KR102591595B1 - 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 나노 다이아몬드 및 이의 제조 방법 - Google Patents
알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 나노 다이아몬드 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 형광 나노 다이아몬드 및 이의 제조법에 관한것이다.
본 발명에서는 나노 다이아몬드의 표면에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 결합시켜 형광 방출을 조절하고, 수분산성을 향상시켜 바이오 이미징에 응용 할 수 있다.
본 발명에서는 나노 다이아몬드의 표면에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 결합시켜 형광 방출을 조절하고, 수분산성을 향상시켜 바이오 이미징에 응용 할 수 있다.
Description
본 발명은 바이오 이미징(bioimaging)에 사용할 수 있는 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 형광 나노 다이아몬드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
다기능성 나노입자는 독특한 전기적, 화학적, 광학적 및 자기적 성질을 가지고 있어, 바이오 분야에서 활발한 연구가 진행되고 있다. 다양한 나노입자 중에서, 풀러렌(fullerene), 탄소나노튜브(carbon nanotube, CNT), 그래핀(graphene), 흑연 및 나노 다이아몬드 (nanodiamond) 등의 탄소기반 나노입자는 조직공학, 유전자/약물 전달, 바이오센서(biosensors) 및 나노메디슨(nanomedicine)을 포함한 바이오 분야에서 응용이 되고 있다.
최근, 나노 다이아몬드와 같은 결정성 탄소기반 나노입자는 높은 기계적 강도, 열전도성, 광범위한 전기전도성 및 생체적합성이 뛰어나다는 연구 결과를 통해, 나노 신소재로 관심을 받고 있다. Chang 등은 형광 나노 다이아몬드를 제조하기 위하여 이온 빔 조사법을 이용하였다. 상기 형광 나노 다이아몬드는 초록 또는 빨강 방출, 지속적인 형광 그리고 뛰어난 광학안정성의 독특한 특징 때문에 바이오 이미징에 응용 할 수 있다는 가능성을 보였다. 또한, 질소 공동 중심 (nitrogen vancacy center)인 나노 다이아몬드는 수소 빔에 조사되었을 때 빨강 방출이 되는 것을 확인하였다. 그러나 이온 빔 조사법은 실험공정이 복잡하고 장비 값이 비싸기 때문에 한계점이 있었다.
이를 해결하기 위해, Mochalin 등은 옥타데실아민 (octadecylamine)을 나노 다이아몬드의 카르복실그룹에 아마이드 결합하여 파란 형광 나노 다이아몬드를 제조하였다(비특허문헌 1). 이들은 파란 형광이 나오는 기작은 나노 다이아몬드의 표면에 옥타데실아민이 폴리아로마틱(polyaromatic) 구조를 형성하기 때문이라고 설명하였다. 하지만 파란 형광 나노 다이아몬드는 옥타데실아민에 의해 물에 대한 분산성이 낮아지는 단점이 있어 바이오 분야에 응용하는데 어려움이 있었다.
따라서 형광 나노 다이아몬드를 바이오 이미징에 응용하기 위해서는 물에 대한 분산성 증진에 대한 연구가 요구된다.
1. Wet Chemistry Route to Hydrophobic Blue Fluorescent Nanodiamond, Vadym N. Mochalin and Yury Gogotsi, J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 4594-4595.
본 발명은 바이오 이미징(bioimaging)에 사용할 수 있는 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 형광 나노 다이아몬드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 나노 다이아몬드; 알킬화합물; 및 생분해성 고분자를 포함하며,
상기 알킬화합물은 나노 다이아몬드에 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합되어 있고, 상기 생분해성 고분자는 나노 다이아몬드에 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합되어 있으며,
상기 알킬화합물은 알킬 이소시아네이트인 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 나노 다이아몬드에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 결합시키는 단계를 포함하며,
상기 알킬화합물은 나노 다이아몬드에 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합되고, 상기 생분해성 고분자는 나노 다이아몬드에 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합되고,
상기 알킬화합물은 알킬 이소시아네이트인 전술한 나노입자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 바이오 이미징을 위해 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드의 표면에 친수성 고분자를 결합하여 물에 대한 분산 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서는 나노입자에서 상기 알킬화합물의 탄소 길이에 따른 형광 방출을 확인 및 조절하였다. 또한, 나노 다이아몬드에 결합된 알킬화합물의 농도를 최적화 하였으며, 높은 세포 생존률과 세포 내 조형 효과를 극대화 할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드의 독특한 광학적 특성, 생분해성 고분자에 의한 높은 생체적합성, 우수한 세포 생존력, 높은 청색 형광 및 장기간의 수분산성을 가져 진단 치료가 가능한 나노플랫폼으로 응용 할 수 있다. 이를 통해, 상기 나노입자는 질병이 생겼을 때 치료 부위를 정확히 진단하고 치료 효율의 극대화하기 위한 의료 및 생명 분야에 넓게 응용 될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명에 따른 나노입자의 제조 방법을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 2는 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 (A) 입자 크기 분포도와 표면 전하 (B) 입자 표면 모습 (C) 물 또는 유기용매에 대한 분산도 사진, 및 (D) UV흡광도를 나타낸다.
