KR102611992B1 - 키토산으로 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 키토산이 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도에 관한 것으로, 500 ㎚ 이하, 또는 300 ㎚, 특히 100 ㎚ 이하의 입자 크기를 갖고 안정성이 우수한 나노 캡슐 제조 방법을 확립하였고, 이로부터 제조된 나노 캡슐에 난용성 약물을 로딩하여, 약물을 포함하는 나노 캡슐의 우수한 피부 투과율 및 이로 인한 피부 내로의 약물 전달과 약물에 의한 효능이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 제조한 나노 캡슐의 경구 투여를 통한 생체 내 유효성분들의 생체이용률이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 이용하여 의약 분야, 화장품 업계, 식품 산업 등에서의 난용성 약물 또는 유효물질들의 인체 및 가축, 반려 동물 등과 같은 동물에 전달 효율이 현저히 증가된 우수한 전달 시스템을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

키토산으로 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도{Nanocapsule coated with chitosan and use thereof}
본 발명은 키토산으로 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 플루로닉을 포함하는 나노 입자를 키토산으로 코팅한 나노 캡슐 및 이의 용도에 관한 것이다.
나노 입자(nanoparticles)는 일반적으로 원자보다 크고 세포보다 작은 크기로서 지름이 1~1,000 ㎚ 사이의 입자 형태의 물질을 일컫는 것으로, 나노 입자의 크기가 작아지면서 생기는 표면적 증가 효과나 침투 효과를 이용해 새로운 응용 분야를 만들어내고 있는 소재이다. 특히나 전자기적 성질을 이용하는 전자 부품분야, 약물 흡수 성질을 이용하는 의약, 화장품 분야, 광촉매나 연료 전지 분야 등에서 사용이 크게 증대되고 있다.
나노 입자는 보통 금(gold), 산화주석(tin oxide), 알부민(albumin) 등의 중합물질(polymeric material)과 같은 비활성 물질들을 이용해 만들 수 있는데, 이러한 수준의 입자들은 보자 직경이 큰 입자들에 비해 생물학적 시스템에 적용되었을 때 막을 통한 투과성 증대, 광학적 활성화, 분자 수준에서의 응집 현상에 대한 조절 등과 같은 물리적, 화학적, 생물학적으로 뚜렷이 구분되는 특성을 가지고 있다.
나노 캡슐은 나노 크기의 속이 비어 있는 공 모양의 캡슐로, 나노 캡슐의 비어 있는 내부에 다양한 물질을 담을 수 있다. 리포좀은 대표적인 나노 캡슐의 한 종류로서, 양쪽성 성질을 지닌 인산지방질 등이 두 겹으로 층을 이루어 구의 형태로 존재하는 것으로 수용성인 약을 빈 공간에 포함시킬 수 있어 약물 전달 등에서 이용되고 있다. 그러나 이러한 리포좀의 경우 구조가 안정하지 않고 투과도가 낮다는 단점을 지니고 있어 제한적인 분야에서만 응용되고 있다. 따라서 속이 빈 캡슐의 안정성과 투과도를 늘리고자 하는 시도가 많은 방법에서 접근되어 왔고, 그 결과 고분자로 만든 나노 캡슐이 탄생하게 되었다.
의약 분야에서는 현재 다양한 약물이 함유된 나노 전달체들을 이용하여 세포막 안으로 전달하여 약물의 약효가 발현될 수 있도록 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 대표적인 약물 전달체를 살펴보면, 먼저 리포좀(liposome)은 인지질로 구성된 전달체로써 친유성 및 친수성 약물을 모두 함유시킬 수 있으며, 생체적합성 물질로 독성이 없으며 목적에 맞도록 입자 표면을 개질화 할 수 있다는 장점을 가지고 있으나, 간이나 비장의 세포 내에서 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의해 포획되어 혈액으로부터 신속하게 제거되거나 입자가 깨져 표적에 도달하는 양이 적다는 단점을 가지고 있어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 리포좀 표면에 수식화하여 체내 혈중 체류 시간을 늘리거나 다양한 항체 또는 리간드를 적용시켜 표적성 증가를 의해 사용되기도 한다. 마이셀(micelle)은 친수성과 소수성 사슬로 이루어진 공중합체로 구성된 전달체로써, 수용액 상에서 중심부는 소수성 부분이 서로 모여 구형을 이루게 되며, 보통 난용성 약물을 중심부에 함유시켜 용해도 증가 및 생체 이용률을 높이는 연구들이 진행되고 있다(권익찬, 2010).
화장품 업계는 미백, 주름, 항산화, 항노화 등의 기능성 화장품의 신소재 개발과 더불어 실제적으로 피부에 적용시 경피 흡수율을 높이는 기술이 중요한 과제이다. 피부라는 장벽에 의해 유효성분이 흡수되지 못하기 때문에 아무리 뛰어난 효능을 가진 성분이라고 할지라도 피부에 적용 시 그 효과를 발휘하지 못하기 때문이다. 따라서 화장품 업계의 가장 큰 관심은 유효성분을 피부에 자극을 주지 않으면서도 흡수를 촉진시키고 효과를 최대화할 수 있느냐에 놓여 있다. 이에, 유효 성분의 흡수를 촉진시키기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며 현재도 국소 작용(topical effect)에서 전신 작용(systemic effect) 등으로 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이러한 연구를 통해 크기가 500 ㎚ 이하이고, 수중유(oil in water, O/W) 제형일 경우에 피부 투과가 보다 용이하다는 사실을 확인하였다(김은주, et al., 2010).
최근 경피 흡수 촉진 방법 중 가장 많은 연구를 차지하는 방법은 제형적 접근법으로, 크게 5가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 pH 감응형 고분자 수화젤이다. 즉, pH 감응성을 가지는 고분자 수화젤을 만들어 외부 환경에 불안정한 활성물질을 화장품 제형 내에서는 안정하게 보존하고, 피부 도포 시 빠른 방출로 피부에 흡수될 수 있는 시스템이다. 두 번째는 친수성 고분자와 소수성 고분자가 블록 공중합체의 형태로 결합되어 소수성 활성성분을 수용액상에 분산시키는데 있어서 효율적인 고분자 마이셀이다. 세 번째는 100~500 ㎚의 입자 크기를 갖는 에멀젼의 한 종류로 일반 에멀젼과는 달리 입자들 사이 응집 현상이나 합일 현상이 없어 낮은 점도 조건에서도 장가간 안정성을 보유하는 특징이 있는 나노 에멀젼이다. 네 번째는 세포막 또는 각질층의 세포 간 지질과 구조적으로 유사한 지질 이중층으로 구성되어 있어 세포막과 융합하여 활성성분을 효과적으로 세포 내로 전달하는 구조인 리포좀이다. 다섯 번째는 에토좀과 탄성리포좀으로 리포좀보다 피부 투과율을 높이기 위해 고안된 방법으로 막을 좀 더 유연하고 변형이 쉬운 상태로 만든 제형이다(Chung, J.Y., et al., 2014).
식품 산업에서의 나노 입자는 주로 입자나 캡슐의 형태로 만들어지는데, 이는 영양 성분 등을 빛, 산소, 수분, 온도 등의 외부요인으로부터 보호하여 손실을 줄이고 유용성 증대, 생리활성 증대, 안정성 증대, 표적 조절 등의 장점을 지니고 있어 장래의 고부가가치 식품 등에도 다양하게 적용될 수 있다. 나노 기술을 적용한 식품 소재는 기존의 식품 소재에 비하여 크기가 감소되고 표면적이 증가되었기 때문에, 입자 및 캡슐의 투과성과 체류 시간이 향상되어 생체 내 흡수 및 이용이 증가될 것으로 기대되며, 또한 용해도 및 분산성(dispersibility)을 향상시킬 수 있고, 생체 내 세포에 이용시 투과하기 어려운 세포의 지질 이중막을 통과할 잠재력을 가지므로 기능성 물질의 효율적 이용을 기대할 수 있다(김세훈, et al., 2014).
이에 본 발명자들은, 생리학적으로 유효한 물질들의 인체 내 전달 시스템을 개발하는 과정에서, 500 ㎚ 이하, 특히나 200 ㎚ 이하의 입자 크기를 갖고 안정성이 우수한 나노 캡슐 제조 방법을 확립하였고, 이로부터 제조된 나노 캡슐에 난용성 약물을 로딩하여, 약물을 포함하는 나노 캡슐의 우수한 피부 투과율 및 이로 인한 피부 내로의 약물 전달과 약물에 의한 효능이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 제조한 나노 캡슐의 경구 투여를 통한 생체 내 유효성분들의 생체이용률이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래선행기술인 한국등록특허 제1698809호에는 난용성 약물, 플루로닉 및 키토산으로 이루어진 다층 나노 입자가 기재되어 있으나, 약물을 포함하는 제1코어에는 글리콜계 화합물이, 폴록사머를 포함하는 제2코어에는 폴리옥시에테르계 화합물 또는 폴리옥시피마자유계 화합물이 추가로 포함되어 있어, 본 발명의 난용성 약물 및 플루로닉으로만 이루어진 나노 입자와는 그 구성이 차이가 있다. 또한, 한국등록특허 제1748127호에는 약물 및 플루로닉(폴록사머)를 포함하는 나노 입자를 키토산으로 코팅한 나노 입자가 기재되어 있으나, 약물에 플루로닉 및 PLGA가 포함된 나노 입자를 키토산으로 코팅한 나노 입자로, 본 발명의 약물 및 플루로닉으로만 이루어진 나노 입자를 키토산으로 코팅한 나노 캡슐과는 그 구성이 차이가 있으며, 본 발명의 나노 캡슐의 우수한 피부 투과 효과는 기재되어 있지 않다.
비특허문헌인 Escobar-Chavesz, J.J., et al., (2006)에는 플루로닉 겔의 약학적 제형 및 나노 입자, 온도반응성 및 피부 전달이 기재되어 있고, 키토산의 피부 투과 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 약물 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산으로 코팅된 나노 캡슐 및 이의 피부 투과율 증가 효과는 기재되어 있지 않다.
한국등록특허 제1698809호, 천연 난용성 약물이 봉입된 다층 나노 입자를 포함하는 약학적 제제 및 이의 제조 방법, 2017. 01. 17. 등록. 한국등록특허 제1748127호, 신규한 알벤다졸 나노 입자 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물, 2017. 06. 12. 등록.
권익찬, 나노 입자를 이용한 약물전달 기술, News& Information for chemical engineers, 28(2), 177-182, 2010. 김세훈, et al., 나노기술응용식품의 저의 및 적용 범주, 식품과학과 산업, 47(1), 2-11, 2014. 김은주, et al., 마이크로니들 시술에 의한 발효제품의 피부재생 및 항상성 강화 기술, 한국생물공학회, 25, 116-122, 2010. Chung, J.Y., et al., The Recent Trend of Percutaneous Absorption Used in Cosmetics, Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 12(5), 597-605, 2014. Escobar-Chavez, J.J., et al., Applications of thermoreversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulation, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 9(3), 339-358, 2006.
