KR102591921B1 - 체지방 감소 및 장 건강 증진 활성을 갖는 유산균 및 그의 용도 - Google Patents

체지방 감소 및 장 건강 증진 활성을 갖는 유산균 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체지방 감소용 유산균 및 그의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 유산균인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)는 식욕 저하를 유발하지 않으면서도, 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 저하, 체중증가 감소 및 체지방 감소 효과가 뛰어난 장점이 있다.

Description

체지방 감소 및 장 건강 증진 활성을 갖는 유산균 및 그의 용도{Probiotics for reduction of body fat and gut health promoting activity and use thereof}
본 발명은 체지방 감소용 유산균 및 그의 용도에 관한 것이다.
체지방은 신체를 구성하는 지방조직으로, 피하, 유선, 신장주위 등에 널리 분포한다. 체지방은 저장지방으로 에너지에 이용되는 것 외에 내장 보호와 체온 조절기능을 한다. 지방조직은 주로 지방세포와 물로 구성되며 성인은 약 6~25㎏ 정도이다. 지방 1kg은 약 7,300kcal의 에너지로 전환된다.
그러나 에너지원, 항상성 조절에 중요한 지방도 과도하게 축적되면 비만이 야기되고, 그 중에서도 복강 내 내장지방의 축적은 간장에서의 인슐린 저항이나 지방합성항진을 일으켜, 당, 지질대사이상, 고혈압 또는 관상동맥질환 등을 야기하는바, 비만 치료에 대한 중요성이 강조되고 있다.
비만 치료법은 크게 식이-운동요법, 수술 요법 및 약물 요법이 있다. 식이-운동 요법은 저칼로리-저지방 섭취와 산소를 소비하는 육체의 활동을 통한 치료 방법인데, 이는 인내심을 가지고 반복적·지속적으로 수행되어야 하기 때문에 대중적인 효과를 보기 어려운 것으로 인식되고 있다.
수술요법은 외과적 수술을 통해 체지방을 물리적으로 제거하는 방법으로 단기간에 효과를 볼 수 있는 장점이 있지만, 수술에 대한 부담감과 효과의 지속성이 떨어지고, 경제적 부담이 크기 때문에 제한적으로 활용되고 있다. 약물 요법은 식욕 저하를 유발하거나 지방 흡수를 억제하는 약제들을 이용해서 비만을 치료 또는 예방하고자 하는 방법이나, 우울함, 요요현상 등 많은 부작용을 내포하고 있어 문제되고 있다. 따라서, 장기적인 체지방 감소 효능이 보장되고, 부작용이 적은 대체제의 마련이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-1686558호(2007.02.16.)
본 발명자는 체지방 감소 효과가 우수한 유산균을 발굴하고, 이를 포함하는 체지방 감소용 식품 조성물, 건강기능식품 조성물 및 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 체지방 감소능을 보유한 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 제공한다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 내산성 및 내담즙성을 보유하는 것이 좋다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 지방세포의 분화를 억제하고, 지방의 축적을 억제하는 것이 좋다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 식욕저하에 영향을 미치지 않으면서 체중증가를 감소시키는 것이 좋다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol, LDL-cholesterol)의 수준을 낮추는 것이 좋다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 혈중 아스파르테이트아미노전달효소(aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌아미노전이효소(alanine aminotransferase; ALT)의 수준을 낮추는 것이 좋다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 혈중 렙틴(leptin)의 수준을 낮추고, 혈중 아디포넥틴(adiponetin)의 수준을 높이는 것이 좋다.
본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 체지방 감소용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 체지방 감소용 식품 조성물에 있어, 상기 체지방은, 일 예로 간, 장간막, 신장주위 및 피하 중 선택되는 어느 하나에 위치하는 체지방일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 체지방 감소용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어, 상기 대사성 질환은, 바람직하게 비만, 당뇨, 지방간, 고지혈증 및 지방증(steatosis) 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.
본 발명의 유산균인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)는 식욕 저하를 유발하지 않으면서도, 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 저하, 체중증가 감소 및 체지방 감소 효과가 뛰어난 장점이 있다.
도 1은 고지방식이 비만 유도 마우스의 체중 증가 및 본 발명 유산균 투여에 따른 체중증가 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 고지방식이 비만 유도 마우스의 식이 섭취량 및 식이 섭취효율 변화를 나타낸 도이다(A: 식이 섭취량 변화, B: 식이 섭취효율 변화).
도 3은 고지방식이 비만 유도 마우스의 간 및 지방조직의 무게 변화를 나타낸 도이다((A): 간, (B): 장간막, (C): 신장주위, (D): 피하).
도 4는 고지방식이 비만 유도 마우스의 혈청 생화학적 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 고지방식이 비만 유도 마우스 간 조직의 조직학적 변화를 나타낸 도이다.
본 발명은 체지방 감소능을 보유한 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 제공한다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 내산성 및 내담즙성을 보유하는 것이 좋다. 본 발명의 상기 균주는 바람직하게는 pH 2 내지 7에서 안정하며, 더 바람직하게는 위가 비워지는 시간(gastric emptying time)인 2 내지 3시간 동안 체내 위액 조건인 pH 2 내지 7에서 안정하다. 또한, 상기 균주는 바람직하게 담즙염에 안정하고, 더 바람직하게는 0.1 내지 1% 담즙염에서 안정하며, 더욱더 바람직하게는 0.1 내지 0.5% 담즙염에서 안정하다.