도 3은 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 탄소 길이에 따른 분산도를 확인하기 위하여, 21일 동안 크기 변화와 표면 전하 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 탄소 길이에 따른 형광 방출 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예에서 제조된 나노입자의 농도에 따른 형광 방출 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 세포 생존률을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 세포 내 조형 효과를 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 (A) 입자 크기 분포도와 표면 전하 (B) 입자 표면 모습 (C) 물 또는 유기용매에 대한 분산도 사진, 및 (D) UV흡광도를 나타낸다.
도 3은 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 탄소 길이에 따른 분산도를 확인하기 위하여, 21일 동안 크기 변화와 표면 전하 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 탄소 길이에 따른 형광 방출 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예에서 제조된 나노입자의 농도에 따른 형광 방출 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 세포 생존률을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 나노 다이아몬드 및 실시예에서 제조된 나노입자의 세포 내 조형 효과를 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 상기 종래의 실정을 감안하여 고안된 것으로서, 바이오 이미징에 사용할 수 있는 나노입자 및 이의 제조법을 제공한다.
본 발명의 나노입자는 나노 다이아몬드; 알킬화합물; 및 생분해성 고분자를 포함한다. 이때, 상기 알킬화합물은 나노 다이아몬드에 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합되어 있고, 상기 생분해성 고분자는 나노 다이아몬드에 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합되어 있다.
즉, 상기 나노입자는 나노 다이아몬드 표면에 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 구조를 가진다. 본 발명에서는 상기 나노입자를 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 나노 다이아몬드 또는 알킬화합물 및 생분해성 고분자로 개질 (modification)된 나노 다이아몬드로 표현할 수 있다.
본 발명에서 나노 다이아몬드는 표면에 결합된 알킬화합물에 의해 형광, 구체적으로 청색 형광을 방출하며, 바이오 이미징에 사용된다.
상기 나노 다이아몬드(Nano diamond, ND)는 결정성 탄소기반 나노 입자로써, 기계적 강도, 열전도성, 전기전도성 및 생체적합성이 뛰어나며, 화학적 안정성 및 분산 안정성이 우수하다. 따라서, 조직공학, 유전자/약물 전달, 바이오센서 및 나노메디슨 등을 포함한 바이오 분야에서 응용 가능하며, 최근 이러한 나노 다이아몬드의 연구가 증가하고 있는 추세이다.
상기 나노 다이아몬드는 중심부가 sp3 혼성괘도함수로 구성되는 결정 구조로, 표면은 sp2 오비탈 구조로 되어있다. 따라서 중심부는 다이아몬드의 특성을 그대로 유지하지만 표면은 반응성이 강하여 단글링 본드(Dangling bond)에 여러 원자나 분자가 화학 반응에 의하여 결합될 수 있는데 이들의 조성은 나노 다이아몬드를 어떤 방법으로 합성하느냐에 따라 달라진다. 입자의 표면에 존재하는 화학 결합들이 나노 다이아몬드 입자의 표면을 안정화시키는데 기여하고 또한 새로운 화학 반응을 통하여 다양한 관능기(Functional group)를 나노 다이아몬드의 표면에 부착시킬 수도 있다.
