KR102601437B1 - A method for screening immune checkpoint inhibitor - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 T세포가 농축(enrichment)되도록 제 1 배양하는 단계, 농축된 상기 T세포에 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitors)를 처리하는 단계, 면역 관문 저해제가 처리된 상기 T세포와 면역관문 리간드(immune checkpoint ligand)에 대한 유전자가 녹아웃(knock-out)된 암 세포주를 혼합하여 제 2 배양하는 단계, 및 제 2 배양된 상기 T세포의 싸이토카인 분비량을 측정하는 단계를 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present specification includes the steps of first culturing a biological sample isolated from an individual to enrich T cells, treating the enriched T cells with immune checkpoint inhibitors, and treating the enriched T cells with immune checkpoint inhibitors. Including the step of second culturing a mixture of T cells and a cancer cell line in which the gene for the immune checkpoint ligand has been knocked out, and measuring the amount of cytokine secretion of the second cultured T cells. Provided is a method for screening immune checkpoint inhibitors.
Description
본 발명은 면역 관문 저해제에 의한 싸이토카인 분비량을 측정할 수 있는 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a screening method for an immune checkpoint inhibitor that can measure the amount of cytokine secretion by the immune checkpoint inhibitor.
종래의 항암치료로서 종양 절제법과 같은 수술적 치료, 방사선 치료, 화학 치료 및 표적 치료제가 수행되어 왔다. 그러나, 전술한 치료 방법 중 방사선 치료 또는 화학 치료는 암세포만 특이적으로 저해하는 것이 아니기 때문에 정상 세포까지 사멸시키는 부작용을 가지고 있으며, 표적 치료제는 암세포가 치료제의 내성 즉, 회피 기작을 획득할 경우, 이를 표적하지 못하지 못한다는 한계를 가지고 있다. As conventional anti-cancer treatments, surgical treatments such as tumor resection, radiotherapy, chemotherapy, and targeted treatments have been performed. However, among the above-mentioned treatment methods, radiation therapy or chemotherapy do not specifically inhibit only cancer cells, so they have the side effect of killing normal cells, and targeted treatments are used when cancer cells acquire resistance to the treatment agent, that is, an evasion mechanism. It has the limitation of not being able to target it.
이에, 생체 내 면역 체계를 활성화시킴으로써 자가 면역력을 높여 면역세포가 암세포를 직접적으로 공격하도록하는 면역 항암 요법이 주목을 받고 있다. 나아가, 면역 항암 요법 즉, 면역 항암제는 암세포 표적뿐만 아니라 암세포 주변에 존재하는 세포 즉, 종양미세환경환경(tumor microenvironment)까지도 영향을 미쳐 보다 향상된 항암 효과를 가진다. 또한, 면역 항암제는 면역 세포의 기억 능력으로 인하여 종래의 항암 치료들보다 향상된 치료 지속기간을 갖는다. 이에, 면역 항암제는 환자의 생존기간을 대폭 연장시킬 뿐만 아니라 환자의 삶의 질을 높일 수 있다.Accordingly, immunotherapy for cancer, which increases autoimmunity by activating the immune system in vivo and allowing immune cells to directly attack cancer cells, is attracting attention. Furthermore, immune anti-cancer therapy, that is, immune anti-cancer drugs, affects not only the cancer cell target but also the cells existing around the cancer cells, that is, the tumor microenvironment, resulting in improved anti-cancer effects. In addition, immuno-anticancer drugs have an improved treatment duration compared to conventional anti-cancer treatments due to the memory ability of immune cells. Accordingly, immunotherapy anticancer drugs can not only significantly extend the patient's survival period but also improve the patient's quality of life.
이러한, 면역 항암제는 크게 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody) 및 항암백신(anticancer vaccine)을 포함하고 있다. 이 중, 면역 관문 억제제는 T세포 억제에 관여하는 면역 관문 단백질의 활성을 차단하여, T세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약물이다. These immuno-anticancer drugs largely include immune checkpoint inhibitors, immune cell therapy, therapeutic antibodies, and anticancer vaccines. Among these, immune checkpoint inhibitors are drugs that block the activity of immune checkpoint proteins involved in T cell suppression and activate T cells to attack cancer cells.
보다 구체적으로, 면역 관문 억제제로서, 항 PD-1 항체는 T세포 표면에 분포하는 PD-1(programmed cell death)과 이의 암세포 리간드인 PD-L1의 결합(binding)을 차단함으로써, 종양의 면역 회피기작을 차단하고 T세포를 활성화시켜 암세포를 공격하도록 할 수 있다. 실제, 항 PD-1 및 항 PD-L1과 같은 면역 관문 억제제인 니볼루맙(Nivolumab, BMS사) 및 펨브로리주맙 (Pembrolizumab, MSD사)이 실제 악성 흑생종이나 폐암에서 항암 완치 효과가 입증됨에 따라, 다양한 면역 관문 억제제에 대한 개발이 활발하게 이루어 지고 있다. More specifically, as an immune checkpoint inhibitor, anti-PD-1 antibodies block the binding of PD-1 (programmed cell death) distributed on the surface of T cells and its cancer cell ligand, PD-L1, thereby evading the immune system of tumors. It can block the mechanism and activate T cells to attack cancer cells. In fact, Nivolumab (BMS) and Pembrolizumab (MSD), immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 and anti-PD-L1, have been proven to be effective in curing cancer in malignant melanoma and lung cancer. Development of various immune checkpoint inhibitors is actively underway.
이러한, 다양한 면역 관문을 갖는 종양에서 최적의 효과를 갖는 면역 항암제(면역 관문 저해제) 후보 물질을 예측하기 위하여, 환자 유래 3차원 배양 및 유전자 편집 기술 등을 이용하여 항암제 후보물질을 선별 또는 개발하기 위한 스크리닝 기술이 개발되고 있다. 그러나, 면역 항암제는 종래의 화학 항암제와 작용기전이 상이하여 기존의 약물 반응 평가 방법이 아닌 새로운 약물 반응 평가 기술 개발이 필요하나, 현재까지 표준화되어 이를 객관적으로 평가할 수 있는 방법은 없는 실정이다. In order to predict candidate immuno-anticancer drugs (immune checkpoint inhibitors) that have optimal effects on tumors with various immune checkpoints, we use patient-derived 3D culture and gene editing technology to select or develop anticancer drug candidates. Screening technologies are being developed. However, immuno-anticancer drugs have a different mechanism of action from conventional chemical anti-cancer drugs, so it is necessary to develop new drug response evaluation techniques rather than existing drug response evaluation methods. However, to date, there is no standardized method to objectively evaluate them.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. The technology behind the invention has been written to facilitate easier understanding of the invention. It should not be understood as an admission that matters described in the technology underlying the invention exist as prior art.
한편, 면역 항암제 즉, 면역 관문 억제제의 후보 물질을 선발하기 위해서는 in-vitro 및/또는 in-vivo에서 효능이 평가되어야 한다. 보다 구체적으로, 면역 관문 억제제는 T세포의 활성화 즉, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 싸이토카인(cytokine)의 분비를 향상시킬 수 있다. 이에, 면역 관문 억제제 후보 물질 평가는 in-vitro에서 싸이토카인의 분비능 측정을 통하여 이루어 질 수 있다. 그러나, 이러한 평가 방법은 실험하는 사람 및 기관에 따라 매우 다양하고, 표준화되어 있지 않아 일관적인 결과가 도출되기 어려운 실정이다.Meanwhile, in order to select candidates for anti-cancer immunotherapy, that is, immune checkpoint inhibitors, their efficacy must be evaluated in-vitro and/or in-vivo. More specifically, immune checkpoint inhibitors can enhance the activation of T cells, that is, the secretion of cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Accordingly, evaluation of immune checkpoint inhibitor candidates can be accomplished by measuring cytokine secretion ability in-vitro. However, these evaluation methods vary widely depending on the person and institution conducting the experiment, and are not standardized, making it difficult to derive consistent results.
보다 구체적으로, 종래의 방법은 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포와 같은 다양한 종류의 면역세포가 포함되어 있는 상태에서 조기 활성화(early activation)하여 싸이토카인의 분비를 측정하였다. 이에, 싸이토카인을 분비하는 CD8+ T세포의 비율이 낮을 경우, 분비하는 싸이토카인 양도 적어짐에 따라, 이를 정량화하여 비교하는 것이 어려울 수 있다. More specifically, the conventional method measures cytokine secretion through early activation in the presence of various types of immune cells such as CD4+ T cells and CD8+ T cells. Accordingly, when the ratio of CD8+ T cells secreting cytokines is low, the amount of secreted cytokines also decreases, making it difficult to quantify and compare them.
나아가, CD8+ T세포가 다량으로 배양되었어도, 면역 관문 수용체를 발현하지 않을 수 있다. 이에, 종래의 평가 방법에서는 표적하고자 하는 면역 관문 수용체를 발현한 환자의 혈액으로부터 이를 분리하여 사용되어 왔으며, 이는 환자로부터 공급됨에 따라, 시료 확보가 한정적이라는 한계가 있다. Furthermore, even if CD8+ T cells are cultured in large quantities, they may not express immune checkpoint receptors. Accordingly, in the conventional evaluation method, it has been used to isolate the immune checkpoint receptor to be targeted from the blood of a patient who expressed it. However, as this is supplied from the patient, there is a limitation in that sample acquisition is limited.
즉, 종래의 방법은 싸이토카인을 분비하는 T세포의 비율 및 분포가 일정치 않음에 따라, 일괄적인 싸이토카인의 분비를 측정하기 어렵다.That is, with conventional methods, it is difficult to measure the uniform secretion of cytokines because the ratio and distribution of T cells secreting cytokines are not constant.
이에, 본 발명의 발명자들은 전술한 시료 확보에 대한 한계성을 극복할 수 있으며, 획일화된 방법으로 일관적인 결과를 도출할 수 있는 표준화된 면역 관문 저해제에 대한 스크리닝 방법을 개발하고자 하였다.Accordingly, the inventors of the present invention attempted to develop a screening method for standardized immune checkpoint inhibitors that can overcome the limitations in securing samples described above and produce consistent results using a standardized method.
나아가, 본 발명의 발명자들은 T세포의 활성화가 다양한 면역 관문을 통하여 억제된다는 것을 인지하여, 측정하고자 하는 표적 면역 관문을 제외한 나머지 변수 요인이 제거될 경우, 보다 향상된 T세포의 활성화 즉, 싸이토카인의 분비량을 확인할 수 있다는 것을 인지하였다.Furthermore, the inventors of the present invention recognized that T cell activation is suppressed through various immune checkpoints, and when the remaining variable factors excluding the target immune checkpoint to be measured are removed, more improved T cell activation, that is, the secretion amount of cytokines, is achieved. It was recognized that it could be confirmed.
또한, 본 발명의 발명자들은 특정 배양 방법을 통하여, 건강한 개체로부터 수집된 생물학적 시료에서도 표적하고자 하는 면역 관문 수용체가 발현된 다량의 CD8+ T세포를 획득할 수 있음을 확인하였으며, 이를 통하여 시료 확보에 대한 한계성을 극복할 수 있다는 것을 인지하였다.In addition, the inventors of the present invention confirmed that, through a specific culture method, a large amount of CD8+ T cells expressing the immune checkpoint receptor to be targeted can be obtained from biological samples collected from healthy individuals, and through this, the It was recognized that limitations could be overcome.
또한, 본 발명의 발명자들은 변수 즉, 표적하고자하는 면역 관문 리간드가 제거된 녹아웃 세포주와 고농축된 CD8+ T세포의 공동배양을 통하여, 향상된 싸이토카인 분비량을 확인하였다.In addition, the inventors of the present invention confirmed improved cytokine secretion through co-culture of a variable, that is, a knockout cell line from which the immune checkpoint ligand to be targeted was removed, and highly concentrated CD8+ T cells.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 향상된 싸이토카인 분비량을 기초로 면역 관문 억제제에 대한 후보물질에 대한 평과를 정량화하여 평가할 수 있는 면역 관문 저해제의 스크리닝 밥법을 개발하기에 이르렀다. As a result, the inventors of the present invention developed a screening method for immune checkpoint inhibitors that can quantify and evaluate candidates for immune checkpoint inhibitors based on improved cytokine secretion.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 고농축화된 CD8+ T세포와 특정 면역 관문 리간드가 녹아웃된 암 세포주를 통하여, 면역 관문 저해제에 대한 효과를 분명하게 확인할 수 있는 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to provide a screening method that can clearly confirm the effect of immune checkpoint inhibitors through highly enriched CD8+ T cells and cancer cell lines in which specific immune checkpoint ligands have been knocked out.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. The problems of the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 T세포가 농축(enrichment)되도록 제 1 배양하는 단계, 농축된 상기 T세포에 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitors)를 처리하는 단계, 면역 관문 저해제가 처리된 상기 T세포와 면역 관문 리간드(immune checkpoint ligand)에 대한 유전자가 녹아웃(knock-out)된 암 세포주를 혼합하여 제 2 배양하는 단계, 및 제 2 배양된 상기 T세포의 싸이토카인 분비량을 측정하는 단계를 포함하는 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법를 제공한다.In order to solve the problems described above, the present invention includes the steps of first culturing a biological sample isolated from an individual to enrich T cells, and treating the enriched T cells with immune checkpoint inhibitors. a second culture step of mixing the T cells treated with an immune checkpoint inhibitor with a cancer cell line in which a gene for an immune checkpoint ligand has been knocked out, and the second cultured T cells. Provided is a screening method for an immune checkpoint inhibitor comprising measuring the amount of cytokine secretion from cells.
본 발명의 특징에 따르면, 생물학적 시료는, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 골수유래 단핵세포(bone marrow mononuclear cell, BMMC)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역 세포 즉, T세포를 포함하고 있는 다양한 시료를 모두 포함할 수 있다. According to features of the present invention, the biological sample may include, but is not limited to, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or bone marrow mononuclear cells (BMMC), and immune cells. In other words, it can include all various samples containing T cells.