또한, 본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 자가응집능력이 우수하여, 장부착능이 뛰어나다. 또한, 본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 수준을 낮추는 것이 좋다. 보통 저밀도 지단백 콜레스테롤은 나쁜 콜레스테롤로 표현되는데, 저밀도 지단백 콜레스테롤의 수치가 정상에서 벗어난 경우 혈관이 막히는 동맥경화가 발생할 확률이 높아질 수 있고, 뇌, 심장, 심혈관질환 등의 발병 확률이 높아질 수 있어, 저밀도 지단백 콜레스테롤의 수치를 낮추는 것이 매우 중요하다.
또한, 본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 혈중 아스파르테이트아미노전달효소(aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌아미노전이효소(alanine aminotransferase; ALT)의 수준을 낮추는 것이 좋다. AST 및 ALT는 대표적인 간 기능 검사 지표로, 간세포 내에 존재하는 효소들이다. 이들은 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출돼 수치가 증가한다. 따라서, 이들 수치가 지나치게 높다면 간 질환 가능성을 의심해 볼 수 있다. 본 유산균이 AST 및 ALT의 수준을 낮추는 것은 본 발명의 유산균이 체내에서 독성을 나타내지 않음을 의미하는 것이다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 혈중 렙틴(leptin)의 수준을 낮추고, 혈중 아디포넥틴(adiponetin)의 수준을 높이는 것이 좋다. 렙틴은 지방세포가 식욕을 조절할 때 분비하는 주요 호르몬으로, 많은 동물에서 찾아볼 수 있다. 비만형의 동물일수록 체내 렙틴의 양이 많은데 이는 식욕을 줄이기 위해서이다. 한편, 아디포넥틴은 비만형 동물보다 지방이 적은 동물에서 더 많이 분비되는 호르몬으로 렙틴과는 반대작용을 하는 것으로 알려졌다. 본 발명의 균주는 혈중 렙틴의 수준을 낮추고 아디포넥틴의 수준을 높임으로써, 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 균주는, 바람직하게 지방세포의 분화를 억제하고, 지방의 축적을 억제하는 것이 좋고, 바람직하게 식욕저하에 영향을 미치지 않으면서 체중증가를 감소시키는 것이 좋다. 특히, 종래 비만 치료를 위한 약물 요법은 식욕 저하를 유발하거나 지방 흡수를 억제하는 약제들을 이용해서 비만을 치료 또는 예방하고자 하는 방법이나, 우울함, 요요현상 등 많은 부작용을 내포하고 있어 문제되고 있다. 따라서, 본 발명 균주의 식욕을 저하시키지 않으면서도 체지방, 체중증가를 감소시키는 효과는 약물이 가지는 부작용 없이 비만 개선을 위해 유용하게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 체지방 감소용 또는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 체지방 감소용 식품 조성물에 있어, 상기 체지방은, 일 예로 간, 장간막, 신장주위 및 피하 중 선택되는 어느 하나에 위치하는 체지방일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어, 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)는 바람직하게 식품 조성물 대비 0.00001~50 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
본 발명의 식품 조성물은 일 예로 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 유산균의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어, 상기 대사성 질환은, 비만으로 인해 유발될 수 있는 다양한 질환을 포함할 수 있으며, 바람직하게 비만, 당뇨, 지방간, 고지혈증 및 지방증(steatosis) 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.
여기서 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)을 포함하는 의미이며, 나아가 다른 질병 등으로 인하여 췌장이 손상됨에 따라 발생하는 당뇨병 예컨대, 갑상선 기능 항진증, 부신피질 기능 항진증, 성장호르몬 과다증 또는 카테콜라민 과다증에 의한당뇨병, 임신성 당뇨병을 포함하는 의미이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 포함하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 약학 조성물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 유산균은 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％ 로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
특히, 본 발명의 상기 조성물은 그 유효성분을 혈당 저하 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 혈당 저하 활성을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 본 발명의 체지방 감소효능을 갖는 유산균의 선발]
1. 지방세포(3T3-L1) 분화 및 시료처리
실험에 사용된 3T3-L1 지방 전구 세포는 10% BCS(bovine calf serum), 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신(penicillin, streptomycin)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 세포는 2일마다 계대 배양하여 적정 수의 세포를 유지하였다.
3T3-L1 아지방세포를 12-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/㎖로 씨딩(seeding)하고, 세포가 컨플루언트(confluent)하게 증식한 것을 확인한 후, 추가로 2일간 더 배양하였다. 플레이트에 완전히 찬 3T3-L1 세포에 분화 유도 물질로 MDI 용액 (0.5mM 3-isobutyl-1- methylxanthine, 1μM dexamethasone 및 1㎍/㎖ insulin)이 첨가된 DMEM 배지를 처리하여 분화를 유도(0일차)하였다. 2일, 4일 차에는 각각 1㎍/㎖ 인슐린(insulin)만이 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 0, 2, 4일차 세포에 CFE를 각각 100㎕씩 처리하였다. 이후, 2일에 한 번씩 총 8일간 DMEM 배지로 갈아주면서 분화를 유도하였다. 대조군(control; Con)은 DMEM 배지만을 처리하였다.
2. Oil Red O 염색 (Oil Red O staining)
지방 세포로 분화시킨 3T3-L1 세포에서 생성된 총 지질량은 Oil Red O (ORO) 염색법을 통해 분석하였다. 이를 위하여, 상기의 방법으로 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거하고, PBS로 2회 세척하였다. 이후, 세포를 고정하기 위해 3.7% 포름알데하이드(formaldehyde)를 200㎕씩 각 웰에 첨가하여 15분 동안 고정시킨 후 포름알데하이드를 제거하고 PBS로 3회 세척하였다.