이러한 나노 다이아몬드를 제조하는 대표적인 기술로는 고온고압법, 충격파를 이용한 합성법, 화학증착법, 화학폭발법, 초음파법, 레이저법, 습식법 등이 있다. 그 중 화학증착법은 '국내 공개특허공보 제10-2006-0134515호, 경면 가공용 다이아몬드 공구제조를 위한 나노기상화학합성 다이아몬드 소재의 제조방법'과 같이 메탄 또는 수소와 같은 기체를 원료로 하고, 고온 및 저압 분위기 하에서 분해 및 합성에 필요한 에너지를 투입하는 기술이다. 또한 화학폭발법은 '국내 등록특허공보 제10-1203835호, 나노 다이아몬드 및 그 제조방법'와 같이 응축상 탄소에 비활성인 기체 매질에서 음의 산소 밸런스의 탄소포함 폭약 혼합물을 폭연하고 이를 정제하여 나노 다이아몬드를 제조하는 기술이다.
본 발명에서는 전술한 제조 방법을 통해 제조된 나노 다이아몬드를 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로, 고온고압법 또는 습식법을 통해 제조된 나노 다이아몬드를 사용할 수 있다.
또한, 나노 다이아몬드는 신경아세포, 대식세포, PC-12 세포와 같은 다양한 세포형태에 대해 독성을 띠지 않는다고 보고된 바 있다(Biocompatible and detectablecarboxylated nanodiamond on human cell, Kuang-Kai Liu1, Chia-Liang Cheng, Chia-Ching Chang and Jui-I Chao, Nanotechnology, 18 (2007) 325102). 따라서, 나노 다이아몬드는 바이오 이미징 등에 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 나노 다이아몬드의 표면에는 아민기 (amine group)가 형성되어 있다. 상기 나노 다이아몬드 표면의 아민기는 알킬화합물의 이소시아네이트기 (NCO-)와 우레아 결합을 형성하거나, 생분해성 고분자의 카르복실기 (COOH-)와 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
상기 나노 다이아몬드의 크기 (평균 입경)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 30 내지 250 nm일 수 있다. 상기 범위 내에서 수용액 또는 유기용매에서의 분산성이 우수하며, 형광 특성을 나타내어 바이오 이미징으로의 사용에 적합하다.
본 발명에서 알킬화합물은 나노 다이아몬드에 결합하여 형광 특성을 나타낸다.
상기 알킬화합물은 알킬 이소시아네이트이며, 탄소수 8 내지 20의 알킬 이소시아네이트일 수 있다. 구체적으로 상기 알킬 이소시아네이트 (ISO)는 헥실이소시아네이트 (HI), 옥틸이소시아테이트 (OI), 데실이소시아네이트 (DI), 도데실이소시아네이트 (DDI), 테트라데실이소시아네이트 (TDI) 및 옥타데실이소시아네이트 (ODI)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 알킬 이소시아네이트의 사슬 길이, 즉 알킬기의 탄소수가 증가할수록 나노 다이아몬드의 형광 강도가 증가한다.
본 발명에서 상기 알킬 이소시아네이트의 이소시아네이트기는 나노 다이아몬드의 아민기와 우레아 결합을 통해 결합될 수 있다.
본 발명에서 생분해성 고분자는 나노 다이아몬드의 수분산성을 향상시키기 위해 사용된다.
구체적으로, 상기 생분해성 고분자는 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드에 결합되어, 종래 수중에서 분산이 어려웠던 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드의 분산성을 향상시킬 수 있다.
이러한 생분해성 고분자는 그 구조 내에 카르복실기를 포함한다. 상기 생분해성 고분자의 카르복실기는 나노 다이아몬드의 아민기와 아마이드 결합을 통해 결합될 수 있다.
이러한 생분해성 고분자로 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리에틸이민, 키토산, 히알루론산, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniy alcohol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(poly acrylicacid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 전술한 종류의 고분자들은 그 구조 내에 카르복실기 (-COOH)를 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 생분해성 고분자로 폴리에틸렌글리콜 카르복실 메틸산 (poly(ethylene glycol) carboxyl methyl acid, mPEG-COOH)을 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노입자는 나노 다이아몬드의 아민기에 알킬화합물, 구체적으로 알킬 이소시아네이트가 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합되어 있고, 생분해성 고분자가 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합된 구조를 가진다. 이에 의해 본 발명에 따른 나노 입자는 형광 방출이 가능하면서도, 증가된 수분산성을 부여할 수 있다.