본 발명의 다른 특징에 따르면, T세포는, CD8+ T세포를 포함할 수 있으며, CD8+ T세포는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 제 1 배양하기 전보다 150배 이상 세포수가 증가될 수 있다. 나아가, T세포는 전술한 CD8+ T세포 즉, 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell)뿐만 아니라, 도움 T 세포(helper T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell), 기억 T 세포(memory T cell) 및 자연 살해 T 세포(natural killer T cell) 등을 모두 포함할 수 있다.According to another feature of the present invention, the T cells may include CD8+ T cells, and the number of CD8+ T cells is more than 150 times that before the first culture in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention. can be increased. Furthermore, T cells include not only the aforementioned CD8+ T cells, that is, cytotoxic T cells, but also helper T cells, regulatory T cells, and memory T cells. and natural killer T cells.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 농축된 T세포는, PD-1-TIM-3-TIGIT-CD8+T세포, PD-1+TIM-3-TIGIT-CD8+T세포, PD-1-TIM-3+TIGIT-CD8+T세포, PD-1-TIM-3-TIGIT+CD8+T세포, PD-1+TIM-3+TIGIT-CD8+T세포, PD-1+TIM-3-TIGIT+CD8+T세포, PD-1-TIM-3+TIGIT+CD8+T세포 및 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T세포로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 이때, PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T세포는, 농축된 T세포 전체에 대하여 9 %이상 발현될 수 있다. According to another feature of the present invention, the enriched T cells are PD-1-TIM-3-TIGIT-CD8 + T cells, PD-1 + TIM-3-TIGIT-CD8 + T cells, PD-1-TIM -3+TIGIT-CD8+T cells, PD-1-TIM-3-TIGIT+CD8+T cells, PD-1+TIM-3+TIGIT-CD8+T cells, PD-1+TIM-3-TIGIT+ It may include at least one of the group consisting of CD8 + T cells, PD-1-TIM-3 + TIGIT + CD8 + T cells, and PD-1 + TIM-3 + TIGIT + CD8 + T cells, where PD- 1+TIM-3+TIGIT+CD8+T cells can be expressed at more than 9% of the total concentrated T cells.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 측정하는 단계는, 제 2 배양된 상기 T세포를 게이팅(gating)하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 게이팅하는 단계는, 면역 관문 수용체(immune checkpoint receptor) 발현에 따라 게이팅할 수 있다. 이때, 면역 관문 수용체는, PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2 및 ILT3으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, T세포에서 발현될 수 있는 다양한 면역 관문 수용체를 모두 포함할 수 있다. 나아가, 게이팅하는 단계는, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 면역자기 세포 분류(immunomagnetic cell sorting: MACS)를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역 관문 수용체의 종류에 따라 T세포를 선별 및 분류할 수 있는 다양한 방법을 모두 포함할 수 있다.According to another feature of the present invention, the measuring step may further include gating the second cultured T cells, and the gating step determines the expression of an immune checkpoint receptor. You can gate accordingly. At this time, the immune checkpoint receptor may include at least one of the group consisting of PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2, and ILT3. However, it is not limited to this, and may include all various immune checkpoint receptors that can be expressed in T cells. Furthermore, the gating step may be performed using, but is not limited to, fluorescence-activated cell sorting (FACS) or immunomagnetic cell sorting (MACS), and is not limited to this. It can include a variety of methods to select and classify T cells depending on their type.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 배양하는 단계는, 생물학적 시료에 제 1 T세포 자극 인자(Tcell activating factor)를 처리하는 단계, 및 자극 인자가 처리된 생물학적 시료를 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때, 제 1 T세포 자극 인자는, 0.5 내지 2 ㎍/ml의 α-CD3, 5 내지 20 ng/ml의 hIL-2 및 5 내지 20 ng/ml의 hIL-7을 가질 수 있다. 나아가, 배양된 생물학적 시료는, CD8+ T세포를 90 %이상 포함할 수 있다. 더 나아가, 제 1 배양하는 단계는, 7 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the first culturing step may include treating a biological sample with a first T cell activating factor, and culturing the biological sample treated with the stimulating factor. In this case, the first T cell stimulating factor may have 0.5 to 2 μg/ml of α-CD3, 5 to 20 ng/ml of hIL-2, and 5 to 20 ng/ml of hIL-7. Furthermore, cultured biological samples may contain more than 90% of CD8+ T cells. Furthermore, the first culturing step may be performed for at least one period of 7 to 21 days, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 암 세포주는, HCC4006이며, PD-L1, Galectin-9, CEACAM1 및 PVR으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나의 면역 관문 리간드에 대한 유전자가 녹아웃된 암 세포주일 수 있다. 그러나, 암 세포주는 HCC4006에 제한되는 것은 아니며, 면역 관문 리간드를 발현할 수 있는 다양한 암 세포주를 모두 포함할 수 있다.According to another feature of the present invention, the cancer cell line is HCC4006, and may be a cancer cell line in which the gene for at least one immune checkpoint ligand from the group consisting of PD-L1, Galectin-9, CEACAM1, and PVR has been knocked out. However, the cancer cell line is not limited to HCC4006 and can include all various cancer cell lines capable of expressing immune checkpoint ligands.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 면역 관문 리간드는, PD-L1, PD-L2, PVR(CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4 및 ALCAM으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the immune checkpoint ligand is PD-L1, PD-L2, PVR (CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM , CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4, and ALCAM, but limited thereto. It doesn't work.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, T세포의 기능을 증진시키기 위해 암 세포주에 공동자극 리간드(co-stimulatory ligand) 또는 싸이토카인(cytokine) 발현 유전자를 더 포함할 수 있다. 공동자극 리간드는, B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L 및 LIGHT으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 공동자극 리간드 및 싸이토카인은 유전자 편집 기술을 이용하여 암 세포주 내에 이를 발현하는 유전자가 삽입(Gene insertion)되어 발현될 수 있다.According to another feature of the present invention, a co-stimulatory ligand or cytokine expression gene may be further included in the cancer cell line to enhance the function of T cells. The costimulatory ligand may be at least one of the group consisting of B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L and LIGHT, but is not limited to no. At this time, co-stimulatory ligands and cytokines can be expressed by inserting genes expressing them into cancer cell lines using gene editing technology.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 싸이토카인은, TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 및 Oncostatin M으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 2 배양하는 단계는, 면역 관문 저해제가 처리된 상기 T세포 및 암 세포주에 제 2 T세포 자극 인자를 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때, 제 2 T세포 자극 인자는, 10 내지 30 ㎍/ml의 α-CD3 및 3 내지 7 ㎍/ml의 α-CD28을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the cytokines include TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL- It may be at least one of the group consisting of 21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1, and Oncostatin M, but is not limited thereto. no. According to another feature of the present invention, the step of culturing may include treating the T cells and the cancer cell line treated with the immune checkpoint inhibitor with a second T cell stimulating factor, wherein the second T cell Stimulating factors may include, but are not limited to, 10 to 30 μg/ml of α-CD3 and 3 to 7 μg/ml of α-CD28.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 2 배양하는 단계는, 14 내지 20일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the second culturing step may be performed for at least one period of 14 to 20 days, but is not limited thereto.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since these examples are only for illustrative purposes of the present invention, the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.
본 발명의 일 실시예에 따른, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 개조된 녹아웃 암 세포주와 T세포를 통하여, 싸이토카인 분비량을 차이를 명확하게 확인할 수 있음에 따라, 직관적으로 면역 관문 저해제에 대한 효과를 평가할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the screening method for immune checkpoint inhibitors can clearly identify differences in the amount of cytokine secretion through modified knockout cancer cell lines and T cells, thereby intuitively evaluating the effect of immune checkpoint inhibitors. You can.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 여러 면역세포가 혼합되어 존재하는 PBMC와는 달리 순도 90% 이상의 고농축화된 CD8+ T세포를 포함함에 따라, T세포의 항암효과를 보다 명확하게 관찰할 수 있다.More specifically, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention contains highly concentrated CD8+ T cells with a purity of 90% or more, unlike PBMCs, which exist as a mixture of various immune cells, thereby demonstrating the anticancer effect of T cells. can be observed more clearly.
나아가, 이러한 고농축화된 T세포는 PD-1, TIM-3 및 TIGIT를 모두 발현하는 세포뿐만 아니라 PD-1, TIM-3 및 TIGIT 중 적어도 하나인 단일(single) 또는 이중(double) 양성 T세포를 모두 포함할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 이들 중 표적하고자 하는 수용체를 발현하는 T세포를 선별하여, 면역 관문 저해제의 효과를 확인할 수 있다.Furthermore, these highly enriched T cells include cells expressing all of PD-1, TIM-3, and TIGIT, as well as single or double positive T cells that are at least one of PD-1, TIM-3, and TIGIT. Can include all. Accordingly, the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention can confirm the effect of the immune checkpoint inhibitor by selecting T cells that express the receptor to be targeted among these.
더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 고농축화된 T세포는 표적하고자 하는 수용체만을 발현하는 T세포를 선별하여 제공할 수 있음에 따라, 보다 명확한 싸이토카인의 분비량을 확인할 수 있다.Furthermore, highly enriched T cells according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can select and provide T cells that express only the receptor to be targeted, resulting in a more specific secretion amount of cytokines. You can check it.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 녹아웃 암 세포주는 시험하고자 하는 표적 면역 관문 리간드 이외의 면역 관문 리간드 즉, 변수가 제거됨에 따라, 표적 면역 관문 리간드의 차단에 따른 싸이토카인 분비 효과를 더 명확하게 확인할 수 있다.In addition, in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention, the knockout cancer cell line contains immune checkpoint ligands other than the target immune checkpoint ligand to be tested, that is, variables are removed, and thus the knockout cancer cell line is affected by blocking the target immune checkpoint ligand. The effect of cytokine secretion can be confirmed more clearly.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 증진된 싸이토카인의 분비량을 통하여, 특정 면역 관문 수용체 및 리간드를 표적할 수 있는 저해제에 대한 효과를 정량적으로 뚜렷하게 관찰할 수 있음에 따라, 저해제의 후보 물질 비교 및 선정을 보다 쉽고 용이하게 수행할 수 있다.Ultimately, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention allows the effect of inhibitors that can target specific immune checkpoint receptors and ligands to be clearly observed quantitatively through the increased secretion of cytokines. , comparison and selection of inhibitor candidates can be performed more easily and easily.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 시료 및 실험자 등과 같은 변수 요인이 제외된 획일화된 방법으로서, 면역 관문 저해제에 대한 후보물질에 대한 평가를 표준화시킬 수 있다.Accordingly, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention is a standardized method that excludes variable factors such as samples and experimenters, and can standardize the evaluation of candidates for immune checkpoint inhibitors.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 개조된 녹아웃 암 세포주와 T세포 또한 제공함에 따라, 시료 확보의 한계성을 극복할 수 있다. 이에, 시료 한계에 의하여 제한되어 있는 면역 관문 저해제의 스크리닝을 보다 많이 수행할 수 있게 됨에 따라, 면역 함암 치료제를 개발 속도를 더 증진시킬 수 있다.Furthermore, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can overcome limitations in securing samples by also providing modified knockout cancer cell lines and T cells. Accordingly, as it becomes possible to perform more screening of immune checkpoint inhibitors, which are limited by sample limitations, the speed of development of immune-anticancer therapeutics can be further improved.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다. The effects according to the present invention are not limited to the contents exemplified above, and further various effects are included in the present specification.
도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 기작을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 T세포의 고농축화(enrichment)에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 4a 내지 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 고농축화된 T세포의 공동 배양 기간에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 5a 및 5b는, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 CD8+ T세포의 면역 관문 수용체 발현에 따른 싸이토카인 분비량에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 6a 내지 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 T세포의 게이팅(gating)에 따른 싸이토카인 분비량에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 7a 내지 7b은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 녹아웃 암 세포주 및 고농축화 T세포의 예시도를 도시한 것이다.
도 8a 내지 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 9a 내지 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 고농축된 T세포 및 녹아웃 암 세포주에 따른 면역 관문 저해제의 효능 평가에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 공동 배양에 의한 면역 관문 수용체 및 리간드 간의 직접적인(direct) 상호작용 검증에 대한 결과를 도시한 것이다.1A and 1B exemplarily illustrate the mechanism of an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows a flowchart of a screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention.
Figures 3A to 3C show the results of high enrichment of T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figures 4A to 4B show the results of the co-culture period of highly enriched T cells according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figures 5a and 5b show the results of the amount of cytokine secretion according to the expression of immune checkpoint receptors in CD8+ T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figures 6a to 6d show the results of the amount of cytokine secretion according to gating of T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figures 7a and 7b show examples of knockout cancer cell lines and highly enriched T cells according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figures 8a and 8b show the results of cytokine secretion according to highly enriched T cells and knock out cancer cell lines in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figures 9a and 9b show the results of evaluating the efficacy of immune checkpoint inhibitors according to highly enriched T cells and knockout cancer cell lines in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
Figure 10 shows the results of verification of direct interaction between an immune checkpoint receptor and a ligand by co-culture in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms, but the present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and are within the scope of common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 일반적으로 즉, 하나 이상의 추가적인 (명시되지 않은) 특징 또는 성분의 존재를 허용하는 것을 포함하는 의미로 사용된다. 나아가, 본 명세서에 사용되는 용어 "포함한"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함하다(include, includes)" 및 "포함된 (included)"은 제한적인 것이 아니다.As used herein, the terms “comprise” or “comprising” are used generally, i.e., to include allowing for the presence of one or more additional (unspecified) features or elements. Furthermore, the term “including” as well as other forms such as “include, includes” and “included” used in this specification are not limiting.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비소세포성 폐암"은, 상피성 암의 일종으로 폐소성암 (small lung cancer) 이 아닌 모든 상피성 폐암을 의미한다.As used herein, the term “non-small cell lung cancer” is a type of epithelial cancer and refers to all epithelial lung cancers other than small lung cancer.
본 명세서에서 사용되는 "유의 확률(p-value)"은 *, **. *** 및 **** 으로 표기되었으며, *은 p<0.05를 의미하며, **은 p<0.01를 의미하며, ***은 p<0.001를 의미하며, ****은 p<0.0001을 의미한다.“Significance probability (p-value)” used in this specification is *, **. Indicated by *** and ****, * means p<0.05, ** means p<0.01, *** means p<0.001, **** means p<0.0001 means.
면역 관문 저해제의 스크리닝 방법Screening methods for immune checkpoint inhibitors
이하에서는 도 1a 내지 2를 참조하며, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 관하여 설명하도록 한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 1A to 2, a method for screening an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention will be described.
먼저, 도 1a을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 기작에 대하여 구체적으로 설명한다.First, referring to FIG. 1A, the mechanism of the immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention will be described in detail.
암 세포(cancer cell)를 공격할 수 있는 세포 독성(cytotoxic) T세포 즉, CD8+ T세포는 다양한 면역 관문 수용체(immune checkpoint receptor)를 발현할 수 있으며, 암 세포는 이러한 면역 관문 수용체를 통하여 면역 기능을 회피할 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포는 PD-L1, CECAM1 및 PVR과 같은 세포막 단백질인 면역 관문 리간드를 발현시켜, T세포 표면에 발현된 면역 관문 수용체와 결합할 수 있다. 전술한 결합에 의하여, T세포 내부에 억제 신호(inhibitory signal)가 전달되어, 암 세포를 공격할 수 있는 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 싸이토카인의 분비가 감소(-)될 수 있다.Cytotoxic T cells, i.e. CD8+ T cells, that can attack cancer cells can express various immune checkpoint receptors, and cancer cells function immune through these immune checkpoint receptors. can be avoided. More specifically, cancer cells can express immune checkpoint ligands, which are cell membrane proteins such as PD-L1, CECAM1, and PVR, and bind to immune checkpoint receptors expressed on the surface of T cells. By the above-mentioned combination, an inhibitory signal is transmitted inside the T cell, and the secretion of cytokines such as IFN-γ and TNF-α, which can attack cancer cells, can be reduced (-).
이에, 전술한 면역 관문 수용체를 차단할 수 있는 물질(antagonist)을 처리하여 T세포의 면역 반응을 증진시키는 것이 종래의 항암 치료의 한계를 극복할 수 있는 좋은 대안으로 주목을 받고 있으며, 이에 따라, 다양한 면역 관문 저해제가 활발히 개발되고 있다.Accordingly, enhancing the immune response of T cells by treating them with substances (antagonists) that can block the above-mentioned immune checkpoint receptors is attracting attention as a good alternative to overcome the limitations of conventional anticancer treatment. Accordingly, various Immune checkpoint inhibitors are being actively developed.
한편, 건강한 개체로부터 획득한 CD8+ T세포는 면역 관문 수용체의 발현율이 매우 낮다. 이에, 면역 관문 저해제의 후보 물질을 선별하기 위하여, 환자로부터 획득한 CD8+ T세포를 사용되어 왔으나, 환자로부터 획득한 CD8+ T세포는 일정하게 면역 관문 수용체를 발현하고 있는 것이 아닌, 개체 및 시료에 따라 상이하게 면역 관문 수용체를 발현하고 있어, 균일한 싸이토카인 분비량을 측정하기 어렵다. 나아가, 전술한 CD8+ T세포는 환자로부터 획득됨에 따라, 이의 양은 매우 한정적일 수 있다.Meanwhile, CD8+ T cells obtained from healthy individuals have a very low expression rate of immune checkpoint receptors. Accordingly, to select candidates for immune checkpoint inhibitors, CD8+ T cells obtained from patients have been used. However, CD8+ T cells obtained from patients do not consistently express immune checkpoint receptors, but vary depending on the individual and sample. Because they express immune checkpoint receptors differently, it is difficult to measure uniform cytokine secretion. Furthermore, as the above-described CD8+ T cells are obtained from patients, their quantity may be very limited.
또한, 암 세포주는 한 종류의 면역 관문 리간드만 발현하는 것이 아닌 다양한 면역 관문 리간드를 발현하고 있다. 보다 구체적으로, 도 1b를 참조하면, 암 세포주는 CD8+ T세포와 마찬가지로 개체 및 시료에 따라 상이하게 면역 관문 리간드를 발현하고 있어, 일반적인 암 세포주로는 표적하고자 하는 특정 리간드에 대한 차단 효과를 측정하기 어렵다. 예를 들어, CEACAM1 및 TIM3의 결합을 차단할 수 있는 TIM-3 항체에 대한 효과를 측정하고자 할 경우, 이에 대한 결합이 차단되었어도, 여전히 PD-L1 및 PD-1과 PVR 및 TIGIT 등의 다양한 면역 관문 결합에 의한 저해 신호를 차단하지 못하여, 표적 면역 관문 차단에 의하여 향상된 싸이토카인 분비량을 관찰하기 어려울 수 있다. Additionally, cancer cell lines do not express only one type of immune checkpoint ligand, but instead express a variety of immune checkpoint ligands. More specifically, referring to Figure 1b, cancer cell lines, like CD8+ T cells, express immune checkpoint ligands differently depending on the individual and sample, so it is difficult to measure the blocking effect on the specific ligand to be targeted with general cancer cell lines. difficult. For example, if you want to measure the effect of a TIM-3 antibody that can block the binding of CEACAM1 and TIM3, even though binding to TIM3 is blocked, it still targets PD-L1 and PD-1, as well as various immune checkpoints such as PVR and TIGIT. Since the inhibitory signal due to binding cannot be blocked, it may be difficult to observe the improved cytokine secretion amount by blocking the target immune checkpoint.