본 발명의 목적은 키토산이 코팅된 나노 캡슐 및 이의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 나노 캡슐을 포함하는 다양한 용도의 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 활성제 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노 캡슐에 관한 것이다.
상기 나노 캡슐은, 활성제 및 플루로닉을 유기용매에 녹여 상온에서 반응시켜 반응 용액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 반응 용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응 용액의 유기용매를 자연 증발시켜 제거하여 나노 입자를 제조하는 2단계; 및 상기 2단계의 나노 입자에 키토산을 첨가하여 키토산을 코팅하는 3단계; 로 이루어진 과정을 통해 제조될 수 있다.
상기 활성제는 플루로닉 100중량부를 기준으로 0중량부 초과~20중량부일 수 있다.
상기 활성제는 항암제, 면역억제제, 항산화제, 항염증제, 주름방지제, 탈모방지제, 상처치유제, 피부미백제, 영양보충제, 면역항원, 단백질치료제, 혈관재생제, 항진균제, 항생제, 항바이러스제, 진정제, 진통제, 노화방지제, 주름방지제, 피부 미백제, 피부탈색소제, 자외선차단제, 염료, 착색제, 탈취제 및 방향제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 활성제는 지용성 또는 난용성 약물일 수 있으며, 상기 지용성 또는 난용성 항암제로, 파클리탁셀(paclitaxel), 도탁셀(docetaxel), 테트라드라인(tetradrine), 상기 지용성 또는 난용성 면역억제제로 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 덱사메타손(dexamethasone), 상기 지용성 또는 난용성 항산화제로 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 아스타잔틴(astaxanthin), 커큐민(curcumin), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 상기 지용성 또는 난용성 항염증제로 덱스판테놀(dexpanthenol), 카페인산 페네틸에스터(caffeic acid phenethyl ester; CAPE), 상기 지용성 또는 난용성 주름방지제로 레티닐아세테이트(retinyl palmitate), 상기 지용성 또는 난용성 탈모방지제로 마이녹시딜(minoxidil), 피나스테라이드(finasteride), 상기 지용성 또는 난용성 상처치유제로 병풀(centella asiatica) 추출물, 베타-사이토스테롤, 상기 지용성 또는 난용성 피부미백제로 아스코르빌 테트라아이소팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate), 상기 지용성 또는 난용성 영양보충제로 트리펩타이드 콜라겐(tripeptide collagen)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 활성제는 수용성 약물일 수 있으며, 상기 수용성 항암제로 독소루비신(doxorubicin), 상기 수용성 항염증제로 포스포리파제 A2(phospholipase A2; PLA2), 상기 수용성 면역항원으로 오브알부민(ovalbumin), 상기 수용성 단백질치료제로 소혈청알부민(bovine serum albumin), 상기 수용성 상처치유제로 섬유아세포성장인자(b-FGF), 상기 수용성 혈관재생제로 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGE)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 플루로닉은 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 나노 입자는 32.5~37℃에서 입자 크기가 5~80 ㎚일 수 있다. 바람직하게는 5~50 ㎚이다.
상기 키토산은 분자량이 3~100 kDa인 키토산일 수 있다.
상기 키토산은 플루로닉 100중량부를 기준으로 0.001~200중량부를 포함할 수 있다.
상기 나노 캡슐은 32.5~37℃에서 입자 크기가 700 ㎚ 이하일 수 있다. 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~500 ㎚일 수 있다. 더욱 바람직하게는 30~300 ㎚이며, 가장 바람직하게는 30~100 ㎚이다.
상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 클로로포름(chloroform) 및 다이클로로메테인(dichloromethane) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 2단계의 증류수는 상기 1단계의 유기 용매 부피를 기준으로 4배를 이용할 수 있다.
상기 나노 캡슐은 피부 투과율이 활성제 단독 처리와 대비하여 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상, 더욱더 바람직하게는 14배 이상 증가될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 나노 캡슐을 포함하는 약물전달시스템, 화장료 조성물 건강기능식품 조성물, 의료기기용 조성물, 생활용품용 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 키토산이 코팅된 나노 캡슐에 관한 것으로, 구체적으로 활성제 및 플루로닉으로 이루어진 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노 캡슐에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "나노 캡슐"은 나노 크기의 속이 비어 있는 공 모양의 캡슐로, 나노 캡슐의 비어 있는 내부에 다양한 물질, 예컨대 활성제를 담을 수 있다.
본 발명의 나노 캡슐은 당업계에 공지된 제조 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 나노 침전법 및 막재분산법이고, 더 바람직하게는 나노 침전법을 이용할 수 있다.
가장 바람직하게, 상기 나노 캡슐은 활성제 및 플루로닉을 유기용매에 녹여 상온에서 반응시켜 반응 용액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 반응 용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응 용액의 유기용매를 자연 증발시켜 제거하여 나노 입자를 제조하는 2단계; 및, 상기 2단계의 나노 입자에 키토산을 첨가하여 키토산을 코팅하는 3단계; 로 이루어진 과정을 통해 제조될 수 있다.
상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 클로로포름(chloroform) 및 다이클로로메테인(dichloromethane) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 아세톤, 테트라히드로푸란, 에탄올 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더 바람직하게는 아세톤이다.
상기 2단계의 증류수는 상기 1단계의 유기용매 부피를 기준으로 하여 2~10배를 이용할 수 있다. 바람직하게는 2~5배를 이용하며, 더 바람직하게는 4배를 이용한다. 상기 증류수가 유기용매 부피를 기준으로 2배 미만을 사용할 경우에는 부분적으로 침전이 발생할 수 있고, 10배 초과일 경우에는 키토산 코팅이 불안정하거나 나노 캡슐의 농도가 희석되어 농축 공정이 추가될 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 활성제는 수용성 및 지용성 특성을 지닌 유효 물질들로, 항암제, 면역억제제, 항산화제, 항염증제, 주름방지제, 탈모방지제, 상처치유제, 피부미백제, 영양보충제, 면역항원, 단백질치료제, 혈관재생제, 항진균제, 항생제, 항바이러스제, 진정제, 진통제, 노화방지제, 주름방지제, 피부 미백제, 피부탈색소제, 자외선차단제, 염료, 착색제, 탈취제 및 방향제 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 활성제는 플루로닉 100중량부를 기준으로 활성제의 효능 및 효과를 나타내는 가장 최소한의 중량부부터 20중량부까지, 즉, 0중량부 초과~20중량부가 포함될 수 있다. 바람직하게는 0중량부 초과~10중량부가 포함된다. 상기 활성제가 20중량부 초과일 경우에는 나노 입자의 크기가 너무 커지거나, 나노 입자에 활성제가 모두 포함되지 않아 정확한 유효량의 활성제를 전달할 수 없어 바람직하지 못하다.
본 발명에 있어서 "플루로닉(pluronic, poloxamer)"은 친수성 고분자로 온도 감응성 성질을 나타내며, 다양한 HLB(hydrophile-lipophile balance)를 가진 유도체가 존재한다. 상기 플루로닉은 HLB가 8~29인 플루로닉, 예컨대, 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 HLB가 15~29인 플루로닉, 예컨대, 플루로닉 L35, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 나노 입자는 활성제 및 플루로닉으로 이루어진 나노 입자로, 온도 민감성 성질로 인해 측정 온도에 따라 나노 입자의 크기가 달라질 수 있다. 구체적으로, 온도가 낮을수록 입자 크기가 커질 수 있다.
상기 나노 입자는 32.5~37℃에서 입자 크기가 5~80 ㎚인 것일 수 있다. 바람직하게는 5~50 ㎚이다.
본 발명에 있어서, "키토산(chitosan)"은 키틴의 부분적인 탈아세틸화에 의해 형성되는 다당류로서 독성이 없는 생체적합성, 생분해성이 높은 고분자 물질로 친수성이 높고 점막부착성이 높은 성질을 가지고 있다. 키토산은 산성 환경에서 용해도가 높고 양전하를 띠는 경향이 있어 점막질 같은 곳에 쉽게 부착하는 성질이 있고, 항세균성과 지혈효과가 있다. 상기 키토산은 일반적으로 아세트산, 락트산 등과 같은 산성 용액에 높은 용해도를 보인다. 상기 산성 용액에 용해된 키토산의 경우, 인체에 적용시 피부 자극이나 인체 내 pH의 변화로 인한 장애 등을 유발할 수 있다.
반면에, 본 발명의 상기 키토산은 물에 쉽게 용해되는 것으로, 산성 용액에 용해되는 키토산을 이용하는 경우에 나타나는 문제점들을 극복할 수 있다. 상기 키토산은 분자량이 3~100kDa인 것일 수 있다. 바람직하게는 3~20kDa, 더욱 바람직하게는 3~10kDa이다. 상기 키토산의 분자량이 100kDa 초과일 경우에는 물에 대한 용해도가 낮아 바람직하지 못하다.
상기 키토산은 플로로닉 100중량부를 기준으로 200중량부 이하를 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.001~200중량부이고, 더 바람직하게는 0.001~100중량부이다. 키토산이 0.001중량부 미만이면 나노 입자의 표면이 키토산에 의해 충분히 코팅되지 않아 양전하의 표면 전하를 나타내기 어려울 수 있으며, 키토산이 200중량부 초과이면 나노 캡슐의 크기가 너무 커지거나 부분적으로 침전이 발생할 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 나노 캡슐은 온도 민감성 성질을 나타내는 것으로, 온도가 낮을수록 입자 크기가 커질 수 있다. 상기 나노 캡슐은 10℃에서 입자 크기가 1,000 ㎚이하인 것으로, 10℃ 보다 높은 온도에서는 입자 크기가 작아진다.
상기 나노 캡슐은 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 700 ㎚이고 이하이고, 더 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~500 ㎚이고, 더욱 바람직하게는 입자 크기가 30~300 ㎚이며, 가장 바람직하게는 입자 크기가 30~100 ㎚이다. 상기 나노 캡슐의 입자 크기가 700 ㎚ 초과이면 피부에 적용 시 피부 투과 효율이 낮아 바람직하지 못하다.
상기 나노 캡슐은 비어 있는 내부에 다양한 활성제를 담을 수 있다. 또한 상기 나노 캡슐은 온도 민감성 성질로 인해 낮은 온도에서는 나노 캡슐이 팽윤(swelling)되어 나노 캡슐을 이루는 플루로닉 물질 사이사이에 활성제가 끼어들어갈 수 있어, 지용성 및 수용성 활성제 모두를 포함할 수 있다.