상기 나노입자의 크기 (평균 입경)은 30 내지 250 nm일 수 있다. 상기 범위 내에서 수용액 또는 유기용매에서의 분산성이 매우 우수하며, 형광 특성을 나타내어 바이오 이미징으로의 사용에 적합하다.
또한, 본 발명은 전술한 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자의 제조 방법은 나노 다이아몬드에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 나노입자는 나노 다이아몬드 표면에 알킬화합물 및 생분해성 고분자가 결합된 구조를 가질 수 있다. 상기 나노 다이아몬드 표면에의 알킬화합물 및 생분해성 고분자의 결합은 동시에 수행될 수 있으며, 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 나노 다이아몬드를 포함하는 용액에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 동시에 첨가하여 반응시는 방법으로 나노입자를 제조할 수 있다. 일 구체예에서, 나노 다이아몬드를 포함하는 용액에 알킬화합물을 첨가하여 반응시킨 후, 생분해성 고분자를 첨가하여 반응시키는 방법으로 나노입자를 제조할 수 있다. 또한, 일 구체예에서 나노 다이아몬드를 포함하는 용액에 생분해성 고분자를 첨가하여 반응시킨 후, 알킬화합물을 첨가하여 반응시키는 방법으로 나노입자를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 나노 다이아몬드에 알킬화합물을 결합시키는 단계; 및
상기 단계에서 제조된 나노 다이아몬드에 생분해성 고분자를 결합시키는 단계를 통해 나노입자를 제조할 수 있다.
상기 나노 다이아몬드에 알킬화합물을 결합시키는 단계에서는 알킬화합물이 나노 다이아몬드에 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합을 형성하여, 나노 다이아몬드-알킬화합물 (또는 알킬 이소시아네트), 즉 ND-ISO가 제조될 수 있다. 이때, 알킬화합물은 알킬 이소시아네이트일 수 있으며, 상기 알킬 이소시아네이트로 전술한 종류를 제한없이 사용할 수 있다.
상기 단계에서 알킬화합물의 함량은 나노 다이아몬드 100 중량부에 대하여 0.0001 내지 10 중량부 또는 0.001 내지 1 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계는 나노 다이아몬드를 포함하는 용액에 알킬화합물을 포함하는 용액을 첨가하여 수행하는데, 이때 알킬화합물의 농도는 0.001 내지 1.0 mM일 수 있다. 상기 범위에서 형광 방출 강도가 우수하다. 농도가 1 mM을 초과하는 경우 방출 강도가 오히려 저하되므로, 전술한 범위로 조절하는 것이 좋다.
본 발명에서는 나노 다이아몬드에 알킬화합물을 결합시킨 후에, 상기 나노 다이아몬드에 생분해성 고분자를 결합시키는 단계를 수행한다.
이때, 생분해성 고분자로는 전술한 종류를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 폴리에틸렌글리콜 카르복실 메틸산 (poly(ethylene glycol) carboxyl methyl acid, mPEG-COOH)을 사용하였다.
상기 단계에서는 나노 다이아몬드에 생분해성 고분자가 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합되어, 생분해성 고분자-나노 다이아몬드-알킬화합물 (또는 알킬 이소시아네트), 생분해성 고분자-ND-ISO, 즉 나노입자가 최종 제조될 수 있다.
상기 단계에서 생분해성 고분자의 함량은 나노 다이아몬드 100 중량부에 대하여 0.001 내지 10 중량부 또는 0.01 내지 5 중량부일 수 있다.
또한, 생분해성 고분자의 분자량은 5000 이하, 3000 이하, 또는 2000 이하일 수 있다. 상기 범위 내에서 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드에 우수한 수분산성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 도 1은 알킬화합물, 구체적으로 알킬이소시아네이트 (ISO) 및 생분해성 고분자가 결합된 나노 다이아몬드, 즉 나노입자의 제조 방법을 개략적으로 도시한 모식도이다.
상기 도 1에서는 생분해성 고분자로 mPEG-COOH를 사용하였다. 나노 다이아몬드 표면에 있는 아민기는 먼저 우레아 결합을 통해 ISO와 결합되고, 이어서 아마이드 결합을 통해 mPEG-COOH와 결합된다.
본 발명에 따른 나노입자 및 나노입자의 제조방법은 하기와 같은 특징을 가진다.