결국, 본 발명의 발명자들은, 특정 면역 관문 차단에 의한 명확한 싸이토카인 분비량 차이를 측정하기 위하여, 측정하고자 하는 표적 면역 관문 리간드를 제외한 불특정 다수의 리간드가 제거된 암 세포주와 건강한 개체로부터 획득하여도 면역 관문 수용체가 발현되어 있는 고농축화된 CD8+ T세포를 개발하였다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 전술한 암 세포주와 T 세포 통하여 면역 관문 저해제의 평가에 있어, 실험자 및 시료와 같은 환경적 요인에 영향받지 않고, 일관적인 결과를 도출해 낼 수 있는 스크리닝 방법을 더 개발하였다.Ultimately, in order to measure a clear difference in the amount of cytokine secretion caused by blocking a specific immune checkpoint, the inventors of the present invention obtained an immune checkpoint from cancer cell lines and healthy individuals from which an unspecified number of ligands other than the target immune checkpoint ligand to be measured were removed. Highly enriched CD8+ T cells expressing receptors were developed. Furthermore, the inventors of the present invention further developed a screening method that can produce consistent results in the evaluation of immune checkpoint inhibitors through the cancer cell lines and T cells described above, without being influenced by environmental factors such as experimenters and samples. .
이에, 도 2를 참조하면, 전술한 암 세포주와 T세포를 이용한 본 발명의 일 실시예에 따른, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 대한 순서도가 도시된다.Accordingly, referring to FIG. 2, a flowchart of a screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention using the above-described cancer cell line and T cells is shown.
본 발명의 일 실시예에 따른, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 T세포가 농축되도록 제 1 배양하는 단계(S110), 농축된 T세포에 면역 관문 저해제를 처리하는 단계(S120), 면역 관문 저해제가 처리된 T세포와 면역 관문 리간드 그룹에 대한 유전자가 녹아웃된 암 세포주를 혼합하여 제 2 배양하는 단계(S130) 및 제 2 배양된 T세포의 싸이토카인 분비량을 측정하는 단계(S140)을 포함할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, a method for screening an immune checkpoint inhibitor includes first culturing a biological sample isolated from an individual to enrich T cells (S110), and treating the enriched T cells with an immune checkpoint inhibitor (S110). S120), a second culture step of mixing T cells treated with an immune checkpoint inhibitor and a cancer cell line in which the gene for the immune checkpoint ligand group has been knocked out (S130), and a step of measuring the amount of cytokine secretion of the second cultured T cells (S130). S140) may be included.
먼저, 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 T세포가 농축되도록 제 1 배양하는 단계(S110)는, 생물학적 시료에 제 1 T세포 자극 인자(Tcell activating factor)를 처리하는 단계 및 자극 인자가 처리된 상기 생물학적 시료를 배양하는 단계를 포함하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 제 1 T세포 자극 인자는, α-CD3, hIL-2 및 hIL-7을 포함할 수 있으며, 각각의 양은 anti-CD3 0.5 내지 2 ㎍/ml, IL-2 5 내지 20 ng/ml 및 IL-7 5 내지 20 ng/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 α-CD3 1 ㎍/ml, IL-2 10 ng/ml 및 IL-7 10 ng/ml일 수 있다. First, the first step of culturing a biological sample isolated from an individual to enrich T cells (S110) includes treating the biological sample with a first T cell activating factor and the biological sample treated with the stimulating factor. A step including culturing the sample may be included. At this time, the first T cell stimulating factor may include α-CD3, hIL-2, and hIL-7, and each amount is 0.5 to 2 μg/ml for anti-CD3, 5 to 20 ng/ml for IL-2, and IL-7 may be 5 to 20 ng/ml, but is not limited thereto, and preferably may be α-CD3 1 μg/ml, IL-2 10 ng/ml, and IL-7 10 ng/ml.
이러한, 제 1 배양하는 단계는, 7 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 바람직하게, 종양 세포를 파괴할 수 있는 CD8+ T세포가 가장 많이 배양될 수 있는 제 1 배양하는 단계의 기간은, 14일일 수 있다.This first culturing step may be performed for at least one period of 7 to 21 days, but is not limited thereto. However, preferably, the period of the first culture step, during which the largest number of CD8+ T cells capable of destroying tumor cells can be cultured, may be 14 days.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 생물학적 시료는, 제 1 배양하는 단계(S110)를 통하여, CD8+ T세포를 전체 생존 세포에 대하여 90 %이상 포함할 수 있으며, CD8+ T세포는 제 1 배양하기 전보다 150배 이상 세포수가 증가될 수 있다. Accordingly, the biological sample in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention may contain more than 90% of CD8+ T cells based on total viable cells through the first culturing step (S110), CD8+ T cells can increase in number by more than 150 times compared to before the first culture.
이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 생물학적 시료는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 골수유래 단핵세포(bone marrow mononuclear cell, BMMC)를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 PBMC일 수 있다. 나아가, PBMC는 다양한 면역 세포를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, PBMC는 T세포, B세포 및 NK세포를 포함하는 림프구 및 단핵구를 포함하고 있으나, 전술한 본 발명의 제 1 배양하는 단계(S110)에 의하여, CD8+ T세포가 고농축화되어 있을 수 있다. 즉, PBMC 내에 있는 T세포 중 CD8+ T세포가 제 1 T세포 자극 인자의 처리 및 배양으로 인하여, 증식이 활발해져 세포 수(population)이 증가될 수 있으며, 나아가 면역 관문 수용체의 발현도 증가될 수 있다. At this time, the biological sample according to an embodiment of the present invention may include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or bone marrow mononuclear cells (BMMC), but may preferably be PBMC. there is. Furthermore, PBMCs may contain a variety of immune cells. More specifically, PBMC contains lymphocytes and monocytes, including T cells, B cells, and NK cells, but CD8+ T cells may be highly concentrated by the first culturing step (S110) of the present invention described above. there is. In other words, among the T cells in PBMC, CD8+ T cells can become active in proliferation due to treatment and culture with the first T cell stimulating factor, increasing the cell population, and further increasing the expression of immune checkpoint receptors. .
그 다음, 농축된 T세포에 면역 관문 저해제를 처리하는 단계(S120)에서 농축된 T세포는 다양한 면역 관문 수용체를 발현하고 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 농축된 T세포는 CD8+ T세포가 전체 생존 세포에 대하여 90%이상 차지하는 T세포를 의미할 수 있으며, T세포에 발현될 수 있는 면역 관문 수용체는 PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2 및 ILT3으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 T세포에서 발현될 수 있는 면역 관문 수용체를 모두 포함할 수 있다.Next, in the step of treating the enriched T cells with an immune checkpoint inhibitor (S120), the enriched T cells may express various immune checkpoint receptors. More specifically, enriched T cells can refer to T cells in which CD8+ T cells account for more than 90% of total viable cells, and immune checkpoint receptors that can be expressed on T cells include PD-1, TIM-3, and TIGIT. , CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2, and ILT3, but is not limited to an immune checkpoint receptor that can be expressed on T cells. All can be included.
나아가, 면역 관문 수용체가 발현된 T세포는 PD-1-TIM-3-TIGIT-CD8+T세포, PD-1+TIM-3-TIGIT-CD8+T세포, PD-1-TIM-3+TIGIT-CD8+T세포, PD-1-TIM-3-TIGIT+CD8+T세포, PD-1+TIM-3+TIGIT-CD8+T세포, PD-1+TIM-3-TIGIT+CD8+T세포, PD-1-TIM-3+TIGIT+CD8+T세포 및 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T세포로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이때, PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T세포는, 농축된 T세포 전체에 대하여 9 %이상 발현될 수 있다.Furthermore, T cells expressing immune checkpoint receptors include PD-1-TIM-3-TIGIT-CD8+T cells, PD-1+TIM-3-TIGIT-CD8+T cells, and PD-1-TIM-3+TIGIT. -CD8+T cells, PD-1-TIM-3-TIGIT+CD8+T cells, PD-1+TIM-3+TIGIT-CD8+T cells, PD-1+TIM-3-TIGIT+CD8+T cells , may include at least one of the group consisting of PD-1-TIM-3+TIGIT+CD8+T cells and PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T cells, but is not limited thereto. In this case, PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T cells can be expressed at more than 9% of the total concentrated T cells.
이때, 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor)는 본 발명의 고농축된 T세포의 표면에 발현된 면역 관문 수용체의 작용을 억제할 수 있는 길항제(antagonist)를 의미할 수 있으며, 면역 관문 억제제와 동일한 의미로 호환되어 사용될 수 있다. 나아가, 면역 관문 저해제는 길항제로서, 항체, 단백질, 올리고 펩타이드, 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으며, T세포의 면역 관문 수용체의 작용을 억제함으로써 싸이토카인 분비량을 증가시킬 수 있다. 즉, 면역 관문 저해제는 면역 관문의 작용을 억제하여, T세포의 싸이토카인 분비량을 증가시킬 수 있는 모든 물질을 포함할 수 있으며, 이에 따라, T세포의 면역 관문 수용체를 표적할 수 있는 물질뿐만 아니라, 암 세포에서 발현되는 면역 관문 리간드를 표적하여, 이의 작용을 저해시킬 수 있는 물질 또한 포함될 수 있다.At this time, the immune checkpoint inhibitor may refer to an antagonist that can inhibit the action of the immune checkpoint receptor expressed on the surface of the highly concentrated T cells of the present invention, and has the same meaning as the immune checkpoint inhibitor. Can be used interchangeably. Furthermore, the immune checkpoint inhibitor is an antagonist, which may be at least one of the group consisting of antibodies, proteins, oligopeptides, organic molecules, polysaccharides, and polynucleotides, and can increase the amount of cytokine secretion by inhibiting the action of the immune checkpoint receptor of T cells. there is. In other words, immune checkpoint inhibitors may include all substances that can inhibit the action of immune checkpoints and increase the amount of cytokine secretion of T cells. Accordingly, not only substances that can target immune checkpoint receptors of T cells, Substances that can target immune checkpoint ligands expressed in cancer cells and inhibit their actions may also be included.
그 다음, 면역 관문 저해제가 처리된 T세포와 면역 관문 리간드에 대한 유전자가 녹아웃된 암 세포주를 혼합하는 단계(S130)에서암 세포주는 HCC4006인 폐암 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 암 세포주를 모두 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 암 세포주는 다양한 유전자 편집 기술을 통하여 면역 관문 리간드의 발현에 관여하는 유전자를 녹아웃시킨 녹아웃 암 세포주를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포주는, PD-L1, Galectin-9, CEACAM1 및 PVR으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 대한 유전자가 녹아웃될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 녹아웃될 수 있는 유전자는 암 세포주에서 발현될 수 있는 다양한 면역 관문 리간드의 발현에 관여하는 유전자를 모두 포함할 수 있다. 나아가, 암 세포주에서 발현될 수 있는 면역 관문 리간드는 PD-L1, PD-L2, PVR(CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4 및 ALCAM으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 이의 발현에 관여하는 모든 유전자가 녹아웃될 수 있다.Next, in the step (S130) of mixing T cells treated with an immune checkpoint inhibitor and a cancer cell line in which the gene for the immune checkpoint ligand has been knocked out, the cancer cell line may be a lung cancer cell line such as HCC4006, but is not limited to this, and various cancers. All cell lines may be included. Furthermore, cancer cell lines in the method for screening immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention may include knockout cancer cell lines in which genes involved in the expression of immune checkpoint ligands have been knocked out through various gene editing techniques. More specifically, the cancer cell line may have at least one gene knocked out from the group consisting of PD-L1, Galectin-9, CEACAM1, and PVR, but is not limited thereto. At this time, genes that can be knocked out may include all genes involved in the expression of various immune checkpoint ligands that can be expressed in cancer cell lines. Furthermore, immune checkpoint ligands that can be expressed in cancer cell lines include PD-L1, PD-L2, PVR (CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, It may include at least one of the group consisting of CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4 and ALCAM, All genes involved in expression can be knocked out.
나아가, 암 세포주에서 면역 관문 리간드의 제거는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 전술한 시스템에 제한되는 것은 아니며, 표적하고자 하는 면역 관문 리간드의 발현을 제거할 수 있는 다양한 유전자 편집 기술을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, ZFN(Zinc Finger Nuclease) 및 TALEN(Tranor Activator-Like Effector Nuclease) 등과 같은 다양한 기술이 이용될 수 있다. Furthermore, removal of immune checkpoint ligands from cancer cell lines can be performed using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 system. However, it is not limited to the above-described system, and may include various gene editing technologies that can eliminate the expression of the immune checkpoint ligand to be targeted. For example, various technologies may be used, such as Zinc Finger Nuclease (ZFN) and Tranor Activator-Like Effector Nuclease (TALEN).
더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 녹아웃 암 세포주는 T세포의 싸이토카인 분비량 증진을 위하여, 공동자극 리간드(co-stimulatory ligand) 또는싸이토카인(cytokine)과 같은 T세포 자극 인자들을 더 포함할 수 있다. 이때, 암세포주에서의 공동자극 리간드 및 싸이토카인은 이를 발현시킬 수 있는 유전자가 암 세포주 내에 삽입되어 발현될 수 있다. 이때, 면역 관문 리간드 가 녹아웃된 암 세포주에서 발현될 수 있는 공동 자극 리간드는 B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L 및 LIGHT로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 싸이토카인은 TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 및 Oncostatin M으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이에, 녹아웃된 암 세포주는 공동자극 리간드 또는 싸이토카인을 더 포함함으로써, T세포를 자극하여 싸이토카인 분비능을 더 향상시킬 수 있다. Furthermore, the knockout cancer cell line in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention is a T cell line that contains T cells such as co-stimulatory ligands or cytokines in order to enhance the cytokine secretion of T cells. Additional stimulating factors may be included. At this time, co-stimulatory ligands and cytokines in cancer cell lines can be expressed by inserting genes capable of expressing them into the cancer cell line. At this time, costimulatory ligands that can be expressed in cancer cell lines in which the immune checkpoint ligand has been knocked out are B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L, and LIGHT. It may be at least one of the group consisting of, but is not limited to, cytokines include TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, Can be at least one of the group consisting of IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 and Oncostatin M However, it is not limited to this. Accordingly, the knocked-out cancer cell line can further improve the cytokine secretion ability by stimulating T cells by further containing co-stimulatory ligands or cytokines.
그 다음, 면역 관문 저해제가 처리된 T세포 및 면역 관문 리간드에 대한 유전자가 녹아웃된 암 세포주를 혼합하여 제 2 배양하는 단계(S130)는, 혼합된 T세포 및 암 세포주에 제 2 T세포 자극 인자를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 제 2 T세포 자극 인자는, α-CD3 및 α-CD28를 포함하고 있으며, 각각의 양은 α-CD3 10 내지 30 ㎍/ml 및 α-CD28 3 내지 7 ㎍/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 α-CD3 20 ㎍/ml 및 α-CD28 5 ㎍/ml일 수 있다. 나아가, 제 2 배양하는 단계(S130)는 싸이토카인의 분비량이 가장 많이 분비되는 14 내지 20일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있다. Next, in the second culture step (S130) of mixing the T cells treated with the immune checkpoint inhibitor and the cancer cell line in which the gene for the immune checkpoint ligand has been knocked out, the mixed T cells and the cancer cell line are injected with the second T cell stimulating factor. It may include processing steps. At this time, the second T cell stimulating factor includes α-CD3 and α-CD28, and the respective amounts may be 10 to 30 μg/ml for α-CD3 and 3 to 7 μg/ml for α-CD28, but are limited thereto. This does not mean that it is possible, and is preferably 20 μg/ml for α-CD3 and 5 μg/ml for α-CD28. Furthermore, the second culturing step (S130) may be performed for at least one period of 14 to 20 days when the highest amount of cytokine secretion is secreted.
그 다음, 제 2 배양된 T세포 및 암 세포주의 싸이토카인 분비량을 측정하는 단계(S140)는 제 2 배양된 T세포를 게이팅(gating)하는 단계를 더 포함할 수 있다. 나아가, 게이팅 하는 단계는 면역 관문 수용체(immune checkpoint receptor) 발현에 따라 게이팅이 수행될 수 있다. 즉, T세포에서 발현되는 면역 관문 수용체의 형광 발현을 이용하여, 표적하고자 하는 특정 면역 관문 수용체만을 발현하는 T세포를 선별할 수 있다. 이때, 게이팅하는 단계는, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 면역자기 세포 분류(immunomagnetic cell sorting: MACS)를 이용하여 수행될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 측정하는 단계(S140)를 통하여 표적 저해제에 대한 효과 즉, 싸이토카인의 분비량 차이를 명확하게 확인할 수 있다.Next, the step of measuring the cytokine secretion amount of the second cultured T cells and the cancer cell line (S140) may further include the step of gating the second cultured T cells. Furthermore, the gating step may be performed according to the expression of an immune checkpoint receptor. In other words, using the fluorescence expression of immune checkpoint receptors expressed in T cells, T cells that express only the specific immune checkpoint receptor to be targeted can be selected. At this time, the gating step may be performed using fluorescence-activated cell sorting (FACS) or immunomagnetic cell sorting (MACS). Accordingly, the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention can clearly confirm the effect of the target inhibitor, that is, the difference in the secretion amount of cytokines, through the measuring step (S140).
