KR102611903B1 - 3차원 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3차원의 세포 배양을 위한 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것으로, 상세하게는 다공성 지지체의 적어도 일면에 세포를 배양하는 단계에 있어서, 다공성 지지체의 적어도 일면에 세포를 배양하는 단계에 있어서, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법; 및 개구부, 적어도 일면에 세포를 배양하기 위한 다공성 지지체 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 상부 챔버, 및 적어도 하나의 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버를 포함하며, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추기 위한 장치로써, 상기 하부 챔버에 유체의 운동을 제공하는 장치를 구비하는, 세포 배양 장치를 제공한다.
Description
본 발명은 3차원 세포 배양을 위한 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것으로, 상세하게는 생체 내 조직, 예를 들어 장 상피세포의 생체 내 구조와 유사한 형태로 세포를 배양할 수 있는 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.
미세유체공학 기반 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 기술은 생체모방 장기칩(organ-on-a-chip)의 개념으로 확장되고 있으며, 약물반응 시험의 새로운 플랫폼으로 적용 가능한 잠재성을 보여주고 있다. 이에, 최근 많은 연구자들이 미세유체 기술 활용하여, 특정 목적에 부합하는 설계 최적화 연구를 활발히 진행하고 있다. 이 기술은 각기 다른 장기의 성질과 기능을 체외 환경(in vitro)에서 구현하고, 세포와 주위 미세환경 간 상호 작용을 모사함으로써, 약물 스크리닝, 약물 전달시스템에 대한 정량적 정보를 제공해 줄 수 있다.
그러나, 미세유체 시스템이 세포 배양 장치에 적용되는 경우 미세유체 시스템이 요구하는 복잡한 도관 및 펌프 설비에 의해 실질적으로 널리 활용되는데 어려움이 있다. 특히, 미세유체 시스템의 복잡성은 장치의 스케일이 커지고 표본(Sample)의 개수가 많아질수록 기하급수적으로 높아지는데, 그에 따라 설비 비용 및 사용 난이도가 함께 상승하게 된다. 이로 인해 미세유체 시스템을 기반하여 많은 수의 표본이 필요한 약물 스크리닝이 가능한 장치를 개발하는 것은 공학적으로 어렵다.
한편, 생체의 여러 장기 중 장 조직 모델은 약물 평가 및 신약 개발에 널리 활용되는 대표적인 체외 동물 조직 모델로써, 상기 모델은 장에서 일어나는 약물의 흡수 및 대사 현상 등을 체외에서 모사, 관찰, 분석할 수 있도록 하는 중요한 역할을 수행한다.
그러나, 실제 체내의 장 조직은 3차원 융모 구조를 이루는 반면, 상술한 바와 같이 인서트 상에서 배양된 장 세포들은 3차원 융모 구조의 형태가 유도되지 않으며, 2차원 형태를 유지한 채 배양되는 것에 그치며, 이로 인해 종래 2차원의 장 조직 모델에서 일어나는 생화학적 현상 및 외부 자극에 의한 반응들은 체내에서의 현상 및 반응과 다르게 나타나게 된다. 이는 체외 장 조직 모델 상 미생물 거동 및 영향 연구, 약물 평가 및 약물 후보 선별의 신뢰성 및 유효성을 현저히 저하시키는 원인이 되나, 체내 장 조직과 유사한 3차원 형태와 생리적 기능을 갖도록 장 세포를 배양하는 것은 매우 어렵다.
본 발명은 세포 배양 시 3차원 구조의 형태를 유도할 수 있는 세포 배양 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 배양 시 3차원 구조에 영향을 미치는 세포 분비 물질의 조절 및 이를 위한 유동의 형성과 같은 물리적 환경 구현을 통해, 동물 세포의 체외 배양 시, 동물 세포들이 3차원 구조를 가지며, 특히 3차원의 융모 형태로 유도될 수 있는 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 견지에 있어서, 본 발명은 다공성 지지체의 적어도 일면에 세포를 배양하는 단계에 있어서, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 추가적인 유체의 제공 없이 낮추는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 본 발명은 개구부, 적어도 일면에 세포를 배양하기 위한 다공성 지지체 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 상부 챔버; 및 적어도 하나의 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버를 포함하며, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추기 위한 장치로써, 상기 하부 챔버에 유체의 운동을 제공하는 장치를 구비하는, 세포 배양 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 세포 배양 방법 및 장치에 의해 세포를 배양하는 경우 세포 배양 시 세포에서 스스로 분비하는 분비 물질을 효율적으로 제어할 수 있고, 이에 따라 체외에서 배양되는 동물 세포가 3차원 구조, 예를 들어 장 상피 세포 배양 시 체내와 동일하거나 유사한 융모의 3차원 구조를 형성할 수 있도록 할 수 있다. 이로 인해, 약물 평가 및 신약 개발과 같은 장 조직 모델이 사용되는 분야에 있어서, 실제 체내에서의 약물의 흡수 및 대사 현상 등과 유사한 현상을 체외에서 모사, 관찰, 및 분석할 수 있다.
도 1A는 기존의 세포 배양 장치를 나타내며, 도 1B는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치 중 일부를 나타낸다.
도 2A는 다양한 종류의 Wnt 신호 경로의 길항제가 장 조직의 형태 발생에 미치는 영향에 대한 결과를 나타내며, 도 2B 및 2C는 DKK-1이 장 세포의 형태 발생에 미치는 실험 결과를 나타낸다.