Oil Red O 염색약은 증류수와 6:4의 비율로 섞은 후 0.2㎛ 필터로 여과하여 사용하였다. 각 웰에 ORO 용액을 500㎕씩 첨가하고, 상온에서 30분간 염색한 후 PBS로 3회 세척하였다. 이후, 염색된 세포 내 지방구를 현미경으로 관찰하였다. 그 후, 각 웰당 200㎕의 2-프로판올(propanol)을 넣어 염색약을 추출한 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
3. 시험 결과
메디오젠이 보유한 100여 종의 균주의 3T3-L1의 지방축적 억제율을 비교하였고, 이 중 우수한 지방축적 억제 효능을 보인 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 및 와이셀라 시바리아(W. cibaria) 종의 지방축적율(lipid accumulation)을 측정하여 하기 표 1 내지 4에 나타내었다. 지방축적율은 상기에서 지방세포(3T3-L1) 분화 유도 후, Oil Red O 염색을 통해 수득한 측정값을 MDI 처리군의 흡광도로 나누어 백분율(%)로 표기하였다. Std는 표준편차(standard deviation)를 의미한다.
락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)
순서 균주번호 균주명 Lipid accumulation (%) std
CON CON - 39.36 1.46
MDI MDI - 100.00 9.59
1 4502 Lactobacillus rhamnosus 40.99 3.11
2 4505 Lactobacillus rhamnosus 48.38 5.50
3 4511 Lactobacillus rhamnosus 52.98 6.13
4 4501 Lactobacillus rhamnosus 54.80 5.90
5 316 Lactobacillus rhamnosus 65.99 11.33
6 4298 Lactobacillus rhamnosus 75.24 6.38
7 4289 Lactobacillus rhamnosus 93.93 2.24
8 5200 Lactobacillus rhamnosus 97.03 0.88
락토바실러스 가세리(L. gasseri)
순서 균주번호 균주명 Lipid accumulation (%) std
CON CON - 39.36 1.46
MDI MDI - 100.00 9.59
1 4524 Lactobacillus gasseri 57.36 4.68
2 4583 Lactobacillus gasseri 67.47 5.19
3 4575 Lactobacillus gasseri 72.04 3.26
4 4238 Lactobacillus gasseri 76.94 1.77
5 4243 Lactobacillus gasseri 85.67 6.18
6 4247 Lactobacillus gasseri 85.71 6.45
7 4522 Lactobacillus gasseri 90.73 0.33
8 4508 Lactobacillus gasseri 94.54 3.03
9 4503 Lactobacillus gasseri 94.99 2.80
10 4507 Lactobacillus gasseri 97.41 3.52
11 4520 Lactobacillus gasseri 98.29 2.07
12 4512 Lactobacillus gasseri 101.02 1.50
13 4506 Lactobacillus gasseri 101.71 4.17
14 4513 Lactobacillus gasseri 107.35 4.09
15 4521 Lactobacillus gasseri 109.94 7.87
16 4514 Lactobacillus gasseri 112.64 1.23
17 4523 Lactobacillus gasseri 117.85 7.91
18 4515 Lactobacillus gasseri 119.36 4.77
락토바실러스 루테리(L. reuteri)
순서 균주번호 균주명 Lipid accumulation (%) std
CON CON - 39.36 1.46
MDI MDI - 100.00 9.59
1 5149 Lactobacillus reuteri 47.41 3.70
2 505 Lactobacillus reuteri 72.16 3.91
3 4224 Lactobacillus reuteri 101.38 4.10
와이셀라 시바리아(W. cibaria)
순서 균주번호 균주명 Lipid accumulation (%) std
CON CON - 39.36 1.46
MDI MDI - 100.00 9.59
1 5285 Weissella cibaria 53.41 3.34
2 5252 Weissella cibaria 76.01 2.50
3 4549 Weissella cibaria 80.08 18.07
4 5318 Weissella cibaria 85.68 10.75
5 5227 Weissella cibaria 89.14 0.62
6 5234 Weissella cibaria 89.81 5.12
7 5223 Weissella cibaria 93.13 13.35
표 1 내지 표 4에 나타낸 바와 같이, 동일 종의 균주들 사이에서도 지방축적율이 최대 1.7배에서 2.3배, 지방세포 분화 억제율이 최대 6.8배에서 84.4배까지 차이가 나타났으며, 특히, 락토바실러스 가세리 및 락토바실러스 루테리의 경우 오히려 음의 값의 지방세포 분화 억제율(지방세포 분화를 촉진)을 보이는 균도 존재하였다.
본 발명에서는 각 균주 중 지방축적 억제율 및 지방세포 분화 억제율이 가장 우수한 종으로 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 중에는 MG4502(KCTC14095BP)가, 락토바실러스 가세리(L. gasseri) 중에는 MG4524(KCTC14188BP)가, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 중에는 MG5149(KCTC14099BP)가, 와이셀라 시바리아(W. cibaria) 중에는 MG5285(KCTC14189BP)가 확인되어, 이들을 선별하여 하기 실험에 이용하였다.
[ 실험예 1: 본 발명 유산균의 프로바이오틱 활성 평가]
1. 내산성 , 내담즙성
인간 장관에서의 조건과 유사한 조건에서 상기 실시예 1에서 선별한 균주의 생존력을 평가하기 위하여, 내산성은 균주를 MRS 평판배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양된 콜로니를 일부 채취하여 MRS 액상배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정치배양하여 종균 배양액을 제조하였다. 배양액을 수득한 다음 원심분리하여 균체를 침전시킨 후 상등액을 제거하였고, 모의 위액(SIF; simulated gastric fluid)을 처리하기 전에 pH 7.4의 PBS로 2회 세척하여 재현탁(1×108 CFU/㎖)하였고, 이를 배양에 사용하였다. 1N HCl을 이용하여 pH 3.0, 4.0으로 조정한 0.1M 인산완충액(0.1M Phosphate buffer)에 펩신을 3g/L의 농도로 첨가하였고, 이에 균액을 동일한 부피로 각각 첨가하였다. 이후, 37℃로 유지되는 배양기에서 방치하면서 3시간째 시료를 채취하였고 다단희석한 다음 일정농도의 희석액을 MRS 평판배지에 도말하고, 각 균주에 대한 생존 카운트 (log CFU / mL)로 표시하였다. 실험은 3회 반복 수행하였고, 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다.