상기 나노 캡슐은 표면이 키토산으로 코팅되어 있어 나노 캡슐의 표면 전하가 양전하를 띠어 피부 투과율 및 점막 접착성이 증가할 수 있다.
상기 키토산으로 코팅된 나노 캡슐의 피부 투과율은 키토산을 코팅하지 않은 고분자 캡술(PluNC) 보다 현저하게 높고, 상업적으로 가장 많이 사용되고 있는 리포좀 제형(Liposome) 보다 6배 이상 증가될 수 있으며, 나노 캡슐에 포함되어 있는 활성제를 단독으로 처리한 경우에 대비하여 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상, 더욱더 바람직하게는 14배 이상 증가될 수 있다.
상기 나노 캡슐은 나노 입자를 구성하는 플루로닉과 나노 입자의 표면에 코팅되는 키토산간의 물리학적 결합에 의해 이루어지는 것으로, 플루로닉과 키토산의 화학적 결합을 통해 제조된 플루로닉-키토산 중합체를 이용하여 제조하는 나노 입자와 달리, 중합체 제조 공정이 별도로 필요가 없으며, 중합체 제조를 위해 사용되는 결합제에 의한 독성을 고려하지 않아도 된다.
또한, 본 발명은 상기 나노 캡슐을 포함하는 약물전달시스템에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "약물전달시스템"은 치료 효능이 있는 약물을 생체 내 필요한 부분에 전달하는 시스템으로, 약물이 필요한 조직으로의 전달 효율 및 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달하는 것으로, 약물 조성물, 약물 처방, 배합 방법 또는 약물 제제로 이해할 수 있다.
상기 약물전달시스템은 치료 효능이 있는 약물을 포함하는 나노 캡슐일 수 있다.
상기 약물은 항암제, 면역억제제, 항산화제, 항염증제, 주름방지제, 탈모방지제, 상처치유제, 피부미백제, 영양보충제, 면역항원, 단백질치료제, 혈관재생제, 항진균제, 항생제, 항바이러스제, 진정제, 진통제, 노화방지제, 주름방지제, 피부 미백제, 피부탈색소제, 자외선차단제, 염료, 착색제, 탈취제 및 방향제등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항진균제는 폴리엔(polyene)계, 예컨대, 암포데리신 B(amphotericin B), 니스타틴(nystatin, fungicidin) 등, 아졸계(azole), 예컨대, 케토코나졸(ketoconazole), 이트라코나졸(itraconazole) 등, 알릴아민계(allylamine), 예컨대, 부테나핀(butenafine), 테르비나핀(terbinafine), 나프티핀(naftifine) 등, 에키노칸딘계(echinocandin), 예컨대, 아니둘라펀진(anidulafungin), 카스포펀진(caspofungin) 등, 기타 항진균제, 예컨대 아우론(aurones), 벤조산(benzoic acid), 시클로피록스(ciclopirox), 플루시토신(flucytosine), 그리세오풀빈(griseofulvine) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항생제는 페니실린계(penicillin), 세팔로스포린계(cephalosporin), 폴리믹신(polymyxin), 술폰아미드(sulfonamide), 퀴놀론계(quinoline), 리팜피신(rifampicin), 아미노글리코사이드계(aminoglycoside), 마크로라이드계(macrolide), 테트라사이클린계(tetracycline) 등이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항바이러스제는 항인플루엔자바이러스(anti-influenza virus)제, 예컨대, 아만타딘(amantadine), 리만다딘(rimantadine), 오셀타미비르(oseltamivir), 자나미비르(zanamivir) 등, 항헤르페스바이러스(anti-herpes virus)제, 예컨대, 비다라빈(vidarabine), 아시클로비르(acyclovir), 포스카넷(foscarnet) 등, 항B형간염바이스(anti-hepatitis B virus)제, 예컨대, 라미부딘(lamivudine), 엔테카비르(entecavir), 테노포비르(tenofovir) 등, 항HIV제, 예컨대, 지도부딘(zidovudine), 디다노신(didanosine), 잘시타빈(zalcitabine), 에파비렌즈(efavirenz), 릴피비린(rilpivirine), 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 랄테그라비르(raltegravir), 엘비테그라비르(elvitegravir), 돌루테그라비르(dolutegravir), 엔푸비르티드(enfuvirtide) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진정제는 졸피뎀(zolpidem), 디아제팜(diazepam), 모르핀(morphine) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 진통제는 아세트아미노펜(acetaminophen) 계열, 비스테로이드성 소염진통제(nonsteroidal antiinflammatory drugs) 계열, 모르핀(morphine), 펜타닐(fentanyl), 옥시코돈(oxycodone), 하이드로몰폰(hydromorphone) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 상처 치유제는 센텔라 아시아티카(centella asiatica), 콜라겐(collagen), 표피생장인자(epithelial growth factor, EGF) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항염증제는 멜록시캄(meloxicam), 실리비닌(silibinin), 인도메타신(indomethacin), 프로폴리스(propolis), 카페인산 페네틸에스테르(caffeic acid phenethyl ester) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항암제는 팍클리탁셀(paclitaxel), 에스트로겐(estrogen), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluoro uracil), 로피나비어(popinavir), 니무수리드(nimusulide), 프로게스테론(progesterone), 레파글리니드(repaglinide), 테트라씨클린(tetracycline), 올트랜스레티논산(all-trans retinoic acid), 루테올린(luteoline), VEGFR 억제제(vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR) inhibitor), Wnt/β-카테닌 조절제(Wnt/β-catenin modulator), 헤지호그 억제제(hedgehog inhibitor), PI3K/Akt/mTOR 조절제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역억제제는 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 타크로리무스(tacrolimus), 메톡트렉세이트(methotrexate), 라파마이신(rapamycin), 시로리무스(sirolimus) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 탈모방지제는 탈모억제 또는 모발 성장 촉진 효과가 있는 물질로, 피나스테리드(finasteride), 미녹시딜(minoxidil), 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 천연탈모방지제, 예컨대, 의이인(Coicis semen) 추출물, 복분자(Rubus coreanus) 추출물, 감초(Glycyrrhiza radix) 추출물, 측백나무(Thuja orientalis) 추출물, 당귀(Angelical radix) 추출물, 산수유(Cornus officinalis) 추출물 등, 모발 성장 촉진 효과가 있는 펩타이드 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 활성제는 지용성 또는 난용성 약물일 수 있으며, 상기 지용성 또는 난용성 항암제로, 파클리탁셀(paclitaxel), 도탁셀(docetaxel), 테트라드라인(tetradrine), 상기 지용성 또는 난용성 면역억제제로 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 덱사메타손(dexamethasone), 상기 지용성 또는 난용성 항산화제로 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 아스타잔틴(astaxanthin), 커큐민(curcumin), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 상기 지용성 또는 난용성 항염증제로 덱스판테놀(dexpanthenol), 카페인산 페네틸에스터(caffeic acid phenethyl ester; CAPE), 상기 지용성 또는 난용성 주름방지제로 레티닐아세테이트(retinyl palmitate), 상기 지용성 또는 난용성 탈모방지제로 마이녹시딜(minoxidil), 피나스테라이드(finasteride), 상기 지용성 또는 난용성 상처치유제로 병풀(centella asiatica) 추출물, 베타-사이토스테롤, 상기 지용성 또는 난용성 피부미백제로 아스코르빌 테트라아이소팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate), 상기 지용성 또는 난용성 영양보충제로 트리펩타이드 콜라겐(tripeptide collagen)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 활성제는 수용성 약물일 수 있으며, 상기 수용성 항암제로 독소루비신(doxorubicin), 상기 수용성 항염증제로 포스포리파제 A2(phospholipase A2; PLA2), 상기 수용성 면역항원으로 오브알부민(ovalbumin), 상기 수용성 단백질치료제로 소혈청알부민(bovine serum albumin), 상기 수용성 상처치유제로 섬유아세포성장인자(b-FGF), 상기 수용성 혈관재생제로 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 약물전달시스템은 상기 나노 캡슐 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
상기 약물전달시스템은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 나노 캡슐에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 제형에 특별한 제한을 두지는 않으나, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 1종의 제형을 갖는 피부 외용제로 사용될 수 있다. 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들면 비한정적인 의미로 특히 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 계면활성제, 알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있다. 도포 빈도는 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 상당히 변할 수 있으며, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 보다 더 바람직하게 는 1일 1회 또는 2회가 제안된다.
본 발명의 약물전달시스템은 쥐, 가축, 인간, 반려동물 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부 투여이다.
본 발명은 또한 상기 나노 캡슐을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 나노 캡슐은 미백, 주름, 항산화, 항노화, 항염증, 자외선 차단 등의 기능성 화장품 소재를 포함할 수 있다.
상기 미백 기능성 소재는 닥나무 추출물, 알부틴(arbutin), 에틸아스코르빌에테르(ethyl ascorbyl ether), 유용성 감초추출물, 아스코르빌글루코사이드(ascorbyl glucoside), 나이아신아마이드(niacinamide), α-비사보롤(α-bisabolol) 및 아스코르빌테트라이소팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate) 등일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 주름 기능성 소재는 비타민 A, 비타민 A 유도체(레티닐팔미테이트, 레티닐아세테이트 등), 아데노신, 폴리에톡실레이티드레틴아마이드 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항산화 기능성 소재는 비타민 A, 비타민 A 유도체, 비타민 E, 비타민 E 유도체, 카로텐(carotene), 리코펜(lycopene), 루테인(lutein), 코엔자임 Q10, 아스타잔틴 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 상기 나노 캡슐 및 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료를 함유할 수 있다.
상기 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 앰플, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 마스크팩, 비누, 바디클렌져, 클렌징폼, 샴푸, 린스, 헤어트리트먼트, 헤어오일, 바디오일 및 바디로션으로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며, 또한, 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있고, 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노 캡슐을 포함하는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 나노 캡슐은 건강기능식품 소재를 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품 소재는 비타민, 미네랄, 생균제, 생물활성 펩타이드, 항산화제, 식물성 스테롤, 식물 추출물, 코엔자임 Q10, 오메가-3, 아스타잔틴 등일 수 있다. 바람직하게는 콜라겐 트리펩타이드, 홍삼 오일, 아스타잔틴, 오메가-3일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 나노 캡슐 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 나노 캡슐을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 본 발명의 나노 캡슐을 포함하는 의료 기기를 제공한다.
상기 의료 기기는 필러, 창상피복제, 골수복제, 임플란트 코팅제, 색전술 보조제, 진단제 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 본 발명의 나노 캡슐을 포함하는 생활용품용 조성물을 제공한다.