도 3A-3C는 장 세포 배양 시, 세포 배양 층을 기준으로 상단 및/또는 하단에 적용되는 유동의 존재 여부에 따른 장 조직의 형태 발생의 영향을 나타낸다. 도 3A는 상단 및 하단 모두에 배양액의 유동을 구현한 경우, 도 3B는 하단에만 배양액의 유동을 구현한 경우, 및 도 3C는 상단에만 배양액의 유동을 구현한 경우에 형성된 세포 형태를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A-4C는 종래 세포 배양 장치 및 본 발명의 장치에서 물질 농도 저하 효과를 비교한 것으로 도 4A는 유체의 운동이 제공되지 않은 경우, 도 4B는 유체의 운동이 제공된 경우, 도 4C는 유체의 운동을 제공하기 위한 시도를 하였으나, 하부 챔버에 담기는 유체의 질량이 불충분하여 실질적으로 유체의 운동이 발생하지 않은 경우를 나타낸 것이다.
도 5A-5C는 유체의 회전 운동에 의한 장 조직의 형태 발생의 영향을 나타낸 것으로, 도 5A는 유체의 회전운동이 제공되지 않은 경우, 도 5B는 유체의 회전 운동을 제공하기 위한 시도를 하였으나, 하부 챔버에 실질적으로 유체의 운동이 발생하지 않은 경우 및 도 5C는 유체의 회전운동이 제공된 경우를 나타낸 것이다.
도 6A-6C는 발명된 장치에서 배양된 유체의 회전 운동에 의해 3차원 융털 구조를 가지게 된 장 조직의 기능과 종래 세포 배양 장치에서 배양된 장 조직이 가지는 기능을 비교한 것으로, 경우, 도 6A는 증식이 활발하게 일어나는 장 세포 핵(Ki67) 의 비율을 확인한 것이고, 도 6B는 물질 대사 단백질(CYP3A4)의 발현을 확인한 것이며, 도 6C는 장 세포의 점액 분비와 관련된 단백질(MUC2)의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타낸다.
도 2A는 다양한 종류의 Wnt 신호 경로의 길항제가 장 조직의 형태 발생에 미치는 영향에 대한 결과를 나타내며, 도 2B 및 2C는 DKK-1이 장 세포의 형태 발생에 미치는 실험 결과를 나타낸다.
도 3A-3C는 장 세포 배양 시, 세포 배양 층을 기준으로 상단 및/또는 하단에 적용되는 유동의 존재 여부에 따른 장 조직의 형태 발생의 영향을 나타낸다. 도 3A는 상단 및 하단 모두에 배양액의 유동을 구현한 경우, 도 3B는 하단에만 배양액의 유동을 구현한 경우, 및 도 3C는 상단에만 배양액의 유동을 구현한 경우에 형성된 세포 형태를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A-4C는 종래 세포 배양 장치 및 본 발명의 장치에서 물질 농도 저하 효과를 비교한 것으로 도 4A는 유체의 운동이 제공되지 않은 경우, 도 4B는 유체의 운동이 제공된 경우, 도 4C는 유체의 운동을 제공하기 위한 시도를 하였으나, 하부 챔버에 담기는 유체의 질량이 불충분하여 실질적으로 유체의 운동이 발생하지 않은 경우를 나타낸 것이다.
도 5A-5C는 유체의 회전 운동에 의한 장 조직의 형태 발생의 영향을 나타낸 것으로, 도 5A는 유체의 회전운동이 제공되지 않은 경우, 도 5B는 유체의 회전 운동을 제공하기 위한 시도를 하였으나, 하부 챔버에 실질적으로 유체의 운동이 발생하지 않은 경우 및 도 5C는 유체의 회전운동이 제공된 경우를 나타낸 것이다.
도 6A-6C는 발명된 장치에서 배양된 유체의 회전 운동에 의해 3차원 융털 구조를 가지게 된 장 조직의 기능과 종래 세포 배양 장치에서 배양된 장 조직이 가지는 기능을 비교한 것으로, 경우, 도 6A는 증식이 활발하게 일어나는 장 세포 핵(Ki67) 의 비율을 확인한 것이고, 도 6B는 물질 대사 단백질(CYP3A4)의 발현을 확인한 것이며, 도 6C는 장 세포의 점액 분비와 관련된 단백질(MUC2)의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 동물 조직의 형태 발생에 중요한 역할을 하는 인자와 그 영향을 규명하고, 해당 인자의 조절을 통해 동물 조직의 형태 발생을 유도할 수 있는 세포 배양 장치 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명에 의하면 예를 들어 장 상피 세포와 같은 상피세포의 배양에 있어서, 3차원의 융털 구조의 형성을 유도할 수 있으며, 나아가 이와 같은 배양을 대량으로 생산할 수 있는 장치 및 방법이 제공될 수 있다.
상세하게, 본 발명의 세포 배양 장치를 이용하여 수행되는 세포 배양 방법은 다공성 지지체의 적어도 일면에 세포를 배양하는 단계에 있어서, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계를 포함하는 것이다.