첫 번째 특징은 나노 다이아몬드의 표면에 알킬화합물을 결합하여 형광을 방출한 것에 있다. 나노 다이아몬드와 알킬화합물은 특정 빛을 조사하였을 때 형광 방출이 불가능하지만, 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드는 형광 방출이 가능하다. 이러한 특성으로 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드는 높은 생체적합성 및 독특한 광학적 특성으로 진단치료가 가능한 나노플랫폼으로 응용될 수 있다.
두 번째 특징은 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드의 표면에 항암제, 단백질, 유전자 및 항생제 등과 같은 치료용 재료의 사용이 가능하다는 것에 있다. 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드의 표면에는 다양한 관능기가 있어, 질병에 맞는 약물을 추가하여 제조가 가능하다. 구체적으로, 본 발명에 따른 나노 다이아몬드는 표면에 아민기를 가지며 상기 아민기에 치료용 재료가 결합될 수 있다. 또는 나노 다이아몬드는 아민기 외의 다른 관능기, 예를들어, 카르복실기 등의 관능기를 가져 상기 상기 다른 관능기에 치료용 재료가 결합될 수 있다. 따라서, 치료의 목적에 따라 종양, 골다공증 및 뇌종양 등의 다양한 질병 치료에 다양하게 적용할 수 있다.
세 번째 특징은 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드의 분산성을 증가하는데 있다. 본 발명에서는 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드에 친수성 소재, 즉 생분해성 고분자를 결합하여 분산도를 극대화할 수 있다.
또한, 네 번째 특징은 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드에서 알킬화합물의 탄소 길이와 농도에 따라 광학적 특성이 변하는 것에 있다. 본 발명에서는 나노 다이아몬드에 결합된 알킬화합물의 종류와 농도에 따라 형광의 조절이 가능하여, 바이오 이미징 뿐만 아니라 진단치료, 바이오센서 등과 같은 분야에 응용 범위가 넓다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예
1.
알킬화합물
및 생분해성 고분자가
결합된
형광 나노 다이아몬드 (나노입자) 및 이의 제조
(1) 단계 1:
알킬화합물이
결합된
나노 다이아몬드 분산액 제조_ND-ISO 제조
나노다이아몬드(Neomond, Korea) 30 mg을 디메틸포름아마이드 (N,N-dimethyl formamide, DMF) 15 mL에 넣고, 초음파 (Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA)를 사용하여 24 시간 동안 교반하여 나노 다이아몬드 분산액 (30 mg/15 mL DMF)을 제조하였다. 알킬화합물 (헥실이소시아네이트, 옥틸이소시아테이트, 데실이소시아네이트, 도데실이소시아네이트, 테트라데실이소시아네이트 또는 옥타데실이소시아네이트) 1 mM를 5 mL DMF에 각각 녹였다.
상기 나노다이아몬드 분산액 (30 mg/15 mL DMF)에 알킬화합물 (5 mL DMF)를 각각 넣고, 24 시간 동안 상온에서 교반하고, 투석 및 동결건조 하여, 알킬화합물이 결합된 나노다이아몬드 분산액을 제조하였다.
(2) 단계 2:
알킬화합물이
결합된
나노 다이아몬드의 분산성 향상_mPEG-ND-ISO 제조
폴리에틸렌글리콜 (mPEG-COOH)는 DMTMM (4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)과의 아미드 결합 형성에 의해 상기 알킬화합물이 결합된 나노다이아몬드에 결합되었다.
구체적으로, 상기 단계 1에서 제조된 알칼화합물이 결합된 나노 다이아몬드 분산액 (5 mL DMF)에 폴리에틸렌글리콜 (mPEG-COOH) 5g 및 DMTMM 70 mg을 첨가하고, 24 시간동안 실온에서 교반하였다. 2일 동안 투석 후, mPEG-COOH로 개질된 나노 다이아몬드를 제조하였다.
실험예
1: 나노입자 (mPEG-ND-ISO) 특성 측정
나노 다이아몬드 (ND) 및 실시예에서 제조된 나노입자의 특성을 제타전위/사이즈 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)와 UV/vis 스펙트로포토미터 (PerkinElmer, Norwalk, CT, USA)로 측정을 하였으며, 표면 형태를 주사전자현미경 (Hitachi, Tokyo, Japan)을 통해 측정하였다.
