 전체에 걸쳐 포함됨, 이하, pH 76% G로 표기함)을 제조하였다. 76% G 및 pH 76% G의 pH는 pH 미터를 사용하여 측정한 결과, 각각 4.37 ± 0.06 및 2.94 ± 0.01의 pH 값을 나타냈다(n = 3). pH 76% G는 GSE의 pH와 큰 차이 없이 주의해서 준비되었다. GSE에는 항균 효과가 있는 플라보노이드가 포함되어 있는 것으로 알려져 있으므로 글리세롤 외에 플라보노이드 또한 LC-MS 및 LC-MS/MS로 분석하였다. GSE는 상대적으로 많은 양의 flavonoid naringin을 함유하고 있는 것으로 알려져 있어 naringin을 정량적으로 분석하였다. 글리세롤과 나린진은 LC-MS/MS로 분석하였고, 다른 플라보노이드인 헤스페리딘(hesperidin), 에리오시트린(eriocitrin), 폰시린(poncirin), 케르세틴(quercetin)은 LC-MS로 분석하였다. GSE에서 글리세롤 및 나린진의 농도를 측정하기 위해 참조 화합물로서 글리세롤(≥99.0%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 naringin(≥95.0%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 구입했다. 이러한 시약들을 DW에 용해한 후 LC-MS/MS로 측정하여 GSE 분석 결과와 비교하였다. 글리세롤 농도는 0.63분에 762.544 mg/mL(760 mg/mL, 76%로 간주됨)로 측정되었으며, 나린진 농도는 3.64분에 1.726 mg/mL(1.7 mg/mL로 간주됨)로 측정되었다. LC-MS 결과로부터, GSE에서 케르세틴과 헤스페리딘이 각각 0.74분과 3.70분에 확인되었다. 그러나, 케르세틴과 헤스페리딘 농도가 매우 낮기 때문에 도 2b에서 피크로 나타나지 않았다. 에리오시트린과 폰시린은 GSE에서 검출되지 않았다.
3. 디스크 확산 테스트에서의 GSE의 용매 및 pH의 항균 효과
76% G에 용해된 GSE를 분석한 결과, pH 값도 낮은 것으로 나타났다. 고농도의 글리세롤과 낮은 pH는 세균 생장에 영향을 미칠 수 있기 때문에, GSE 및 LZD와 함께 76% G 및 pH 76% G의 항균 활성을 평가했다. 디스크 확산 테스트에서 GSE 및 LZD는 도 1에 표시된 것과 거의 동일한 효과를 나타냈지만 76% G 및 pH 76% G는 테스트된 세균에 대해 어떠한 억제 영역도 나타내지 않았다(도 3). 따라서 76% G 및 pH 76% G는 막대 그래프에서 N.D.(검출되지 않음)로 표시되었다. VRSA48을 이용한 실험에서는 글리세롤 그룹에서 억제 영역이 형성되는 것으로 나타났으나, 억제 영역과 유사한 원 내부에서 세균의 생장이 확인되었다. 디스크 확산 테스트에서 글리세롤 및 GSE의 pH가 GSE의 항균 효과에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
4. 미세희석 MIC 테스트에서의 GSE의 용매 및 pH의 항균 효과
글리세롤 또는 GSE의 pH가 GSE의 항균 활성에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해 미세희석 MIC 테스트를 수행했다. MIC 테스트는 CLSI에서 설명하는 표준 방법이기도 하다. 이 방법은 다양한 농도에 따라 항균 효과를 나타내므로 디스크 확산 테스트보다 세밀한 분석 방법이다. 96-웰 플레이트 이미지에서 pH 76% G 및 76% G의 MIC는 빨간색 화살표로 표시되고 항생제의 MIC는 파란색 화살표로 표시된다. GSE의 MIC 및 >32 μg/mL 항생제에 대한 MIC는 표시되지 않는다. MIC 테스트에서, GSE는 테스트된 모든 세균에 대해 강력한 항균 활성을 보였다. 1/1024의 농도에서도 테스트된 모든 세균 생장이 억제되었다. 1/64 및 1/128 농도에서 세균 집락을 닮은 붉은 점과 다른 농도 그룹에서 보이는 탁도는 GSE 자체의 영향의 결과이며, CFU 값의 확인을 통해, 세균이 1/2에서 1/1024 농도까지 생장하지 않음을 확인하였다(데이터는 표시되지 않음). 76% G 및 pH 76% G 처리는 MIC 테스트에서 약간의 항균 효과를 보였다. pH 76% G는 MRSA를 제외하고 76% G(1/2 농도)보다 한 수준 낮은(1/4 농도) MIC 값을 나타냈다. MRSA의 경우, 76% G와 pH 76% G는 모두 1/2 농도에서 MIC 값을 나타냈다. 항생제를 대조군으로 사용하여 실험이 제대로 수행되었는지 확인하고 MRSA 및 VRSA를 확인하는 데에도 사용했다. MSSA와 MRSA는 OXA MIC 값(≥4 μg/mL, MRSA)으로 구분할 수 있고 VRSA는 VAN MIC 값(≥16 μg/mL, VRSA)으로 구분할 수 있다. VAN, OXA 및 LZD는 MSSA에 대해 각각 1 μg/mL, 0.25 μg/mL 및 2 μg/mL의 MIC 값을 보여주었다. VAN, OXA 및 LZD는 MRSA 33591에 대해 각각 1 μg/mL, >32 μg/mL 및 1 μg/mL의 MIC 값을 보여주었다. VAN, OXA 및 LZD는 MRSA 3795에 대해 각각 1 μg/mL, >32 μg/mL 및 1 μg/mL의 MIC 값을 보여주었다. VAN, OXA 및 LZD는 VRSA48에 대해 각각 >32 μg/mL, >32 μg/mL 및 4 μg/mL의 MIC 값을 보여주었다. 