한편, 상기 다공성 지지체 타면의 하부 영역은 다공성 지지체를 기준으로 0.01mm 이격된 영역을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어 세포가 배양되는 면의 반대 면에 있어서 다공성 지지체를 기준으로 0.01mm 이격된 영역을 포함하는 0.1mm, 0.5mm, 1mm, 2mmm, 3mm 등의 간격으로 이격된 부분과 다공성 지지체 사이의 영역을 지칭하는 것일 수 있다. 다만, 이가 제한되는 것은 아니며, 상기와 같은 영역을 포함하는 이 보다 넓은 범위 영역일 수도 있으며, 또한 다공성 지지체를 기준으로 0.01mm 이내로 이격된 영역을 제외하려는 의도는 아니며, 0.0001mm, 0.005mm 등과 같이 0.01mm 이내로 이격된 영역도 본 발명의 '다공성 지지체 타면의 하부 영역'에 포함되는 것으로 해석되어야 하는 것으로, 다공성 지지체에 인접한 영역이라면 모두 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명에 의한 세포 배양 방법은 적어도 상기와 같이 다공성 지지체에 인접한 영역은 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 것을 전제로 한다.
한편, 상기 상기 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계의 세포 분비 물질의 농도는 10 μg/ml 이하로 유지되는 것일 수 있으며, 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계는 전체 세포 배양 기간을 기준으로 10% 이상, 예를 들어 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 기간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 상기 기간은 연속적이거나 불연속적일 수 있다.
상기 세포 분비 물질은 sFRP1, FRZB, Sizzled, Sizzled2, Crescent, WIF-1, Cerberus, Coco, DKK-2, DKK-3, DKK-4, Soggy, sFRP2, sFRP3, sFRP4, sFRP5 및 DKK-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 DKK-2를 포함하는 것이다. 보다 바람직하게 상기 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계는 DKK-1의 농도가 10 μg/ml 이하로 유지되는 것이다.
본 발명에 있어서 상기 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계는 i) 하부 영역에 유동하는 유체를 제공하거나, ii) 하부 영역에 유체의 운동을 제공하거나, iii) 세포 분비 물질에 대한 항체를 추가하여 수행되는 것일 수 있으며, 보다 상세하게 상기 i) 하부 영역에 유동하는 유체를 제공하는 단계는 상기 하부 영역을 포함하는 세포의 하단에 유체의 유입 및 배출을 형성하여 유체의 적어도 한 방향으로 흐름(flow)을 형성하는 것이나, 이와 같이 하부 영역에 유동하는 유체를 제공하는 경우에는 새로운 유체의 유입 및 배출이 요구되고, 이를 위한 장치가 하부 챔버에 연결되어야 하는 등 장치가 복잡해지는 문제가 있다.
따라서, ii) 하부 영역에 유체의 운동(fluid motion)을 제공하는 단계가 바람직하며, 상기 단계는 상기와 같이 유체가 흐르지는 않지만, 정치 상태에서의 유체의 이동을 모두 포함하는 것으로, 예를 들어 상기 유체의 운동은, 유체의 왕복 운동, 유체의 회전 운동, 유체의 소용돌이 형성, 유체의 기울기 운동 및 유체의 랜덤 운동으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 의해 제공되는 것일 수 있으며, 상하 운동 및/또는 수평 운동을 모두 포함하는 것으로, 다만 이에 제한되는 것은 아니며, 배양되는 세포의 하부 영역에서 세포 분비 물질을 확산 촉진시키거나, 희석시키거나, 이격시키는 모든 유체의 운동을 포함하는 것이다. 다만, 상기 유체의 운동(fluid motion)을 제공하는 단계는 새로운 유체의 유입 및 사용된 유체의 배출이 수반되지 않는 것을 전제로 한다.
한편, 유체의 유동 및 이동을 제공하지 않고 하부 영역의 유체 부피를 증가시켜 세포의 하단의 세포 분비 물질에 대한 단순 확산을 유도하여 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮출 수도 있으나, 이 경우 융모 유사 돌출부와 같은 3차원 구조의 형성이 유체의 유동 및 이동을 제공하는 경우에 비하여 원활하지 못한 경향이 있고, 돌출부의 밀도가 낮거나 형성 위치의 분포가 균일하지 않았다.
또한, 본 발명에 의하면 상술한 본 발명의 세포 배양 방법을 구현할 수 있는 세포 배양 장치가 제공된다.
보다 상세하게, 본 발명의 세포 배양 장치는 개구부, 적어도 일면에 세포를 배양하기 위한 다공성 지지체 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 상부 챔버; 및 적어도 하나의 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버를 포함하며, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추기 위한 장치로써, 상기 하부 챔버에 유체의 운동을 제공하는 장치를 구비하는 것이다.
이때 다공성 지지체 타면의 하부 영역은 다공성 지지체를 기준으로 0.01 mm 이격된 영역을 포함하는 것으로, 세포 배양 방법에서 기술한 바와 같다.
본 발명의 세포 배양 장치에 있어서 상기 상부 챔버는 예를 들어 당업계에서 사용되는 세포 배양용 트랜스 웰 인서트일 수 있으며, 이 경우 트랜스웰 인서트와 상호 호환적으로 지칭될 수 있으며, 상부 챔버에 결합된 다공성 지지체는 공극 구조를 가진 두께 1 mm 이하의 박막일 수 있다.
한편, 상기 다공성 지지체는 다수의 공극을 포함할 수 있는 것으로, 예를 들어, 공극률이 2 % 내지 60 %의 다공성 지지체인 것이며, 예를 들어 공극률이 5 % 내지 20 % 의 다공성 지지체일 수 있다. 상기 공극률이 2% 미만인 경우에는 투수 계수가 낮아지고, 이에 따라 다공성 지지체를 통한 물질 확산이 저해됨으로써, 다공성 지지체상에 배양 중인 세포의 생존률이 저하되는 문제를 발생시킬 수 있다.