나아가, 측정하는 단계(S140)를 통하여, 측정되는 싸이토카인은 싸이토카인은, TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 및 Oncostatin M 으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역 세포에서 분비되어 암 세포를 공격할 수 있는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다.Furthermore, through the measuring step (S140), the cytokines to be measured are TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, Can be at least one of the group consisting of IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 and Oncostatin M However, it is not limited to this, and may include various substances that are secreted from immune cells and can attack cancer cells.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 개조된 암 세포주와 T세포를 통하여, 표적하고자 하는 면역 관문 저해제의 효과 즉, 싸이토카인 분비량을 차이를 명확하게 확인할 수 있다.Ultimately, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can clearly confirm the difference in the effect of the immune checkpoint inhibitor to be targeted, that is, the amount of cytokine secretion, through modified cancer cell lines and T cells.
T세포의 고농축화(enrichment)High enrichment of T cells
이하에서는 도 3a 내지 3c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 T세포의 고농축화(enrichment)에 대하여 설명하도록 한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 3A to 3C, the high enrichment of T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention will be described.
도 3a를 참조하면, 인간 말초 혈액 단핵세포(human peripheral blood mononuclear cell, hPBMC)을 통한 CD8+ T세포의 고농축화에 대한 결과가 도시된다. 먼저, 도 3a의 (a)를 참조하면, 건강한 개체(healthy donor)의 혈액으로부터 획득한 PBMC에 anti-CD3, growth factor interleukin 2(IL-2) 및 growth factor interleukin 7(IL-7)을 처리하여 9일 동안 배양한다. 이때, 배양기간은 9일로 도시되었지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 7 내지 14일 중 적어도 하나의 기간동안 배양할 수 있다. Referring to Figure 3A, the results of high enrichment of CD8+ T cells through human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC) are shown. First, referring to (a) of Figure 3a, PBMCs obtained from the blood of a healthy donor were treated with anti-CD3, growth factor interleukin 2 (IL-2), and growth factor interleukin 7 (IL-7). and cultured for 9 days. At this time, the culture period is shown as 9 days, but is not limited thereto, and the culture may be performed for at least one period of 7 to 14 days.
이때, 인간 말초 혈액 단핵세포(human peripheral blood mononuclear cell, hPBMC)은 둥근 핵을 가진 혈액의 모든 세포로서, T세포, B세포 및 NK세포를 포함하는 림프구 및 단핵구를 포함하고 있으며, 배양을 통하여 다양한 면역세포로 분화될 수 있다.At this time, human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC) are all cells in the blood with round nuclei, and include lymphocytes and monocytes, including T cells, B cells, and NK cells, and can be used in various ways through culture. Can be differentiated into immune cells.
또한, anti-CD3, human growth factor interleukin 2(hIL-2) 및 human growth factor interleukin 7(hIL-7)는 CD8+ T세포를 활성화시키기 위한 자극 인자로서, T세포 수용체를 자극하여 증식(proliferation)을 유발하고, CD3 complex와 관련된 T세포 표면의 항원 수용체(antigen receptor)를 교란하여 항원 수용체를 활성시킬 수 있다. 나아가, PBMC 배양 시 첨가되는 각각의 양은 anti-CD3 0.5 내지 2 ㎍/ml, IL-2 5 내지 20 ng/ml 및 IL-7 5 내지 20 ng/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 α-CD3 1 ㎍/ml, IL-2 10 ng/ml 및 IL-7 10 ng/ml일 수 있다. In addition, anti-CD3, human growth factor interleukin 2 (hIL-2), and human growth factor interleukin 7 (hIL-7) are stimulatory factors for activating CD8+ T cells and stimulate T cell receptors to promote proliferation. It can cause activation of antigen receptors by disrupting the antigen receptors on the surface of T cells related to the CD3 complex. Furthermore, the amounts added during PBMC culture may be 0.5 to 2 μg/ml for anti-CD3, 5 to 20 ng/ml for IL-2, and 5 to 20 ng/ml for IL-7, but are not limited thereto and are preferred. Examples include 1 μg/ml of α-CD3, 10 ng/ml of IL-2, and 10 ng/ml of IL-7.
이에, 도 3a의 (b)를 참조하면, 전술한 도 3a의 (a) 과정에 의하여 배양된 T세포의 발현 결과가 도시된다. SSC-A로 생존 세포(live cell)을 선별한 결과, 세포 생존은 배양 7일 및 14일째에 가장 높은 것으로 나타나며, 이때의 세포 생존율은 각각 91 % 및 90 %인 것으로 나타난다. 나아가, 배양 기간이 21일 이상 진행될수록 생존 세포수가 감소하는 것으로 나타난다. Accordingly, referring to (b) of FIG. 3A, the expression results of T cells cultured through the process of (a) of FIG. 3A are shown. As a result of selecting live cells with SSC-A, cell survival was highest on the 7th and 14th day of culture, and the cell survival rates at this time were 91% and 90%, respectively. Furthermore, as the culture period progresses for more than 21 days, the number of viable cells appears to decrease.
또한, 생존 세포 중 CD8+ T세포의 비율은 배양이 진행될수록 증가하며, 배양 14일째에 CD8+ T세포의 비율은 91%로 가장 높은 것으로 나타난다. 이와는 반대로, CD4+ T세포의 비율은 배양이 진행될수록 감소하며, 배양 14일 이후부터 급격하게 5% 이하의 낮은 비율을 차지하는 것으로 나타난다.Additionally, the proportion of CD8+ T cells among surviving cells increases as culture progresses, and the proportion of CD8+ T cells appears to be the highest at 91% on day 14 of culture. On the contrary, the percentage of CD4+ T cells decreases as the culture progresses, and after 14 days of culture, it appears to rapidly reach a low percentage of less than 5%.
보다 구체적으로, 도 3a의 (c)를 참조하면, 도 3a의 (b)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. 배양 기간에 따른 PBMC로 유래된 전체 세포 수는 배양 7일부터 증가하여 배양 21일에 약 300 x 106 로 가장 높은 것으로 나타나며, 21일 초과의 배양이 진행될 경우, 세포 수가 감소하는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법을 통한 PBMC로부터 유래된 전체 세포는 배양 7 내지 21일 기간 사이에 가장 높은 증식율을 갖는 것을 의미할 수 있으며, 배양 기간이 21일 초과하여 진행될 경우, 세포의 증식율이 감소하는 것을 의미할 수 있다. More specifically, referring to (c) of FIG. 3A, a graphical representation of the results for (b) of FIG. 3A is shown. The total number of cells derived from PBMC according to the culture period increases from the 7th day of culture and reaches the highest value of about 300 x 10 6 on the 21st day of culture. If the culture continues for more than 21 days, the number of cells appears to decrease. In other words, this may mean that total cells derived from PBMCs through the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention have the highest proliferation rate between 7 and 21 days of culture, and the culture period exceeds 21 days. If this progresses, it may mean that the proliferation rate of cells decreases.
나아가, 배양 기간에 따른 PBMC로부터 유래된 전체 세포의 생존 세포 비율은 배양 7 내지 21일기간 내에는 87 % 이상인 것으로 나타나며, 21일 초과의 배양이 진행될 경우, 생존 세포 수가 감소하는 것으로 나타난다. Furthermore, the percentage of viable cells of total cells derived from PBMCs according to the culture period appears to be more than 87% within 7 to 21 days of culture, and when culture continues for more than 21 days, the number of viable cells appears to decrease.
나아가, PBMC로 유래된 전체 세포 중 CD8+ T세포의 비율은 배양 7일부터 급격하게 증가하여, 배양 14일부터는 90% 이상 유지하는 것으로 나타나며, 이와 대조적으로 CD4+ T세포의 비율은 7일부터 급격하게 감소하여, 배양 14일부터는 5% 미만인 것으로 나타난다. Furthermore, the proportion of CD8+ T cells among the total cells derived from PBMCs increases rapidly from day 7 of culture and appears to be maintained above 90% from day 14 of culture. In contrast, the proportion of CD4+ T cells increases rapidly from day 7. It decreases and appears to be less than 5% from day 14 of culture.
이에, PBMC로 유래된 전체 세포 중 CD8+ T세포의 수는 배양 7일째에는 약 15 내지 20 x 106 인 것으로 나타나지만, 이후 배양 14일 내지 21일 기간 동안에는 급격하게 CD8+ T세포가 증가하여 약 150 x 106 인 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 T세포의 고농축화를 통하여 CD8+ T세포를 첫 세포수의 약 150배 정도 분화(증식) 즉, 고농축화시킬 수 있다. 이때, CD8+ T세포를 증식시키기 위한 최소한의 배양 기간은, CD8+ T세포가 급속도로 증가하는 7 내지 14일 중 적어도 하나의 기간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 9일일 수 있다.Accordingly, the number of CD8+ T cells among the total cells derived from PBMC appears to be about 15 to 20 It appears to be 10 6 . Accordingly, in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention, CD8+ T cells can be differentiated (proliferated), that is, highly enriched, by about 150 times the initial cell number through high enrichment of T cells. At this time, the minimum culture period for proliferating CD8+ T cells may be at least one of 7 to 14 days during which CD8+ T cells rapidly increase, but is not limited thereto, and may preferably be 9 days.
한편, 배양 28일째에는 CD8+ T세포 수가 급격히 감소하는 것으로 나타나나, 이는 전술한 바와 같이, 전체 세포의 수가 감소됨에 따라, 감소된 것으로 나타난다. 이에, PBMC로부터 가장 많은 수의 CD8+ T세포를 얻기 위한 최장 배양기간으로 21 내지 28일 중 적어도 하나의 기간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 21일일 수 있다.Meanwhile, on the 28th day of culture, the number of CD8+ T cells appears to decrease rapidly, but as described above, this appears to decrease as the total number of cells decreases. Accordingly, the longest culture period to obtain the largest number of CD8+ T cells from PBMC may be at least one of 21 to 28 days, but is not limited thereto, and is preferably 21 days.
전술한 과정에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 여러 면역세포가 혼합되어 존재하는 PBMC와는 달리 순도 90% 이상의 CD8+ T세포를 포함함에 따라, T세포의 항암효과를 보다 명확하게 관찰할 수 있다.According to the above-described process, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention contains CD8+ T cells with a purity of 90% or more, unlike PBMCs, which exist as a mixture of various immune cells, thereby enhancing the anticancer effect of T cells. It can be observed more clearly.
도 3b를 참조하면, 전술한 과정에 의하여 고농축화된 T세포의 면역 관문 수용체 발현 결과가 도시된다. 먼저, 도 3b의 (a)를 참조하면, 배양 0일째에는 PBMC가 건강한 개체로부터 획득됨에 따라, CD8+ T세포 및 CD4+ T세포에서 면역 관문 수용체(immune checkpoint receptor)인 PD-1, TIGIT 및 TIM-3가 발현이 거의 되지 않은 것으로 나타난다. 그러나, 배양 기간이 진행될수록, TIGIT 및 TIM-3를 발현하는 CD8+ T세포 및 CD4+ T세포 수가 증가하는 것으로 나타난다. Referring to Figure 3b, the results of expression of immune checkpoint receptors in T cells highly enriched by the above-described process are shown. First, referring to (a) of Figure 3b, on day 0 of culture, as PBMCs were obtained from healthy individuals, the immune checkpoint receptors PD-1, TIGIT, and TIM- in CD8 + T cells and CD4 + T cells. It appears that 3 is rarely expressed. However, as the culture period progresses, the number of CD8+ T cells and CD4+ T cells expressing TIGIT and TIM-3 appears to increase.
보다 구체적으로, 도 3b의 (b)를 참조하면, 도 3b의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. 먼저, 배양 기간에 따른 PD-1을 발현하는 CD8+ T세포 및 CD4+ T세포의 비율은 배양 3일 차를 제외하곤 모두 각각 약 70% 및 20% 대로 유지되는 것으로 나타난다. More specifically, referring to (b) of FIG. 3B, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 3B is shown. First, the proportions of CD8+ T cells and CD4+ T cells expressing PD-1 according to the culture period appear to be maintained at about 70% and 20%, respectively, except for the third day of culture.
그 다음, TIM-3을 발현하는 CD8+ T세포의 비율은 배양 3 내지 14일에 80% 이상인 것으로 나타나며, 배양 21일부터는 감소하는 것으로 나타난다. 나아가, TIM-3을 발현하는 CD4+ T세포의 비율은 배양 기간 동안 60 내지 80 %대로 일정하게 유지되는 것으로 나타난다. Next, the proportion of CD8+ T cells expressing TIM-3 appears to be more than 80% on days 3 to 14 of culture, and appears to decrease from day 21 of culture. Furthermore, the proportion of CD4+ T cells expressing TIM-3 appears to remain constant at 60 to 80% during the culture period.
그 다음, TIGIT를 발현하는 CD8+ T세포의 비율은 배양 기간이 증가함에 따라, 증가하는 것으로 나타나며, TIGIT을 발현하는 CD4+ T세포의 비율은 약 20 %대로 일정하게 유지되는 것으로 나타난다. Next, the proportion of CD8+ T cells expressing TIGIT appears to increase as the culture period increases, and the proportion of CD4+ T cells expressing TIGIT appears to remain constant at about 20%.
결과적으로, CD8+ T세포에서 면역 관문 수용체인 PD-1, TIGIT 및 TIM-3가 공통적으로 가장 많이 발현되는 배양 기간은 3 내지 14일인 것으로 나타나며, 바람직하게는 14일일 수 있다. 그러나, 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니며, 발현하고자 하는 면역 관문 수용체의 종류에 따라, 배양 기간이 다양하게 달라질 수 있다. As a result, the culture period during which the immune checkpoint receptors PD-1, TIGIT, and TIM-3 are commonly expressed most frequently in CD8+ T cells appears to be 3 to 14 days, and may be preferably 14 days. However, the culture period is not limited to this, and may vary depending on the type of immune checkpoint receptor to be expressed.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포는 In-vivo와는 달리 PD-1 발현이 높지 않아도, 배양 7 내지 14일 동안 높은 TIM-3 및 TIGIT 발현율을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, In-vivo에서의 T세포는 PD-1이 발현되어야 다른 면역 관문 수용체들이 발현된다. 이에, PD-1 발현이 낮은 T세포는 TIM-3 및 TIGIT를 포함하는 다른 면역 관문 수용체에 대한 발현이 낮을 수 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포는 PD-1 발현이 되지 않아도, TIM-3 및 TIGIT를 포함하는 면역 관문 수용체의 높은 발현율을 가질 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포는 각각의 면역 관문 수용체를 포함하는 T세포만을 선별하여 활용할 수 있다.Furthermore, although T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention do not have high PD-1 expression, unlike in-vivo , they show high TIM-3 and TIGIT expression rates during 7 to 14 days of culture. You can have More specifically, in-vivo T cells must express PD-1 to express other immune checkpoint receptors. Accordingly, T cells with low PD-1 expression may have low expression of other immune checkpoint receptors, including TIM-3 and TIGIT. However, T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention may have a high expression rate of immune checkpoint receptors including TIM-3 and TIGIT even if they do not express PD-1. . Furthermore, T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can be utilized by selecting only T cells containing each immune checkpoint receptor.
한편, 도 3c를 참조하면, 전술한 도 3b에서 배양 14일에 대한 CD8+ T세포의 면역 관문 수용체 발현 결과가 도시된다. 먼저, 도 3c의 (a)를 참조하면, 배양 14일에 TIM-3(+) 및 PD-1(+) 모두를 발현하는 CD8+ T세포는 전체 CD8+ T세포 중 17%인 것으로 나타나며, TIM-3+PD-1+CD8+ T세포 중 TIGIT(+)을 발현하는 세포는 49%인 것으로 나타난다. Meanwhile, referring to FIG. 3C, the results of immune checkpoint receptor expression of CD8+ T cells for 14 days of culture in FIG. 3B are shown. First, referring to (a) of Figure 3c, CD8+ T cells expressing both TIM-3(+) and PD-1(+) on day 14 of culture appear to be 17% of all CD8+ T cells, and TIM- Among 3+PD-1+CD8+ T cells, 49% of cells express TIGIT(+).
보다 구체적으로, 3c의 (b)를 참조하면, 3c의 (a)의 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. 배양 14일에 대한 CD8+ T세포 중 PD-1만 발현하는 세포는 약 2%인 것으로 나타나며, TIM-3만 발현하는 세포는 약 47%인 것으로 나타나며, TIGIT만 발현하는 세포는 약 5%인 것으로 나타난다. More specifically, referring to (b) of 3c, a graphical representation of the result of (a) of 3c is shown. Among CD8+ T cells after 14 days of culture, cells expressing only PD-1 appear to be approximately 2%, cells expressing only TIM-3 appear to be approximately 47%, and cells expressing only TIGIT appear to be approximately 5%. appear.
또한, 배양 14일에 대한 CD8+ T세포 중 PD-1 및 TIM-3을 동시에 발현하는 세포는 약 9%인 것으로 나타나며, PD-1 및 TIGIT을 동시에 발현하는 세포는 약 4%인 것으로 나타나며, TIM-3 및 TIGIT을 동시에 발현하는 세포는 약 14%인 것으로 나타난다.In addition, among CD8+ T cells for 14 days of culture, approximately 9% of cells simultaneously express PD-1 and TIM-3, and approximately 4% of cells simultaneously express PD-1 and TIGIT, and TIM The number of cells co-expressing -3 and TIGIT appears to be approximately 14%.