내담즙성은 18시간 동안 배양한 균주를 4℃에서 5분 동안 원심분리(2000×g)하여 수확하고, 판크레아틴에 대한 내성을 시험하기 위한 모의 장액(SIF; simulated intestinal fluid)을 처리하기 전에 pH 7.4의 PBS로 2회 세척하여 재현탁(1×108 CFU/㎖)하였고, 이를 배양에 사용하였다. 모의 장액(SIF)은 1N NaOH의 첨가로 pH 7.0 내지 8.0으로 조정된 멸균 PBS의 최종 농도가 1g/L가 되도록 판크레아틴(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 제조하였다. 모의 장액에 균주를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였고, 각 균주에 대한 생존 카운트 (log CFU / mL)로 표시하였다. 실험은 3회 반복 수행하였고, 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 실시예 1에서 선별된 균주의 내산성 및 내담즙성을 확인한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Strains Simulated gastric fluid
(log CFU / mL) 		Simulated intestinal fluid
(log CFU / mL)
pH 3 pH 4 pH 7 pH 8
L. rhamnosus MG4502 8.6 ± 0.04 8.6 ± 0.2 8.7 ± 0.1 8.6 ± 0.04
L. gasseri MG4524 7.6 ± 0.1 7.5 ± 0.1 8.9 ± 0.1 8.8 ± 0.03
L. reuteri MG5149 8.7 ± 0.04 8.7 ± 0.1 8.8 ± 0.03 8.8 ± 0.03
W. cibaria MG5285 7.3 ± 0.1 7.7 ± 0.1 7.8 ± 0.04 7.9 ± 0.1
표 5에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 MG4502, 락토바실러스 가세리 MG4524, 락토바실러스 루테리 MG5149 및 와이셀라 시바리아 MG5285는 모두 펩신을 포함하는 강산 조건인 pH 3.0 내지 4.0의 조건에서 균주의 생존율의 감소가 거의 없이 높은 생존율을 유지하는 것을 확인함으로써, 상기 균주의 내산성을 확인하였다.
또한, 네 균주 모두 pH 7.0 및 pH 8.0의 조건의 판크레아틴을 포함하는 담즙염의 처리에도 생존율의 감소가 거의 없이 높은 생존율을 유지하는 것을 확인함으로써, 상기 균주의 내담즙성을 확인하였다.
결론적으로, 락토바실러스 람노서스 MG4502, 락토바실러스 가세리 MG4524, 락토바실러스 루테리 MG5149 및 와이셀라 시베리아 MG5285는 프로바이오틱스의 필수 요건 중 하나인 낮은 pH 및 담즙염에 대한 높은 저항성을 가짐을 확인한 것이다.
2. 항생제 최소 저해 농도(minimal inhibitory concentration, MIC )
선별된 균주의 항생제 최소 저해 농도 실험은 CLSI(Clinical and Laboratory Standard Institute) 가이드라인을 따라 BHI(Brain Heart Infusion Agar) 평판배지를 이용하여 수행하였다. 선별 균주는 MRS 배지에 1% 접종한 뒤, 18시간 동안 배양하였으며, 배양액은 원심분리(4,000×g, 4℃, 5분)한 후, PBS에 2회 세척하였다. 이후, McFarland turbidity standard 0.5로 균액의 탁도를 맞춘 뒤 멸균된 면봉을 이용하여 BHI 평판배지에 균주를 도말하였다. 배지가 마른 뒤 항생제가 처리된 스트립을 균액이 도말된 배지 위에 놓고 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 스트립을 따라 생성된 억제대와 스트립이 만나는 지점을 MIC 값으로 판독하였다. 그 결과를 EFSA(European Food Safety Authority)에서 2018년 발표한 기준에 따라 sensitive(S), resistant (R), not require (n.r.)로 표시하여 하기 표 6에 나타내었다.
Antibiotics MG4502 MG4524 MG5149 MG5285
Ampicillin S S S S
Gentamicin S S S S
Kanamycin S S S S
Streptomycin S S S S
Tetracycline S S S S
Chloramphenicol S S S S
Erythromycin S S S S
Vancomycin n.r. S n.r. n.r.
Clindamycin S S S S
표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 선별된 4종의 균주 모두가 항생제에 감수성을 보유하여, 인체에 적용하기에 안전한 균주인 것으로 확인되었다.
3. 자가 응집 능력 ( autoaggregation ability)
선별된 균주의 자가 응집 능력을 확인하기 위하여, MRS 배지에서 18시간 배양한 유산균액을 원심분리(4,000×g, 4℃, 5분)한 후, PBS에 2회 세척하였다. 이후 0.1M PBS(pH 7.4)를 이용하여 OD600=1.0로 현탁한 균액 4㎖를 10초간 진탕한 뒤 상온에 방치하였다. 5시간 후 상등액 0.1㎖를 취하여 3.9㎖ PBS와 혼합한 뒤 흡광도를 측정하고 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 하기 표 7에 나타내었고, 결과는 평균±SD로 표시하였다.
Figure 112020076049383-pat00001
* A0는 0시간의 흡광도
* At는 5시간 후의 흡광도
Antioxidant assays Auto-aggregation (%)
L. rhamnosus MG4502 34.0±3.6
L. gasseri MG4524 87.8±4.8
L. reuteri MG5149 40.6±1.4
W. cibaria MG5285 84.1±3.8
표 7에 나타낸 바와 같이, 실험 수행 5시간 후에 측정한 락토바실러스 가세리 MG4524 및 와이셀라 시바리아 MG5285의 자가응집능은 각각 87.8±4.8% 및 84.1±3.8%로 나타나 높은 자가 응집능을 통하여 효과적인 프로바이오틱스로 작용할 수 있음을 확인하였다.