한편, 상기 다공성 지지체는 나노섬유 네트워크로 이루어질 수 있으며, 복수개의 고분자 나노 섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 이루어지거나, 고분자 합성 수지가 성형됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 다공성 지지체가 복수개의 고분자 나노 섬유의 네트워크로 이루어짐에 따라, 다공성 지지체는 생체 내 기저막과 유사한 구조를 가질 수 있어, 생체 미세 구조 환경과 유사한 환경을 제공할 수 있다.
한편, 상기 다공성 지지체는 나노 스케일, 마이크로 스케일 또는 이들의 조합을 포함하는 스케일의 기공을 갖는 나노섬유 네트워크, 다공성 박막 또는 이들의 조합을 포함하는 것으로, 다수의 공극을 포함할 수 있는 것이다. 이때, 상기 공극은 수㎚ 내지 수백㎛의 크기를 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 지지체는 공극으로 인해, 단일 세포들은 투과시키지 않으면서 세포 배양액 내 영양분, 성장인자 등의 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 지지체는 예를 들어 평균 직경 10 nm 내지 100 μm, 바람직하게는 10㎚내지 8㎛의 기공 사이즈를 가질 수 있다.
이때, 상기 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 열가소성 수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으며, 예를 들어 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 실크 피브로인 (Silk Fibroin), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드 (Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(polystyrene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan) 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 상부 챔버의 다공성 지지체는 하부 방향으로 오목하게 형성된 함몰 패턴이 형성된 몰드를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 고분자 나노섬유로 이루어진 편평한 다공성 멤브레인을 상기 몰드 상에 위치시키고 엠보싱 공정을 위해 별도의 몰드로 상기 다공성 멤브레인을 가압함으로써 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 경우 상기 상부 챔버의 다공성 지지체의 상면은 세포 배양층으로 작용하는 영역으로, 오목하게 형성되어 배양액을 수용하는 세포 배양 공간에 의해 상기 세포 배양층에 세포가 쉽게 안착되고, 3D 구조로 배양되고, 안정적으로 증식하거나 분화할 수 있게 된다.
한편, 본 발명의 세포 배양 장치는 하부 챔버를 포함하며, 상기 하부 챔버는 적어도 하나의 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추기 위한 장치에 의해 유체의 유동 및/또는 운동이 구현될 수 있는 형태인 것이다.
상기 하부 챔버는 복수의 상부 챔버를 단일의 공간에 구비하는 것일 수 있으며, 예를 들어 2개 이상의 상부 챔버를 구획되지 않은 공간에 구비하는 것일 수 있으며, 이와 같이 상부 챔버에 비하여 확장된 형태의 하부 챔버를 구현하여 하부 챔버 내에서 유체의 운동을 원활하게 할 수 있다.
예를 들어, 종래의 복수개의 트랜스웰 인서트가 배치되는 챔버의 경우 각 트랜스웰 인서트가 별도의 구획으로 나뉘어 배치되도록 형성되어 있으나, 이와 같은 형태의 경우에는 유체의 운동으로 세포 분비 물질이 이격, 확산 등이 이루어질 수 없기 때문에 본 발명의 목적을 달성할 수 없다. 따라서, 본 발명의 세포 배양 장치는 상부 챔버가 하부 챔버에 배치된 후 하부 챔버의 부피가 바람직하게는 상부 챔버 부피의 1.5 배 이상, 예를 들어 2배 내지 1000배인 것일 수 있다.
즉, 본 발명의 세포 배양 장치에 있어서 상부 챔버가 하부 챔버에 배치된 후 하부 챔버의 다공성 지지체와 하부 챔버 바닥의 거리는 1mm, 2mmm, 3mm 등의 간격일 수 있는 것으로 특히 제한되는 것은 아니며, 다만 이보다 간격이 작은 경우에도 유체의 유동 및/또는 운동에 의해 다공성 지지체 하부 영역의 유체가 이동됨에 따라 다공성 지지체에 인접한 영역에 존재하는 세포 분비 물질이 함께 확산 촉진, 희석, 이격 등이 이루어질 수 있는 측면 부피가 존재하도록 형성될 수 있다.
이와 같이 상기 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추기 위한 장치는 i) 상기 하부 챔버에 유동하는 유체를 제공하는 장치이거나, 또는 ii) 상기 하부 챔버에 유체의 운동을 제공하는 장치일 수 있으나, 바람직하게는 상기 하부 챔버에 유체의 운동을 제공하는 장치이다.
보다 상세하게, 상기 유체의 운동을 제공하는 장치는 하부 챔버를 특정한 혹은 랜덤의 궤도 및/또는 방향으로 운동시킴으로써, 상기 유체에 유동를 일으킬 수 있는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 유동 장치는 상기 하부 챔버를 수평 선상에서 운동시키는 것일 수 있으나, 상기와 같은 운동에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 믹서(mixer), 펌프 (pump), 오비탈 쉐이커, 웨이빙 쉐이커, 락킹 쉐이커 등과 같은 진탕기(shaker), 오비탈 쉐이커(orbital shaker), 교반기(agitater) 및 초음파장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 장치를 포함하는 것일 수 있으며, 다만 이에 제한되는 것은 아니며, 정치 상태에서의 유체의 이동을 구현할 수 있는 장치를 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 오비탈 쉐이커(orbital shaker)를 이용하는 경우 10 내지 100rpm, 예를 들어 20 내지 50 rpm으로 쉐킹될 수 있다. 도 7은 오비탈 쉐이커를 이용한 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타낸다.