상기 생활용품용 조성물은 염색제, 착색제, 탈취제, 방향제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 키토산이 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도에 관한 것으로, 500 ㎚ 이하, 특히나 200 ㎚ 이하의 입자 크기를 갖고 안정성이 우수한 나노 캡슐 제조 방법을 확립하였고, 이로부터 제조된 나노 캡슐에 난용성 약물을 로딩하여, 약물을 포함하는 나노 캡슐의 우수한 피부 투과율 및 이로 인한 피부 내로의 약물 전달과 약물에 의한 효능이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 제조한 나노 캡슐의 경구 투여를 통한 생체 내 유효성분들의 생체이용률이 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 이용하여 의약 분야, 화장품 업계, 식품 산업 등에서의 난용성 약물 또는 유효물질들의 인체 및 가축, 반려 동물 등과 같은 동물에 전달 효율이 현저히 증가된 우수한 전달 시스템을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 플루로닉의 종류 및 온도에 따른 제조된 나노 입자의 크기를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 플루로닉 종류에 따른 키토산 나노 캡슐의 특성을 분석한 결과로, (a)는 나노 캡슐의 성상을, (b)는 나노 캡슐의 크기를, (c)는 나노 캡슐의 다분산성을, (d)는 나노 캡슐의 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 3은 키토산의 분자량에 따른 제조된 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 특성을 분석한 결과로, (a)는 나노 캡슐의 크기를, (b)는 나노 캡슐의 다분산성을, (c)는 나노 캡슐의 표면 전하를, (d)는 나노 캡슐이 형태를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 용매 종류에 따른 키토산 나노 캡슐의 특성을 분석한 결과로, (a)는 나노 캡슐의 크기를, (b)는 나노 캡슐의 다분산성을, (c)는 나노 캡슐의 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조 방법에 따른 입자의 크기를 확인한 결과이다.
도 6은 나노 침전법을 이용하여 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조 시, 용매와 증류수의 혼합 비율에 따른 나노 캡슐의 입자 크기를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 세포 독성 여부를 확인한 결과이다.
도 8은 Paclitaxel 및 Docetaxel 을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과로, (a)는 나노 캡슐의 크기를, (b)는 나노 캡슐의 다분산성을, (c)는 나노 캡슐의 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 9는 (a) Cyclosporin A 및 (b) Dexamethasone 을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과로, 각각의 나노 캡슐의 크기, 다분산성, 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 10은 (a) Retinyl palmitate 및 (b) Tocopheryl acetate 를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과로, 각각의 나노 캡슐의 크기, 다분산성, 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 11은 (a) Minoxidil 및 (b) Finasteride 을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과로, 각각의 나노 캡슐의 크기, 다분산성, 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 12는 온도에 따른 나노 캡슐의 크기 및 분산도 특성을 나타낸 것이다.
도 13은 Doxorubicin 을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과이다.
도 14는 Ovalbumin을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과이다.
도 15는 Bovine Serum Albumin 을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 약물 로딩양에 따른 특성을 분석한 결과이다.
도 16은 사이클로스포린 A(CsA@ChiNC), 나일레드(Nile red@ChiNC) 또는 피렌(pyrene@ChiNC)을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 침전물 생성 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 17은 약물 (CsA 및 RP) 로딩 키토산 나노 캡슐의 동결 전, 후의 특성을 나타낸 결과이다.
도 18은 키토산 종류에 따른 약물의 피부투과를 나타낸 결과이다.
도 19는 본 발명의 약물(나일레드)을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 피부 투과율을 확인한 결과이다.
도 20은 본 발명의 약물(나일레드)을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 피부 내로의 약물 전달 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 21은 본 발명의 약물(사이클론스포린 A, CsA)을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 피부 내로의 약물 전달에 따른 발모 효능을 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조>
실시예 1-1. 플루로닉 종류에 따른 나노 입자 제조 최적화
플루로닉(pluronic, poloxamer)은 친수성 고분자인 폴리(에틸렌옥사이드)(poly(ethylene oxide), PEO)와 소수성 고분자인 폴리(프로필렌옥사이드)(poly(propylene oxide), PPO)로 구성된 비이온성의 PEO-PPO-PEO 삼중블록공중합체로서 대표적인 온도 감응성 고분자로, 온도 증가에 따른 내부 구조 변화에 의해 가역적으로 변하는 독특한 특징을 가지고 있다. 플루로닉의 PEO 및 PPO의 부가몰수에 따라 다양한 HLB(hydrophile-lipophile balance)를 가진 플루로닉 유도체가 존재하며, 플루로닉의 HLB는 플루로닉을 이용한 나노 입자 제조시 입자 크기에 영향을 줄 수 있다. 이에 플루로닉 종류에 따른 나노 입자의 크기를 확인하였다.
HLB 2~29에 해당되는 플루로닉을 이용하여 나노 입자를 제조하였다. 구체적으로, 플루로닉 20 ㎎을 아세톤 1㎖에 녹여 반응 용액을 제조 하였다. 제조한 반응 용액을 530 rpm으로 교반하고 있는 4㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨려 투입한 후, 12시간 이상 상온에서 각각 반응시켜 아세톤이 자연적으로 증발되어 제거되도록 하여 플루로닉으로 이루어진 나노 입자를 제조하였다. 제조한 나노 입자의 크기를 입도분석기(Zetasizer, Nono-Zs, Malvern)와 투과전자현미경(transmission electron microscopy)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 플루로닉 F127로 이루어진 나노 입자의 경우에 25℃에서 200 ㎚ 이하, 32.5℃~37℃에서 작게는 5 ㎚, 크게는 80 ㎚의 나노 입자를 형성하였으며, 평균 50 ㎚의 나노 입자를 형성할 수 있었다. 플루로닉 F68의 경우, 25℃에서 300 ㎚ 이하, 32.5℃~37℃에서 200 ㎚ 이하의 입자 크기를 보여주었다.
또한, 플루로닉 F127 및 플루로닉 F68 이외에도 2~29에 해당되는 플루로닉으로 이루어진 나노 입자의 경우 32.5℃~37℃에서 크기가 200 ㎚ 이하의 나노 입자가 제조되는 것을 확인하였다.
상기에서와 같이 플루로닉을 이용하여 온도에 따라 입자의 크기를 조절할 수 있다는 것을 확인하였으며, 하기 나노 캡슐의 크기를 100 ㎚ 이하로 제조하기 위하여 HLB 2~29에 해당되는 플루로닉을 이용, 나노 입자의 크기를 5~80 ㎚, 바람직하게는 5~50 ㎚의 크기로 최적화하였다.
실시예 1-2. 플루로닉 종류에 따른 나노 캡슐 제조 최적화
플루로닉 종류에 따른 나노 캡슐 제조 최적화 조건을 확인하기 위하여 하기 표 1의 HLB 2~29에 해당되는 플루로닉을 이용하여 나노 입자를 제조하고, 키토산으로 코팅하여 나노 캡슐을 제조하였다.
구체적으로, 각각의 플루로닉 20 ㎎을 아세톤 1 ㎖에 녹여준 뒤, 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후 고분자 용액을 400 rpm으로 stirring 하는 4 ㎖의 3차 증류수 (deionized water)에 천천히 떨어뜨려 주어서 고분자 나노 입자를 제조한 후, 6시간 정도 후드에서 아세톤을 제거해 주었다. 최종적으로 탈아세틸화 90%, 분자량 10 kDa의 키토산 20 mg을 각각의 고분자 나노 입자에 첨가해 주고 2시간 동안 상온에서 교반해 줌으로써 키토산 나노 캡슐을 제조하였다. 플루로닉 종류에 따라서 제조된 키토산 나노 캡슐 (ChiNC)의 크기, 분산도 및 표면전하를 electrophoretic light scattering spectrophotometer (ELS-Z2, Otsuka) 장비를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
플루로닉 분자량 (Da) HLB value
F68(P188) 8,400 29
F127(P407) 12,600 22
L35 1,900 19
P123 5,750 8
L81 2,750 2
도 2에서 보듯이, HLB(Hydrophilic and Lipophilic Balance) 지수가 다른 플루로닉 5종(F127, P123, P188, L35, L81) 을 이용하여 나노 침전법(nanoprecipitation)으로 제조된 키토산 나노 캡슐 (ChiNC)은 모든 플루로닉 종류에서 침전물 발생 없이 안정적으로 제조되었다.
F127과 P123로 제조된 키토산 나노 캡슐은 32.5℃~37℃에서 크기가 30 ㎚에서 80㎚로, 평균 60㎚ 정도의 크기를 나타내어 안정적으로 100 ㎚ 이하의 키토산 나노 캡슐을 형성하였다. P188, L35로 제조된 키토산 나노 캡슐은 209 ㎚에서 688㎚로 평균 500 ㎚의 크기를 나타내었으며, L81로 제조된 키토산 나노 캡슐은 크게는 1.4 ㎛의 크기를 나타내었다. 분산성의 경우, F127, P123, P188, L35로 제조된 키토산 나노 캡슐은 0.3 이하로 대체적으로 단분산성을 보여주었고, 그에 비하여 L81로 제조된 키토산 나노 캡슐은 마이크로 크기로서 다소 분산도가 크게 나타났다. 표면전하의 경우 키토산이 플루로닉 캡슐 표면에 안정적으로 코팅됨으로써 평균적으로 +20mV 정도를 보여주었다.
이러한 결과를 바탕으로, 플루로닉 종류에 따라서 키토산 나노 캡슐 제형 최적화를 위해서는 HLB 8 부터 29에 해당되는 플루로닉 종류는 모두 적합하다는 것을 알 수 있었으며, 플루로닉 종류와 온도에 따라 키토산 나노 캡슐의 크기를 700 ㎚ 이하, 30~500 ㎚, 30~300 ㎚ 또는 30~100 ㎚로 형성할 수 있었다.
HLB 지수가 8 이하인 경우에도 나노크기는 아니나, 마이크로캡슐로 제조할 수 있음을 확인하여, 국소부위 적용 등의 필요에 따라 나노 및 마이크로 크기를 지닌 키토산 캡슐을 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1-3. 키토산 분자량에 따른 키토산 나노 캡슐 제조 최적화
상기 실시예 1-1 및 1-2의 결과를 바탕으로, 플루로닉 조건에 따라 다양한 키토산 (3 kDa ~ 100 kDa)에 따른 키토산 나노 캡슐 제조 최적화 조건을 확립하였다.
