KR102592352B1 - 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학조성물 - Google Patents
플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항진균제로 제공하는 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD) 및 7-플루오로인돌 (7-FD)은 식물 종자의 발아 및 세포 독성 없이 잿빛 곰팡이균 균사체의 성장을 억제하고 다른 할로겐화 인돌 또는 인돌과 비교하여 향상된 항진균 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD) 및 7-플루오로인돌 (7-FD)을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항진균제 및 식물 병원균 방제용 조성물로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항진균제로 제공하는 기술에 관한 것이다.
잿빛곰팡이 병균(Botrytis cinerea)은 딸기, 상추, 오이, 가지 등 채소 작물부터 나리, 글라디올러스 등 화훼 작물에 이르기까지 수 많은 작물에 잿빛곰팡이병을 유발하는 곰팡이 균으로 기주범위가 대단히 넓고, 분생포자의 비산에 의하여 계속적인 전염이 가능하여, 현재와 같이 년중 기주작물이 재배되는 형태에서는 병원균의 월동 없이도 식물에 병을 일으키는 균으로서 이 병원균에 의한 작물의 수확에 미치는 피해가 막대하다. 식물 병원균의 경우, 병원균이 생성하는 독소나 효소가 식물체의 침입에 큰 역할을 하는데, 잿빛 곰팡이병균의 침입기작은 오이의 검은별무늬병등과 함께 병원균 침입의 제 1관문이 되는 큐티클층을 분해하는 효소인 큐티나아제를 생성 하여 큐티클층을 분해함으로서 식물체를 침입하는 것으로 알려져 있다. 상기 잿빛곰팡이병은 익는 과일이나 열매 꼭지, 잎, 잎자루 등에 발병하며, 과실을 흑갈색으로 변해 썩게 하므로 상품으로서의 가치가 떨어지는 원인이 되기도 하고 수확 중 병든 과일은 그대로 버려지기 때문에 상업 농장에서 잿빛곰팡이병으로 인한 수량 손실은 수확량의 50%를 넘기도 한다. 또한 운송중이나 판매 중에도 피해를 일으키기 때문에 그 피해액은 예상을 훨씬 넘을 것으로 생각된다.
잿빛곰팡이 병균은 유전적 변이가 용이하기 때문에 약제에 대한 저항성을 비교적 쉽게 획득할 수 있다. 그 예로 benzimidazole계 농약의 빈번한 사용은 저항성균의 발생을 촉진시켰으며, 단일약제의 지속적인 사용으로 저항성균의 우점화가 이루어졌다. 특히 benzimidazoles, dicarboximides, diethofencarb 및 sterol biosynthesis inhibitors와 같은 약제에서 짧은 기간 내에 저항성균이 발생하고, 잿빛곰팡이병균이 point mutation을 통해 β-tubulin 합성 저해 약제에 저항성을 획득한다고 보고되었다. 저항성균의 발생 빈도가 늘어감에 따라 딸기 재배시 여러 계통 약제의 교호 처리가 불가피해졌으며, 약제 처리량도 늘어나 농가에 막대한 경제적 손실을 야기하게 되었다. 최근 선진국을 비롯한 국내 시장에서 농약을 처리하지 않은 과채류 등이 소비자들에게 선호되고 있으며, 그에 따라 저농약, 무농약, 천연물 농약, 미생물 농약 재배법 등이 각광받고 있다. 그러나 저농약, 무농약 농법은 그 재배법이 까다롭고 많은 인력을 필요로 하며 갑작스런 병해충 발생에 대해 무방비 상태로 노출되는 결정적인 단점이 있어 널리 보급되지 않았다.
이에 따라, 환경과 작물에 대한 독성을 나타내지 않으면서 잿빛곰팡이 병균에 대한 우수한 항진균 효과를 나타내어 작물 피해를 감소시킬 수 있는 방법에 대한 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항진균제 및 식물 병원균 방제용 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD) 및 7-플루오로인돌 (7-FD)은 식물 종자의 발아 및 세포 독성 없이 잿빛 곰팡이균 균사체의 성장을 억제하고 다른 할로겐화 인돌 또는 인돌과 비교하여 향상된 항진균 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD) 및 7-플루오로인돌 (7-FD)을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항진균제 및 식물 병원균 방제용 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 16개의 할로겐화 인돌의 잿빛 곰팡이균 (Botrytis cinerea)에 대한 항균 활성 및 time killing, C. elegans 독성 및 종자 발아 분석 결과로, 도 1A는 10 mg L-1 농도의 인돌 유사체 또는 3개의 양성대조군 플루코나졸 (Fluco), 카벤다짐 (Carb), 또는 나타마이신 (Nata)의 존재하에서 균사체 성장 억제를 확인한 결과이며, 도 1B는 잿빛 곰팡이균에 대하여 3개의 선택된 플루오로인돌의 용량의존적 항진균 활성을 확인한 결과이며, 도 1C는 0, 100, 또는 200 mg L-1 농도의 플루오로인돌에 의한 잿빛 곰팡이균의 신속한 사멸 효과를 확인한 결과이며, 도 1D는 7일 동안 플루오로인돌이 처리된 선충류의 생존율을 확인한 결과로, N/D는 검출 한계 이하의 벌레 생존율을 나타내며, 도 1E는 무 (R. raphanistrum, 왼쪽) 및 당근 (D. carota, 오른쪽) 발아에 대한 할로겐화 인돌 유도체의 영향을 확인한 결과로, 결과값은 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 나타내었다.