상기 실험예에서는 알킬화합물로 옥타데실 이소시아네이트 (ODI)를 사용하였다. ND, ND-ODI 및 mPEG-ND-ODI (0.1 중량%)를 탈이온수 (D.W.)에 분산시키고, 이들의 제타 전위 및 크기를 21 일 동안 측정 하였다.
(1) 입자 크기 분포도 및 표면 전하 측정
본 발명의 도 2A는 나노 다이아몬드 (ND) 및 나노입자 (mPEG-ND-ODI)의 입자 크기 분포도 및 표면 전하를 측정한 결과를 나타낸다.
ND 및 mPEG-ND-ODI는 각각 22.3 ± 6.5 nm 및 37.6 ± 10.7 nm의 평균 크기를 가진다. mPEG-ND-ODI는 mPEG-COOH와 ODI에 의해 표면이 변형되었으므로, ND 보다 더 큰 크기를 가진다.
ND의 제타 전위는 36.5 ± 6.4 mV로 측정되었다. 이는 ND 표면에 존재하는 아민기의 존재에 의한 것이다. mPEG-ND-ODI의 제타 전위는 26.6 ± 0.5 mV로 측정되었으며, 이는 ODI와의 결합에 의한 ND의 아민기의 감소에 의한 것이다.
(2) 입자 표면 모습 측정
본 발명의 도 2B는 나노입자 (mPEG-ND-ODI)의 입자 표면을 측정한 SEM 이미지이다.
상기 도 2B에서 scale bars의 크기는 50 nm로, 37.6 ± 10.7 nm 크기를 가지는 mPEG-ND-ODI가 제조된 것을 확인할 수 있다.
(3) 물 또는
유기용매에
대한 분산도 측정
본 발명의 도 2C는 나노 다이아몬드 (ND), 옥타데실 이소시아네이트가 결합된 나노 다이아몬드 (ND-ODI) 및 나노입자 (mPEG-ND-ODI)의 물 또는 유기용매에 대한 분산도를 측정한 결과를 나타내는 이미지이다. 구체적으로, ND, ODI-ODI 및 mPEG-ND-ODI의 물에서의 분산성 및 ND-ODI의 클로로포름 (CF)에서의 분산성을 나타낸다.
상기 ND-ODI는 표면에 결합된 ODI의 긴 소수성 사슬로 인해 10 분 이내에 물에서 완전히 침전되며, 클로로포름 등의 유기용매의 사용시에만 완전히 분산된다. 그러나, mPEG-ND-ODI는 소수성인 ODI의 결합에도 불구하고 물에 잘 분산되며, 우수한 수분산성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
(4) UV 흡광도 측정
본 발명의 도 2D는 나노 다이아몬드 (ND), 폴리에틸렌글리콜 (mPEG-COOH) 및 옥타데실 이소시아네이트가 결합된 나노 다이아몬드 (ND-ODI) 및 나노입자 (mPEG-ND-ODI)의 UV 흡광도를 측정한 결과를 나타낸다.
ND와 mPEG-COOH는 특징적인 피크를 보이지 않았지만, ND-ODI와 mPEG-ND-ODI의 경우 넓은 흡광도 스펙트럼과 342 nm에서 뚜렷한 특성 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실험예
2: 나노입자에서
알킬화합물의
탄소 길이와 농도에 따른 형광의 변화 측정
나노 다이아몬드 및 실시예 1에서 제조된 나노입자의 광학적 특성을 확인하였다.
구체적으로, ND 및 mPEG-ND-ISO의 수성 분산액 (0.1 mL)을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가 하였다. 상대 형광 강도 (relative fluorescence intensity, RFU) 스펙트럼은 150-W Xe 램프 (Biotek, Winooski, VT, USA)를 사용하는 형광스펙트로포토미터로 측정 하였다. 방출 스펙트럼 (emission spectra)은 320 nm에서 여기 될 때 600 내지 350 nm의 파장 범위에서 기록되었다. 방출의 슬롯 폭은 10.0 nm였다.