한편, 락토바실러스 람노서스 MG4502 및 락토바실러스 루테리 MG5149의 자가응집능은 각각 34.0±3.6% 및 40.6±1.4%로 나타나, 앞선 두 균주보다는 낮으나 비교적 높은 자가 응집능을 통하여 본 발명 균주의 우수한 세포부착력(장내 부착력)을 확인함으로써, 본 발명의 균주가 효과적인 프로바이오틱스로 작용할 수 있음을 확인하였다.
4. 발효패턴 분석
실시예 1에서 선별한 균주의 당이용성을 확인하기 위하여 생화학적 조사를 수행하였다. 생화학적 조사는 API 50CHL system(BioMerieux, Marcy IEtoile, France)을 이용하여 확인하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 하기 표 8 상에서, - 또는 +는 당대사능 또는 당이용능을 기준으로 결정한 것으로, 각 당에 대한 당대사능이 없는 경우 -라고 표시하고, 당대사능이 있는 경우 +라고 표시하였다.
Substrate MG4502 MG4524 MG5149 MG5285
0 Control (Negative) - - - -
1 Glycerol - - - -
2 Erythritol - - - -
3 D-arabinose + - - -
4 L-arabinose - - + +
5 D-ribose - - + +
6 D-xylose - - - +
7 L-xylose - - - -
8 D-adonitol - - - -
9 Methyl-β D-xylopyranoside - - - -
10 D-galactose + + + +
11 D-glucose + + + +
12 D-fructose + + - +
13 D-mannose + + - +
14 L-sorbose - - - -
15 L-rhamnose - - - -
16 Dulcitol + - - -
17 Inositol + - - -
18 D-mannitol + - - +
19 D-sorbitol + - - +
20 Methyl-α D-Mannoside - - - -
21 Methyl-α D-glucoside - - - -
22 N-acethyl-glucosamine + + - +
23 Amygdalin + + - +
24 Arbutin + + - +
25 Esculin + + + +
26 Salicin + + - +
27 D-cellobiose + + - +
28 D-maltose - + + +
29 D-lactose - + + -
30 D-melibiose - - - +
31 D-sucrose - + + +
32 D-trehalose + + - +
33 Inulin - - - -
34 D-melezitose + - - -
35 D-raffinose - - - -
36 Starch - + - -
37 Glycogen - - - -
38 Xylitol - - - -
39 Gentiobiose + + - +
40 D-turanose - + - +
41 D-lyxose - - - -
42 D-tagatose + + - -
43 D-fucose - - - -
44 L-fucose + - - -
45 D-arabitol - - - -
46 L-arabirol - - - -
47 Gluconate + - + +
48 2-keto-gluconate - - - +
49 5-keto-gluconate - - - -
표 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 선별한 4종의 균주는 공통적으로 D-갈락토스, D-글루코스, 이슐린 등에 당대사능을 갖고, 글리세롤, 에리스리톨, L-자일로즈, D-아도니톨, 메틸-β D-자일로피라노사이드, L-솔보스, L-람노스, 메틸-α D-만노사이드, 이눌린, D-라피노스, 글리코겐, 자일리톨, D-락소스, D-프록토스, D-아라비톨, L-아라비톨과 5-케토-글루코네이트 이용능이 없는 것을 확인하였다.
락토바실러스 람노서스 MG4502는 상기한 당 외에도 D-프록토스, D-만노스, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 살리신, D-셀로비오스, D-말토스, D-락토스, D-수크로스, D-트레할로즈, 스타치, 젠티오비오스, D-투라노스, D-타가토즈등을 더 이용하였다.
락토바실러스 가세리 MG4524는 D-아라비노스, D-프록토스, D-만노스, 둘시톨, 이노시톨, D-만니톨, D-솔비톨, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 살리신, D-셀로비오스, D-트레할로스, D-멜레지토스, 젠티오비오스, D-타가토스, L-푸코스, 글루코네이트를 이용하였다.
락토바실러스 루테리 MG5149는 L-아라비노스, D-리보스, D-말토스, D-락토스, D-수크로스, 글루코네이트를 더 이용하였다.
외이셀라 시바리아 MG5285는 L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-프록토스, D-만노스, D-만니톨, D-솔비톨, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 살리신, D-셀로비오스, D-말토스, D-멜리비오스, D-수크로스, D-트레할로스, 젠티오비오스, D-투라노스, 글루코네이트, 2-케토-글루코네이트를 더 이용한 것으로 나타났다.