또한, 배양 14일에 대한 CD8+ T세포 중 PD-1, TIM-3 및 TIGIT을 모두 발현하는 세포는 약 9%인 것으로 나타난다. Additionally, among CD8+ T cells after 14 days of culture, approximately 9% of cells express all of PD-1, TIM-3, and TIGIT.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포는 PD-1, TIM-3 및 TIGIT를 모두 발현하는 세포뿐만 아니라 PD-1, TIM-3 및 TIGIT 중 적어도 하나인 단일(single) 또는 이중(double) 양성 T세포를 모두 포함할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 이들 중 표적하고자 하는 수용체를 발현하는 T세포를 선별하여, 면역 관문 저해제의 효과를 확인할 수 있다.That is, the T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention are not only cells expressing all of PD-1, TIM-3, and TIGIT, but also cells expressing PD-1, TIM-3, and TIGIT. It may include at least one single or double positive T cell. Accordingly, the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention can confirm the effect of the immune checkpoint inhibitor by selecting T cells that express the receptor to be targeted among these.
고농축화된 T세포의 공동 배양 기간 설정Establishment of co-culture period of highly enriched T cells
이하에서는 도 4a 내지 4b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 고농축화된 T세포가 최대의 싸이토카인을 분비할 수 있는 공동 배양 기간에 대하여 설명하도록 한다. Hereinafter, with reference to FIGS. 4A and 4B, the co-culture period during which highly enriched T cells according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can secrete maximum cytokines will be described.
먼저, 도 4a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 고농축화된 T세포 및 암 세포주의 예시도가 도시된다. First, referring to FIG. 4A, an illustration of highly enriched T cells and cancer cell lines according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention is shown.
암 세포주는 HCC4006(Human lung adenocarcinoma cell line, HCC) wild type(WT)의 폐암 세포주가 사용되었으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역 관문 리간드를 발현할 수 있는 다양한 암 종류의 세포주를 모두 포함하여 사용할 수 있다. The cancer cell line used was HCC4006 (Human lung adenocarcinoma cell line, HCC) wild type (WT) lung cancer cell line, but it is not limited to this, and cell lines of various cancer types that can express immune checkpoint ligands can be used. there is.
나아가, 폐암 세포주는 면역 관문 리간드인 PD-L1, PVR, CEACAM1 및 Galecitn-9을 모두 발한혀고 있는 것으로 나타난다. 이에, 전술한 폐암 세포주와 고농축화된 T세포와의 공동 배양(co-culture)을 통하여, 싸이토카인의 분비능이 가장 극대화될 수 있는 시기를 확인할 수 있다. 이때, 고농축화된 T세포는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 선별된 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포를 의미한다.Furthermore, lung cancer cell lines appear to express all of the immune checkpoint ligands PD-L1, PVR, CEACAM1, and Galecitn-9. Accordingly, through co-culture between the above-mentioned lung cancer cell line and highly enriched T cells, it is possible to confirm the time when the secretion ability of cytokines can be maximized. At this time, highly enriched T cells refer to PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells selected by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention.
이에, 도 4b를 참조하면, 공동 배양 기간에 따른 고농축화된 T세포의 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. 이때, 공동 배양 기간에 따른 싸이토카인 분비량을 확인하기 위하여, 본 발명의 고농축화된 T세포(PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포)에 폐암 세포주(PD-L1+CEACAM1+PVR+), α-CD3 및 α-CD28을 처리하여 공동 배양하였다. 나아가, α-CD3 및 α-CD28는 CD8+ T세포를 활성화시키기 위한 자극 인자로서, T세포 수용체를 자극하여 싸이토카인의 분비량을 증진시키고, 세포의 사멸을 억제할 수 있으며, 공동 배양 시 첨가되는 각각의 양은, α-CD3 10 내지 30 ㎍/ml 및 α-CD28 3 내지 7 ㎍/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 α-CD3 20 ㎍/ml 및 α-CD28 5 ㎍/ml일 수 있다.Accordingly, referring to Figure 4b, the results of the cytokine secretion amount of highly enriched T cells according to the co-culture period are shown. At this time, in order to confirm the amount of cytokine secretion according to the co-culture period, the highly enriched T cells of the present invention (PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells) were mixed with lung cancer cell line (PD-L1+CEACAM1+PVR+), α-CD3 and α-CD28 were treated and co-cultured. Furthermore, α-CD3 and α-CD28 are stimulating factors for activating CD8+ T cells, and can stimulate T cell receptors to enhance the secretion of cytokines and inhibit cell death, and each added during co-culture The amount may be 10 to 30 μg/ml of α-CD3 and 3 to 7 μg/ml of α-CD28, but is not limited thereto, and is preferably 20 μg/ml of α-CD3 and 5 μg/ml of α-CD28. You can.
먼저, 도 4b의 (a)를 참조하면, 공동 배양 0일째에는 제 1 사분면, 제 2사분면 및 제 4사분면의 싸이토카인 분비량이 거의 관찰되지 않은 것으로 나타나나, 배양 기간이 경과될수록 제 1사분면, 제 2사분면 및 제 4사분면의 싸이토카인의 분비량이 증가되는 것으로 나타난다. First, referring to (a) of Figure 4b, on day 0 of co-culture, the amount of cytokine secretion in the first, second, and fourth quadrants was hardly observed, but as the culture period elapsed, the secretion of cytokines in the first, second, and fourth quadrants was observed. It appears that the secretion of cytokines in the 2nd and 4th quadrants increases.
보다 구체적으로, 도 4b의 (b)를 참조하면, 도 4b의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. IFN-γ를 분비하는 CD8+ T세포 수는 공동 배양 14 및 20일째에 가장 많은 것으로 나타나며, 이때, IFN-γ를 분비하는 CD8+ T세포가 차지하는 비율은 전체 T세포에 대하여 약 30%인 것을 나타난다.More specifically, referring to (b) of FIG. 4B, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 4B is shown. The number of CD8+ T cells secreting IFN-γ appears to be highest on days 14 and 20 of co-culture, and at this time, the proportion of CD8+ T cells secreting IFN-γ is approximately 30% of all T cells.
나아가, TNF-α를 분비하는 CD8+ T세포 수는 공동 배양 14일째에 가장 많은 것으로 나타나며, 이때, IFN-γ를 분비하는 CD8+ T세포가 차지하는 비율은 전체 T세포에 대하여 약 43%인 것을 나타난다.Furthermore, the number of CD8+ T cells secreting TNF-α appears to be highest on the 14th day of co-culture, and at this time, the proportion of CD8+ T cells secreting IFN-γ is approximately 43% of all T cells.
더 나아가, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD8+ T세포 수는 공동 배양 14 및 20일째에 가장 많은 것으로 나타나며, 이때, IFN-γ및 TNF-α를 분비하는 CD8+ T세포가 차지하는 비율은 전체 T세포에 대하여 약 25%인 것을 나타난다.Furthermore, the number of CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α appears to be highest on days 14 and 20 of co-culture, and at this time, the proportion of CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α accounts for the total. It appears to be about 25% for T cells.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 고농축화된 T세포는 공동 배양 시 14일 내지 20일째에 가장 많은 싸이토카인을 분비하는 것으로 나타남에 따라, 면역 관문 저해제의 뚜렷한 효과를 확인하기 위한 암 세포주와의 공동 배양 기간은 싸이토카인의 분비량이 가장 많이 분비될 수 있는 14 내지 20일 중 적어도 하나의 기간일 수 있다.Accordingly, the highly enriched T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention were found to secrete the most cytokines on days 14 to 20 during co-culture, showing a distinct effect of the immune checkpoint inhibitor. The co-culture period with the cancer cell line to confirm may be at least one period of 14 to 20 days when the highest amount of cytokines can be secreted.
고농축화된 T세포의 선별(gating)에 따른 싸이토카인 분비 차이 확인Confirmation of differences in cytokine secretion according to gating of highly enriched T cells
이하에서는 도 5a 내지 6d를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 T세포의 게이팅에 따른 싸이토카인 분비에 대하여 설명하도록 한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 5A to 6D, cytokine secretion according to gating of T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention will be described.
먼저, 도 5a 및 5b를 참조하면, 공동 배양 시 CD8+ T세포의 면역 관문 수용체 발현에 따른 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. 이때, 면역 관문 수용체 발현에 따른 싸이토카인 분비량을 확인하기 위하여, 도 5a에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포 중 PD-1이 발현되지 않은 CD8+ T세포가 사용되었으며, 도 5b에서는 고농축화된 T세포 중 PD-1이 발현된 CD8+ T세포가 사용되었다. 나아가, 폐암 세포주로는 PD-L1, CEACAM1 및 PVR이 모두 발현된 폐암 세포주(PD-L1+CEACAM1+PVR+)가 사용되었다.First, referring to Figures 5a and 5b, the results of the amount of cytokine secretion according to the expression of immune checkpoint receptors of CD8 + T cells during co-culture are shown. At this time, in order to confirm the amount of cytokine secretion according to the expression of immune checkpoint receptors, Figure 5a shows CD8 + T cells that do not express PD-1 among T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention. was used, and in Figure 5b, among the highly enriched T cells, CD8+ T cells expressing PD-1 were used. Furthermore, a lung cancer cell line expressing PD-L1, CEACAM1, and PVR (PD-L1+CEACAM1+PVR+) was used.
먼저, 도 5a의 (a)를 참조하면, 면연 관문 수용체인 TIM-3 또는 TIGIT의 발현이 많아질수록 싸이토카인의 분비량이 감소하는 것으로 나타나다.First, referring to (a) of FIG. 5A, it appears that as the expression of TIM-3 or TIGIT, an immune checkpoint receptor, increases, the amount of cytokine secretion decreases.
보다 구체적으로, 도 5a의 (b)를 참조하면, 도 5a의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. IFN-γ를 분비하는 PD-1-CD8+ T세포 수는 TIM-3 및 TIGIT 발현이 모두 음성(-)인 경우, 가장 많은 것으로 나타나며, 이때의 IFN-γ를 분비하는 TIM-3-TIGIT-PD-1-CD8+ T세포 수는 전체 PD-1-CD8+ T세포에 대하여 약 50 %인 것으로 나타난다.More specifically, referring to (b) of FIG. 5A, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 5A is shown. The number of PD-1-CD8+ T cells secreting IFN-γ is highest when both TIM-3 and TIGIT expressions are negative (-), and in this case, TIM-3-TIGIT-PD secreting IFN-γ The number of -1-CD8+ T cells appears to be approximately 50% of the total PD-1-CD8+ T cells.
반면에, IFN-γ를 분비하며 TIM-3 및 TIGIT 발현이 모두 양성(+)인 PD-1-CD8+ T세포(TIM-3+TIGIT+PD-1-CD8+ T세포) 수는 전체 PD-1-CD8+ T세포에 대하여 약 10 %로 가장 적은 것으로 나타난다. On the other hand, the number of PD-1-CD8+ T cells (TIM-3+TIGIT+PD-1-CD8+ T cells) that secrete IFN-γ and have positive (+) expression of both TIM-3 and TIGIT is the total PD-1 -CD8+ T cells appear to be the least at about 10%.
또한, IFN-γ 및 TNF-α 모두를 분비하는 TIM-3-TIGIT-PD-1-CD8+ T세포 수는 전술한 바와 마찬가지로, 전체 PD-1-CD8+ T세포에 대하여 약 42 %로 가장 많은 것으로 나타나며, TIM-3+TIGIT+PD-1-CD8+ T세포 수는 전체 PD-1-CD8+ T세포에 대하여 약 8 %로 가장 적은 것으로 나타난다. In addition, as described above, the number of TIM-3-TIGIT-PD-1-CD8+ T cells secreting both IFN-γ and TNF-α was the largest at approximately 42% of all PD-1-CD8+ T cells. It appears that the number of TIM-3+TIGIT+PD-1-CD8+ T cells is the lowest at about 8% of the total PD-1-CD8+ T cells.
나아가, 도 5b의 (a)를 참조하면, 4c와 마찬가지로, 면연 관문 수용체인 TIM-3 또는 TIGIT의 발현이 많아질수록 싸이토카인의 분비량이 감소하는 것으로 나타나다.Furthermore, referring to (a) of Figure 5b, similar to 4c, it appears that as the expression of TIM-3 or TIGIT, an immune checkpoint receptor, increases, the secretion amount of cytokines decreases.
보다 구체적으로, 도 5b의 (b)를 참조하면, 도 5b의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. IFN-γ를 분비하는 PD-1+CD8+ T세포 수는 TIM-3 및 TIGIT 발현이 모두 음성(-)인 경우, 가장 많은 것으로 나타나며, 이때의 IFN-γ를 분비하는 TIM-3-TIGIT-PD-1+CD8+ T세포 수는 전체 PD-1+CD8+ T세포에 대하여 약 63 %인 것으로 나타난다.More specifically, referring to (b) of FIG. 5B, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 5B is shown. The number of PD-1+CD8+ T cells secreting IFN-γ is highest when both TIM-3 and TIGIT expressions are negative (-), and in this case, TIM-3-TIGIT-PD secreting IFN-γ The number of -1+CD8+ T cells appears to be approximately 63% of the total PD-1+CD8+ T cells.
반면에, IFN-γ를 분비하며 TIM-3 및 TIGIT 발현이 모두 양성(+)인 PD-1-CD8+ T세포(TIM-3+TIGIT+PD-1+CD8+ T세포) 수는 전체 PD-1+CD8+ T세포에 대하여 약 20 %로 가장 적은 것으로 나타난다. On the other hand, the number of PD-1-CD8+ T cells (TIM-3+TIGIT+PD-1+CD8+ T cells) that secrete IFN-γ and have positive (+) expression of both TIM-3 and TIGIT is the total number of PD-1+ T cells. +CD8+ T cells appear to be the least at about 20%.
나아가, IFN-γ 및 TNF-α 모두를 분비하는 TIM-3-TIGIT-PD-1+CD8+ T세포 수는 전술한 바와 마찬가지로, 전체 PD-1+CD8+ T세포에 대하여 약 59 %로 가장 많은 것으로 나타나며, TIM-3+TIGIT+PD-1+CD8+ T세포 수는 전체 PD-1+CD8+ T세포에 대하여 약 18 %로 가장 적은 것으로 나타난다. Furthermore, as described above, the number of TIM-3-TIGIT-PD-1+CD8+ T cells secreting both IFN-γ and TNF-α was the largest at approximately 59% of all PD-1+CD8+ T cells. It appears that the number of TIM-3+TIGIT+PD-1+CD8+ T cells is the lowest at about 18% of the total PD-1+CD8+ T cells.
결국, CD8+ T세포는 표적 수용체가 차단되어도, 이외의 면역 관문 수용체 즉, PD-1, TIM-3 및 TIGIT 중 적어도 하나와 암 세포주의 면역 관문 리간드와의 결합에 의하여, 억제 신호가 전달되어 싸이토카인의 분비량이 감소될 수 있음에 따라, 표적 수용체 이외의 결합을 제거하여 표적 수용체 저해제를 확인하는 것이 보다 뚜렷한 효과를 관찰할 수 있다. Ultimately, even if the target receptor is blocked, CD8+ T cells receive an inhibitory signal by binding to at least one of the other immune checkpoint receptors, namely PD-1, TIM-3, and TIGIT, and the immune checkpoint ligand of the cancer cell line, producing cytokines. As the secretion amount can be reduced, a more distinct effect can be observed by identifying the target receptor inhibitor by removing binding other than the target receptor.
이에, 이하에서는, 도 6a 내지 6d를 참조하여, CD8+ T세포의 선별 즉, 표적하고자 하는 면역 관문 수용체를 발현하는 T세포의 게이팅(gating)에 따른 싸이토카인 분비량에 대하여 설명하도록 한다.Accordingly, hereinafter, with reference to FIGS. 6A to 6D, the amount of cytokine secretion according to the selection of CD8+ T cells, that is, the gating of T cells expressing the immune checkpoint receptor to be targeted, will be described.
먼저, 도 6a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 게이팅 방법을 예시적으로 도시한 것이다. First, referring to FIG. 6A, an exemplary gating method in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention is shown.
Isotype control을 처리하는 경우, 일반적으로 사용되는 staining 항체로 PD-1 및 TIM-3가 염색될 수 있다. 그러나, 차단 항체(blocking antibody)를 처리할 경우, 일반적으로 사용되는 staining 항체와 경쟁(competition)을 하게 됨에 따라, PD-1 및 TIM-3가 염색되지 않을 수 있다. 즉, 차단 항체에 의하여 일반적으로 사용되는 staining 항체가 결합되지 못하여 원하고자 하는 표적 수용체에 대한 발현 확인이 어려울 수 있다.When processing isotype control, PD-1 and TIM-3 can be stained with commonly used staining antibodies. However, when treated with a blocking antibody, PD-1 and TIM-3 may not be stained due to competition with commonly used staining antibodies. In other words, it may be difficult to confirm the expression of the desired target receptor because the commonly used staining antibody cannot bind to the blocking antibody.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서는 차단 항체 즉, 면역 관문 저해제에 대한 항체를 표적할 수 있는 2차 항체(secondary antibody)를 사용하여, 표적하고자 하는 수용체의 발현을 확인하고, 이를 게이팅할 수 있다.Accordingly, in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention, a blocking antibody, that is, a secondary antibody capable of targeting an antibody against the immune checkpoint inhibitor, is used to suppress the expression of the receptor to be targeted. You can check and gate it.