본 발명의 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조시 미국 식약처에서 승인 받은 생체적합성 물질인 플루로닉 F127(pluronic F127, poloxamer 407)을 이용하였고, 키토산이 코팅된 나노 캡슐은 나노침전법(nanoprecipitation)을 이용해 제조하였다. 구체적으로, 플루로닉 F127 20 ㎎을 아세톤 1 ㎖에 녹여 반응 용액을 제조 하였다. 제조한 반응 용액을 530 rpm으로 교반하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨려 투입한 후, 12시간 이상 상온에서 반응시켜 아세톤이 자연적으로 증발되어 제거되도록 하여 플루로닉으로 이루어진 나노 입자(PluNC)를 확보하였다. 확보한 PluNC에 키토산을 넣고 상온에서 1시간 이상 섞어주어, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노 캡슐(ChiNC)을 제조하였다. 이때, 분자량이 3, 10, 20, 50, 100 kDa 분자량의 키토산을 이용하여 PluNC를 코팅 하였고, 키토산의 분자량에 따라 제조된 ChiNC의 형태, 크기, 다분산성 지수(polydispersity index, PDI) 및 표면 전하를 입도분석기(Zetasizer, Nono-Zs, Malvern)와 투과전자현미경(transmission electron microscopy)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
키토산은 플루로닉에 대하여 0.001~200 중량부 혼합하여 키토산 나노 캡슐을 제조하였다. 이때 키토산이 0.001 중량부 미만이면 나노 입자의 표면이 키토산에 의해 충분히 코팅되지 않아 양전하의 표면 전하를 나타내기 어려웠으며, 키토산이 200 중량부를 초과하면 나노 캡슐의 크기가 너무 커지거나 부분적으로 침전이 발생하였다. 이후 실험에서는 플루로닉과 동일한 중량의 키토산을 혼합하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 입자 크기의 경우(a), 분자량이 20 kDa 이하의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K)은 100 ㎚ 이하의 키토산 나노 입자를 형성하였으며, 분자량이 50 kDa 및 100 kDa의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 50K, ChiNC 100K)는 약 200 ㎚의 크기를 나타내는 것을 확인하였다. 다분산성에서는(b) 분자량이 20 kDa 이하의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K)은 분산도가 0.2 이하였고, 분자량이 50 kDa 및 100 kDa의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 50K, ChiNC 100K)는 분산값이 0.2~0.3 정도임을 확인하였으며, 표면 전하에서는(c) 키토산을 코팅하지 않은 PluNC 자체 표면 전하 값이 ??5 ㎷ 정도의 음전하를 띠는 것으로 나타난 반면에, 키토산을 코팅한 경우, 키토산의 분자량에 상관없이 모두 양전하를 띠는 것을 확인하였다. 또한, 나노 캡슐의 형태를 관찰한 결과, 나노 캡슐이 구형의 구조를 나타내며, 키토산의 분자량이 커짐에 따라 나노 캡슐의 크기도 커지는 것을 확인하였다(d).
본 명세서에서는 보여주지 않았으나, 분자량이 100 kDa을 초과하는 키토산을 이용할 경우에는, 키토산을 아세트산에 용해시켜 코팅을 해주어야 하며, 아세트산에 녹여 코팅할 경우 침전물이 발생하여 제형의 안정성이 감소되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 키토산으로 코팅된 나노 캡슐의 경우, 상기 제조 방법을 통해 키토산이 플루로닉으로 이루어진 나노 입자 표면에 안정적으로 코팅된다는 것을 알 수 있었고, 코팅하는 키토산의 분자량에 따라 나노 캡슐의 크기 및 분산성에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 나아가 키토산의 분자량이 3~20 kDa일 경우에 크기가 작고, 균일한 크기로 제형의 안정성이 확보된 나노 캡슐을 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1-4. 용매에 따른 키토산 나노 캡슐 제조 최적화
키토산 나노 캡슐 제조공정 중, 용매에 따른 키토산 나노 캡슐 제조 공정 최적화 하였다.
용매로 아세톤 (acetone; ACE), 에탄올 (ethanol; ETH), 테트라하이드로푸란 (tetrahydrofuran; THF), 클로로포름 (chloroform; CHL) 및 다이클로로메테인(dichloromethane;DCM)을 선택하여 평가하였다. 이에 따라 용매에 따라 용해도가 다른 다양한 약물(활성제)을 로딩할 수 있는 플랫폼을 확립할 수 있다.
먼저, Nanoprecipitation 방법에 따라 플루로닉 F127 20 ㎎을 acetone, ethanol, tetrahydrofuran 1 ㎖에 녹여준 뒤 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 반응 용액을 400rpm으로 stirring 하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수 (deionized water)에 천천히 떨어뜨려 주어서 고분자 나노 캡슐을 제조한 후, 6시간 동안 후드에서 용매를 제거하였다. 최종적으로 키토산 (탈아세틸화 90%, 분자량 10 kDa) 20 ㎎을 각각의 고분자 나노 캡슐에 첨가해 주고 2시간 동안 상온에서 교반해 줌으로써 키토산 나노 캡슐을 제조하였다.
클로로포름은 Single emulsion 방법을 이용하였다. 플루로닉 F127 20 ㎎을 chloroform 1 ㎖에 녹여준 뒤 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후 반응 용액을 400 rpm으로 stirring 하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수 (deionized water)에 천천히 떨어뜨려 주어 나노 입자 제조한 후, homogenizer를 이용하여 분산시킨 다음, 2시간 동안 vacuum drying을 통해 용매를 제거하였다. 최종적으로 키토산 (탈아세틸화 90%, 분자량 10 kDa) 20 ㎎을 각각의 고분자 나노 캡슐에 첨가해 주고 2 시간 동안 상온에서 교반해 줌으로써 키토산 나노 캡슐을 제조하였다.
상기 nanoprecipitation 방법과 single emulsion 방법에 따른 분자량 10 kDa 키토산 코팅 나노 캡슐(ChiNC 10K)의 크기, 분산도 및 표면전하를 electrophoretic light scattering spectrophotometer (ELS-Z2, Otsuka) 장비를 이용하여 분석하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, water miscibility가 높은 유기용매인 acetone(ACE), ethanol(ETH), tetrahydrofuran(THF)을 이용한 나노 침전법(nanoprecipitation)으로 제조된 키토산 나노 캡슐 (ChiNC 10K)은 모두 60 nm 정도의 크기를 보여주었다. 또한, 다분산성 (PDI:polydispersity)도 0.3 이하를 보여줌으로써 단분산성을 나타내었다.
이에 비하여 water miscibility가 낮은 유기용매인 chloroform(CHL)을 이용하여 싱글 에멀전(single emulsion) 방법으로 제조된 키토산 나노 캡슐 (ChiNC 10K)은 약 750 nm 정도의 크기를 보여주었고 (다이클로로메테인(dichloromethane)에서도 동일), 다분산성 (PDI:polydispersity)도 상기 acetone(ACE), ethanol(ETH), tetrahydrofuran(THF)을 이용한 나노 침전법(nanoprecipitation)으로 제조된 키토산 나노 캡슐보다 크게 나타났다. 그러나 모든 키토산 나노 캡슐 그룹에서 표면전하는 20 mV 정도를 보여줌으로써 다양한 용매 및 공정법에서 안정적으로 키토산이 코팅된 고분자 캡슐 즉, 키토산 나노 캡슐을 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1-5. 약물을 포함하는 나노 캡슐의 제조 방법 확립
약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 제조하는 방법으로 나노침전법(nanoprecipitation) 및 막재분산법(membrane resuspension)을 이용하여 각각의 제조 방법에 따라 제조된 나노 캡슐의 특성을 확인하였고, 약물로는 난용성 물질인 사이클로스포린 A(cyclosporine, 이하 CsA이라 함)을 이용하였다.
막재분산법(membrane resuspension)은 CsA 0.2 ㎎(2중량%) 또는 0.6 ㎎(6중량%)과 플루로닉 F126 10㎎을 1㎖의 아세톤에 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하여 반응 용액을 제조하였다. 제조한 반응 용액을 2시간 동안 흄후드(fume hood) 내 방치하여 아세톤이 날아가면서 막이 형성되도록 하였다. 형성된 막에 3차 증류수 5 ㎖을 첨가하여 30분 이상 교반하고, 플루로닉과 동일한 중량으로 10 kDa 키토산을 첨가한 뒤 교반하여 나노 캡슐을 제조하였다.
또 다른 방법인 나노 침전법(nanoprecipitation)은 CsA 0.2 ㎎ 또는 0.6 ㎎과 플루로닉 F126 10 ㎎을 1 ㎖의 아세톤에 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하여 반응 용액을 제조하였다. 제조한 반응 용액을 530rpm으로 교반하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨리고, 4시간 이상 흄 후드(fume hood) 내에서 교반하면서 자연적으로 아세톤이 증발하도록 하였다. 아세톤이 제거된 플루로닉으로 이루어진 나노 입자가 포함되어 있는 3차 증류수에 플루로닉과 동일한 중량으로 10 kDa 키토산을 첨가한 뒤 교반하여 나노 캡슐을 제조하였다. 상기의 제조 방법으로 제조한 나노 캡슐의 입자 크기를 입도분석기와 투과전자현미경을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보듯이, CsA가 포함되지 않은 나노 캡슐의 경우, 나노 침전법으로 제조한 나노 캡슐이 막재분산법으로 제조한 나노 캡슐에 비해 크기가 2배 정도 작은 것을 확인하였고, CsA를 포함하는 나노 캡슐의 경우, 막재분산법으로 제조한 경우에 CsA의 함량에 따라 제조된 나노 캡슐의 입자 크기의 차이가 크게 나타나고 CsA의 함량이 6중량%일 경우에는 일부 나노 캡슐의 응집이 일어나는 반면에, 나노 침전법으로 제조한 CsA를 포함하는 나노 캡슐은 CsA의 함량에 따른 입자 크기의 차이가 막재분산법에 비해 크지 않아 안정된 크기 범위의 나노 캡슐을 제조할 수 있었으며, 나노 캡슐의 응집이 일어나지 않고, 제조된 입자의 크기가 CsA의 함량이 2중량%일 대에는 100 ㎚ 이하, 6중량%을 포함할 때에는 200 ㎚ 이하가 되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제형의 안정성을 높이기 위해서는 나노 침전법을 이용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 1-6. 나노 침전법에 있어서 용매 및 증류수의 비율 확인
상기 실시예 1-5의 나노 침전법 과정 중에 반응 용액의 용매인 아세톤과 나노 입자를 제조하기 위한 3차 증류수의 혼합 비율에 따른 제조된 나노 캡슐의 크기를 확인하였다.
상기 실시예 1-5의 나노 침전법과 동일한 방법으로 제조하되, 약물의 함량은 6 중량%로 하고, 아세톤 및 증류수의 혼합비율을 아세톤:증류수가 1:5 또는 1:4가 되도록 하여 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 제조하여 입자 크기를 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 키토산으로 코팅하기 전과 후의 나노 캡슐의 크기를 분석하였다.