도 2는 감염된 후 수확된 과일에 대한 플루오로인돌의 항진균 효과를 확인한 결과로, 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD), 7-플루오로인돌 (7-FD) 또는 인돌을 25 mg L-1로 귤 및 딸기에 처리한 후 잿빛 곰팡이균을 감염시킨 결과로, 도 2A는 귤에서의 항진균 효과를 확인한 결과이며, 도 2B는 딸기에서 항진균 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 잿빛 곰팡이균에 대한 항진균 활성을 이용하여 인돌 유도체의 QSAR 및 약물특이분자단을 예측한 결과로, 도 3A는 하나의 수용체 (녹색구), 하나의 공여체 (파랑색 구) 및 하나의 방향족 고리 (갈색 원)으로 정렬된 리간드를 확인한 결과이며, 도 3B는 상기 도 3A의 리간드와 약물특이분자단 원자의 결합 거리 및 결합 거리에 따른 두 수용체 및 두 방향족 고리 약물특이분자단의 정렬을 확인한 결과이며, 도 3C는 다양한 치환기 (어두운 적색 큐부는 양성 전하를 나타내며, 파랑색 큐브는 음성 전하를 나타냄) 의 3D-QSAR 데이터 결과이며, 도 3D는 활성 리간드 및 약물들이분자단의 정렬을 확인한 결과로, 플롯은 각각 RMSD 및 (E-E’) 4-FD, (F-F’) 5-FD, 및 (G-G’) 7-FD의 결합에너지 프로파일을 이용하여 시간경과에 따른 MD 시뮬레이션 동안 미세소관 중합효소 복합체 내에서 4-FD, 5-FD, 또는 7-FD 간의 상호작용의 안정성을 확인한 결과이며, 도 3H는 장시간의 MD 시뮬레이션 전후 플루오로인돌-미세소관 중합효소 복합체 내 결합위치를 확인한 결과이며, 도 3I는 (i) 4-FD, (ii) 5-FD, 및 (iii) 7-FD에 대한 에너지 갭과 함께 LUMO 및 HOMO로 차별화된 최적의 분자 기하학은 DFT 접근법을 사용하여 계산되었으며, (iv) 4-FD, (v) 5-FD, 및 (vi) 7-FD의 최적화된 구조는 각 분자 주변의 전하 분포의 색에 따라 표시된 결과이며, 도 3J는 튜불린 중합 분석 키트를 사용하여 시험관 내 미세소관 조립에 대한 3개의 플루오로인돌의 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 잿빛 곰팡이균 (Botrytis cinerea)에 대한 플루오로인돌의 효과에 대한 제안된 메커니즘이다.
도 2는 감염된 후 수확된 과일에 대한 플루오로인돌의 항진균 효과를 확인한 결과로, 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD), 7-플루오로인돌 (7-FD) 또는 인돌을 25 mg L-1로 귤 및 딸기에 처리한 후 잿빛 곰팡이균을 감염시킨 결과로, 도 2A는 귤에서의 항진균 효과를 확인한 결과이며, 도 2B는 딸기에서 항진균 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 잿빛 곰팡이균에 대한 항진균 활성을 이용하여 인돌 유도체의 QSAR 및 약물특이분자단을 예측한 결과로, 도 3A는 하나의 수용체 (녹색구), 하나의 공여체 (파랑색 구) 및 하나의 방향족 고리 (갈색 원)으로 정렬된 리간드를 확인한 결과이며, 도 3B는 상기 도 3A의 리간드와 약물특이분자단 원자의 결합 거리 및 결합 거리에 따른 두 수용체 및 두 방향족 고리 약물특이분자단의 정렬을 확인한 결과이며, 도 3C는 다양한 치환기 (어두운 적색 큐부는 양성 전하를 나타내며, 파랑색 큐브는 음성 전하를 나타냄) 의 3D-QSAR 데이터 결과이며, 도 3D는 활성 리간드 및 약물들이분자단의 정렬을 확인한 결과로, 플롯은 각각 RMSD 및 (E-E’) 4-FD, (F-F’) 5-FD, 및 (G-G’) 7-FD의 결합에너지 프로파일을 이용하여 시간경과에 따른 MD 시뮬레이션 동안 미세소관 중합효소 복합체 내에서 4-FD, 5-FD, 또는 7-FD 간의 상호작용의 안정성을 확인한 결과이며, 도 3H는 장시간의 MD 시뮬레이션 전후 플루오로인돌-미세소관 중합효소 복합체 내 결합위치를 확인한 결과이며, 도 3I는 (i) 4-FD, (ii) 5-FD, 및 (iii) 7-FD에 대한 에너지 갭과 함께 LUMO 및 HOMO로 차별화된 최적의 분자 기하학은 DFT 접근법을 사용하여 계산되었으며, (iv) 4-FD, (v) 5-FD, 및 (vi) 7-FD의 최적화된 구조는 각 분자 주변의 전하 분포의 색에 따라 표시된 결과이며, 도 3J는 튜불린 중합 분석 키트를 사용하여 시험관 내 미세소관 조립에 대한 3개의 플루오로인돌의 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 잿빛 곰팡이균 (Botrytis cinerea)에 대한 플루오로인돌의 효과에 대한 제안된 메커니즘이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD) 및 7-플루오로인돌 (7-FD)이 식물 종자의 발아 및 세포에 독성을 나타내지 않으면서 잿빛 곰팡이균 균사체의 성장을 억제하고 다른 할로겐화 인돌 또는 인돌과 비교하여 향상된 항진균 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 플루오로인돌은 4-플루오로인돌 (4-FD), 5-플루오로인돌 (5-FD) 및 7-플루오로인돌 (7-FD)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 진균은 식물 병원균일 수 있으며, 보다 상세하게는 흰가루병 병원균(Phyllactinia kakicola), 잿빛 곰팡이병 병원균 (Botrytis cinerea), 시들음병 병원균(Fusarium oxysporum f. sp. fragariae) 및 탄저병 병원균 (Colletotrichum gloeosporioides 또는 Glomerella cingulata)으로 구성된 군으로부터 선택되는 병원균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 플루오로인돌은 진균의 균사체 성장을 억제하고 세포사멸을 촉진시키는 것일 수 있다.
상기 플루오로인돌은 진균의 미세소관 중합효소의 Pro174, Ala175, Ser179 및 Glu184 잔기와 결합하여 진균의 미세소관 형성을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 플루오로인돌의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 플루오로인돌을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 통상적인 방법으로 식물 병원균 방제용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상 형태로 제조할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 의한 조성물은 액상 생물농약 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
상기 조성물을 이용한 방제방법은 통상 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 화합물 및 곰팡이 균주
잿빛곰팡이균 (Botrytis cinerea, B. cinerea)은 영남대학교 백광현 교수님께 제공받았다. 곰팡이균을 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA)로 25 ℃에서 배양하였으며, 균사체 현탁액을 ~ 5 × 105 CFU mL-1로 조절하고 인산염완충 식염수(PBS)로 희석하였다.