본 발명에서 도 3은 나노 다이아몬드 (ND), mPEG-ND, 나노입자 (mPEG-ND-HI, mPEG-ND-TDI 및 mPEG-ND-ODI)의 탄소 길이에 따른 분산도를 확인하기 위하여, 21일 동안 크기 변화와 표면 전하 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
형광 특성에 대한 알킬화합물의 알킬 사슬 길이의 효과를 평가하기 위해, 상이한 사슬 길이를 가지는 알킬화합물 (HI, TDI 및 ODI)이 나노 다이아몬드에 결합되었다. 그 결과, ND의 크기 및 제타 전위 모두 21일 동안 유의적으로 변화하지 않았으며, 우수한 안정성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에서 도 4는 나노 다이아몬드와 나노입자에서 알킬화합물의 탄소 길이에 따른 형광 방출 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프로, 구체적으로, ND, mPEG-ND-HI, mPEG-ND-OI, mPEG-ND-DI, mPEG-ND-DDI, mPEG-ND-TDI, 및 mPEG-ND-ODI (0.1 wt%)의 (A) 방출 스펙트럼 및 (B) 방출 강도를 나타내는 그래프이다. 여기 파장은 350 nm로 유지되었다.
결과, ND 그 자체는 매우 약한 방출 스펙트럼을 가지는데, 이는 디토네이션 ND 코어 (detonation ND core)에 질소의 양이 조금이라도 존재했기 때문으로 여겨진다. ND 및 mPEG-ND-ISO들 중 방출 피크의 파장 길이에 약간의 변화가 있었다. 특히, mPEG-ND-ODI는 다른 것들보다 넓은 방출 스펙트럼과 강한 형광 강도를 보였다. mPEG-ND-ODI의 강도는 ND의 약 7배였다. mPEG-ND-ODI의 블루 형광 (blue fluorescence)은 부분 열 분해 (partial thermal degradation) 및 사슬 형태 (chain configurations)에 의해 발생되는 ND에 연결된 ODI의 지방족 사슬의 (폴리)방향족 유사 구조에 기인한 것으로 여겨진다.
도 4B에서 확인할 수 있듯이, 410 nm에서의 방출 강도는 알킬 ISO의 사슬 길이가 증가함에 따라 4606 ± 363에서 10984 ± 426 RFU로 증가하였다.
또한, mPEG-ND-ODI 표면에서의 ODI의 농도를 변화시켜, ODI 농도가 방출 강도에 미치는 영향을 평가 하였다.
본 발명에서 도 5는 ODI가 결합된 나노 다이아몬드에서 ODI의 농도에 따른 형광 방출 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프로, 410 nm에서의 방출 강도의 변화를 도시한다.
410 nm에서의 방출 강도는 0.001에서 1 mM까지 ODI의 결합 농도가 증가함에 따라 1444 ± 328에서 10725 ± 492 RFU로 증가하였다. 1 mM 이상의 농도에서는 형광 강도가 급격히 감소한 것을 확인할 수 있다.
이러한 형광 강도의 감소는 수 중에서 많은 ODI 분자를 가지는 mPEG-ND-ODI의 낮은 수분산성에 기인한다. 따라서, ODI 농도가 1 mM인 mPEG-ND-ODI를 세포 영상 실험에 사용하였다.
실험예
3: 나노입자의 세포
생존률
측정
나노 다이아몬드 및 상기 실시예 1에서 제조된 나노입자를 섬유아세포 (NIH/3T3)에 0.1 mL 처리하여 세포 생존률을 확인하였다.
구체적으로, NIH/3T3 세포에 대한 ND, mPEG-ND-HI, mPEG-ND-TDI, 및 mPEGND-ODI의 세포 독성을 CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo Co. Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 평가하고, 생존률은 죽은 세포의 수를 전체 세포의 수로 나눈 값으로 계산하였다.
나노입자의 농도는 20-100 μg/mL로 조절되었다. 각각의 웰에 상이한 ND, mPEG-ND-HI, mPEG-ND-TDI, 및 mPEG-ND-ODI 나노 입자 농도를 갖는 수용액 (0.1 mL)을 첨가 한 후, 24 시간 배양 한 후 세포 독성을 측정하였다. ND 처리된 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.
본 발명에서 도 6은 NIH/3T3를 사용한 ND, mPEG-ND-HI, mPEG-ND-TDI, 및 mPEG-ND-ODI의 시험관 내 (in vitro) 세포 생준률을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
모든 ND 및 mPEG-ND-ISO는 우수한 세포 생존 능력을 가지는 것을 확인할 수 있다.