5. 효소 활성(Enzyme activity)
일반적으로, 유산균이 프로바이오틱스로 사용되기 위해서는 이들이 생산하는 효소 또한 매우 중요한 부분을 차지하고 있어, 실시예 1에서 선별한 균주의 효소활성(효소 생산 여부)을 확인하기 위하여, 총 19종의 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM 키트 (BioMerieux, Marcy-I'Etoile, France)를 사용하였다. 선별 유산균을 MRS 아가 배지에서 획선 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 콜로니를 2㎖ 현탁배지에 재부유하고, McFarland(BioMerieux)로 탁도 5~6으로 조정하여 각 튜브에 60㎕씩 분주하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후, ZYM A 및 ZYM B 시약을 각 튜브에 한 방울씩 떨어뜨리고 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화로 각각의 기질 효소에 대한 활성 여부를 판독하여 하기 표 9에 나타내었다. 평가는 색의 변화 정도에 따라 0~5까지의 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (=40 nanomoles)는 최대 강도의 반응이고, 4~1은 각각 30, 20, 10 및 5nM의 중간 값을 나타내며, 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
Enzyme assayed for MG4502 MG4524 MG5149 MG5285
Alkaline phosphatase 2 0 0 0
Esterase (C4) 3 1 1 0
Esterase Lipase (C8) 3 0 1 0
Lipase (C14) 2 0 0 0
Leucine arylamidase 5 4 1 0
Valine arylamidase 5 1 3 0
Crystine arylamidase 3 1 0 0
α-chymotrypsin 1 0 0 0
Acid phosphatase 3 1 2 4
Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase 5 1 2 1
α-galactosidase 2 3 0 0
β-galatosidase 3 1 4 0
α-glucosidase 2 1 1 0
β- glucosidase 5 5 0 0
N -acetyl -β- glucosaminidase 0 3 0 0
α-fucosidase 3 0 0 0
표 9에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 람노서스 MG4502는, 에스터레이스(esterase; C4), 에스터레이스 리파아제(esterase Lipase; C8), 루신 아릴아미다제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase), 크리스틴 아릴아미다제(crystine arylamidase), 산성포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase), β-갈락토시다아제(β-galatosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), α-푸코시데이즈(α-fucosidase)에 뚜렷한 활성을 보였다.
락토바실러스 가세리 MG4524는 루신 아릴아미다제(leucin arylamidase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)에 뚜렷한 활성을 보였다.
락토바실러스 루테리 MG5149는 발린 아릴아미다제(valine arylamidase)와 β-갈락토시다아제(β-galatosidase)에서 뚜렷한 활성을 보였다.
와이셀라 시바리아 MG5285는 산성포스파타아제(acid phosphatase)에서 활성을 보였다.
6. 용혈성 ( Hemolysis )
실시예 1에서 선별한 균주의 용혈성을 확인하기 위하여, 균주는 MRS 배지에서 3회 계대 배양하여 활성을 높인 후, 5%(w/v) 혈액이 함유된 콜롬비아 아가(Difco) 배지에 획선 접종하였다. 이후, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 콜로니 주변에 생성되는 환을 확인하였다. 용혈성은 적혈구 막을 파괴하여 황달 및 빈혈을 유발하는 β-헤몰리시스 (황색 투명환이 생성)와 적혈구 막을 파괴하지 않고 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 α-헤몰리시스 (녹색환이 생성), 용혈현상이 없는 γ-헤몰리시스 (환 생성이 없음)로 구분되므로, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
No. 동정명 균주번호 헤몰리시스
α β γ
1 Lactobacillus rhamnosus MG4502 - - +
2 Lactobacillus gasseri MG4524 - - +
3 Lactobacillus reuteri MG5149 - - +
4 Weissella cibaria MG5285 - - +
표 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 선별한 균주 모두가 γ-헤몰리시스의 용혈성을 가지는 것으로 확인되어 인체에 적용이 가능한, 안전한 프로바이오틱스로 사용될 수 있음을 확인하였다.
[ 실험예 2: 고지방 식이 유도 비만 마우스 모델에서의 유산균의 항비만 활성 평가]
1. 시험 재료 및 방법
(1) 시험 물질
본 실험에 사용된 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) MG4502, 락토바실러스 가세리(L. gasseri) MG4524, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) MG5149 및 와이셀라 시바리아(W. cibaria) MG5285의 분말은 메디오젠 사(MEDIOGEN Co., Ltd.; (제천, 한국)으로부터 공급받았다.
구체적으로 상기 유산균 균주의 분말의 제조방법은 다음과 같다. 배양된 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) MG4502, 락토바실러스 가세리(L. gasseri) MG4524, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) MG5149 및 와이셀라 시바리아(W. cibaria) MG5285 각각의 펠렛(pellet)을 동결보호제와 1:25(w/w)의 비율로 잘 혼합하였다. 동결건조제는 동량의 알긴산 나트륨과 호박 분말 (SP 분말)의 혼합물을 이용하였다.
동결건조제와 혼합한 균주현탁액은 분산시키고, 동결건조하였다(Heto Drywinner, 덴마크 Allerod). 이후, 분말화된 균주 분말을 수거하여 폴리에틸렌 백에 수집하고, 알루미늄 호일에 싸서, 추가 사용까지 4℃에서 보관하였다.
(2) 시험 동물
수컷 C57BL/6J 마우스 (4주령, 18~20g)를 오리엔트바이오(주) (성남, 한국)로부터 입수하였다. 마우스를 12±12시간의 밝고 어두운 주기로 23±1.0℃ 및 45±5% 습도(relative humidity; RH)의 냉방실에서 관리하였다. 마우스는 표준실험실 기준으로 식이와 물을 자유롭게 공급하였다. 모든 마우스는 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침서(Guide of the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 처리되었다. 실험 프로토콜은 덕성여자대학교의 기관 동물관리 및 사용위원회(IACUC)의 승인을 받았으며(승인 번호 2019-003-010), 고통을 최소화하고자 하였다.
(3) 시험 디자인
비만 유도를 위하여, 마우스를 정상식이(ND), 고지방식이(HFD), 실시예 1에서 선별한 4종의 유산균 투여군(n=8/군)으로 무작위로 분배하였다. 모든 유산균 투여군은 고지방식이를 함께 진행하면서 개체당 2×108 CFU/day의 멸균 유산균을 PBS에 용해시켜 8주 동안 매일 1회 경구투여하였다. 정상식이(ND)군은 14% 지방, 21% 단백질 및 64% 탄수화물을 포함하는 식이를 공급하였다. 또한, 모든 고지방식이(HFD) 공급군은 60% 지방, 20% 단백질 및 20% 탄수화물(D12492, Research Diets Inc., USA)을 포함하는 식이를 공급하였다(EEGJ26060, Furina Inc.). 본 실험을 위해 설계된 군 구성을 하기 표 11에 나타내었다.