화합물 및 16 개의 할로겐화 인돌 유도체 4-브로모인돌 (4-bromoindole, 4-BrD), 5-브로모인돌 (5-bromoindole, 5-BrD), 6-브로모인돌 (6-bromoindole, 6-BrD), 7-브로모인돌 (7- bromoindole, 7-BrD), 4-클로로인돌 (4-chloroindole, 4-ClD), 5-클로로인돌 (5-chloroindole, 5-ClD), 6-클로로인돌 (6-chloroindole, 6-ClD), 7-클로로인돌 (7-chloroindole, 7-ClD), 4-플루오로인돌 (4-fluoroindole, 4-FD), 5-클로로인돌 (5-fluoroindole, 5-FD), 6-플루오로인돌 (6-fluoroindole, 6-FD), 7-플루오로인돌 (7-fluoroindole, 7-FD), 4-아이오도인돌 (4-iodoindole, 4-ID), 5-아이오도인돌 (5-iodoindole, 5-ID), 6-아이오도인돌 (6-iodoindole, 6-ID), 7-아이오도인돌 (7-iodoindole, 7-ID)과 플루코나졸 (fluconazole, Fluco), 카벤다짐 (carbendazim, Carb) 및 나타마이신 (natamycin, Nata)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 및 Combi-Blocks, Inc. (San Diego, CA, USA)에서 구입하고, 0.1 % (vol/vol)를 초과하지 않는 다이메틸설폭사이드 (dissolved in dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켰다. DMSO는 Duksan Pure Chemicals (Daegu, South Korea)에서 구입하였으며, 곰팡이 성장에 영향을 미치지 않는 ≤ 0.1 % (vol/vol)의 배지 농도의 DMSO를 음성대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 최소 3번의 독립적인 배양물로 수행되었다.
2. 균사체 성장 및 최소 억제 농도 (MIC) 분석을 이용한 인돌의 항진균 활성 확인
B. cinerea 균사체 성장에 대한 상기 16 개의 할로겐화 인돌 유사체의 항진균 효과를 아가 방법(Zhang et al., 2019)을 이용하여 시험관 내에서 확인하였다.
각 유도체를 PDA 배지에 10 mg L-1로 첨가하고, 상기 용액 20 mL를 멸균 페트리 접시 (90 mm 직경)에 부었다.
punching bear로 7 일간 배양된 PDA 플레이트의 측면으로부터 접종원의 디스크 (10 mm 직경)를 제거하였다. 이후 상기 균사체 디스크를 새로운 페트리 접시에 중앙에 올려놓고 접시를 거꾸하여 25 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다.
상기 시험은 3번 반복 수행되었으며, 균사체 성장 억제율을 하기 계산식을 사용하여 확인하였다 (Yahyazadeh et al., 2008).
MGI (%) = [(dc-dt)/ dc] x 100
상기 dc (cm)는 평균 대조군 콜로니 직경이며, dt (cm)는 평균 처리 콜로니 직경이다 (Talibi et al., 2012).
최소 억제 농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)는 곰팡이 성장을 완전히 억제하는 최소 농도로 정의되었다. B. cinerea 균사체는 16개의 할로겐화 인돌이 각각 포함된 PDA 배지에 0 내지 100 mg L-1 농도로 접종되었다.
곰팡이 성장이 발생하지 않는 최저 농도는 B. cinerea에 치명적인 것으로 간주됨에 따라, 추가 실험에 사용되었다.
3. 플루오로인돌의 Time killing 분석
잿빗 곰팡이균 (B. cinerea)에 대한 플로오로인돌의 시간-사멸 효과를 확인하기 위해, 앞서 보고된 방법으로 민감도 분석을 수행하였다 (Zhu et al., 2018). 간략하게, 10 mm 균사 플러그는 3개의 플루오로인돌 각각을 0, 100 또는 200 mg L-1 포함한 2 mL 감자 덱스트로스 브로스 (PDB) 배지에서 25℃, 암조건에서 7일간 배양된 배양물의 가장자리로 부터 옮겼다.
표시된 시점에서 진균 플러그를 수확하고, PDA 플레이트 위에 올려놓고 25℃, 암조건에서 72시간 동안 배양한 후 균사체 성장의 직경을 측정하였다. 실험은 2개의 독립적 배양에 대해 최소 3번 반복되었다.
4. C. elegans에 대한 인돌의 독성 프로파일 확인
인돌 독성을 확인하기 위해, 약간 수정된 방법(Manoharan et al., 2018)으로 동기화된 성충 C. elegans [fer-15(b26);fem-1(hc17)] 선충을 사용하였다.
간략하게, 20-30개의 감염되지 않은 벌레를 M9 완충액이 포함된 96-웰 디쉬의 단일 웰에 피펫으로 옮겼다. 인돌 용액 (300 μl)을 0, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500 mg L-1 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 플레이트를 25℃에서 7일간 교반시켜 배양하였다. 결과는 배양 7일 후 벌레의 백분율로 나타내었으며, iRiSTM Digital Cell Imaging System (Logos Bio Systems, Korea)를 이용하여 10-30초 동안 LED 또는 UV LED 빛에 벌레를 노출시켜 생존력을 확인하였다. 각각 세 번의 독립적인 실험을 수행하여 결과를 확인하였다.
5. 인돌의 종자 발아 독성 프로파일 확인
3 가지 플루오로인돌 (4-FD, 5-FD 및 7-FD)의 독성 효과를 이전에 보고된 방법 (Rajasekharan et al., 2020b)으로 Murashige 및 Skoog 아가 플레이트에서 시험관 내 종자 발아 실험으로 확인하였다.
간략하게, 당근 및 무 (Raphanus raphanistrum) 종자를 멸균 증류수로 하룻밤동안 흠뻑 적시고, 100% 에탄올 1 mL로 세척한 후 3% 치아염소산염 용액에 넣어 15분간 멸균하였다.
종자를 멸균수로 3번 세척하고 각각의 플루오로인돌이 0에서 500 mg L-1 농도로 포함되거나 포함되지 않은 0.8 % 박토(bacto)-아가와 Murashige and Skoog 배지 0.86 g/L가 포함된 아가 플레이트 위에 위치시켰다. 상기 플레이트를 25℃에서 배양하였으며, 7일 이상 배양 후 이미지를 얻었다.
6. 수확 후 과일의 저장 기간 연장 확인
귤 (Citrus tangerina) 및 딸기 (Fragaria ananassa)를 이용한 잿빛곰팡이 제어 실험을 앞서 보고된 방법(Saito et al., 2020)을 약간 수정하여 수행하였다.
간략하게, 귤 및 딸기를 영남대학교 근처 상점에서 구입하였다. 숙성되고 건강하며 균일한 크기의 상처가 없는 노란색 감귤 (weight of 95 ± 4 gm) 및 딸기 (20 ± 3 gm)를 사용하였다. 모든 과일의 표면을 1.5% (w/v) 차아염소산나트륨 용액으로 3 분간 멸균하고, 멸균수로 세척한 후 30분간 기건(air-dried)하였다.
멸균된 과일을 멸균 메스 (5 mm deep 및 ~1 cm wide)로 동일한 거리에 4개의 구멍을 뚫었다. 각 상처 부위에 균사체 현탁액 50 μl를 귤 과일에 접종하여 독성을 확인하였다.