도 6에서 보듯이, 아세톤과 증류수의 혼합 비율이 1:4일 경우, 혼합 비율이 1:5에 비해 키토산 코팅 전과 후의 키토산 나노 캡슐의 크기가 모두 100 ㎚ 이하로 형성되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 나노 침전법을 이용하여 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 제조하는 경우에 용매 및 증류수가 1:4의 비율일 때 안정적인 크기의 나노 캡슐을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
본 명세서에서는 보여주지 않았으나, 용매가 DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran) 클로로포름(chloroform) 및 다이클로로메테인(dichloromethane)에서도 용매 및 증류수가 1:4의 비율일 때 안정적인 크기의 나노 캡슐을 제조할 수 있음을 알 수 있었다 (실시예 1-4 참조).
<실시예 2. 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 세포 독성 확인>
상기 실시예 1-3에서 제조한 키토산이 코팅된 나노 캡슐(ChiNC)의 세포 독성 유발 여부를 확인하였다.
NIH3T3 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 10,000개가 되도록 분주한 후, 8~12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 1-3에서 제조한 PluNC 또는 ChiNC 모두를 각각 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖가 되도록 처리하고 24시간 동안 배양한 후, CCK8(cell counting kit-8) 및 제조사로부터 제공받은 매뉴얼을 바탕으로 세포 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 NIH3T3 세포를 대조군(control)으로 하여, 대조군의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여 각각의 처리군에 대한 세포 생존율을 분석하였다.
도 7에서 보듯이, PluNC 또는 모든 ChiNC가 모든 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노 캡슐이 세포 독성을 일으키지 않는 생체적합성이 우수한 물질임을 알 수 있었다.
<실시예 3. 난용성(지용성) 활성제를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조 조건 확립>
본 발명에서는 활성제 중, 지용성 특성을 지닌 항암제(paclitaxel, docetaxel), 항염증제(dexamethasone), 면역억제제(cyclosporin A), 항산화제(tocopheryl acetate), 주름방지제(retinyl palmitate), 탈모방지제(minoxidil, finasteride), 노화방지제(tocopheryl acetate, retinyl palmitate)를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조 조건 확립하였다.
Docetaxel, Paclitaxel, Dexamethasone, Tocopheryl acetate, Cyclosporin A, Retinyl palmitate을 각각 1 ㎖의 아세톤에 녹인 후 반응용액을 플루로닉 F127 20 ㎎에 녹이고 2시간 동안 반응시켜 주었다. 그 후 반응 용액을 400 rpm으로 stirring 하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수 (deionized water)에 천천히 떨어뜨려 주어서 약물 로딩 고분자 나노 캡슐을 제조한 후, 6시간 동안 후드에서 아세톤을 제거해 주었다. 최종적으로 키토산 (탈아세틸화 90%, 분자량 10 kDa) 20 ㎎을 각각의 고분자 나노 캡슐에 첨가해 주고 2시간 동안 상온에서 교반해 줌으로써 약물 로딩 키토산 나노 캡슐을 제조하였다. 최종적으로 로딩되지 않은 약물을 제거하기 위해서 ultrafiltration (Amicon Ultra-15 filter)을 진행하였다.
한편, Finasteride, Minoxidil, Tocopheryl acetate, Retinyl palmitate을 각각 1 ㎖의 에탄올에 녹인 후 반응용액을 플루로닉 F127 20 ㎎에 녹이고 2시간 동안 반응시켜 주었다. 그 후 반응 용액을 400 rpm으로 stirring 하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수 (deionized water)에 천천히 떨어뜨려 주어서 약물 로딩 고분자 나노 캡슐을 제조한 후, 6시간 동안 후드에서 에탄올을 제거해 주었다. 최종적으로 키토산 (탈아세틸화 90%, 분자량 10 kDa) 20 ㎎을 각각의 고분자 나노 캡슐에 첨가해 주고 2시간 동안 상온에서 교반해 줌으로써 약물 로딩 키토산 나노 캡슐을 제조하였다. 최종적으로 로딩되지 않은 약물을 제거하기 위해서 ultrafiltration (Amicon Ultra-15 filter)을 진행하였다.
제조된 약물이 로딩된 ChiNC 10K의 크기, 분산도 및 표면전하를 electrophoretic light scattering spectrophotometer (ELS-Z2, Otsuka) 장비를 이용하여 분석하였다.
실시예 3-1. Paclitaxel 및 Docetaxel을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
도 8에서 보는 바와 같이, Paclitaxel(PTX)이 로딩된 나노 캡슐을 제조할 수 있었으며, 로딩 함량 (0.1 wt%)까지 로딩 전후의 크기, 분산도, 표면전하에 큰 영향을 미치지 않았다. 0.2 wt%에서는 나노 캡슐의 직경이 3 ㎛에 달했으나 침전은 발생하지 않아 국소적으로 사용될 수 있는 키토산 마이크로캡슐을 제조하는 것이 가능한 것을 확인하였다. 그러나 0.5 wt%에서는 부분적 침전물이 발생되었다.
Docetaxel(DOC)의 경우에는 2 wt%까지 안정적으로 키토산 나노 캡슐 내에 로딩 될 수 있음을 확인하였다. 또한 3 wt%까지는 침전물 없이 제조되는 제형 조건을 확인하여, 항암제가 로딩된 키토산 나노 캡슐 및 키토산 마이크로캡슐이 제조될 수 있음도 확인하였다.
실시예 3-2. Cyclosporin A 및 Dexamethasone를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
도 9에서 보는 바와 같이, Cyclosporin A(CsA)의 경우에는 5 wt%까지 안정적으로 키토산 나노 캡슐 내에 로딩 될 수 있음을 확인하였다. 또한 10 wt%까지는 침전물 없이 제조되는 제형 조건을 확인하였다. 5 wt%의 로딩 양에서는 키토산 나노 캡슐을 형성하였으며, 조금 더 큰 크기의 키토산 나노 캡슐을 이용한 국소적 치료를 고려하면, 10 wt%까지 로딩 가능한 것을 확인하였다. 또한, 온도 민감성을 평가한 결과, 10℃에서는 입자 크기가 700㎚ 이상이 되고, 32.5℃ 또는 37℃에서는 100㎚ 이하(30~100 ㎚)가 되는 것을 확인하였다
Dexamethasone(DEX)의 경우, 3 wt%까지 최적으로 로딩이 가능하며, 5 wt%까지 침전물은 발생하지 않아서 900 nm 크기의 큰 키토산 나노 캡슐을 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3-3. Retinyl palmitate 및 Tocopheryl acetate를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
도 10에서 보는 바와 같이, Retinyl palmitate(RP)의 경우에는 5 wt%까지 안정적으로 키토산 나노 캡슐 내에 로딩 될 수 있음을 확인하였다. 또한 10 wt% 로딩 함량에서는 키토산 나노 캡슐의 크기가 100 nm 정도의 크기를 보여주었으나, 분산도 및 표면전하에서 거의 유사함을 보여줌으로써 안정적으로 제조되었으며 침전물도 발생하지 않았다.
하기 표 2에서 보는 바와 같이 활성제로 retinyl palmitate을 사용했을 경우, 20 wt%까지 로딩했을 때 크기는 증가하지만 분산도 및 표면전하가 크게 차이가 나지 않아 사용 20 wt%의 고농도로 로딩 가능한 것을 확인하였다.
Loading Content (wt%) size (㎚) PDI Charge
0 52 0.18 25.3
2 53 0.20 22.8
5 67 0.28 23.6
10 104 0.25 20.8
20 254 0.31 17.5
Tocopheryl acetate(TA)의 경우, 2 wt%까지 최적으로 로딩이 가능하며, 5 wt%까지 침전물은 발생하지 않아서 90 nm 크기의 키토산 나노 캡슐을 제조할 수 있었다.
실시예 3-4. Minoxidil 및 Finasteride 을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
도 11에서 보는 바와 같이, Minoxidil(MX)의 경우에는 5 wt%까지는 로딩 전의 키토산 나노 캡슐의 크기, 분산도, 표면전하에 큰 영향이 없었으며, 안정적으로 키토산 나노 캡슐 내에 최적으로 로딩 될 수 있음을 확인하였다.
또한 Finasteride(FS)의 경우에는 0.1 wt%까지 최적으로 로딩이 가능하며, 2 wt%까지 침전물은 발생하지 않아서 4 ㎛ 크기의 키토산 마이크로캡슐을 제조할 수 있었다. 또한, 5 wt%로 로딩했을 때 분산도 및 표면전하가 로딩 전의 키토산 나노 캡슐과 큰 차이가 나기 때문에 바람직하게는 0.1 wt%까지가 최적의 로딩 조건이며, 마이크로 캡슐 제조를 통해 국소적 전달의 목적으로 사용할 경우에는 2 wt%까지 가능하다는 것을 확인하였다.
상기와 같이 난용성(지용성) 활성제를 0.1 wt% 내지 20 wt%의 범위에서 100 ㎚ 이하의 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조 조건을 확립하였고, 이에 따라 테트라드라인(tetradrine), 아스타잔틴(astaxanthin), 커큐민(curcumin), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 카페인산 페네틸에스터(caffeic acid phenethyl ester; CAPE), 센텔라 아시아티카(centella asiatica), 베타-사이토스테롤, 아스코르빌 테트라아이소팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate), 트리펩타이드 콜라겐(tripeptide collagen) 등의 활성제의 키토산 코팅 나노캡슐 최적화 조건을 확립할 수 있었다.
<실시예 4. 수용성 활성제를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조 조건 확립>
본 발명에서는 활성제 중, 수용성 특성을 지닌 항암제(doxorubicin), 면역항원제(ovalbumin), 단백질치료제 약물(bovine serum albumin, BSA)을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조 조건 확립하였다.
1 ㎖의 아세톤에 플루로닉 F127 20 ㎎을 녹이고 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 반응 용액을 400rpm으로 stirring 하고 있는 4 ㎖의 3차 증류수 (deionized water)에 천천히 떨어뜨려 주어서 약물 로딩 고분자 나노 입자를 제조한 후 6시간 동안 후드에서 아세톤을 제거해 주었다. 최종적으로 키토산 (탈아세틸화 90%, 분자량 10 kDa) 20 ㎎을 각각의 고분자 나노 입자에 첨가해 주고 2시간 동안 상온에서 교반해 줌으로써 약물 로딩 키토산 나노 캡슐을 제조하였다.
제조한 키토산 나노 캡슐 내에 수용성 약물 (doxorubicin, BSA, Ovalbumin)을 첨가해 준 뒤, 4℃에서 2시간동안 로딩 될 수 있게 보관하였다. 로딩되지 않은 약물들은 ultrafiltration(Amicon Ultra-15 filter)을 통해 제거한 뒤, 로딩 조건 최적화 하였다.