예를 들어 상기 장치에 의해 발생하는 유체의 운동은, 유체의 왕복 운동, 유체의 회전 운동, 유체의 소용돌이 형성, 유체의 기울기 및 유체의 랜덤 운동으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있으며, 상하 운동 및/또는 수평 운동을 모두 포함하는 것으로, 다만 이에 제한되는 것은 아니며, 배양되는 세포의 하부 영역에서 세포 분비 물질을 확산 촉진시키거나, 희석시키거나, 이격시키는 모든 유체의 운동을 포함하는 것이다.
한편, 상기 하부 챔버에 유동하는 유체를 제공하는 장치는 상기 하부 챔버에 구비된 유체 유입구 및 유체 배출구; 및 유체 유입구로부터 유체 배출구로 유체의 유동을 유도하는 장치를 포함하는 것일 수 있으며, 다만 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 유체의 유동이 가능하게 하는 구조라면 특히 제한되지 않는다.
나아가, 상기 하부 챔버는 상기 유체의 유동을 유도하는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 하부 챔버는 유체가 수평 방향으로 흐르도록 하는 유체 흐름을 유도하는 유동 장치와 연결될 수 있다. 이 때, 상기 유체 흐름을 유도하는 장치로 펌프 등을 사용할 수 있으나, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 장치로 시린지 펌프(syringe pump), 또는 튜브연동펌프(peristaltic pump)를 사용할 수 있으며, 유체의 이동을 유도 내지 촉진시키는 어떠한 장치도 사용할 수 있다.
이 때 유동의 흐름은 한 방향 또는 여러 방향일 수 있으며, 유체의 유동이 존재한다면 그 방향은 특히 제한되지 않는 것이다.
이와 같이 상기 하부 챔버에 유동하는 유체를 제공하는 장치는 새로운 유체가 유입되어야 하고, 이에 따라 사용된 유체는 배출되어야 하므로 유체의 소비가 수반되며, 이를 위해 하부 챔버와 하부 챔버에 유동하는 유체를 제공하는 장치의 직접적인 연결이 필수적이다.
나아가, 본 발명의 세포 배양 장치는 적어도 하나의 상기 상부 챔버가 관통되어 삽입되어 상기 상부 챔버를 고정하는 거치 영역, 예를 들어 플레이트를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 플레이트는 복수개의 상기 상부 챔버가 관통되어 삽입될 수 있는 형태일 수 있다. 보다 상세하게, 도 1B에서 보이는 바와 같이, 복수개의 상부 챔버를 상기 플레이트에 삽입됨으로써, 하부 챔버의 바닥면과 일정 거리 떨어진 위치에 상부 챔버가 고정되어 있을 수 있도록 할 수 있다.
이 때, 상기 플레이트에는 1개 이상의 상부 챔버가 삽입될 수 있으며, 이때 상기 관통부는 상부 챔버의 수에 상응하도록 형성될 수 있다. 예를 들어 당업계에서 사용되는 웰 플레이트와 같이, 6개, 12개, 24개, 48개, 96개, 128개, 256개 등과 같은 개수의 상부 챔버가 삽입될 수 있고, 플레이트에 상응하는 관통부가 형성될 수 있다.
한편, 본 발명의 세포 배양 방법 및 장치에서 사용될 수 있는 상기 유체는 배양액, 식염수(PBS) 또는 이들의 혼합일 수 있고, 바람직하게는 세포 배양액을 사용할 수 있으며, 상기 세포 배양액에는 FBS, 글루코스 및 성장인자 등이 포함될 수 있으며, 당업계에서 사용되는 세포 배양액이라면 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 세포 배양 방법 및 장치가 적용될 수 있는 세포는 특히 제한되지 않으며, 인간을 포함하는 동물의 상피 세포일 수 있으며, 예를 들어 장관계 상피 세포, 바람직하게는 장 상피 세포일 수 있다. 보다 상세하게, 상기 장 상피 세포는 인간 세포일 수 있으며, 장 상피 세포는 1차 세포, 1차 소장 세포, 1차 대장 세포, 소장 세포, 대장 세포, 배양 세포, 계대 세포(passaged cell), 무한 증식 세포(immortalized cell), 트랜스제닉 세포, 유전자 변형 세포, 암 세포 또는 장암에 걸린 동물로부터의 세포, 장 질병 또는 장애에 걸린 동물로부터의 세포, 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 파네트 세포, 크립트 세포, 점액 분비 세포, Caco-2 세포, 또는 HT-29 세포, 장 오가노이드 및 장 오가노이드 유래 세포일 수 있다.
장 상피 세포는 체내에서 주름진 구조, 즉 융모 구조를 형성하며, 본 발명의 세포 배양 장치는 체외에서 배양을 수행함에도 불구하고, 상기와 같이 체내와 유사한 구조를 형성할 수 있다.
이는, 장 조직의 형태 발생 시, 형태발생 관련 신호 체계를 저해하는 물질을 포함하는 세포 분비 물질에 의해 상기 장 조직의 형태 발생이 저해되는데, 상기 세포 분비 물질은 장 조직 세포의 하부 영역에서 발생하여 장 조직 세포에 작용하는 것으로, 본 발명과 같이 세포가 배양되는 다공성 지지체의 하부 영역의 유체에 유동이 형성되는 등에 의해 유체의 흐름 및/또는 이동 등이 원활한 경우, 또는 항체 등에 의해 세포 분비 물질 함량 자체를 조절하는 경우, 세포의 성장을 방해하는 요소들을 제거함으로써, 결과적으로 상기 세포 분비 물질이 장 조직 세포에 작용하는 것을 억제하기 때문에, 체내와 유사한 구조의 세포를 배양할 수 있는 것이다.