도 6b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 고농축화된 T세포의 PD-1 게이팅에 따른 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. 이때, PD-1을 발현하는 CD8+ T세포는 항 PD-1 항체(αPD-1 antibody)를 이용하여 게이팅되었다. Referring to Figure 6b, the results of the amount of cytokine secretion according to PD-1 gating of highly enriched T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention are shown. At this time, CD8+ T cells expressing PD-1 were gated using anti-PD-1 antibody (αPD-1 antibody).
먼저, 도 6b의 (a)를 참조하면, 전체 CD8+ T세포의 경우, PD-1 항체 처리에 따른 싸이토카인 변화 즉, 제 1사분면, 2사분면 및 4사분면에 대한 차이가 없는 것으로 나타난다. 그러나, 항 PD-1 항체를 이용하여, PD-1을 발현하는 CD8+ T세포(PD-1+CD8+ T세포)만을 게이팅한 경우, 제 1사분면, 2사분면 및 4사분면의 싸이토카인을 분비하는 세포가 증가하는 것으로 나타난다.First, referring to (a) of Figure 6b, in the case of total CD8+ T cells, there appears to be no difference in cytokine changes according to PD-1 antibody treatment, that is, in the first, second, and fourth quadrants. However, when only CD8+ T cells expressing PD-1 (PD-1+CD8+ T cells) were gated using an anti-PD-1 antibody, cells secreting cytokines in the first, second, and fourth quadrants were appears to be increasing.
보다 구체적으로, 도 6b의 (b)를 참조하면, 도 6b의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. 전체 CD8+ T세포에서는 PD-1 항체를 처리할 경우, IFN-γ를 분비하는 세포 수의 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.51). 그러나, 항 PD-1 항체를 이용하여 게이팅된 PD-1+CD8+ T세포에서는 PD-1 항체를 처리할 경우, IFN-γ를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.01). More specifically, referring to (b) in FIG. 6B, a graphical representation of the results for (a) in FIG. 6B is shown. When total CD8+ T cells were treated with PD-1 antibody, there appeared to be no change in the number of cells secreting IFN-γ (p=0.51). However, in PD-1+CD8+ T cells gated using anti-PD-1 antibody, when treated with PD-1 antibody, the number of cells secreting IFN-γ significantly increased (p<0.01).
또한, 전체 CD8+ T세포에서는 PD-1 항체를 처리할 경우, TNF-α를 분비하는 세포 수의 증가가 없는 것으로 나타난다. 그러나, 항 PD-1 항체를 이용하여 게이팅된 PD-1+CD8+ T세포에서는 PD-1 항체를 처리할 경우, TNF-α를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.01).In addition, when total CD8+ T cells are treated with PD-1 antibody, there appears to be no increase in the number of cells secreting TNF-α. However, in PD-1+CD8+ T cells gated using anti-PD-1 antibody, when treated with PD-1 antibody, the number of cells secreting TNF-α significantly increased (p<0.01).
또한, 전체 CD8+ T세포에서는 PD-1 항체를 처리할 경우, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 세포 수의 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.23). 그러나, 항 PD-1 항체를 이용하여 게이팅된 PD-1+CD8+ T세포에서는 PD-1 항체를 처리할 경우, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.01).In addition, when total CD8+ T cells were treated with PD-1 antibody, there appeared to be no change in the number of cells secreting IFN-γ and TNF-α (p=0.23). However, in PD-1+CD8+ T cells gated using anti-PD-1 antibody, when treated with PD-1 antibody, the number of cells secreting IFN-γ and TNF-α appears to significantly increase (p< 0.01).
즉, CD8+ T세포에서는 PD-1 항체의 처리에 따른 싸이토카인의 분비량 차이가 나타나지 않으나, 게이팅을 통하여 선별된 PD-1+CD8+ T세포에서는 PD-1 항체의 처리에 따른 싸이토카인의 분비량 차이를 확인할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 선별된 PD-1+CD8+ T세포는 다양한 PD-1 저해제에 대한 효과를 보다 명확하게 확인할 수 있다.In other words, in CD8+ T cells, there is no difference in the amount of cytokine secretion due to treatment with PD-1 antibody, but in PD-1+CD8+ T cells selected through gating, a difference in cytokine secretion amount according to treatment with PD-1 antibody can be confirmed. there is. Accordingly, the effects of PD-1+CD8+ T cells selected by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention on various PD-1 inhibitors can be confirmed more clearly.
도 6c를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 고농축화된 T세포의 TIM-3 게이팅에 따른 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. 이때, TIM-3을 발현하는 CD8+ T세포는 항 TIM-3 항체(αTIM-3 antibody)를 이용하여 게이팅되었다. Referring to FIG. 6C, the results of the amount of cytokine secretion according to TIM-3 gating of highly enriched T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention are shown. At this time, CD8+ T cells expressing TIM-3 were gated using anti-TIM-3 antibody (αTIM-3 antibody).
먼저, 도 6c의 (a)를 참조하면, 전체 CD8+ T세포의 경우, TIM-3 항체 처리에 따른 싸이토카인 변화 즉, 제 1사분면 및 4사분면에 대한 차이가 없는 것으로 나타난다. 그러나, 항 TIM-3 항체를 이용하여, TIM-3을 발현하는 CD8+ T세포(TIM-3+CD8+ T세포)만을 게이팅한 경우, 제 1사분면, 2사분면 및 4사분면의 싸이토카인을 분비하는 세포가 증가하는 것으로 나타난다.First, referring to (a) of Figure 6c, in the case of total CD8+ T cells, there appears to be no difference in cytokine changes according to TIM-3 antibody treatment, that is, in the first and fourth quadrants. However, when only CD8+ T cells expressing TIM-3 (TIM-3+CD8+ T cells) were gated using an anti-TIM-3 antibody, cells secreting cytokines in the first, second, and fourth quadrants were appears to be increasing.
보다 구체적으로, 도 6c의 (b)를 참조하면, 도 6c의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. 전체 CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체를 처리할 경우, IFN-γ를 분비하는 세포 수의 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.74). 그러나, 항 TIM-3 항체를 이용하여 게이팅된 TIM-3+CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체를 처리할 경우, IFN-γ를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.001). More specifically, referring to (b) of FIG. 6C, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 6C is shown. When total CD8+ T cells were treated with TIM-3 antibody, there appeared to be no change in the number of cells secreting IFN-γ (p=0.74). However, when TIM-3+CD8+ T cells gated using anti-TIM-3 antibody were treated with TIM-3 antibody, the number of cells secreting IFN-γ was significantly increased (p<0.001).
또한, 전체 CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체를 처리할 경우, TNF-α를 분비하는 세포 수의 증가 및 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.68). 그러나, 항 TIM-3 항체를 이용하여 게이팅된 TIM-3+CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체를 처리할 경우, TNF-α를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.05).In addition, when total CD8+ T cells were treated with TIM-3 antibody, the number of cells secreting TNF-α showed no increase or change (p=0.68). However, when TIM-3+CD8+ T cells gated using anti-TIM-3 antibody were treated with TIM-3 antibody, the number of cells secreting TNF-α was significantly increased (p<0.05).
또한, 전체 CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체를 처리할 경우, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 세포 수의 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.64). 그러나, 항 TIM-3 항체를 이용하여 게이팅된 TIM-3+CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체를 처리할 경우, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.01).In addition, when total CD8+ T cells were treated with TIM-3 antibody, there appeared to be no change in the number of cells secreting IFN-γ and TNF-α (p=0.64). However, in TIM-3+CD8+ T cells gated using anti-TIM-3 antibody, when treated with TIM-3 antibody, the number of cells secreting IFN-γ and TNF-α significantly increased (p< 0.01).
즉, CD8+ T세포에서는 TIM-3 항체의 처리에 따른 싸이토카인의 분비량 차이가 나타나지 않으나, 게이팅을 통하여 선별된 TIM-3+CD8+ T세포에서는 PD-1 항체의 처리에 따른 싸이토카인의 분비량 차이를 확인할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 선별된 TIM-3+CD8+ T세포는 다양한 TIM-3 저해제에 대한 효과를 보다 명확하게 확인할 수 있다.In other words, there is no difference in the secretion amount of cytokines according to treatment with TIM-3 antibody in CD8+ T cells, but in TIM-3+CD8+ T cells selected through gating, a difference in secretion amount of cytokines according to treatment with PD-1 antibody can be confirmed. there is. Accordingly, the effects of various TIM-3 inhibitors on TIM-3+CD8+ T cells selected by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can be confirmed more clearly.
도 6d를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 고농축화된 T세포의 TIGIT 게이팅에 따른 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. 이때, TIGIT을 발현하는 CD8+ T세포는 항 TIGIT 항체(αTIGIT antibody)를 이용하여 게이팅되었다. Referring to FIG. 6D, the results of the amount of cytokine secretion according to TIGIT gating of highly enriched T cells in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention are shown. At this time, CD8+ T cells expressing TIGIT were gated using anti-TIGIT antibody (αTIGIT antibody).
먼저, 도 6d의 (a)를 참조하면, 전체 CD8+ T세포의 경우, TIGIT 항체 처리에 따른 싸이토카인 변화 즉, 제 1사분면, 2사분면 및 4사분면에 대한 차이가 거의 없는 것으로 나타난다. 그러나, 항 TIGIT 항체를 이용하여, TIGIT을 발현하는 CD8+ T세포(TIGIT+CD8+ T세포)만을 게이팅한 경우, 제 1사분면, 2사분면 및 4사분면의 싸이토카인을 분비하는 세포가 증가하는 것으로 나타난다.First, referring to (a) of Figure 6d, in the case of total CD8+ T cells, there appears to be little difference in cytokine changes according to TIGIT antibody treatment, that is, in the first, second, and fourth quadrants. However, when only CD8+ T cells expressing TIGIT (TIGIT+CD8+ T cells) are gated using an anti-TIGIT antibody, cells secreting cytokines in the first, second, and fourth quadrants appear to increase.
보다 구체적으로, 도 6d의 (b)를 참조하면, 도 6d의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. 전체 CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체를 처리할 경우, IFN-γ를 분비하는 세포 수의 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.36). 그러나, 항 TIGIT 항체를 이용하여 게이팅된 TIGIT+CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체를 처리할 경우, IFN-γ를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.01). More specifically, referring to (b) of FIG. 6D, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 6D is shown. When total CD8+ T cells were treated with TIGIT antibody, there appeared to be no change in the number of cells secreting IFN-γ (p=0.36). However, in TIGIT+CD8+ T cells gated using anti-TIGIT antibody, when treated with TIGIT antibody, the number of cells secreting IFN-γ significantly increased (p<0.01).
또한, 전체 CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체를 처리할 경우, TNF-α를 분비하는 세포 수의 증가가 없는 것으로 나타난다(p=0.41). 그러나, 항 TIGIT 항체를 이용하여 게이팅된 TIGIT+CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체를 처리할 경우, TNF-α를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.05).In addition, when total CD8+ T cells were treated with TIGIT antibody, there was no increase in the number of cells secreting TNF-α (p=0.41). However, when TIGIT + CD8 + T cells gated using anti-TIGIT antibody were treated with TIGIT antibody, the number of cells secreting TNF-α was significantly increased (p<0.05).
또한, 전체 CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체를 처리할 경우, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 세포 수의 변화가 없는 것으로 나타난다(p=0.53). 그러나, 항 TIGIT 항체를 이용하여 게이팅된 TIGIT+CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체를 처리할 경우, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타난다(p<0.05).In addition, when total CD8+ T cells were treated with TIGIT antibody, there appeared to be no change in the number of cells secreting IFN-γ and TNF-α (p=0.53). However, in TIGIT+CD8+ T cells gated using an anti-TIGIT antibody, when treated with a TIGIT antibody, the number of cells secreting IFN-γ and TNF-α appears to significantly increase (p<0.05).
즉, CD8+ T세포에서는 TIGIT 항체의 처리에 따른 싸이토카인의 분비량 차이가 나타나지 않으나, 게이팅을 통하여 선별된 TIGIT+CD8+ T세포에서는 PD-1 항체의 처리에 따른 싸이토카인의 분비량 차이를 확인할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 선별된 TIGIT+CD8+ T세포는 다양한 TIGIT 저해제에 대한 효과를 보다 명확하게 확인할 수 있다.In other words, there is no difference in the secretion amount of cytokines according to treatment with TIGIT antibody in CD8+ T cells, but a difference in secretion amount of cytokines according to treatment with PD-1 antibody can be confirmed in TIGIT+CD8+ T cells selected through gating. Accordingly, the effects of various TIGIT inhibitors on TIGIT+CD8+ T cells selected by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can be confirmed more clearly.
이상의 결과에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 고농축화된 T세포는 표적하고자 하는 수용체만을 발현하는 T세포를 선별하여 제공할 수 있음에 따라, 보다 명확한 싸이토카인의 분비량을 확인할 수 있다. 이때, T세포의 게이팅은 PD-1, TIM-1 및 TIGIT 중 적어도 하나의 면역 관문 수용체에 의하여 수행되었지만, 이에 제한되는 것은 아니며, T세포에서 발현될 수 있는 다양한 면역 관문 수용체를 모두 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, T세포의 게이팅에 이용될 수 있는 면역 관문 수용체는 PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2 및 ILT3으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to the above results, highly enriched T cells according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention can select and provide T cells that express only the receptor to be targeted, thereby providing more specific cytokines. The amount of secretion can be checked. At this time, the gating of T cells was performed by at least one immune checkpoint receptor among PD-1, TIM-1, and TIGIT, but is not limited to this and was performed using all of the various immune checkpoint receptors that can be expressed in T cells. It can be. For example, immune checkpoint receptors that can be used for gating of T cells include PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2, and ILT3. It may be at least one of the group consisting of, but is not limited to this.
고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비 차이 확인Confirmation of differences in cytokine secretion according to highly enriched T cells and knock out cancer cell lines
먼저, 도 7a 및 7b를 참조하여, 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비 확인을 위하여 결정된 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 대하여 설명하도록 한다.First, with reference to FIGS. 7A and 7B, the highly enriched T cells and knock out cancer cell lines determined to confirm cytokine secretion according to the highly enriched T cells and knock out cancer cell lines will be described.
도 7a을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 녹아웃 암 세포주의 예시도가 도시된다. Referring to FIG. 7A, an exemplary diagram of a knockout cancer cell line according to the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention is shown.
암 세포주는 HCC4006(Human lung adenocarcinoma cell line, HCC) 폐암 세포주가 사용되었으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역 관문 리간드를 발현할 수 있는 다양한 암 종류의 세포주를 모두 포함하여 사용할 수 있다. The cancer cell line used was HCC4006 (Human lung adenocarcinoma cell line, HCC), but it is not limited to this, and cell lines of various cancer types that can express immune checkpoint ligands can be used.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 녹아웃 암 세포주는 싸이토카인의 분비량의 차이를 분명하게 확인하기 위하여, 면역 관문 리간드의 발현이 제거될 수 있다. 이때, 암 세포주에서 면역 관문 리간드의 제거는 면역 관문 리간드의 발현에 관여하는 유전자를 녹아웃(knock out)하여 수행될 수 있으며, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 전술한 시스템에 제한되는 것은 아니며, 표적하고자 하는 면역 관문 리간드의 발현을 제거할 수 있는 다양한 유전자 편집 기술을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 기술로서, ZFN(Zinc Finger Nuclease) 및 TALEN(Tranor Activator-Like Effector Nuclease) 등과 같은 다양한 기술이 이용될 수 있다. Furthermore, in order to clearly confirm the difference in the amount of cytokine secretion in the knockout cancer cell line according to the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention, the expression of the immune checkpoint ligand may be removed. At this time, removal of the immune checkpoint ligand from the cancer cell line can be performed by knocking out the gene involved in the expression of the immune checkpoint ligand, and can be performed using the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 system. there is. However, it is not limited to the above-described system, and may include various gene editing technologies that can eliminate the expression of the immune checkpoint ligand to be targeted. For example, as a gene editing technology, various technologies such as Zinc Finger Nuclease (ZFN) and Tranor Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) can be used.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 녹아웃 암 세포주는 전술한 유전자 편집 기술을 이용하여, 면역 관문 리간드의 발현이 조작된 녹아웃 암 세포주이다. 이때, 발현이 제거될 수 있는 면역 관문 리간드는, 암 세포주에서 발현될 수 있는 다양한 면역 관문 리간드를 모두 포함할 수 있으며, 예를 들어, PD-L1, PD-L2, PVR(CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4 및 ALCAM으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. That is, the knockout cancer cell line in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention is a knockout cancer cell line in which the expression of an immune checkpoint ligand has been manipulated using the above-described gene editing technology. At this time, the immune checkpoint ligand whose expression can be eliminated may include all of the various immune checkpoint ligands that can be expressed in cancer cell lines, for example, PD-L1, PD-L2, PVR (CD155), B7- 1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, It may be at least one of the group consisting of TIM-1, TIM-4, and ALCAM, but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 녹아웃 암 세포주는 T세포의 싸이토카인 분비량 증진을 위하여, 공동자극 리간드(co-stimulatory ligand) 또는 싸이토카인(cytokine)과 같은 T세포 자극 인자들을 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포주에서의 공동자극 리간드 및 싸이토카인은 이를 발현시킬 수 있는 유전자가 암 세포주 내에 삽입되어 발현될 수 있다. 이때, 면역 관문 리간드가 녹아웃된 암 세포주에서 발현될 수 있는 공동 자극 리간드는 B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L 및 LIGHT로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 싸이토카인은 TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 및 Oncostatin M으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 공동자극 리간드 및 싸이토카인을 발현시킬 수 있는 유전자는 전술한 유전자 편집 기술을 이용하여, 암 세포주 내로 삽입(Gene insertion)될 수 있으며, 이에 암 세포주에 공동자극 리간드 또는 싸이토카인이 포함(발현)될 수 있다. In addition, the knockout cancer cell line in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention may be stimulated by T cell stimulation such as a co-stimulatory ligand or cytokine in order to enhance the cytokine secretion of T cells. Additional arguments may be included. More specifically, co-stimulatory ligands and cytokines in cancer cell lines can be expressed by inserting genes capable of expressing them into the cancer cell line. At this time, costimulatory ligands that can be expressed in cancer cell lines in which immune checkpoint ligands have been knocked out include B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L, and LIGHT. It may be at least one of the group consisting of, but is not limited to, cytokines include TNF-α, TNF-βIFN-α, IFN-βIFN-γα, IL-1βIL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, Can be at least one of the group consisting of IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 and Oncostatin M However, it is not limited to this. Furthermore, genes capable of expressing co-stimulatory ligands and cytokines can be inserted into cancer cell lines using the above-described gene editing technology, so that the cancer cell lines can contain (express) co-stimulatory ligands or cytokines. You can.