Group Animal total No. Animal label
G1 ND 8 1-1~8
G2 HFD 8 2-1~8
G3 L. rhamnosus MG4502 8 3-1~8
G4 L. gasseri MG4524 8 4-1~8
G5 L. reuteri MG5149 8 5-1~8
G6 W. cibaria MG5285 8 6-1~8
2. 분석 방법
(1) 체중 및 식이 섭취량 조사
고지방식이 공급기간 동안, 마우스를 매일 모니터링하고, 매주 체중 및 음식 섭취량을 측정하였다. 식이 섭취량은 공급한 사료량에서 케이지에 남아있는 사료의 양으로부터 계산되었다. 식이섭취효율 (FER: Food efficacy ratio)은 식이섭취량을 평균 마우스 무게로 나눈 비로 나타내었다.
(2) 간 및 지방조직 무게 측정
실험 종료 및 12시간 금식 후, 모든 군의 마우스를 CO2 흡입에 의해 마취시키고 심장 천자에 의해 안락사하였다. 추출된 간 및 각 지방 조직 (장간막, 신장주변 및 피하)을 적출하고, PBS 완충액으로 헹구고, 무게 측정 및 육안검사를 실시하였다. 적출된 조직 샘플을 액체 질소에서 동결시키고 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
(3) 혈청생화학적 검사
EDTA-코팅된 튜브에 수집된 혈액 샘플을 실온에서 30분 이상 방치 후, 4℃에서 20분 동안 3,000rpm에서 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 혈액자동생화학분석기(7180, HITACHI, JPN)를 이용하여 다음의 항목을 측정하였다: ALT(Alanine Transaminase), AST(Aspartate Transaminase), TG(triglyceride), T-CHO(Total Cholesterol), LDL(Low Density Lipoprotein Cholesterol), HDL(High Density Lipoprotein Cholesterol, GLU(Glucose).
혈장 렙틴(leptin) 또는 아디포넥틴(adiponectin)의 농도는 ELISA kit (Enzo Diagnotic, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 효소적으로 정량하였다.
(4) 조직병리학적 평가
모든 간 조직 슬라이드는 하기 표 12의 점수체계(scoring system)에 따라 지방침윤(steatosis), 염증(inflammation) 및 간세포 비대(hepatocellular hypertrophy) 정도를 평가하였다. 지방조직 슬라이드는 현미경 100배율에서 서로 다른 30개의 지방세포에서 지름을 측정하였다(300MI CMOS camara (Aptina), Scope Eye Image Analysis System).
Item Definition Score
Steatosis < 5% 0
5~33% 1
> 33~66% 2
> 66% 3
Lobular Inflammation No foci 0
< 2 foci per 200X field 1
2~4 foci per 200X field 2
> 4 foci per 200X field 3
Hepatocellular Hypertrophy < 5% 0
5~33% 1
> 33~66% 2
> 66% 3
3. 시험 결과
(1) 체중 변화량
실시예 1에서 선발된 4종 유산균 균주의 항비만 효과를 평가하기 위하여, 체중 변화량과 식이 섭취의 변화를 관찰 측정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 식이 전의 모든 마우스의 체중에는 차이는 없었다. 고지방식이(HFD) 공급 후 8주차에, 정상식이(ND)군(4.88 ± 0.87g)에 비해 고식이군(16.02 ± 1.52 g)에서 대략 3.3배의 현저한 체중 증가가 나타나, 고지방식이에 의한 비만 마우스 모델이 적절히 유도된 것으로 판단하였다.
한편, 실시예 1에서 선발된 4종의 유산균 투여군은 모두 고지방식이에 의해 비만이 유도된 마우스에서 체중 증가량 감소에 효과가 있는 것으로 나타났다.
(2) 식이섭취량 및 식이섭취효율
고지방식이 공급 후 8주차에, 각 군의 마우스에서 식이 섭취의 변화를 관찰 측정하였다.
도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 정상식이군의 식이섭취량은 평균 3.3 ± 0.24g/day였고, 고지방식이군은 2.31 ± 0.35g/day로 나타났으며, 유산균 투여군의 평균 식이섭취량은 2.08~2.39g/day로 나타나 고지방식이과 유의적 차이는 없었다.
도 2의 B에 나타낸 바와 같이, 식이섭취효율(FER)은 정상식이군이 0.14이었고, 고지방 식이가 공급된 다른 모든 군(고지방식이군 및 유산균 투여군)은 0.08로 나타나, 정상식이군보다 유의적으로 낮았으나, 고지방식이가 급이된 군간 유의적인 차이는 없었다. 이는 본 발명의 유산균 투여가 식욕에는 영향을 미치지 않으면서, 체중 증가 억제 효과의 달성이 가능함을 보여주는 결과이다.
(3) 간 및 지방 조직 무게
고지방식이 공급 후 8주차에, 고지방식이 공급으로 인한 간 및 지방 조직의 지방축적 정도를 조직 무게로서 확인하였다. 각 군의 마우스에서 간 및 지방 조직 (부고환, 장간막, 후복막, 신장주위 및 피하)의 무게를 측정하였다.
도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 고지방식이군 (1.14±0.13g)의 간 무게는 정상식이군 (0.98±0.05g)과 비교하여 160㎎ 증가하였다. 반면, 유산균 투여군은 락토바실러스 람노서스 MG4502가 0.92±0.08g, 락토바실러스 가세리 MG4524가 0.94±0.07g, 락토바실러스 루테리 MG5149가 0.93±0.16g, 와이셀라 시바리아 MG5285가 0.89±0.11g으로 나타나, 유산균 투여군 모두가 고지방식이군보다 유의하게 낮았다.