세포 분비 물질에 대한 항체는 특히 제한되는 것은 아니며, 당업계에 널리 알려진 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 세포 분비 물질은 형태발생 관련 신호 체계를 저해하는 물질을 포함하는 것으로, 예를 들어 sFRP1, FRZB, Sizzled, Sizzled2, Crescent, WIF-1, Cerberus, Coco, DKK-2, DKK-3, DKK-4, Soggy, sFRP2, sFRP3, sFRP4, sFRP5 및 DKK-1 등과 같이 Wnt 신호 체계를 저해하는 물질을 포함하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 세포 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 지지체 상에 세포를 접종하는 단계; 및 배양액을 제공하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공할 수 있으며, 세포 배양 장치와 관련하여 언급된 내용은 세보 배양 방법에 모두 동일하게 적용될 수 있다.
이때 상기 세포는 상부 챔버의 다공성 지지체 상에 세포를 접종하는 단계를 통해 상기 다공성 지지체 상에 상에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 접종은, 상기 상부 챔버에 유체, 즉 배양액을 유입하는 단계에 선행하여 배양할 세포를 상기 다공성 지지체 상에 접종하여 수행될 수 있다.
본 발명의 세포 배양 방법 및 장치에 의하는 경우, 예를 들어 약 5 내지 9일의 배양에 의해 3차원의 구조를 형성할 수 있다. 한편, 본 발명에 있어서 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계는 전체 세포 배양 기간을 기준으로 10% 이상, 예를 들어 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 기간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 상기 기간은 연속적이거나 불연속적일 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 장 조직 형태 발생에 효과적인 인자 검출
(1)
Wnt 신호 경로에 작용하는 다양한 종류의 길항제가 장 조직의 형태 발생에 미치는 영향
실리콘 폴리머로 제작된 GUT-ON-A-CHIP 배양 장치의 상단 미세채널에 Caco-2 세포를 1×107 cells/mL씩 각각 접종하고, 무처리(컨트롤), 재조합 DKK-1(rDKK-1), 재조합 Wnt 억제 요소 1(recombinant Wnt inhibitory factor 1, rWIF-1), 재조합 분비 프리즐드 관련 단백질 1(recombinant secreted frizzled-related protein 1, rsFRP-1), 및 재조합 Soggy-1/DKK-유사 1(rSoggy-1/DKKL-1)을 100 ng/mL의 농도로 각각 하단 미세채널에 유동(30μL/h)을 주며 처리하여, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 배양 결과를 관찰하였다.
그 결과, 도 2A에 보이는 바와 같이, rDKK-1을 처리한 경우 병반 면적(lesion area)이 가장 넓게 나타남을 확인할 수 있었다.
(2) rDKK-1의 농도에 따른 장 조직 형태 발생 억제
3개의 각기 다른 배양 장치 상단 미세채널에 Caco-2 세포를 1×107 cells/mL씩 각각 접종하여 부착한 후 2차원 단일 점막면을 형성한 후에, 무처리(컨트롤), 재조합 DKK-1(rDKK-1) 100ng/mL, 500ng/mL을 각각 하단 미세채널에 유동(30μL/h)을 주며 처리하여, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 배양 결과를 관찰하였다.
그 결과, 도 2B에 보이는 바와 같이, rDKK-1의 농도가 높아짐에 따라 장 조직의 3차원적 형태 발생이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 형성되는 융모의 높이가 낮았다. 도 2B와 같은 본 발명의 예시적인 장치를 'BASIN (Basolateral convective flow-generating multi-well inserts platform)'로 지칭한다.
(3) DKK-1 저해 시 장 조직의 형태 발생 억제 여부
3개의 각기 다른 배양 장치 상단 미세채널에 Caco-2 세포를 1×107 cells/mL씩 각각 접종하고, 무처리(컨트롤), 재조합 DKK-1(rDKK-1) 500 ng/mL, rDKK-1 500 ng/mL + 항-rDKK-1의 항체 20 ng/mL로 각각 처리하여, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 배양 결과를 관찰하였다.
그 결과, 도 2C에 보이는 바와 같이, rDKK-1과 함께 rDKK-1의 항체를 함께 처리한 경우 DKK-1에 의한 장 조직의 형태 발생을 억제하는 것이 사라지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, DKK-1이 장 세포의 3차원적 형태 발생을 억제함을 확인할 수 있었다.
2. 유체의 유동을 수반한 세포 배양 실험
다공성 실리콘 멤브레인으로 상단과 하단이 분리되어 있는 유동성 GUT-ON-A-CHIP 배양 장치에, Caco-2 세포를 1×107 cells/mL 접종하여, Caco-2 세포가 배양되는 세포 배양층을 기준으로 상단 및 하단에 배양액의 유동을 구현하였다. 또한, 장내 연동운동의 기계적 운동을 모사하기 위해 FlexCell이라고 명명된 진공 조절 장치를 이용하여 GUT-ON-A-CHIP 내부에 형성된 진공 챔버에 연결한 후 장의 연동운동을 모사하기에 최적화 된 유동 조건(10% cell stretching, 0.15 Hz 빈도)을 적용하고 Sine 함수와 동일한 반복적 유동 운동 조건을 적용하였다.