로딩되지 않은 doxorubicin은 흡광도(480 nm)를 이용하여 측정하였고, BSA와 Ovalbumin은 Coomassie blue assay를 통해 흡광도(580 nm)에서 측정하였다.
수용성 약물이 로딩된 키토산 나노 캡슐 (ChiNC 10K)의 크기, 분산도 및 표면전하를 electrophoretic light scattering spectrophotometer (ELS-Z2, Otsuka) 장비를 이용하여 분석하였다.
실시예 4-1. Doxorubicin을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
지용성 약물을 키토산 나노 캡슐 내에 로딩하는 방법과 달리, 수용성 약물의 경우 도 12에서 보여주듯이 키토산 나노 캡슐의 온도감응성 특성 (4℃에서 크기가 1 ㎛로 커지면서 volume expansion 발생)을 이용하여 저온 (4℃)에서 로딩하였다.
도 13에서 보여주듯이, Doxorubicin(DOX)를 로딩한 키토산 나노 캡슐의 경우 크기, 분산도, 표면전하 모두 거의 유사하였고, 특히 10 wt%까지 안정적으로 로딩될 수 있음을 확인하였으며, 도 13에서 보여주지는 않았으나, 20 wt%에서도 마이크로캡슐의 형성이 가능하였다.
흡광도 분석법을 통해 확인한 결과, 최적의 로딩 함량은 6 wt% 임을 확인하였다.
실시예 4-2. Ovalbumin을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
도 14에서 보여주듯이, Ovalbumin(OVA)을 로딩한 키토산 나노 캡슐의 경우 5 wt%까지 크기, 분산도, 표면전하가 유사하였고, 침전물 없이 안정적으로 로딩될 수 있음을 확인하였다. 흡광도 분석법을 통해 확인한 결과, 최적의 로딩 함량은 3 wt% 임을 확인하였다.
실시예 4-3. Bovine Serum Albumin (BSA)을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제조
도 15에서 보여주듯이, 다양한 단백질 치료제의 모델 약물인 BSA (67kDa)를 로딩한 키토산 나노 캡슐의 경우 5 wt%까지 크기, 분산도, 표면전하가 유사하였고, 침전물 없이 안정적으로 로딩될 수 있음을 확인하였다. 흡광도 분석법을 통해 확인한 결과, 최적의 로딩 함량은 4 wt% 임을 확인하였다.
상기와 같이 수용성 활성제를 0.1 wt% 내지 20 wt%의 범위에서 100 ㎚ 이하의 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조 조건을 확립하였고, 이에 따라 포스포리파제 A2(phospholipase A2; PLA2), 섬유아세포성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor; b-FGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 등의 활성제의 키토산 코팅 나노캡슐 최적화 조건을 확립할 수 있었다.
<실시예 5. 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제형 안정성 확립>
실시예 5-1. 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 제형 안정성
상기 실시예 4에서 확립된 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조 방법 및 조건을 바탕으로 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 제조하였고, 약물로써 난용성 약물인 싸이클로스포린 A(CsA)와 모델 난용성 약물로 일반적으로 사용되고 있는 나일레드(Nile red) 및 피렌(Pyrene)을 이용하였다.
CsA, 나일레드 또는 피렌 0.2 ㎎ 또는 0.5 ㎎과 플루로닉 F126 10 ㎎을 1 ㎖의 아세톤에 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하여 반응 용액을 제조하였다. 제조한 반응 용액을 530rpm으로 교반하고 있는 4㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨리고, 4시간 이상 흄후드(fume hood) 내에서 교반하면서 자연적으로 아세톤이 증발하도록 하였다. 아세톤이 제거된 플루로닉으로 이루어진 나노 입자가 포함되어 있는 3차 증류수에 플루로닉과 동일한 중량으로 10kDa 키토산을 첨가한 뒤 교반하여 각각의 약물이 포함되어 있는 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 제조하였고(각각 CsA@ChiNC, Nile red@ChiNC, Pyrene@ChiNC라 함), 제조한 CsA@ChiNC, Nile red@ChiNC, Pyrene@ChiNC을 상온에 방치하여 침전물 발생 여부를 확인하여 안정성을 확인하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 보듯이, CsA@ChiNC, Nile red@ChiNC, Pyrene@ChiNC 모두 침전물이 발생하지 않는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐이 제형적으로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5-2. 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 동결건조 안정성
키토산 나노 캡슐 제형의 안정성 평가를 위해서, 3차증류수와 PBS 내에서의 안정성 평가 및 동결건조 전후의 안정성 평가를 실시하였다.
도면 17에서 보여주듯이, Cyclosporin A와 Retinyl palmitate (RP)가 로딩된 키토산 나노 캡슐을 37℃ 100 rpm 조건하에서 안정성을 평가한 결과 4주 동안 정제수와 PBS 내에서 모두 크기가 유사한 결과를 보여줌으로써 안정성이 잘 유지될 수 있다는 것을 확인하였다.
또한 동결건조 전 (Before FD or B.F: before freeze-drying)과 후 (After FD or A.F: after freeze-drying)의 키토산 나노 캡슐의 크기 변화 및 침전물 발생이 없는 것이 관찰됨에 따라서 안정성이 우수함을 확인하였으며, 특히 동결건조 과정에서 동결방지제 (cryoprotectants)없이 동결건조 재분산이 용이한 것을 확인하였다.
<실시예 6. 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 경피 전달 효과 확인>
약물 또는 유효성분의 경피로의 전달 제형의 개발은 제약 및 화장품 업계에서 주목하고 있는 분야이다. 이에 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 피부 투과율 및 이를 통한 약물 전달 효능을 확인하였다.
실시예 6-1. 프란츠 확산 셀 시스템을 이용한 피부 투과 최적화를 위한 키토산 종류 최적화
실시예 1-3에서 분자량이 20 kDa 이하의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K)은 100 ㎚ 이하의 키토산 나노 입자를 안정적으로 형성한 것을 확인하였는데, 이 중 피부투과율에서 최적화된 키토산 나노 캡슐을 확립하기 위하여 프란츠 확산 셀 시스템을 이용하였다.
프란츠 확산 셀 시스템은 도너 챔버(donor chamber)에 약물을 포함하는 제형을 적용하고, 리셉터 챔버(receptor chamber)에는 PBS(phosphate buffered saline)와 같은 생리 식염수 등을 충전시키고, 도너 챔버와 리셉터 챔버 사이에는 투과막, 동물 피부 또는 세포배양 피부 등과 같은 투과층을 고정시켜 준 후, 도너 챔버에서 투과층을 통과하여 리셉터 챔버로 투과되는 약물의 양을 측정함으로써 피부 투과도 등을 측정할 수 있다.
프란츠 확산 셀 시스템의 리셉터 챔버에는 PBS(pH 7.4 containing 0.05% polysorbate 80)를 5㎖을 넣어 준 후, 리셉터 챔버와 도너 챔버 사이에 사람 사체 피부(human cadaver skin)를 1.5 × 1.5 ㎝의 크기로 덮어 고정시키고, Franz cell의 donor 부분에 각 샘플들을 넣어 주었다. Receptor chamber의 조건은 37℃, 600 rpm으로 조절하였으며, sampling time은 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24 시간으로 500 ㎕씩 회수하여 시간별 피부를 통해 투과해서 나온 약물의 양을 HPLC로 측정해 도 18에 나타내었다.
도 18에서 보는 바와 같이, CsA의 경우, 키토산 10 kDa을 사용해서 제조한 키토산 나노 캡슐(ChiNC 10K)에서 최고의 피부투과율을 보여주었다. 키토산 3 kDa 보다 통계적으로 유의적인 차이를 보여준 이유는 도 3에서 보는 바와 같이 ChiNC 10K가 ChiNC 3K보다 표면전하가 더 높았기 때문으로 평가된다.
키토산 10 kDa을 사용해서 제조한 키토산 나노 캡슐(ChiNC 10K)은 키토산을 코팅하지 않은 고분자 캡슐 (PluNC)에 비하여 피부투과율이 현저하게 증가되었으며, 상업적으로 가장 많이 사용되고 있는 리포좀 (Liposome) 제형보다 피부투과율이 6배 이상 높았다.
약물로 RP를 사용하여 평가한 결과, 최적의 조건인 ChiNC 10K에서 대조군인 RP 자체만 실험한 경우에 대해서 14배 이상의 피부투과률을 보여줌으로써 키토산 10kDa의 사용할 경우 약물의 피부투과율을 향상시킬 수 있다는 결과를 얻었다.
실시예 6-2. 프란츠 확산 셀 시스템을 이용한 키토산 코팅 나노 캡슐의 피부 투과율 확인
실시예 6-1과 같은 방법으로, 프란츠 확산 셀 시스템에서 나노 캡슐, 키토산 코팅 나노 캡슐의 피부 투과율을 확인하였다.
도너 챔버에 2 wt%의 나일레드를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐(Nile red@ChiNC)을 2 ㎎/㎖이 되도록 넣었다. 이때, 대조군으로 나일레드 단독(Nile red), 나일레드를 포함하는 키토산이 코팅되지 않은 나노 캡슐(Nile red @PluNC)를 처리하였다. 리셉터 챔버의 조건을 37℃ 600 rpm으로 조절하고, 0.5, 1, 2, 3, 8, 12, 24 시간에 리셉터 챔버에서 500 ㎕씩 샘플을 채취하여, 각 시간별 샘플의 형광을 측정하여 피부 투과율을 측정하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에서 보는 바와 같이, 나일레드를 단독으로 처리한 경우에는 피부 투과가 거의 일어나지 않는 반면에, Nile red@PluNC 및 Nile red@ChiNC을 사용한 경우 피부 투과율이 증가하였고, 특히 Nile red@ChiNC의 피부 투과율이 Nile red@PluNC에 비해 4배 이상 증가한 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 피부 투과율이 우수함을 알 수 있었다.