균사체 현탁액을 PBS 1 mL에 PDA의 접종원 디스크 (10 mm 직경)을 혼합하여 준비하였으며, ~ 5 × 105 CFU mL-1를 포함하였다. 접종된 과일은 지정된 시간 동안 25℃, 암조건에서 배양되었다. 상기 과일 분석은 최소 2번의 독립적인 배양물을 이용하여 3회 반복하였다.
7. 인돌의 구조 활성 관계 확인
모든 16개의 할로겐화 인돌을 사용하여 in silico 연구에 사용하였으며, 상기 할로겐화 인돌의 2-D 구조를 ChemDraw Ultra version 12 (CambridgeSoft)로 그렸으며, 이들의 형상을 GaussView 6.0.로 최적화한 후 구조를 SDF 파일로 저장하였다.
마지막으로, MIC 값을 해당 pMIC [-log (MIC)] 값으로 변환하여 QSAR 계산 및 약물특이분자단(pharmacophore) 생성에 대한 종속 변수로 사용하였다.
8. 잿빗 곰팡이균 (B. cinerea)에 대한 인돌의 약물특이분자단(pharmacophore) 모델 생성
Schrodinger 제품군 (Maestro 11.4, New York, USA)을 사용하여 16 개의 할로겐화 인돌의 약물특이분자단 모델을 생성하였다.
그들의 약물특이분자단 패턴을 확인하기 위해, Schrodinger 제품군의 Phase 모듈을 사용하였다. Ligprep tool을 이용하여 리간드 형태를 평가하여 수소 원자를 부착시키고 사용자 정의 pH 값으로 전하를 중화시켰다. 모든 16개의 구조를 추가적으로 2D에서 3D 구조로 변환시켰다.
활성 역치는 MIC 값을 기준으로 1.67로 설정되었으며, > 또는 < -1.67은 각각 활성 또는 비활성으로 정의되었다. 약물특이분자단 부위는 활성 리간드의 일반적인 약물특이분자단 가설의 트리 기반 구분으로 구축되었다. 리간드의 구성요소 H-결합 억셉터 (H-bond acceptor, (A)), 방향성 고리 (aromatic ring, (R)), H-결합 공여체 (H-bond donor (D)), 소수성기 (hydrophobic group (H)), 음전하 그룹 (negatively charged group (N)) 및 양전하 그룹 (positively charged group (P))과 같은 약리학적 특징으로 분배하였다.
9. 항진균 활성에 대한 인돌의 일반적인 약물특이분자단의 발견 및 점수화
활성 리간드의 생존점수 및 정렬 (alignments)를 확인하기 위해, 가능한 최상의 DHR2 약리학적 가설을 Schrodinger의 위상 모듈을 사용하여 개발하였다.
좋은 생존 점수는 3.581로 간주되었으며, 일반적인 약물특이분자단 가설은 생존 점수를 이용하여 분석되었다. 모든 약물특이분자단 가설들은 활성 생존, 비활성 생존, 일치하는 수, 선택성, 벡터, 부위, 부피, 활성, 비활성 용어 및 형태 에너지에 대한 점수를 매겼다.
평균 제곱근 오차 (root-mean-square error, RMSE) 값은 1.0 미만으로 사용되었으며, 비활성 화합물의 정렬은 일반적인 약물특이분자단 가설의 점수를 매기기 위한 기본 매개변수로 사용되었다.
H-결합 공여체 (D; 파랑색), 중심 부위 소수성 그룹 (H; 녹색), 및 방향성 고리 (R; 갈색)의 하나의 화살 모양을 포함한 고유한 특징을 포함하는 각도 거리와 함께 우수한 품질의 일반적인 약물특이분자단 가설이 발생되었다.
또한, 2D 약물특이분자단 특징은 인돌의 첫 번째 위치에서 하나의 방향성 고리가 녹색을 나타내는 최환된 소수성 그룹 (H)과 질소(-NH-)의 H-결합 공여체의 융합이 확인되었으며, 이러한 특징이 잿빛 곰팡이균(B. cinerea)에 대한 항진균 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다.
10. 3D-QSAR 모델 구축
3D-QSAR 연구 및 약물특이분자단 모델링은 일반적으로 리간드 구조 및 생물학적 활성에 필요한 특성을 가진 약물 분자를 디자인하는데 사용된다.
일반적으로, 원자 기반의 QSAR 모델은 화합물이 가지는 공통 구조적 특징 또는 제한된 구조적 유연성만을 가지는 경우 사용된다. 구조가 상당히 다양하거나, 높은 유연성을 나타낼 경우 악물특이분자단 기반의 QSAR 모델이 더욱 적합하다고보고되어 있다 (Desai et al., 2015).
앞선 연구에서 16개 할로겐화 인돌 각각의 구조에 대한 원자 기반의 3D-QSAR 모델을 구축하였다. 일반적으로 정해진 규칙에 따라, 할로겐은 수소 결합 공여체 내 극성 원자에 부착되어 있다 (D). C-H 수소, 탄소 및 할로겐은 친수성/비극성의 일부이다 (H); 양이온 전하가 양이온 (P); 음이온 전하가 원자가 음이온으로 분류되며 (N); 비이온성 산호 및 질소는 전자 구인성 부분이며 (W), 다른 원자는 기타 (X) 이다.
QSAR를 개발하는 동안 분자의 정렬된 트레이닝 세트의 Van der Waals 모델은 큐브의 표준 격자무늬에 위치하였다. 3D-QSAR를 획득하고 제안된 가설이 발생된 반면, 트레이닝 세트 내 14개 할로겐화 인돌과 테스트 세트 내 2개의 할로겐화 인돌이 확인되었다.
결과적으로 one-component partial least square (PLS) 성분 모델과 우수한 통계 결과를 얻었다. QSAR 모델 분석은 PLS 방법을 이용하여 수행되었으며, 데이터세트는 두 개의 시트로 나뉘었다. 하나는 트레이닝 세트 이고 다른 하나는 테스트 세트이다.
11. 진균 β-튜블린 단백질 복합체 및 리간드 수집
분자 도킹 (molecular docking) 연구는 B. cinerea에서 β 튜블린과 81.4% 동일성을 갖는 미세소관 중합효소 (microtubule polymerase, S. cerevisiae)를 이용하여 수행되었다.
미세소관 중합효소의 결정 구조 (PDB: 4FFB)는 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)의 단백질 데이터 베이스 (https://www.rcsb.org/)에서 2.88 A의 해상도로 검색되었다.(Ayaz et al., 2012).
활성 결합 포켓은 계산 기반 가상 스크리닝을 위해 Computed Atlas of Surface Topography of proteins (CASTp) server (http://sts.bioe.uic.edu/)를 이용하여 예측되었다.