각각 37℃에서 상단 및 하단 모두에 배양액의 유동(30μL/h)을 구현한 경우(100 시간 동안 배양 함), 하단에만 배양액의 유동을 구현한 경우(150 시간 동안 배양함), 및 상단에만 배양액의 유동을 구현한 경우(150 시간 동안 배양함)에 형성된 세포 형태를 관찰하고, 그 결과를 도 3A 내지 도 3C에 나타내었다. 도 3에 있어서 화살표가 기재된 영역은 유동이 구현된 것을 의미한다.
그 결과, 도 3A에 보이는 바와 같이, 상단 및 하단 모두에 배양액의 유동이 구현된 경우인 도 3A의 좌측 및 중간 사진에서 모두 체내 장 조직과 유사하게 형태 발생이 일어난 것을 확인할 수 있다.
나아가, 상기 상단에 배양액의 유동을 구현한 경우에서, 체내 장 조직과 유사하게 형태 발생이 일어난 후, 90시간 동안 하단에서 배양액의 유동을 구현하지 않은 다음, 다시 배양 결과를 관찰하고, 그 결과를 도 3B에 나타내었다.
그 결과, 도 3B에 보이는 바와 같이, 체내 장 조직과 유사하게 3차원 구조로 형태 발생이 일어난 세포라도, 하단 배양액의 유동이 중단되는 경우 시간이 지남에 따라 3차원 구조가 무너짐을 확인할 수 있었다.
또한, 다공성 멤브레인으로 상, 하부 챔버가 분리되어 있는 당업계에서 사용되는 세포 배양 나노다공성 인서트에, Caco-2 세포를 5×105 cells/mL 접종하여, Caco-2 세포가 배양되는 세포 배양층을 기준으로 하단에만 유동 또는 확산을 각각 구현하여 장 세포를 배양하였다. 세포가 접종된 상부 챔버는 당업계에서 사용되는 형태로, 하부에 제한적인 용량의 유체가 정치되어 있는 경우(도 3C의 좌측 사진), 하부 유동만 가해주는 경우(도 3C의 중간 사진), 하부 확산만 가해주는 경우(도 3C의 우측 사진)로 나누어 각각 배양하고 그 결과를 도 3C의 각 경우의 하단에 나타내었다. 이때, 도 3C의 좌측 사진과 관련하여 당업계에서 사용되는 형태로는 하부 챔버에 500 μL의 유체가 사용되었고, 도 3C의 우측 사진과 관련하여 하부 확산을 가해주는 경우 상부 챔버를 70 mL의 대용량 챔버에 장치하여 최대 120시간까지 배양하였다.
그 결과 도 3C에 보이는 바와 같이, 유동뿐만 아니라 확산 유동을 구현한 경우에도 체내 장 조직과 유사한 구조의 형태 발생을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 다만 도 3C 중간과 같이 하부 유동을 가해주는 경우에는 유동을 48 시간 동안 가하여 융도 유사 돌출부가 형성되었으나, 도 3C의 우측과 같이 하부 확산만을 가하는 경우 돌출부의 밀도가 낮거나 형성 위치의 분포가 균일하지 않았다.
도 3A의 결과를 도출한 실험의 경우 컴퓨터 매뉴팩처링 기술 및 마이크로칩 제작 기술을 통해 면밀하게 유량 및 유동을 조절하여 장 상피세포의 융모 형성 조건을 구현한 반면, 도 3C의 결과를 도출한 실험의 경우 당업계에서 흔히 사용되는 나노다공성 인서트를 이용했음에도 불구하고 DKK-1을 포함하는 세포 분비 물질을 제거하거나 그 농도를 최소화 함으로써 장 융모 형성을 유발할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 후자의 경우 형성 발생된 형태의 밀도가 낮거나 위치 분포가 균일하지 않았다.
이와 같은 발견은 향후 당업계에서 통상적으로 사용되는 나노 다공성 인서트 기반의 정치 배양 웰플레이트를 기반으로 하여 배양 과정을 개선할 수 있으므로, 복잡한 기계적인 장치의 도입 없이도 3차원의 장내 융모 형성을 자유롭게 유도하고 그에 따른 복잡계 기능성을 다양하게 구현할 수 있다는 장점을 도출해낼 수 있다.
그 결과, 일반적인 세포 배양 장치인 도 1A의 장치에서 Caco-2 세포를 배양한 경우에는 도 5A에 보이는 바와 같이 2D 구조를 가지며 자라는 반면, 도 1B의 장치에서 유체의 운동을 가하여 Caco-2 세포를 배양한 경우에는, 도 5C에 보이는 바와 같이 체내 장 조직 세포와 유사한 형태로 3차원 구조를 가지는 형태 발생이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
3. 본 발명에 의해 배양된 세포의 특성 확인
당업계에서 통상적으로 사용되는 다공성 인서트들을 본 발명의 BASIN 배양 장치의 구획이 없는 하부 챔버에 고정하고, Caco-2 세포를 5×105 cells/mL로 접종하여, Caco-2 세포가 배양되는 세포 배양층을 기준으로 하단에 배양액의 유동을 MaXshake이라고 명명된 오비탈 쉐이커(30 rpm)를 활용해 도 7과 같이 구현했다. 또한, 이때 다공성 멤브레인으로 상, 하부 챔버가 분리되어 있는 당업계에서 사용되는 세포 배양 다공성 인서트에, Caco-2 세포를 5×105 cells/mL 접종하여, 정치 상태로 장 세포를 배양하였다.