<실시예 7. 동물 모델을 이용한 경피 전달 확인>
실시예 7-1. 동물 모델에서 키토산 코팅된 나노 캡슐을 이용한 나일레드 결피 전달
실시예 4를 바탕으로 제조한 2 중량%의 나일레드를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐(Nile red@ChiNC)을 2 ㎎/㎖의 농도가 되도록 제조하고, 300 ㎕씩 5일 동안, 털이 제거된 쥐의 등 부위에 발라주었다. 이후, 등 피부를 채취하여 10% 중성 포르말린 용액을 이용하여 12시간 고정시키고, 고정된 피부를 OCT(Optimal Cutting Temperature) 컴파운드와 혼합하여 액체 질소 및 -20℃ 이하에서 얼린 뒤, 크리오 섹션(cryosection) 기기를 이용해 20 ㎛의 두께로 절편하고 슬라이드 유리에 부착시켜 피부 조직 샘플을 확보하였다. 확보한 피부 조직 샘플을 3차 증류수로 세척한 후 형광 현매경을 이용하여 나일레드의 피부 내 분포 현황을 관찰하였고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에서 보듯이, Nile red@ChiNC을 도포한 경우, 피부 조직 내에 나일레드가 존재하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐이 피부를 통해 약물을 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7-2. 경피 전달을 통한 약물의 효능 발현 확인
사이클로스포린 A는 건선 및 아토피 치료제로 사용되고 있고, 발모 효과가 있다는 것이 보고되었으나, 사이클로스포린 A는 소수성 성질이 높아 수용액에 용해되지 않아 피부 내로 전달하는데 제한이 있다. 따라서 사이클로스포린 A를 용해시키기 위해서는 아세톤과 같은 유기용매로 용해시킨 후 도포해야 하나, 유기용매의 경우 피부 도포시 피부 자극 및 피부 장벽의 손실을 일으킬 수 있다.
이에, 피부 자극 및 손상 없이 효과적으로 사이클로스포린 A를 피부 내로 침투시켜 발모의 효능을 증대시킴으로써 탈모 치료에 있어 우수한 효과를 얻을 수 있으므로, 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐을 이용하여 사이클로스포린 A의 경피 전달 및 이를 통한 발모 효과를 확인하였다.
발모 실험을 위해서 식약처 가이드라인에 따라 7주령의 검은색 C57B/6, 암컷 쥐의 등 부위 털을 제거하였다. 등 부위 털을 제거한 쥐를 식염수를 처리한 대조군(CTL), 아세톤에 녹인 사이클로스포린 A 처리군(CsA) 및 실시예 4에서 제조한 5중량%의 사이클로스포린 A를 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐 처리군(CsA@ChiNC)으로 나누고, 각각의 시료를 일주일에 5일 동안 4주간 도포(1회 도포 시 CsA의 양이 50 ㎎/kg이 되도록 도포)하여 육안으로 발모 효과를 확인하고 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에서 보듯이, 아세톤에 녹인 CsA 자체 처리군에서는 발모의 최대 효과를 나타내는 4주차에서 5마리 중 5마리에서 모두 털이 자라는 것이 확인된 반면에, 대조군(CTL)에서는 5% 미만으로 자연 발모가 관찰되었다. CsA 자체 처리군의 경우에는 CsA를 녹인 아세톤에 의해서 피부의 조직 및 장벽이 손실되어 CsA의 약물이 피부 내로 침투되었기 때문인 것으로 예상된다.
CsA@ChiNC 처리군에서는 5마리 중 4마리에서 발모가 발생하였고, 그 효능은 CsA 자체 처리군과 비교할 경우 80% 이상의 발모 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
추가적으로, 상기 각각의 처리군의 쥐 등 피부를 채취하여 모낭의 수 및 크기를 관찰하였고, 그 결과를 도 21 (b) 및 (c)에 나타내었다.
도 21 (b) 및 (c)에서 보듯이, 아세톤에 녹인 CsA 자체 처리군(D)과 CsA@ChiNC(C) 처리군에서의 모낭 수 및 크기가 유사함을 확인하였다.
상기 결과들을 통해, 본 발명의 약물을 포함하는 키토산이 코팅된 나노 캡슐이 피부 투과율뿐만 아니라 피부 내로의 약물 전달 효율이 우수함을 알 수 있으며, 난용성 약물의 인체 및 동물 내 전달을 위한 플랫폼 기술로 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 8. 나노 캡슐의 경구 투여를 통한 생체 내 유효성분들의 생체이용률 증가확인>
사이클로스포린 A (CsA) 약물이 담지되어 있는 나노캡슐의 경구 실험을 위하여 Male Sprague-Dawley rat (200~250 g)을 사용하였다. CsA가 5 중량% 로딩되어 있는 나노캡슐 (1㎖ 정제수, 50 ㎎/㎏)을 feeding needle을 이용하여 투여 하였다. 그 이후에 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간에 각각 혈액을 채취하였고, HPLC로 정량 분석하였다.
실험 결과, 키토산 나노캡슐 그룹에서 키토산이 코팅되어 있지 않은 나노캡술에 비해서 CsA의 혈액 내 반감기 및 생체이용률이 증가하는 것을 확인하였다.
또한 상기 실시예 7의 방법과 같이, 발모 실험을 위해서 식약처 가이드라인에 따라 7주령의 검은색 C57B/6, 암컷 쥐의 등 부위 털을 제거한 후, 상기와 같은 방법으로 CsA 및 CsA@ChiNC 용액을 일주일에 3회, 4주 동안 경구 투여한 결과, CsA 경구투여 그룹보다 CsA@ChiNC 용액을 경구 투여한 쥐그룹에서 발모효능이 더 향상되었다. 이는 키토산 나노캡슐에 의하여 생체 내 흡수율이 향상되었기 때문으로 사료되며, 본 발명의 키토산 나노캡슐을 이용한 약물전달시스템이 뛰어난 약물 전달 효과를 갖는 것을 확인하였다.

Claims (24)

  1. 약물 및 플루로닉을 포함하는 5~50 nm 크기의 나노입자에 분자량 3~20 KDa 키토산이 코팅된 것을 특징으로 하는 30~100 nm 크기의 나노캡슐을 포함하는 경구 투여 제제로서,
    상기 약물은, 파클리탁셀(paclitaxel), 도탁셀(docetaxel), 테트라드라인(tetradrine), 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 덱사메타손(dexamethasone), 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 아스타잔틴(astaxanthin), 커큐민(curcumin), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 카페인산 페네틸에스터(caffeic acid phenethyl ester; CAPE), 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate), 마이녹시딜(minoxidil), 피나스테라이드(finasteride), 센텔라 아시아티카(centella asiatica), 베타-사이토스테롤, 아스코르빌 테트라아이소 팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate), 트리펩타이드 콜라겐(tripeptidecollagen), 독소루비신(doxorubicin), 포스포리파제A2(phospholipase A2; PLA2), 오브알부민(ovalbumin), 소혈청알부민(bovine serum albumin), 섬유아세포성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor; b-FGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며,
    상기 나노캡슐은, 약물 및 HLB(hydrophile-lipophile balance)가 8~29인 플루로닉을 상온에서 유기용매에 녹여 반응 용액을 제조하는 1단계; 나노침전법(nanoprecipitation)에 따라 상기 1단계의 고분자 용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응 용액의 유기용매를 자연 증발시켜 5~50 nm 크기의 나노입자를 제조하는 2단계; 상기 2단계의 나노입자에 분자량 3~20 KDa 키토산을 증류수에서 첨가 교반하여 키토산을 코팅하는 3단계;로 이루어진 제조방법을 통해 제조되며,
    상기 경구 투여 제제는 부형제, 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 및 산미제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 경구 투여 제제.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 플루로닉 100중량부를 기준으로 0중량부 초과~20중량부인 것을 특징으로 하는 경구 투여 제제.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 플루로닉은 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 경구 투여 제제.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 키토산은 플루로닉 100중량부를 기준으로 0.001~200 중량부인 것을 특징으로 하는 경구 투여 제제.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서,
    상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 클로로포름 (chloroform) 및 다이클로로메테인(dichloromethane) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 경구 투여 제제.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 2단계의 증류수는 1단계의 유기용매의 부피를 기준으로 4배인 것을 특징으로 하는 경구 투여 제제.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 활성제 및 플루로닉을 포함하는 5~50 nm 크기의 나노입자에 분자량 3~20 KDa 키토산이 코팅된 것을 특징으로 하는 30~100 nm 크기의 나노캡슐을 포함하는 건강기능식품으로서,
    상기 활성제는, 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 아스타잔틴(astaxanthin), 커큐민(curcumin), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 카페인산 페네틸에스터(caffeic acid phenethyl ester; CAPE), 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate), 센텔라 아시아티카(centella asiatica), 베타-사이토스테롤, 아스코르빌 테트라아이소 팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate), 트리펩타이드 콜라겐(tripeptidecollagen), 포스포리파제A2(phospholipase A2; PLA2), 오브알부민(ovalbumin) 및 소혈청알부민(bovine serum albumin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며,
    상기 나노캡슐은, 활성제 및 HLB(hydrophile-lipophile balance)가 8~29인 플루로닉을 상온에서 유기용매에 녹여 반응 용액을 제조하는 1단계; 나노침전법(nanoprecipitation)에 따라 상기 1단계의 고분자 용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응 용액의 유기용매를 자연 증발시켜 5~50 nm 크기의 나노입자를 제조하는 2단계; 상기 2단계의 나노입자에 분자량 3~20 KDa 키토산을 증류수에서 첨가 교반하여 키토산을 코팅하는 3단계;로 이루어진 제조방법을 통해 제조되는 나노 캡슐인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  23. 삭제
  24. 약물 및 플루로닉을 포함하는 5~50 nm 크기의 나노입자에 분자량 3~20 KDa 키토산이 코팅된 것을 특징으로 하는 30~100 nm 크기의 나노캡슐을 포함하는 주사제로서,
    상기 약물은, 파클리탁셀(paclitaxel), 도탁셀(docetaxel), 테트라드라인(tetradrine), 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 덱사메타손(dexamethasone), 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 아스타잔틴(astaxanthin), 커큐민(curcumin), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 카페인산 페네틸에스터(caffeic acid phenethyl ester; CAPE), 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate), 마이녹시딜(minoxidil), 피나스테라이드(finasteride), 센텔라 아시아티카(centella asiatica), 베타-사이토스테롤, 아스코르빌 테트라아이소 팔미테이트(ascorbyl tetraisopalmitate), 트리펩타이드 콜라겐(tripeptidecollagen), 독소루비신(doxorubicin), 포스포리파제A2(phospholipase A2; PLA2), 오브알부민(ovalbumin), 소혈청알부민(bovine serum albumin), 섬유아세포성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor; b-FGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며,
    상기 나노캡슐은, 약물 및 HLB(hydrophile-lipophile balance)가 8~29인 플루로닉을 상온에서 유기용매에 녹여 반응 용액을 제조하는 1단계; 나노침전법(nanoprecipitation)에 따라 상기 1단계의 고분자 용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응 용액의 유기용매를 자연 증발시켜 5~50 nm 크기의 나노입자를 제조하는 2단계; 상기 2단계의 나노입자에 분자량 3~20 KDa 키토산을 증류수에서 첨가 교반하여 키토산을 코팅하는 3단계;로 이루어진 제조방법을 통해 제조되며,
    상기 주사제는 희석제 및 현탁제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사제.
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