Schrodinger 제품을 이용한 단백질 준비 프로그램 접근은 표적 단백질을 준비하고 정제하기 위해 사용되었다. 과량의 공동 결정화 물 분자는 제거되었으며, 복잡한 단백질 구조에 필요한 수소가 추가되었다.
인돌 및 인돌 유도체의 2D 구조는 PubChe의 simulation description format (SDF)에서 다운 받았다 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/).
12. 분자 역학 (molecular dynamics, MD) 시뮬레이션에 의한 인돌-미세소관 중합효소 복합체의 안정성 확인
MD 시뮬레이션을 사용하여 미세소관 중합효소(S. cerevisiae)와 4-FD, 5-FD 또는 7-FD의 최상의 토킹 형태 안정성을 확인하였다. 앞서 보고바와 같이(Raj, et al., 2021) YASARA dynamic software를 이용하여 수용액 내 MD 시뮬레이션을 수행하였다.
간략하게, X = 61.30 Å, Y = 82.84 Å, 및 Z = 52.14 Å의 주기적인 시뮬레이션 세포 경계 크기를 전체 복합체에 할당하고 0.997 g/L 밀도의 명시적 물과 함께 적용하였다. Cl 및 Na 이온은 시스템의 중성 전하 달성을 위해 사용되었다. AMBER14 분자역학력장은 298 K, 0.9% NaCl 및 pH 7.4와 같은 생리학적 조건하에서 사용되었으며, 미세소관 중합효소와 인돌의 평균 제곱근 편차 (root mean square deviations, RMSDs)는 0에서 22100ps 까지의 MD 실행 궤적을 사용하여 확인하였다.
13. DFT에 의해 결정되는 플루로오인돌의 구조 안정성 확인
할로겐화 인돌의 화학 구조의 안정성을 최적화하고 평가하기 위해 DFT를 이용하여 highest occupied molecular orbitals (HOMOs) 및 lowest unoccupied molecular orbitals (LUMO)을 포함한 프론티어 분자 궤도 (FMOs)를 확인하였다 (Duarte et al., 2017).
플루오로 인돌의 오비탈 및 HOMO-LUMO 에너지 차이의 안정성 및 반응성을 하기 계산식을 이용하여 추정하였다 (Chattaraj et al., 2006);
화학 포텐셜 (μ) 및 화학적 경도 (η)는 HOMO 및 LUMO 에너지를 이용하여 계산되었다.
친전자성 (ω) 및 전기 음성도 (χ)는 음의 EHOMO 값으로 정의되는 이온화 전위 (I)을 사용하여 정의된 반면, 전하 친화력 (A)는 음의 ELUMO 값으로 정의되었다.
플루오로인돌 구조를 최적화하기 위해, Gaussian 09의 프로그램을 사용하여 아세톤을 용매로 사용하는 B3LYP 수준 이론을 사용하였다. HOMO 및 LUMO 오비탈 간의 큰 간격은 좋은 분자 구조 안정성을 나타내며, η 값은 분자 반응성을 나타낸다. 즉, 높은 η 값은 화학 모티프의 낮은 반응성을 나타낸다 (Duarte et al., 2017).
14. 튜블린 중합 예방에 대한 인돌 능력 확인
상업적으로 사용되는 형광 기반의 튜블린 중합 분석 키트(Catalog no. BK0066P; Cytoskeleton, Inc., Denver, CO, USA)를 사용하여 튜블린 중합 분석을 수행하였다.
간략하게, 튜블린 단백질 (3000 mg L-1)를 사전에 데워진 96웰 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 제공된 양성대조군으로서의 미세소관 억제제 (파클리탁섹; 10 μM) 및 5 mg L-1 농도의 플루오로인돌과 각각 상호작용시켰다. 30분 동안 표시된 시간마다 340 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 실험은 3번 반복하여 수행되었다.
<실시예 1> 잿빛 곰팡이균 (B. cinerea mycelial) 균사체 성장에 대한 인돌의 살균 활성 확인
인돌 및 16가지 할로겐화 유도체의 항진균 활성을 확인하기 위해, 다른 농도에서 초기 스크리닝하였다.
표 1을 참고하면, 잿빛 곰팡이균에 대한 할로겐화 인돌의 MIC 값은 2-100 mg L-1 범위에서 확인되는 반면, 항진균제 플루코나졸 (fluconazole), 카벤다짐 (carbendazim) 및 나타마이신 (natamycin)의 MIC 값은 각각 50, 0.1 및 20 mg L-1이 었다.
16개의 인돌 중 3개의 플루오로인돌 (4-FD, 5-FD 및 7-FD)은 2 내지 5 mg L-1의 MIC 범위를 나타낸 반면, 다른 인돌들은 25 내지 100 mg L-1 사이의 MIC을 나타내는 것이 확인되었다. 인돌 자체는 >100 mg L-1의 MIC를 가진다. 또한, 잿빛 곰팡이의 균사체 성장을 확인한 결과, 표 1과 같이 10 mg L-1에서 인돌의 항진균 활성이 확인되었다. 도 1A 및 표 1과 같이 4-FD, 5-FD 및 7-FD은 플루코나졸 및 나타마이신 보다 더욱 유의한 균사체 성장 억제 효과를 나타낸 반면, 다른 13개의 할로겐화 인돌은 30-60% 정도로 중간 수준의 성장 억제를 나타내었다.
또한, 도 1B와 같이 최대 72시간 동안 배양한 후 4-FD, 5-FD 및 7-FD는 용량 의존적으로 균사체 성장을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 시간-사멸 (Time-killing) 및 광학현미경 분석
잿빛 곰팡이균 (B. cinerea) 균사체 성장에 대한 플루오로인돌의 신속한 억제 능력을 확인하기 위해, 시간-사멸 및 광학 현미격 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1B 및 표 1과 같이 7-FD은 2 mg L-1로 72시간 후 B. cinerea 세포 생존율을 0 까지 감소시켰으며, 도 1C와 같이 3시간 이내에 100× MIC (200 mg L-1)에서 완벽한 사멸 효과를 나타내었다. 3개의 플루오로인돌에 대한 신속한 사멸 활성의 순서는 7-FD >5-FD > 4-FD으로 확인되었다.
또한, 광학 현미경 이미지에서 정상 대조군과 비교하여 4-FD, 5-FD, 또는 7-FD 처리된 B. cinerea에서 액포형성이 확인되었다.