그 결과 도 4B에 보여지는 것처럼, 본 발명에 따른른 장치의 구획이 없는 하부 챔버는 상용 (Transwell) 웰 플레이트와 달리 담겨있는 유체에 유동을 훨씬 효과적으로 일으킬 수 있었으며, 이를 통해 유체 내부의 물질의 대류를 통한 움직임과 그에 수반하는 혼합(mixing)을 유도할 수 있었다. 이러한 장치의 특징은 상부 챔버의 다공성 지지체 하부 영역의 세포 분비 물질 농도를 낮추는 효과를 야기할 수 있다.
한편, 도 5A 및 도 5B 에서 보이는 것처럼, 유체의 운동이 제공되지 않은 일반적인 형태의 트랜스웰 웰플레이트 뿐만 아니라, 오비탈 쉐이커 상에서 돌아가는 이러한 트랜스웰 웰플레이트 상에서도 Caco-2 세포가 3D 융털 구조 형성 없이 평평한 2D 단일 세포층 형태로 배양되는 반면, 도 5C에서 보이는 것처럼 본 발명의 BASIN 장치에서 배양된 Caco-2 세포들은 3D 융털 구조를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 도 5A 내지 도 5C의 중간 및 우측 사진은 각 경우에 Caco-2 세포가 5일 내지 9일 동안 상부 챔버(트랜스웰 인서트)에서 자란 후의 세포 골격 염색 결과를 위에서(중간) 본 것과 측면(우측)에서 확인한 것을 나타낸 것이다.
본 발명의 BASIN 에서 배양된 Caco-2 세포의 기능적 향상을 평가하기 위해 100 시간 동안 배양한 후 Ki67 마커, CYP3A4 마커 및 MUC2 마커의 형광 염색을 각각 수행하였고, 대조군으로 도 5A와 같은 정적 트랜스웰 플레이트에서 배양된 장 세포들을 선정하여 비교를 진행하였다.
그 결과 본 발명의 세포 배양 방법에 의하는 경우, 도 6A-6C에서 확인할 수 있는 바와 같이 증식이 활발하게 일어나는 장 세포 핵(Ki67)의 비율이 높아지며, 물질 대사 단백질(CYP3A4)이 더 많이 발현되고, 나아가 장 세포의 점액 분비와 관련된 단백질(MUC2)이 더 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (20)
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- 개구부, 적어도 일면에 장 상피 세포가 배치된 세포를 배양하기 위한 다공성 지지체 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 상부 챔버; 및 적어도 하나의 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부 챔버를 포함하며,
다공성 지지체 타면의 하부 영역에서 DKK-1을 포함하는 세포 분비 물질의 농도를 낮추기 위한 장치로써, 유체가 흐르지는 않지만 정치 상태에서의 유체의 운동을 제공하는 장치를 상기 하부 챔버에 구비하는, 장 상피 세포 배양 장치를 이용하여 다공성 지지체의 적어도 일면에 장 상피 세포를 배양하는 단계에 있어서, 다공성 지지체 타면의 하부 영역의 DKK-1을 포함하는 세포 분비 물질의 농도를 10 μg/ml 이하로 낮추는 단계를 포함하는, 장 상피 세포 배양 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 다공성 지지체 타면의 하부 영역은 다공성 지지체를 기준으로 0.01 mm 이격된 영역을 포함하는, 장 상피 세포 배양 방법.
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- 제8항에 있어서, 상기 세포 분비 물질은 sFRP1, FRZB, Sizzled, Sizzled2, Crescent, WIF-1, Cerberus, Coco, DKK-2, DKK-3, DKK-4, Soggy, sFRP2, sFRP3, sFRP4, 및 sFRP5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 추가로 포함하는, 장 상피 세포 배양 방법.
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- 제8항에 있어서, 상기 하부 영역의 세포 분비 물질의 농도를 낮추는 단계는 ii) 하부 영역에 유체의 운동을 제공하거나, iii) 세포 분비 물질에 대한 항체를 추가하여 수행되는, 장 상피 세포 배양 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 유체의 운동은, 유체의 왕복 운동, 유체의 회전 운동, 유체의 소용돌이 형성, 유체의 기울기 운동 및 유체의 랜덤 운동으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 의해 제공되는, 장 상피 세포 배양 방법.
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- 제8항에 있어서, 상기 유체의 운동은 유체의 왕복 운동, 유체의 회전 운동, 유체의 소용돌이 형성, 유체의 기울기 운동 및 유체의 랜덤 운동으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 장 상피 세포 배양 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 유체의 운동을 제공하는 장치는 믹서(mixer), 펌프 (pump), 진탕기(shaker), 오비탈 쉐이커(orbital shaker), 교반기(agitater) 및 초음파장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 장치인, 장 상피 세포 배양 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 상부 챔버를 고정하며, 적어도 하나의 상부 챔버가 관통 삽입되는 거치 영역을 추가로 포함하는, 장 상피 세포 배양 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 다공성 지지체는 나노 스케일, 마이크로 스케일 또는이들의 조합을 포함하는 스케일의 기공을 갖는 나노섬유 네트워크, 다공성 박막 또는 이들의 조합을 포함하는, 장 상피 세포 배양 방법.
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