이에, wild type의 폐암 세포주는 면역 관문 리간드인 PD-L1, PVR, CEACAM1 및 Galecitn-9을 모두 발한혀고 있는 것으로 나타나나, 본 발명의 녹아웃 암 세포주는 PD-L1(-) 및/또는 PVR(-)에 대한 발현이 없는 것으로 나타난다. 즉, 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비 차이 확인을 위하여 도 8a 및 8b에서 사용될 암 세포주는 면역 관문 리간드가 모두 발현되어 있는 WT의 폐암 세포주(HCC4006), 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 녹아웃 암 세포주인 PD-L1-/- 폐암 세포주, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주이다.Accordingly, the wild type lung cancer cell line appears to express all of the immune checkpoint ligands PD-L1, PVR, CEACAM1, and Galecitn-9, but the knockout cancer cell line of the present invention expresses PD-L1(-) and/or PVR ( It appears that there is no expression for -). That is, in order to confirm differences in cytokine secretion according to highly enriched T cells and knock out cancer cell lines, the cancer cell line to be used in FIGS. 8A and 8B is a WT lung cancer cell line (HCC4006) in which all immune checkpoint ligands are expressed, according to the present invention. PD-L1-/- lung cancer cell line, PVR-/- lung cancer cell line, and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, which are knockout cancer cell lines in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to one embodiment.
결국, 녹아웃 암 세포주와 고농축화된 T세포와의 공동 배양(co-culture)을 통하여, 싸이토카인의 분비능이 가장 극대화될 수 있는 녹아웃 암 세포주를 확인할 수 있다. Ultimately, through co-culture between the knockout cancer cell line and highly enriched T cells, the knockout cancer cell line that can maximize the cytokine secretion ability can be identified.
도 7b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 고농축화 T세포의 예시도가 도시된다. Referring to FIG. 7B, an illustration of highly enriched T cells according to the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention is shown.
본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포는 다양한 면역 관문 수용체를 포함할 수 있으나, 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비 차이 확인을 위하여, 특정 면역 관문 수용체를 발현하는 T세포를 선별(gating)할 수 있다. T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention may contain various immune checkpoint receptors, but differences in cytokine secretion depending on highly enriched T cells and knock out cancer cell lines For confirmation, T cells expressing specific immune checkpoint receptors can be gated.
예를 들어, TIM-3는 세포 면역 반응을 조절하는 세포막 분자로서, T세포 활성에 의하여 증가하며 단핵구에서는 항상 발현될 수 있다. 나아가, TIM-3와 결합할 수 있는 면역 관문 리간드는 다수 존재하며, 이 중 가장 우세한(dominant) 면역 관문 리간드가 명확하지 않아 특정 면역 관문 리간드를 제거하여도, 밝혀지지 않은 리간드에 의한 억제 신호를 차단하기 어려울 수 있다.For example, TIM-3 is a cell membrane molecule that regulates cellular immune responses. It increases with T cell activity and can always be expressed in monocytes. Furthermore, there are many immune checkpoint ligands that can bind to TIM-3, and the most dominant immune checkpoint ligand among them is not clear, so even if a specific immune checkpoint ligand is removed, the inhibitory signal caused by the unidentified ligand is not present. Can be difficult to block.
이에, 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비 차이 확인을 위하여, TIM3의 발현에 기초하여 선별한 다음, 이 중 표적하고자 하는 수용체 즉, 도 7a에서의 암 세포주의 리간드에 대응하는 PD-1 및 TIGIT을 발현하는 T세포를 선별할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따라, 이에 대응하는 면역 관문 수용체를 발현하는 T세포가 선별될 수 있다. 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축화된 T세포 중 TIM-3을 발현하는 CD8+ T세포(TIM-3+CD8+ T세포)는 82 %를 차지하는 것으로 나타나며, 전술한 TIM-3+CD8+ T세포 중 PD-1 및 TIGIT을 동시에 더 발현하는 세포(PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포)는 13 %를 차지하는 것으로 나타난다.Accordingly, in order to confirm differences in cytokine secretion according to highly enriched T cells and knock-out cancer cell lines, selection was performed based on the expression of TIM3, and then the receptor to be targeted, that is, the ligand of the cancer cell line in Figure 7a. T cells expressing PD-1 and TIGIT corresponding to can be selected. However, the method is not limited thereto, and depending on the knock out cancer cell line, T cells expressing the corresponding immune checkpoint receptor may be selected. In this regard, among the T cells highly enriched by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention, CD8+ T cells expressing TIM-3 (TIM-3+CD8+ T cells) appear to account for 82%. , Among the aforementioned TIM-3+CD8+ T cells, cells that simultaneously express PD-1 and TIGIT (PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells) appear to account for 13%.
이에, 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비 차이 확인을 위하여, TIM-3+CD8+ T세포 및 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포가 선별(gating)될 수 있다. 이하에서는 도 8a 내지 8b를 참조하여, 전술한 과정에 의하여 결정된 고농축화된 T세포 및 녹아웃(knock out) 암 세포주에 따른 싸이토카인 분비에 대하여 설명하도록 한다.Therefore, in order to confirm differences in cytokine secretion according to highly enriched T cells and knock out cancer cell lines, TIM-3+CD8+ T cells and PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells were selected (gating). It can be. Hereinafter, with reference to FIGS. 8A to 8B, cytokine secretion according to highly enriched T cells and knockout cancer cell lines determined by the above-described process will be described.
도 8a를 참조하면, 녹아웃 암 세포주에 따른 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포의 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. Referring to Figure 8a, the results of the cytokine secretion amount of PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells according to the knockout cancer cell line are shown.
*먼저, 도 8a의 (a)를 참조하면, 면역 관문 리간드의 발현이 적을수록 제 1사분면 및 제 2사분면의 싸이토카인 분비량이 증가되는 것으로 나타난다. *First, referring to (a) of Figure 8a, it appears that as the expression of the immune checkpoint ligand decreases, the amount of cytokine secretion in the first and second quadrants increases.
보다 구체적으로, 도 8a의 (b)를 참조하면, 도 8a의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. IFN-γ를 분비하는 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포 수는 PD-L1-/- 폐암 세포주, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주와 공동 배양을 하였을 경우에 가장 많은 것으로 나타나며, WT와 공동 배양을 하였을 경우에 가장 적은 것으로 나타난다. 이때, PD-L1-/- 폐암 세포주, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주간 IFN-γ를 분비하는 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포 수의 차이는 없는 것으로 나타난다(p=0.25).More specifically, referring to (b) of FIG. 8A, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 8A is shown. The number of PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ was compared with PD-L1-/- lung cancer cell line, PVR-/- lung cancer cell line, and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line. It appears to be the most abundant when co-cultured, and least abundant when co-cultured with WT. At this time, PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ in PD-L1-/- lung cancer cell line, PVR-/- lung cancer cell line, and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line. There appears to be no difference in number (p=0.25).
나아가, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포 수는 전술한 바와 마찬가지로, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주와 공동 배양을 하였을 경우에 가장 많은 것으로 나타나며, WT와 공동 배양을 하였을 경우가 가장 적은 것으로 나타난다. 이때, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주간 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포 수의 차이는 없는 것으로 나타난다(p=0.58).Furthermore, the number of PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α was calculated for PVR-/- lung cancer cell lines and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cells, as described above. It appears to be the most when co-cultured with a cell line, and the least when co-cultured with WT. At this time, there is no difference in the number of PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α between PVR-/- lung cancer cell line and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line. appears to be (p=0.58).
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축된 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T세포는 암 세포주의 면역 관문 리간드가 편집될 경우, 보다 많은 양의 싸이토카인을 분비하는 것으로 나타난다. Accordingly, PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+ T cells highly concentrated by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention produce a greater amount of cytokines when the immune checkpoint ligand of the cancer cell line is edited. appears to be secreted.
나아가, 도 8b를 참조하면, 녹아웃 암 세포주에 따른 TIM-3+CD8+ T세포의 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. Furthermore, referring to Figure 8b, the results of the cytokine secretion amount of TIM-3+CD8+ T cells according to the knockout cancer cell line are shown.
먼저, 도 8b의 (a)를 참조하면, 면역 관문 리간드의 발현이 적을수록 제 1사분면 및 제 2사분면의 싸이토카인 분비량이 증가되는 것으로 나타난다. First, referring to (a) of Figure 8b, it appears that as the expression of the immune checkpoint ligand decreases, the amount of cytokine secretion in the first and second quadrants increases.
보다 구체적으로, 도 8b의 (b)를 참조하면, 도 8b의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. IFN-γ를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수는 PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주와 공동 배양을 하였을 경우에 가장 많은 것으로 나타나며, WT와 공동 배양을 하였을 경우에 가장 적은 것으로 나타난다. 이때, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주간 IFN-γ를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수의 차이는 없는 것으로 나타난다(p=0.19).More specifically, referring to (b) of FIG. 8B, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 8B is shown. The number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ was highest when co-cultured with PVR-/- lung cancer cell line and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, and co-cultured with WT. It appears to be the least when . At this time, there appears to be no difference in the number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ between PVR-/- lung cancer cell lines and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell lines (p=0.19).
나아가, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수는 전술한 바와 마찬가지로, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주와 공동 배양을 하였을 경우에 가장 많은 것으로 나타나며, WT와 공동 배양을 하였을 경우가 가장 적은 것으로 나타난다. 이때, PVR-/- 폐암 세포주 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주간 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수의 차이는 없는 것으로 나타난다(p=0.74).Furthermore, the number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α was determined by co-culture with the PVR-/- lung cancer cell line and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, as described above. It appears to be the most common in some cases, and the least common in cases of co-culture with WT. At this time, there appears to be no difference in the number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α between PVR-/- lung cancer cell line and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line (p=0.74 ).
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 의하여 고농축된 TIM-3+CD8+ T세포는 암 세포주의 면역 관문 리간드가 편집될 경우, 보다 많은 양의 싸이토카인을 분비하는 것으로 나타난다. Accordingly, TIM-3+CD8+ T cells highly concentrated by the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention appear to secrete larger amounts of cytokines when the immune checkpoint ligand of the cancer cell line is edited.
결국, 표적 면역 관문 리간드 이외의 다른 면역 관문 리간드로 인한 억제 신호가 차단됨에 따라, 싸이토카인의 분비량이 증가되어 표적 면역 관문 리간드에 대한 차단 효과를 보다 뚜렷하게 확인할 수 있다. Ultimately, as the inhibitory signal caused by immune checkpoint ligands other than the target immune checkpoint ligand is blocked, the secretion amount of cytokines increases, allowing the blocking effect on the target immune checkpoint ligand to be more clearly confirmed.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서의 녹아웃 암 세포주는 시험하고자 하는 표적 면역 관문 리간드 이외의 면역 관문 리간드 즉, 변수가 제거됨에 따라, 표적 면역 관문 리간드의 차단에 따른 싸이토카인 분비 효과를 명확하게 확인할 수 있다.Accordingly, in the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention, the knockout cancer cell line contains immune checkpoint ligands other than the target immune checkpoint ligand to be tested, that is, variables are removed, resulting in blockage of the target immune checkpoint ligand. The effect of cytokine secretion can be clearly confirmed.
본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에 따른 면역 관문 저해제 평가Evaluation of immune checkpoint inhibitors according to the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention
*이하에서는, 도 9a 내지 10을 참조하여, 전술한 과정의 의하여, 선택된 고농축된 T세포 및 녹아웃 암 세포주에 따른 면역 관문 저해제의 효능 평가에 대하여 설명하도록 한다.*Hereinafter, with reference to FIGS. 9A to 10, the evaluation of the efficacy of immune checkpoint inhibitors according to highly enriched T cells and knockout cancer cell lines selected through the above-described process will be described.
도 9a를 참조하면, TIM-3+CD8+ T세포 및 PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주에 따른 TIM-3 항체에 대한 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. Referring to FIG. 9A, the results of cytokine secretion in response to TIM-3 antibody according to TIM-3+CD8+ T cells and PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell lines are shown.
먼저, 도 9a의 (a)를 참조하면, WT 세포주의 경우, TIM-3 항체 처리에 따른 제 1사분면 및 2사분면의 TIM-3+CD8+ T세포 수의 차이가 거의 없는 것으로 나타난다. 그러나, PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주의 경우, TIM-3 항체 처리에 따른 제 1사분면 및 2 사분면의 TIM-3+CD8+ T세포 수가 증가하는 것으로 나타난다.First, referring to (a) of Figure 9a, in the case of the WT cell line, there appears to be little difference in the number of TIM-3 + CD8 + T cells in the first and second quadrants according to TIM-3 antibody treatment. However, in the case of the PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, the number of TIM-3+CD8+ T cells in the first and second quadrants appears to increase following TIM-3 antibody treatment.
보다 구체적으로, 도 9a의 (b)를 참조하면, 도 9a의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. WT 폐암 세포주에서 TIM-3 항체 처리에 따른 IFN-γ를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수는 isotype control 항체 처리한 그룹과 차이가 거의 없는 것으로 나타난다. 즉, WT 세포주에서는 TIM-3 항체 처리에 따른 싸이토카인 분비량의 차이 즉, TIM-3 면역 관문 차단에 의한 IFN-γ 증가 효과가 관찰되지 않는다.More specifically, referring to (b) of FIG. 9A, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 9A is shown. In the WT lung cancer cell line, the number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ according to TIM-3 antibody treatment showed little difference from the group treated with isotype control antibody. That is, in the WT cell line, no difference in the amount of cytokine secretion due to TIM-3 antibody treatment, that is, the effect of increasing IFN-γ due to TIM-3 immune checkpoint blocking, was observed.
그러나, PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주에서 TIM-3 항체 처리에 따른 IFN-γ를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수는 isotype control 항체 처리한 그룹보다 유의하게 증가한 것으로 나타난다(P<0.01). 즉, PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주에서는 TIM-3 항체 처리에 따른 IFN-γ의 분비량이 증가됨에 따라, TIM-3 면역 관문 차단에 의한 IFN-γ의 분비량에 대한 차이를 분명하게 관찰할 수 있다.However, in the PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, the number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ following TIM-3 antibody treatment was significantly increased compared to the isotype control antibody treatment group ( P<0.01). In other words, in the PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, as the amount of IFN-γ secretion increased due to TIM-3 antibody treatment, a difference in the amount of IFN-γ secretion due to TIM-3 immune checkpoint blockade was evident. can be clearly observed.
이와 마찬가지로, PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주에서 TIM-3 항체 처리에 따른 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 TIM-3+CD8+ T세포 수는 isotype control 항체 처리한 그룹보다 유의하게 증가한 것으로 나타난다(P<0.01). 즉, PD-L1-/-PVR-/- 폐암 세포주에서는 TIM-3 항체 처리에 따른 싸이토카인의 분비량이 증가됨에 따라, TIM-3 면역 관문 차단에 의한 싸이토카인의 분비량에 대한 차이를 분명하게 관찰할 수 있다.Similarly, in PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell lines, the number of TIM-3+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α following TIM-3 antibody treatment was significantly higher than that of the isotype control antibody treated group. It appears to have increased significantly (P<0.01). In other words, in PD-L1-/-PVR-/- lung cancer cell line, as the amount of cytokine secretion increases due to TIM-3 antibody treatment, a difference in the amount of cytokine secretion due to TIM-3 immune checkpoint blockade can be clearly observed. there is.