할로겐 치환된 인돌은 선충류에서 액포를 생성시키는 것으로 보고된 반면, 인돌은 그렇지 못한 것으로 보고되있다 (Rajasekharan, et al., 2020a; Rajasekharan, et al., 2019). 유사하게 상기 현미경 분석에서도 플루오로인돌은 다중 액포를 형성한 반면, 인돌은 액포를 형성시키지 못하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 플루오로인돌의 잿빛 곰팡이균에 대한 항진균 활성이 확인되었으며, 특히 7-FD이 4-FD 또는 5-FD 보다 빠르게 잿빛 곰팡이균을 사멸시키는 것이 확인됨에 따라, 7-FD은 잿빛 곰팡이균 살균제로서의 가능성이 확인되었다.
<실시예 3> C. elegans 생존율 및 종자 발아를 통한 플루오로인돌의 안전성 확인
4-FD, 5-FD, 및 7-FD의 안전성을 감염되지 않은 C. elegans에서 확인하였다.
도 1D와 같이 7일 후, 3개의 플루오로인돌이 처리된 선충류에서 비 처리된 대조군과 유사한 경향을 나타내는 것이 확인되었다. 특히, 4-FD, 5-FD 및 7-FD는 100 mg L-1 이하의 농도에서 독성이 나타나지 않았다. 7-FD은 100X MIC (200 mg L-1)에서 거의 독성이 나타나지 않았으나, 4-FD 및 5-FD는 >100 mg L-1에서 벌레에게 독성을 나타내었다.
또한, 종자 발아에 대한 효과를 확인하기 위해, 당근 (D. carota)과 딸기 (R. raphanistrum) 종자를 0-500 mg L-1 범위의 플루오로인돌이 포함되거나 포함되지 않은 Murashige 및 Skoog 아가에서 성장시켰다.
그 결과, 도 1E와 같이 플루오로인돌은 처음 2일까지 종자 발아에 어떠한 영향도 나타내지 않았으나, 200 mg L-1에서는 딸기 발아가 지연되었으며, 500 mg L-1에서는 당근 발아가 7일 후로 지연되었다.
상기 결과로부터 플루오로인돌은 잿빛 곰팡이균의 성장을 제어하기 위해 안전하게 사용될 수 있음이 확인되었다.
<실시예 4> 감염 후 수확된 과일에 대한 플루오로인돌의 효과 확인
잿빛 곰팡이균에 의한 회색곰팡이 병을 제어하고, 잿빛 곰팡이균에 의한 과일의 감염 심각성 (병변 크기)을 감소시키기 위해 16개의 선택된 플루오로인돌의 효과를 확인하기 위해, 귤 및 딸기에 플루오로인돌을 각각 30분간 처리하였다.
그 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이 3개의 플루오로인돌 4-FD, 5-FD 및 7-FD은 각각 3일 및 21일 후 B. cinerea의 우수한 조절 효과와 세포사멸 효과를 나타내었으며, B. cinerea 균사체에 대한 높은 성장 감소는 인돌과 비교한 결과, 25 mg L-1 용량의 플루오로인돌 처리 후 확인되었다.
상기 결과로부터 4-FD, 5-FD 및 7-FD은 잿빛 곰팡이균에 대한 효과적인 살균제로 제공될 수 있음이 확인되었다.
나타마이신은 일반적인 살균제로 사용되고 있으나, 수확 후 나타마이신의 사용 지연은 잿빛 곰팡이균에 대한 최소한의 효과를 나타내는 것으로 보고됨에 따라(Saito, et al., 2020), 잿빛 곰팡이균에 대한 나타마이신의 항진균 활성을 확인한 결과, 4-FD, 5-FD, 또는 7-FD 보다 높은 MIC (20 mg L-1)를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 4-FD, 5-FD 또는 7-FD을 귤에 접종하고 3주 후 회색 곰팡이병에 대한 방제효과가 나타나는 것이 확인되었다.
<실시예 5> 약물특이분자단 생성 및 3D-QSAR 구축
3D-QSAR 모델은 할로겐화 인돌의 생물학적 활성에 관하여 할로겐화 인돌의 구조 활성 관계를 해독하고, 새로운 주요 약물특이분자단의 가상 스크리닝을 위해 사용될 수 있는 공통 약물특이분자단 가설을 개발하기 위해 사용되었다.
몇 가지 약물특이분자단 가설을 발생시키기 위해, 모든 가설 중에서 DHR.2 약물특이분자단이 최고 점수을 나타내는 두 개의 하위 데이터 세트를 생성하였다.
생성된 약물특이분자단 패턴은 하나의 수용체, 하나의 공여체 및 하나의 방향성 고리를 포함하였다.
그 결과, 도 3A, 도 3B 및 도 3C와 같이 약물특이분자단 패턴 분석은 PLS 회귀 인자 1 및 할로겐화 인돌의 3개 부위의 약물특이분자단 일치가 확인되었으며, 1.32에서 3.0 범위 내 리간드의 우수한 적합성을 갖는 예측 모델을 정적으로 나타났다.
또한, DHR2를 사용하여 원자 기반 3D-QSAR 모델을 유도하였으며, 상기 모델에서 높은 견고성(41.1)이 확인되었다. 최고 품질의 QSAR 모델을 생성하기 위해, 교차 검증된 Pearson's coefficient (r2), standard deviation (SD) 및 degree of freedom (F)와 같은 다른 통계 매개변수들이 0.82, 0.12 및 41.1에서 각각 확인되었다. 상기 매개 변수들은 3D-QSAR 모델을 설정하기 위한 우수한 범위의 선형성과 품질을 나타내었다. 또한, 모델에서 높은 F 값과 낮은 분산비 (p)는 통계적 의미가 있다.
또한, SD가 낮을 수록 QSAR 모델에 대한 적합도가 높았으며, 현저한 r2 및 RMSE는 좋은 모델 예측 능력이 우수하였다. 예측된 모델의 가장 적합한 선은 실제 활동 및 예측 활동 사이의 상당한 정확도 범위를 나타내었다. 따라서 QSAR의 예측된 모델은 할로겐화 인돌의 QSAR 특성에 대한 더 좋은 예측을 나타내었다.
<실시예 4> QSAR 시각화
QSAR 기술을 사용하여 얻은 3D 구조적 특징의 주요 장점은 불리하거나 유리한 영역에서 등고선 큐브의 존재이다. 등고선 큐브는 리간드와 타겟의 결합에 필수적인 원자 기능을 생성하기 위한 QSAR 예측 중요성을 설명하는 일반적인 약물특이분자단 가설에서 생성되었다. 리간드 생체활성을 향상시키기 위해 원하는 물리화학적 특성에 대해 필요한 생리활성 원자 특징이 확인되었다.