실험예
4: 나노입자의 세포 흡수 및 바이오
이미징을
측정
상기 실시예 1에서 얻은 알킬화합물이 결합된 나노 다이아몬드를 섬유아세포에 0.1 mL를 처리하여 공초점현미경을 통해 세포 내 흡수를 확인하였다.
먼저, ND 및 mPEG-ND-ISO의 세포 내 분포를 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 통해 NIH/3T3 세포를 사용하여 평가 하였다. 구체적으로, 세포를 1 x 105 cells/mL의 밀도로 1 mL DMEM (Dulbecco's phosphate-buffered saline)을 함유하는 8-웰 세포 배양 슬라이드 글라스에 씨딩하였다 (배양 배지는 10% FBS과 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신)가 보충된 DMEM으로 구성됨, Welgene Inc., Korea). 24 시간 배양한 후, 원래의 배지를 100 ㎍/mL ND 및 mPEG-ND-ISO를 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 12 시간 후, 세포를 DBPS로 3 회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 15 분간 고정시켰다. 마지막으로, 세포 형태 및 나노 입자 분포를 CLSM으로 관찰하였다.
도 7은 나노 다이아몬드와 나노 다이아몬드에 결합된 알킬화합물의 세포 내 조형 효과를 측정한 결과를 나타내는 사진으로, 밝은 필드, 405 nm에서 여기하에서 NIH/3T3 세포의 공초점현미경 이미지를 나타낸다.
ND로 처리한 세포와는 달리, 405 nm의 여기 파장하에서 mPEG-ND-TDI 및 mPEG-ND-ODI가 세포 내부에서 관찰되었다. 이 결과는 mPEG-ND-ISO, 특히 mPEG-ND-ODI가 세포에 의해 흡수되어 세포 생물 이미징을 위한 유용한 나노 플랫폼이 될 수 있음을 나타낸다.
Claims (10)
- 나노 다이아몬드; 알킬화합물; 및 생분해성 고분자를 포함하며,
상기 알킬화합물은 나노 다이아몬드에 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합되어 있고, 상기 생분해성 고분자는 나노 다이아몬드에 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합되어 있으며,
상기 알킬화합물은 알킬 이소시아네이트인 바이오 이미징용 나노입자.
- 제 1 항에 있어서,
나노 다이아몬드는 표면에 아민기가 형성되어 있는 나노입자.
- 제 1 항에 있어서,
알킬 이소시아네이트는 헥실이소시아네이트, 옥틸이소시아테이트, 데실이소시아네이트, 도데실이소시아네이트, 테트라데실이소시아네이트 및 옥타데실이소시아네이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 나노입자.
- 제 1 항에 있어서,
생분해성 고분자는 그 구조 내에 카르복실기를 포함하는 나노입자.
- 제 4 항에 있어서,
생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리에틸이민, 키토산, 히알루론산, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniy alcohol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(poly acrylicacid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 나노입자.
- 제 1 항에 있어서,
나노입자의 크기는 30 내지 250 nm인 나노입자.
- 나노 다이아몬드에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 결합시키는 단계를 포함하며,
상기 알킬화합물은 나노 다이아몬드에 우레아 결합 (-N-C(=O)-N-)을 통해 결합되고, 상기 생분해성 고분자는 나노 다이아몬드에 아마이드 결합 (-N-C(=O)-)을 통해 결합되고,
상기 알킬화합물은 알킬 이소시아네이트인 제 1 항에 따른 바이오 이미징용 나노입자의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서,
나노 다이아몬드에 알킬화합물 및 생분해성 고분자를 결합시키는 단계는
나노 다이아몬드에 알킬화합물을 결합시킨 후, 상기 알킬화합물이 결합된 나노다이아몬드에 생분해성 고분자를 결합시키는 나노입자의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서,
나노 다이아몬드에 알킬화합물을 결합시키는 단계에서 나노 다이아몬드 100 중량부에 대하여 알킬화합물을 0.0001 내지 10 중량부 사용하는 나노입자의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서,
나노 다이아몬드에 생분해성 고분자를 결합시키는 단계에서 나노 다이아몬드 100 중량부에 대하여 생분해성 고분자를 0.001 내지 10 중량부 사용하는 나노입자의 제조 방법.
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