나아가, 도 9b를 참조하면, TIGIT+CD8+ T세포 및 PD-L1-/- 폐암 세포주에 따른 TIGIT 항체에 대한 싸이토카인 분비량에 대한 결과가 도시된다. Furthermore, referring to Figure 9b, the results of cytokine secretion in response to TIGIT antibody according to TIGIT+CD8+ T cells and PD-L1-/- lung cancer cell lines are shown.
먼저, 도 9b의 (a)를 참조하면, PD-L1-/- 폐암 세포주의 경우, WT 폐암 세포주보다 TIGIT 항체 처리에 따른 제 1사분면, 2 사분면 및 4사분면의 TIGIT+CD8+ T세포 수가 크게 증가하는 것으로 나타난다.First, referring to (a) of Figure 9b, in the case of the PD-L1-/- lung cancer cell line, the number of TIGIT+CD8+ T cells in the first, second, and fourth quadrants increased significantly due to TIGIT antibody treatment compared to the WT lung cancer cell line. It appears that it does.
보다 구체적으로, 도 9b의 (b)를 참조하면, 도 9b의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. PD-L1-/- 폐암 세포주에서 TIGIT 항체 처리에 따른 IFN-γ를 분비하는 TIGIT+CD8+ T세포 수는 WT 폐암 세포주에서 보다 큰 폭을 가지며, isotype control 항체 처리한 그룹보다 유의하게 증가한 것으로 나타난다(P<0.05). 즉, PD-L1-/- 폐암 세포주에서는 TIGIT 항체 처리에 따른 IFN-γ의 분비량이 WT보다 크게 증가됨에 따라, TIGIT 면역 관문 차단에 의한 IFN-γ의 분비량에 대한 차이를 분명하게 관찰할 수 있다.More specifically, referring to (b) of FIG. 9B, a graphical representation of the results for (a) of FIG. 9B is shown. In the PD-L1-/- lung cancer cell line, the number of TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ following TIGIT antibody treatment was greater than that in the WT lung cancer cell line and was significantly increased compared to the isotype control antibody-treated group ( P<0.05). In other words, in the PD-L1-/- lung cancer cell line, the secretion amount of IFN-γ due to TIGIT antibody treatment was significantly increased compared to WT, so a difference in the secretion amount of IFN-γ due to TIGIT immune checkpoint blockade could be clearly observed. .
이와 마찬가지로, PD-L1-/- 폐암 세포주에서 TIGIT 항체 처리에 따른 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 TIGIT+CD8+ T세포 수는 WT 폐암 세포주에서 보다 큰 폭을 가지며, isotype control 항체 처리한 그룹보다 유의하게 증가한 것으로 나타난다(P<0.0001). 즉, PD-L1-/- 폐암 세포주에서는 TIGIT 항체 처리에 따른 싸이토카인의 분비량이 WT보다 크게 증가됨에 따라, TIGIT 면역 관문 차단에 의한 싸이토카인의 분비량에 대한 차이를 분명하게 관찰할 수 있다.Similarly, in the PD-L1-/- lung cancer cell line, the number of TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α following TIGIT antibody treatment was greater than that in the WT lung cancer cell line, and the group treated with the isotype control antibody It appears to have increased significantly (P<0.0001). In other words, in the PD-L1-/- lung cancer cell line, the amount of cytokine secretion due to TIGIT antibody treatment is significantly increased compared to WT, and a difference in the amount of cytokine secretion due to TIGIT immune checkpoint blockade can be clearly observed.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 표적 면역 관문 수용체 및 리간드 이외의 변수 요인을 제거함에 따라, 표적하고자 하는 특정 면역 관문 저해제에 대한 효과 즉, 싸이토카인의 증가를 뚜렷하게 관찰할 수 있다. Accordingly, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention removes variable factors other than the target immune checkpoint receptor and ligand, thereby clearly observing the effect of the specific immune checkpoint inhibitor to be targeted, that is, an increase in cytokines. can do.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법은 증진된 싸이토카인의 분비량을 통하여, 특정 면역 관문 수용체 및 리간드를 표적할 수 있는 저해제에 대한 효과를 정량적으로 뚜렷하게 관찰할 수 있음에 따라, 저해제의 후보 물질 비교 및 선정을 보다 쉽고 용이하게 수행할 수 있다.Ultimately, the screening method for immune checkpoint inhibitors according to an embodiment of the present invention allows the effect of inhibitors that can target specific immune checkpoint receptors and ligands to be clearly observed quantitatively through the increased secretion of cytokines. , comparison and selection of inhibitor candidates can be performed more easily and easily.
한편, 도 10을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법에서 공동 배양에 의한 면역 관문 수용체 및 리간드 간의 직접적인(direct) 상호작용 검증에 대한 결과가 도시된다. Meanwhile, referring to FIG. 10, the results of verification of direct interaction between an immune checkpoint receptor and a ligand by co-culture in the screening method for an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention are shown.
먼저, 도 10의 (a)를 참조하면, TIGIT 항체를 처리한 경우, WT 폐암 세포주에서는 제 1사분면의 TIGIT+CD8+ T세포 수가 증가하는 것으로 나타나나, PVR-/- 폐암 세포주에서는 TIGIT+CD8+ T세포 수의 차이가 없는 것으로 나타난다. First, referring to (a) of Figure 10, when treated with TIGIT antibody, the number of TIGIT+CD8+ T cells in the first quadrant appears to increase in the WT lung cancer cell line, but TIGIT+CD8+ T cells in the PVR-/- lung cancer cell line. There appears to be no difference in cell number.
보다 구체적으로, 도 10의 (b)를 참조하면, 도 10의 (a)에 대한 결과를 그래프로 도시한 결과가 도시된다. TIGIT 항체를 처리한 경우, WT 폐암 세포주에서는 IFN-γ를 분비하는 TIGIT+CD8+ T세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타나나(p<0.01), PVR-/- 폐암 세포주에서는 IFN-γ를 분비하는 TIGIT+CD8+ T세포 수의 차이가 없는 것으로 나타난다(p=0.39). More specifically, referring to Figure 10(b), a graphical representation of the results for Figure 10(a) is shown. When treated with TIGIT antibody, the number of TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ was significantly increased in the WT lung cancer cell line (p<0.01), but in the PVR-/- lung cancer cell line, TIGIT secreting IFN-γ There appears to be no difference in the number of +CD8+ T cells (p=0.39).
나아가, TIGIT 항체를 처리한 경우, WT 폐암 세포주에서는 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 TIGIT+CD8+ T세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타나나(p<0.01), PVR-/- 폐암 세포주에서는 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 TIGIT+CD8+ T세포 수의 차이가 없는 것으로 나타난다(p=0.33). Furthermore, when treated with TIGIT antibody, the number of TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α was significantly increased in the WT lung cancer cell line (p<0.01), but in the PVR-/- lung cancer cell line, the number of TIGIT+CD8+ T cells secreting IFN-γ and TNF-α increased significantly (p<0.01). There appears to be no difference in the number of TIGIT+CD8+ T cells secreting -γ and TNF-α (p=0.33).
즉, CD8+ T세포의 면역 관문 수용체 TIGIT과 직접적으로 상호작용하는 면역 관문 리간드 PVR이 폐암 세포주에서 제거됨에 따라, 이를 표적으로 하는 항체 즉, 면역 관문 저해제에 대한 효능이 관찰되지 않는 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 폐암 세포주는 특정 면역 관문 리간드의 발현이 제거될 수 있음에 따라, 면역 관문 저해제의 효과의 검증뿐만 아니라, 다양한 바이오 마커를 확인할 수 있다. In other words, as the immune checkpoint ligand PVR, which directly interacts with the immune checkpoint receptor TIGIT of CD8+ T cells, is removed from lung cancer cell lines, the efficacy of antibodies targeting it, that is, immune checkpoint inhibitors, is not observed. Accordingly, the lung cancer cell line of the present invention can eliminate the expression of a specific immune checkpoint ligand, allowing not only verification of the effect of the immune checkpoint inhibitor but also confirmation of various biomarkers.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and may be modified and implemented in various ways without departing from the technical spirit of the present invention. Accordingly, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention, but rather to explain it, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be interpreted in accordance with the claims below, and all technical ideas within the equivalent scope should be construed as being included in the scope of rights of the present invention.
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Claims (21)
농축된 상기 T세포에 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitors)를 처리하는 단계;
면역 관문 저해제 처리된 상기 T세포와 측정하고자 하는 표적 면역 관문 리간드를 제외한 불특정 다수의 면역 관문 리간드(immune checkpoint ligands)에 대한 유전자가 녹아웃(knock-out)된 암 세포주를 혼합하여 제 2 배양하는 단계, 및
제 2 배양된 상기 T세포를 면역 관문 수용체(immune checkpoint receptor) 발현에 따라 게이팅(gating)하는 단계를 포함하는, 제 2 배양된 상기 T세포의 싸이토카인 분비량을 측정하는 단계를 포함하고,
상기 면역 관문 수용체는,
PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2 및 ILT3으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나인, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.First culturing a biological sample isolated from an individual to enrich T cells;
Treating the concentrated T cells with immune checkpoint inhibitors;
A second culture step of mixing the T cells treated with an immune checkpoint inhibitor with a cancer cell line in which genes for an unspecified number of immune checkpoint ligands have been knocked out, excluding the target immune checkpoint ligand to be measured. , and
A step of measuring the amount of cytokine secretion of the second cultured T cells, including the step of gating the second cultured T cells according to the expression of an immune checkpoint receptor,
The immune checkpoint receptor is,
A method of screening for an immune checkpoint inhibitor, at least one of the group consisting of PD-1, TIM-3, TIGIT, CTLA-4, 2B4, CD160, BTLA, CD200R, SIRPA, SIRPG, VSIG3, VISTA, TMIGD2 and ILT3.
상기 생물학적 시료는,
말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 골수유래 단핵세포(bone marrow mononuclear cell, BMMC)인, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The biological sample is,
A method for screening immune checkpoint inhibitors, which are peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or bone marrow mononuclear cells (BMMC).
상기 T세포는,
CD8+ T세포를 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The T cells,
Method for screening immune checkpoint inhibitors, including CD8+ T cells.
상기 CD8+ T세포는,
상기 제 1 배양하기 전보다 150배 이상 세포수가 증가된, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 3,
The CD8+ T cells are,
A method for screening an immune checkpoint inhibitor, wherein the cell number is increased by more than 150 times compared to before the first culture.
상기 농축된 T세포는,
PD-1-TIM-3-TIGIT-CD8+T세포, PD-1+TIM-3-TIGIT-CD8+T세포, PD-1-TIM-3+TIGIT-CD8+T세포, PD-1-TIM-3-TIGIT+CD8+T세포, PD-1+TIM-3+TIGIT-CD8+T세포, PD-1+TIM-3-TIGIT+CD8+T세포, PD-1-TIM-3+TIGIT+CD8+T세포 및 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T세포로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The concentrated T cells are,
PD-1-TIM-3-TIGIT-CD8+T cells, PD-1+TIM-3-TIGIT-CD8+T cells, PD-1-TIM-3+TIGIT-CD8+T cells, PD-1-TIM -3-TIGIT+CD8+T cells, PD-1+TIM-3+TIGIT-CD8+T cells, PD-1+TIM-3-TIGIT+CD8+T cells, PD-1-TIM-3+TIGIT+ A method for screening an immune checkpoint inhibitor, comprising at least one of the group consisting of CD8 + T cells and PD-1 + TIM-3 + TIGIT + CD8 + T cells.
상기 PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T세포는,
상기 농축된 T세포 전체에 대하여 9 % 이상 발현되는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 5,
The PD-1+TIM-3+TIGIT+CD8+T cells,
A method of screening for an immune checkpoint inhibitor expressed in more than 9% of all concentrated T cells.
상기 게이팅하는 단계는,
형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 면역자기 세포 분류(immunomagnetic cell sorting: MACS)를 이용하여 수행되는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The gating step is,
A method for screening immune checkpoint inhibitors, performed using fluorescence-activated cell sorting (FACS) or immunomagnetic cell sorting (MACS).
상기 제 1 배양하는 단계는,
상기 생물학적 시료에 제 1 T세포 자극 인자(Tcell activating factor)를 처리하는 단계, 및 상기 자극 인자가 처리된 상기 생물학적 시료를 배양하는 단계를 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The first culturing step is,
A method for screening an immune checkpoint inhibitor, comprising treating the biological sample with a first T cell activating factor, and culturing the biological sample treated with the stimulating factor.
상기 제 1 T세포 자극 인자는,
0.5 내지 2 ㎍/ml의 α-CD3, 5 내지 20 ng/ml의 hIL-2 및 5 내지 20 ng/ml의 hIL-7을 가지는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 8,
The first T cell stimulating factor is,
A method for screening immune checkpoint inhibitors with 0.5 to 2 μg/ml α-CD3, 5 to 20 ng/ml hIL-2, and 5 to 20 ng/ml hIL-7.
상기 배양된 생물학적 시료는,
CD8+ T세포를 90 %이상 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 8,
The cultured biological sample,
Method for screening immune checkpoint inhibitors containing more than 90% of CD8+ T cells.
상기 제 1 배양하는 단계는,
7 내지 21일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행되는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The first culturing step is,
A method of screening for an immune checkpoint inhibitor, performed for at least one period of 7 to 21 days.
상기 암 세포주는,
HCC4006인, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The cancer cell line,
Method for screening an immune checkpoint inhibitor, HCC4006.
상기 암 세포주는,
PD-L1, Galectin-9, CEACAM1 및 PVR으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나의 면역 관문 리간드에 대한 유전자가 녹아웃된, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The cancer cell line,
A method for screening an immune checkpoint inhibitor, wherein the gene for at least one immune checkpoint ligand from the group consisting of PD-L1, Galectin-9, CEACAM1, and PVR is knocked out.
상기 면역 관문 리간드는,
PD-L1, PD-L2, PVR(CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA, VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4 및 ALCAM으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나인, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The immune checkpoint ligand is,
PD-L1, PD-L2, PVR (CD155), B7-1, B7-2, CD112, CD113, Galectin-9, CEACAM1, HMGB1, CD48, HVEM, CD200, CD47, B7-H3, B7-H4, VISTA , a method for screening an immune checkpoint inhibitor, at least one of the group consisting of VSIG3, VSIG4, HHLA2, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A1, BTNL2, TIM-1, TIM-4 and ALCAM.
상기 암 세포주는,
공동자극 리간드 또는 싸이토카인 발현 유전자를 더 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The cancer cell line,
A method for screening an immune checkpoint inhibitor, further comprising a costimulatory ligand or a cytokine expression gene.
상기 공동 자극 리간드는,
B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L 및 LIGHT으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나이며, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 15,
The co-stimulatory ligand is,
At least one of the group consisting of B7-1, B7-2, ICOSL, HHLA2, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, TL1A, CD40, CD155, CD30L and LIGHT, and a method for screening immune checkpoint inhibitors.
상기 면역 관문 저해제는,
항체, 단백질, 올리고 펩타이드, 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹 중 적어도 하나인, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The immune checkpoint inhibitor,
A method for screening an immune checkpoint inhibitor, which is at least one of the group consisting of antibodies, proteins, oligopeptides, organic molecules, polysaccharides, and polynucleotides.
상기 싸이토카인은,
TNF-α, TNF-βα, IFN-βγα, IL-1βIL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 및 Oncostatin M 으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나인, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The cytokines are,
TNF-α, TNF-βα, IFN-βγα, IL-1βIL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, G- A method for screening an immune checkpoint inhibitor, at least one of the group consisting of CSF, M-CSF, SLF, LIF, Eta-1 and Oncostatin M.
제 2 배양하는 단계는,
14 내지 20일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행되는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The second culturing step is,
A method of screening for an immune checkpoint inhibitor, performed for at least one period of 14 to 20 days.
제 2 배양하는 단계는,
혼합된 상기 T세포 및 암 세포주에 제 2 T세포 자극 인자를 처리하는 단계를 포함하는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.According to clause 1,
The second culturing step is,
A method for screening an immune checkpoint inhibitor, comprising treating the mixed T cells and cancer cell lines with a second T cell stimulating factor.
상기 제 2 T세포 자극 인자는,
10 내지 30 ㎍/ml의 α-CD3 및 3 내지 7 ㎍/ml의 α-CD28을 가지는, 면역 관문 저해제의 스크리닝 방법.
According to clause 20,
The second T cell stimulating factor is,
A method of screening for an immune checkpoint inhibitor having 10 to 30 μg/ml of α-CD3 and 3 to 7 μg/ml of α-CD28.
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