원자 큐브의 3D 효과는 계수 값에 따라 다른 색상으로 표시되었다. 도 3C와 같이 큐브 색은 양의 계수 = 1.200e-001 및 음의 계수 = -1.200e-001인 수용체와 방향족 고리에서 관찰된 효과를 기반으로 어두운 파랑색은 양의 계수(증가 활성) 및 적색은 음의 계수 (감소 활성)으로 나타내었다.
3D-QSAR은 인돌 고리 내 방향족 고리 (R4; 적색) 및 H-결합 소수성 그룹 (H2; 녹색)의 존재가 증가 활성을 위해 필수적인 것을 밝혔다. 또한, (-NH-) 그룹과 5 번째 위치의 할로겐화 치환 주위의 파랑색은 항진균 활성을 담당하였다.
7번 위치의 적색은 7-FD 내 플루오라이드의 대체가 항진균 활성에 영향을 미치는 반면, 5번 위치의 파랑색은 5-FD 및 5-ID에서 확인되는 것과 같이 할로겐화 치환의 대체가 항진균 활성을 증가시키는 것으로 나타낸다.
3D-QSAR 모델 분석 후 얻은 데이터는 잿빗 곰팡이균에 대한 항진균 활성 향상을 위해 인돌의 약물특이분자단 R, H 및 D가 필수적임이 확인되었다. 소수성, 수소 결합 공여체 및 음성 및 양성 이온 특징과 같은 특성과 관련된 QSAR 모델 큐브들의 시각화는 수용체 부위의 위상 배치, 진균 수용체의 비공유 상호작용 및 리간드 유효성을 나타낸다.
상기 결과들로부터 인돌의 6각 방향족 고리, 특히 5번 위치에서 전자 끌어당김 치환이 항진균 활성을 증가시키는 것이 확인되었으며, 이러한 결과는 상기 전기 음성 그룹이 잿빗 곰팡이균의 세포막 단백질 내 아미노산의 친전자성 원자와의 상호작용을 할 수 있기 때문이다. 6번 위치의 할로겐 치환은 항진균 활성에 주목할만한 영향을 나타내지 않는 반면, F, I, 또는 Br에 의한 4 또는 7 위치의 치환은 항균 활성을 증가시켰다. 그러나 Cl과 같은 다른 할로겐이 치환될 경우 잿빗 곰팡이균에 대한 항진균 활성은 감소된다.
<실시예 7> 미세소관 중합효소와 플루오로인돌의 분자 도킹 및 분자 상호작용 확인
플루오로인돌 및 미세소관 중합효소 간의 상호작용을 확인하기 위해, 가상 스크리닝을 수행하였다.
표 2와 같이 가장 효과적인 할로겐화 인돌 유도체 3 개(4-FD, 5-FD 및 7-FD)와 3개의 양성 대조군 (thiabendazole, carbendazim 및 7-benomyl)의 결합 확인을 위해 미세소관 중합효소의 예측된 활성 부위와의 상호작용을 스크리닝하였다.
인돌의 결합 친화력은 보고된 양성 대조군과 유사한 미세소관 중합효소의 활성 도메인과 함께 상당한 범위인 -5.0 에서 -7.3 kcal/mol 내에서 4-FD, 5-FD 및 7-FD가 확인되었다 (Ayaz, et al., 2012). 또한, 모든 할로겐화 분자들은 상당한 범위의 Lipinski 특성을 나타내므로, 이러한 매개변수들을 통하여 상기 분자들이 상당한 범위의 약물동학적 프로파일을 나타낼 수 있을 것으로 제안될 수 있다.
또한, 상기 3개의 플루오로인돌은 미세소관 중합효소의 아미노산 잔기와 5개의 π-π 결합 및 1개의 수소 결합을 형성하였다.
흥미롭게도, 플루오로인돌은 carbendazim과 동일한 아미노산 잔기, 즉 Pro174, Ala175, Ser179 및 Glu184과 상호작용하였다. 상기 도킹 결과로부터 Pro174, Ala175, Ser179 및 Glu184는 미세소관 중합효소 (S. cerevisiae)의 활성 포켓 도메인에 결합하기 위한 필수적인 아미노산인 것이 확인되었다.
상기 결과들로부터 플루오로인돌은 곰팡이의 미세소관 중합효소에 결합함으로써 벤즈이미다졸과 같이 작용할 수 있음이 확인되었다.
<실시예 8> MD 자극에 의한 플루오로인돌-미세소관 중합효소 복합체 안정성 확인
플루오로인돌-미세소관 중합효소 복합체의 움직임과 형태적 안정성을 MD 시물레이션으로 확인하였다. Root-mean-square deviations (RMSDs) 및 리간드 결합 에너지는 도 3E(3E') 내지 도 3G(3G')와 같이 22.1 ns에 걸쳐 리간드-수용체 복합체의 생성된 궤적으로 평가하였다.
4-FD, 5-FD 및 7-FD의 평균 결합 에너지는 각각 16.40, 57.42 및 19.48 kcal/mol이었다. 할당된 힘 필드 당 상기 양성 결합 에너지는 플루오로인돌과 미세소관 중합효소의 강한 결합을 나타낸다. 도 3과 같이 5-FD-미세소관 중합효소 및 4-FD-미세소관 중합효소 복합체는 각각 15000 및 10000 ps 후 평형 궤적을 나타내었으며, 22.1 ns MD 실행에 걸쳐 복합체 안정성을 나타낸 반면, 7-FD은 6000 ps에서 RMSD 안정성을 나타내었다. 흥미롭게도, 7-FD-미세소관 중합효소 복합체의 RMSD는 MD 작극 실행 동안 추가적인 변동이 나타나지 않았다.
또한, 도 3F와 같은 5-FD-, 4-FD-, 및 7-FD/미세소관 중합효소 복합체의 안정성 프로파일에서 화합물 4-FD는 0 내지 1000 ps 범위에서 골격의 RMSD와 복합체의 중원자 (heavy atoms)의 약간 더 많은 변동을 나타내었으나, MD 실행 동안 RMSD 안정성은 유지되었다. 상기 결과로부터 모든 3개의 복합체는 MD 실행 동안 안정성을 나타내는 것이 확인되었다.
도 3H와 같이 미세소관 중합효소 결합 포켓 내 3개의 플루오로인돌 모두의 최초 및 최종 포즈 (pose)는 22.1 ns MD 실행 동안 구조적 변화를 나타내지 않았다. 또한, 3개의 플루오로인돌 복합체 모두의 에너지는 선형 궤적을 나타내었다. 따라서 RMSD 및 결합 에너지는 22.1 ns MD 시뮬레이션 동안 모든 플루오로인돌-미세소관 중합효소 복합체의 안정성을 확인하였다.