또한, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 장간막 지방은 정상식이군 (0.37±0.1g)과 비교하여, 고지방식이군(1.1±0.05g)에서 3배가량 증가하였으며, 유산균 투여군은 고지방식이군과 비교하여 20%가량 감소한 것으로 나타나, 유의적으로 낮았다.
또한, 도 3의 C에 나타낸 바와 같이, 신장주변의 지방 무게는 유산균 투여군 모두에서 고지방식이군에 비해 낮게 나타났다. 도 3의 D에 나타낸 바와 같이, 피하 무게는 고지방식이군이 2.6±0.4g으로 나타나, 0.3±0.06g인 정상식이군과 비교하여 8배가량 증가하였으며, 모든 유산균 투여군에서 평균 1.25g으로 나타나, 고지방식이군과 비교하여 50% 감소된 수치를 보였다.
간 무게를 제외한 추출된 지방 조직의 무게의 합은 체지방의 총량으로 계산되었다. 총 지방 조직 무게는 정상식군 (0.3±0.2g)과 비교하여 고지방식이군 (7.0±0.8g)은 23배 증가한 수치를 나타내었고, 유산균 투여군에서 각각 고지방식이 급이에 의한 지방 조직 증가를 감소시킴을 확인하였다.
이러한 결과는 간 및 지방 조직에서의 체중 증가가 고지방식이에 의해 야기된 조직에서의 지방축적으로 인한 것이라 판단할 수 있고, 본 발명의 유산균들은 모두 체지방 축적을 효과적으로 억제함을 보여주는 결과이다. 특히, 본 발명의 유산균은 고지방식이로 유도되는 내장지방의 축적을 억제하여, 단순히 체중감소뿐만 아니라 내장지방 억제에도 효과가 있음을 확인하였다.
(4) 혈청생화학적 검사
고지방식이 공급 후 8주차에, 고지방식이 공급으로 인한 혈액 내 생화학적 변화를 혈청분석으로 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, AST와 ALT 수준은 고지방식이군에서 유의적으로 증가하였다. 반면, AST 및 ALT 수준은 유산균 투여군 모두에서 고지방식이군과 비교하여 유의적으로 감소하였다.
LDL-C 수준 또한 고지방식이군에서 유의적으로 증가하였으나, 유산균 투여군 모두에서 유의적으로 감소하였다. 또한, LDL-C 수준은 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 2배 증가하였다. 반면, 유산균 투여군은 고지방식이군과 비교하여 모든 군에서 유의적으로 감소하였다.
혈청 내 렙틴(leptin)은 정상식이군에서 3.85±1.44ng/㎖로 나타났고, 고지방식이군은 52.00±4.83ng/㎖로 나타나 15배가량 증가하였다. 반면, 고지방식이에 의해 증가된 렙틴(leptin) 수준은 유산균 투여에 의해 현저히 감소하였다. 특히, 락토바실러스 루테리 MG5149 및 와이셀라 시바리아 MG5285군은 각각 28.90 ± 8.88 ng/㎖, 2959± 6.33 ng/㎖으로 가장 많이 감소하였다.
혈청 내 아디포넥틴(adiponectin)은 정상식이군에서 152.65±14.89㎍/㎖로 나타났고, 고지방식이군에서 93.42±7.86㎍/㎖로 나타나, 고지방식이군에서 40%가량 감소하였다. 반면, 감소된 아디포넥틴 수준은 유산균 투여군 모두에서 유의적으로 증가하였다. 특히, 와이셀라 시바리아 MG5285군에서 135.10±11.51㎍/㎖로 가장 많이 증가하였다.
(5) 간 조직의 조직병리학적 평가
정상식이군에서는 정상적인 간세포를 유지하고 있었으나, 고지방식이군 모두(고지방식이군 및 유산균 투여군의 유산균 처리 전 상태)에서는 지방증이 다양하게 나타나고, 주로 거대공포성 지방증 (Macrovesicular steatosis)이 관찰되었으며, 미세공포성 지방증 (microvesicular steatosis)도 관찰되었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 고지방식이군의 지방층 생성 수치는 2.88±0.99로 나타났으며, 락토바실러스 람노서스 MG4502 및 락토바실러스 가세리 MG4524는 평균 1.625, 락토바실러스 루테리 MG5149는 1.50±1.07, 와이셀라 시바리아 MG5285는 1.37±0.52로 나타나, 고지방식이군보다 낮은 수치를 나타내었다.
한국생명공학연구원 KCTC14188BP 20200515

Claims (14)

  1. 식욕저하에 영향을 미치지 않으면서 체중증가를 감소시키는 것을 특징으로 하는 체지방 감소능을 보유한 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는,
    내산성 및 내담즙성을 보유하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는,
    지방세포의 분화를 억제하고, 지방의 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP).
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 균주는,
    혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol)의 수준을 낮추는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 균주는,
    혈중 아스파르테이트아미노전달효소(aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌아미노전이효소(alanine aminotransferase; ALT)의 수준을 낮추는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 균주는,
    혈중 렙틴(leptin)의 수준을 낮추고, 혈중 아디포넥틴(adiponetin)의 수준을 높이는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP).
  8. 제1항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 체지방 감소용 식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 체지방은,
    간, 장간막, 신장주위 및 피하 중 선택되는 어느 하나에 위치하는 체지방인 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 식품 조성물.
  10. 제1항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 제1항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 체지방 감소용 건강기능식품 조성물.
  12. 제1항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  13. 제1항의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) MG4524 (KCTC 14188BP)를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 대사성 질환은,
    비만, 당뇨, 지방간, 고지혈증 및 지방증(steatosis) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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