이러한 결과는 막대 그래프로 표시된다. GSE, pH 76% G, 76% G의 MIC는 왼쪽 y축(빨간색 화살표)의 값으로, 항생제의 MIC는 오른쪽 y축(파란색 화살표)의 값으로 판독할 수 있다. GSE는 어떤 실험 그룹에서도 1/1024 농도에서 조차 세균이 자라지 않아 <1/1024로 표시되었다. 항생제의 경우 32 ㎍/mL의 농도에서도 세균의 생장이 억제되지 않으면 MIC는 >32로 표시되었다. 이러한 항생제 MIC 값을 기반으로 MSSA, MRSA 및 VRSA를 식별할 수 있으며 실험의 신뢰성을 확인했다. MIC 테스트는 각 균주별 항생제의 MIC 값을 여러 번 찾아내어 수행하였기 때문에 GSE를 포함한 각 MIC 테스트는 한 번의 실험으로 완료되었다. 디스크 확산 테스트와 MIC 테스트에서 pH 및 글리세롤은 GSE의 항균 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이는 GSE의 pH 및 용매 외에 GSE의 항균 활성에 영향을 미치는 물질이 있음을 의미한다. GSE 또는 다른 식물의 항균 활성과 관련된 여러 기사에서 플라보노이드가 항균 활성을 가지는 것으로 나타냈다. GSE는 플라보노이드 나린진(naringin)을 다량 함유하고 있어 나린진을 중심으로 다음과 같은 실험을 진행하였다.
5. 나린진(naringin)의 항균 효과
S. aureus를 비롯한 여러 세균 종에 대한 나린진의 항균 활성은 이미 여러 논문에서 확인되었다. 실험은 1.7 mg/mL 나린진을 포함하는 pH 76% G 용액을 준비한 후 수행하였다. 도 5에서 “pH 76% G(naringin)”로 표시되어 있다. 96-웰 플레이트 이미지에서 pH 76% G(naringin)의 MIC는 빨간색 화살표로 표시되고 항생제 MIC는 파란색 화살표로 표시된다. GSE의 MIC 및 >32 μg/mL 항생제에 대한 MIC는 표시되지 않는다. 막대 그래프에서, GSE 및 pH 76% G(naringin)의 MIC는 왼쪽 y축(빨간색 화살표)의 값으로 판독할 수 있고, 항생제의 MIC는 오른쪽 y축(파란색 화살표)의 값으로 판독할 수 있다. 도 4의 결과와 비교하여 GSE와 항생제는 동일한 MIC 값을 나타내었다. pH 76% G(naringin) 역시 MSSA, MRSA 33591, MRSA 3795 및 VRSA48에 대해 나린진이 없는 pH 76% G와 동일한 효과를 보였다. 도 5의 결과로부터, 나린진이 GSE의 항균 활성에 중요한 역할을 하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. GSE의 항균 효과는 시판되는 GSE에서 흔히 사용되는 방부제인 염화벤제토늄(benzethonium chloride)에 의해 나타날 수 있으나, 본 실험에 사용된 GSE는 염화벤제토늄이 포함되지 않음을 제조사로부터 확인하였다. 또한, GSE의 항균 효과는 플라보노이드의 상승 효과에 기인할 수 있다. 그러나 나린진 이외의 플라보노이드의 농도는 매우 적기 때문에 시너지 효과의 가능성은 매우 낮다. 이러한 실험과 결과는 GSE에서의 플라보노이드 이외의 다른 페놀 화합물이 GSE의 항균 효과에 기여한다는 주장을 간접적으로 뒷받침할 수 있다. 그러나 LC-MS/MS 분석은 용매(글리세롤)를 제거하지 않고 수행하여 글리세롤의 농도를 확인하고 농축된 GSE를 만드는 필터가 항균 활성 물질을 걸러낼 수 있는 잠재적 위험을 제거하였다.
결론
본 발명은 MRSA 뿐만 아니라, VRSA에 대한 GSE의 항균 효과를 처음으로 확인한 것이다. GSE는 디스크 확산 및 미세희석 MIC 테스트에서 MSSA, MRSA 및 VRSA에 대한 항균 활성을 보였다. 본 발명의 실험은 항균 활성이 있을 것으로 예상되는 글리세롤, 산성조건 및 나린진을 함께 진행하였으나, GSE의 항균 효과는 충분히 설명되지 않았다. 그럼에도 불구하고 GSE는 MSSA 뿐만 아니라 MDR 세균에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지므로, 병원내 감염을 예방하거나 감소시키는 중요한 천연물질이 될 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
Claims (7)
- 76 ~ 80 %(w/v) 글리세롤(glycerol) 용매로 추출된 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract, GSE)을 유효성분으로 포함하는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA) 및 반코마이신-내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)의 항균용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 자몽씨 추출물은 pH가 1.9 ~ 3.9인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 자몽씨 추출물은 미세희석 최소억제농도(microdilution minimum inhibitory concentration, MIC)가 <1/1024인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 MRSA는 S. aureus ATCC33591 또는 S. aureus CCARM3795이고,
상기 VRSA는 S. aureus VRSA48인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
- 제1항에 따른 항균용 조성물을 포함하는 식품 또는 식품첨가물.
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