<실시예 9> DFT로 확인된 플루오로인돌의 구조적 안정성 확인
Frontier molecular orbital (FMOs), 즉 리간드의 높은 점유 분자 괘도 (HOMOs) 및 낮은 비점유 분자 괘도 (LUMOs)를 DFT로 확인하였다. HOMO는 전자 공여체 역할을 하는 반면, LUMO는 전자 수용체 역할을 하며, frontier molecular theory은 HOMOs 및 LUMOs가 생물학적 특성, 이온화, 분자 반응성 및 전자 친화도에 중요한 영향을 미치는 것으로 제안된다. 따라서, FMO 연구는 활성 화합물의 생물학적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있다.
도 2J를 참고하면, 4-FD, 5-FD 및 7-FD는 각각 4.39, 5.35 및 5.47 eV의 HOMO-LUMO 에너지 갭을 나타내었다. 7-FD는 약간 더 높은 에너지 갭을 가지며, 결과적으로 높은 에너지 갭은 전자를 HOMO에서 LUMO로 전자를 이동시키기 위해 더 많은 에너지를 필요로하기 때문에 더 큰 분자 안정성을 나타내는 것으로 예상될 수 있다 (Balachandar et al., 2017).
그러므로, 4-FD, 5-FD 및 7-FD의 안정성은 7-FD > 5-FD > 4-FD 순으로 평가될 수 있다.
표 3 및 도 3I와 같이 5-FD의 HOMO은 C2, C7, C8 위치의 융합된 고리 탄소 및 원자를 제외하고 모든 인돌 탄소 원자를 수용하는 반면, 5-FD의 LUMO는 5 개의 인돌 고리의 2개의 수소를 제외한 모든 원자를 숨긴다.
4-FD의 HOMO는 인돌의 7번 위치를 제외한 인돌 고리의 모든 원자를 포함하는 반면, LUMO는 C2 및 C4를 제외한 모든 고리 원자를 포함한다. 7-FD의 HOMO는 융합된 탄소 고리와 C2, C3, C4, C5 및 C6를 제외한 모든 원자를 포함하는 반면, LUMO는 C3 및 C5를 제외한 모든 원자를 포함한다. 이러한 결과로부터 이들 분자의 활성이 인돌 질소, 융합된 탄소 및 C7의 플루오린 원자에 의한 것임이 확인되었다.
상기 결과로부터 융합된 탄소 원자 및 C1 위치의 질소 및 C4, C5 및 C7 위치의 할로겐은 미세소관 중합효소의 활성 포켓 내에서 아미노산 잔기롸 상호작용하는 주요 작용기임이 확인되었다.
5-FD, 4-FD 및 7-FD의 최적화된 구조의 질소 원자는 인돌의 질소 원자 보다 높은 전기음성 전하 및 낮은 원자 전하 (각각 N = -0.801, -0.991 및 -0.795)를 나타내는 반면, 인돌 고리의 플루오린은 인돌의 질소 원자보다 낮은 원자 전하를 갖는다. 그러므로, 인돌 고리 질소는 미세소관 중합효소의 활성 포겟 내부에 있는 양성 전하를 나타내는 아미노산 잔기와 유리한 상호작용을 할 것으로 예상될 수 있다.
또한, 플루오로 그룹은 양성 전하를 나타내는 아미노산과 상호작용하는 반면, 인돌 고리 내에서 융합된 탄소 원자는 음성 전하를 나타내는 아미노산 잔기와 상호작용한다. 이러한 플루오로인돌의 구조적 특징은 시험관 내에서 유사한 결합 및 활성 패턴을 나타내었으며, 컴퓨터적 연구에서 플루오로인돌은 잿빛 곰팡이균에 대한 항진균 활성 측면에서 유망한 분자임이 확인되었다.
<실시예 10> 플루오로인돌에 의한 미세소관 중합효소 억제 메커니즘 확인
시험관 내에서 튜불린 (tubulin) 중합제인 파클리탁셀을 이용하여 미세소관 중합에 대한 플루오로인돌의 억제 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 3J와 같이 30분 동안 3개의 플루오로인돌 처리 후 튜불린 흡광도가 증가하였으며, 미세소관 조립 속도가 증가한 것이 확인되었다. 또한, 5-FD 및 7-FD은 파클리탁셀과 유사한 억제 효과를 나타내었다.
이에 따라, 파클리탁셀과 같은 증식 및 후속 유사 사멸 동안 미세소관 중합의 손상을 포함한 플루오로인돌의 항진균 효과에 대한 메커니즘은 도 4와 같이 제안될 수 있다.
파클리탁셀과 같은 미세소관 타겟 약물은 미세소관에 결합하여 미세소관 조립을 조립을 촉진하여 세포분열 및 증식을 방해한다. 또한, 16개의 할로겐화 인돌은 진균 튜불린의 이종이량체 소단위체에 결합하여 미세소관 조립을 억제하는 곰팡이 살균제로 널리 사용되는 벤즈이미다졸과 유사하였다.
또한, 컴퓨터 연구를 통하여 벤즈이미다졸(티아벤다졸, 카벤다짐 및 7-베노밀)의해 나타나는 아미노산 상호작용을 포함하여 플로오로인돌과 진균 미세소관 중합효소의 활성 결합 도메인 사이의 결합 친화성이 확인되었다. 시험관 내 미세소관 결합은 또한 할로겐화 인돌이 미세소관 중합을 안정화시킴으로써 작용하는 가설을 뒷받침한다.
상기 결과들로부터 플루오로인돌은 잿빛 곰팡이균에 우수한 항진균제임이 확인되었으며, 이러한 항진균 활성은 잿빛 곰팡이균의 미세소관 중합 붕괴에 의한 것임이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 7-플루오로인돌(7-FD)을 유효성분으로 함유하는 잿빛 곰팡이병 병원균(Botrytis cinere)에 대한 항진균용 약학조성물.
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- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 7-플루오로인돌(7-FD)은 잿빛 곰팡이병 병원균의 균사체 성장을 억제하고 세포사멸을 촉진시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 항진균용 약학조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 7-플루오로인돌(7-FD)은 잿빛 곰팡이병 병원균의 미세소관 중합효소의 Pro174, Ala175, Ser179 및 Glu184 잔기와 결합하여 잿빛 곰팡이병 병원균의 미세소관 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 항진균용 약학조성물.
- 7-플루오로인돌(7-FD)을 유효성분으로 함유하는 잿빛 곰팡이병 병원균(Botrytis cinere) 방제용 조성물.
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 62: 414-417 (1996)* |
| FEMS Microbiol Lett. 329 (2012) 36-44 |
| Proc. Kansai PI. Prot. (42):3-8(2000)* |
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