KR102591021B1 - Composition for clrearing of organoids, clarity method for organoid using the same - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서는 EDTA를 포함하는 계면활성제(detergent) 및 지질 대체제(lipid replacement)를 포함하는 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법을 제공한다.The present specification provides a clearing composition for organoids containing a surfactant (detergent) including EDTA and a lipid replacement (lipid replacement), and a method for clearing organoids using the same.

Description

오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법 {COMPOSITION FOR CLREARING OF ORGANOIDS, CLARITY METHOD FOR ORGANOID USING THE SAME}Transparency composition for organoids and method for organoid transparency using the same {COMPOSITION FOR CLREARING OF ORGANOIDS, CLARITY METHOD FOR ORGANOID USING THE SAME}

본 발명은 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a clearing composition for organoids and a method for clearing organoids using the same.

새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양된다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다. Organoids are attracting attention as a new human body simulation model. Organoids are formed by growing stem cells into specific cells to form three-dimensional structures such as organs. Organoids are cultured in a three-dimensional environment, unlike two-dimensional cell-based models. In addition, organoids are only small in size, but their constituent cells and structure are similar to actual organs. Accordingly, organoids are evaluated as the optimal test object for examining the efficacy and stability of drugs in the process of developing new drugs. Furthermore, the organoid-related field is a field with high potential that can be used not only for drug toxicity and efficacy evaluation in new drug development, but also for disease models, cancer research, personalized medicine, and regenerative treatments.

한편, 약물의 효능 및 안정성에 대한 오가노이드를 평가하기 위해서는 보통 오가노이드를 얇은 슬라이스로 잘라낸 뒤, 이를 광학(현미경) 및 형광으로 관찰하거나, 분석 과정을 통하여 이상 여부를 확인한다. 그러나, 이와 같은 작업은 전문적인 기술이 요구되며, 나아가, 시간이 많이 소요되고, 실험자, 환경 및 샘플 상태 등의 다양한 요인에 의하여 부정확한 결과를 초래할 수 있다. 또한, 광원이 침투될 수 있는 깊이에 의해 관찰되는 영역이 제한될 수 있으며, 슬라이스되어 관찰된 오가노이드 결과를 다시 이미징한 뒤, 재구성해야하는 과정이 추가적으로 필요할 수 있다. 나아가, 슬라이스 과정으로 인하여, 오가노의드의 결합 또는 연결 부위 등의 관찰이 어려울 수 있다. Meanwhile, in order to evaluate organoids for drug efficacy and stability, organoids are usually cut into thin slices and then observed with optical (microscope) and fluorescence, or abnormalities are checked through an analysis process. However, such work requires specialized skills, is time consuming, and can lead to inaccurate results depending on various factors such as the experimenter, environment, and sample condition. In addition, the observed area may be limited by the depth at which the light source can penetrate, and an additional process may be required to re-image and reconstruct the sliced and observed organoid results. Furthermore, due to the slicing process, it may be difficult to observe the binding or connection site of the organopod.

따라서, 보다 용이한 관찰 방법으로, 오가노이드를 투명하게 만드는 것이 가장 바람직할 수 있다. 그러나, 투명화 기술에서 가장 문제 요소는 지질(lipids)이다. 지질은 지방이 포함된 왁스와 같은 물질로서, 빛이 조직을 통과하지 못하도록 차단함에 따라, 오가노이드 투명화 기술에 있어서 지질의 제거는 필수적이다. 그러나, 지질은 오가노이드와 같은 구조체 즉, 조직 및 세포의 구조를 형성하는 역할을 하기 때문에 지질을 제거하게 되면 오가노이드를 포함하는 다양한 구조체의 구조가 붕괴될 수 있다.Therefore, it may be most desirable to make the organoids transparent for easier observation. However, the most problematic element in transparency technology is lipids. Lipids are wax-like substances containing fat, and as they block light from passing through tissues, their removal is essential in organoid transparency technology. However, because lipids play a role in forming structures such as organoids, that is, tissues and cells, removing lipids may cause the structure of various structures, including organoids, to collapse.

이에, 이러한 지질을 제거하고, 지질을 대신하여 구조체의 구조를 유지할 수 있는 조직 투명화 방법이 많이 개발되고 있으나, 종래의 기술은 세포, 스페로이드 및 생체 내 조직에 대해서만, 적용이 가능하며, 보다 촘촘한 구조가 형성되어 있는 오가노이드에 적용되기 어려운 실정이다.Accordingly, many tissue transparency methods have been developed to remove these lipids and maintain the structure of the construct instead of lipids. However, the conventional technology is applicable only to cells, spheroids, and in vivo tissues, and more dense It is difficult to apply it to organoids with already formed structures.

발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. The technology behind the invention has been written to facilitate easier understanding of the invention. It should not be understood as an admission that matters described in the technology underlying the invention exist as prior art.

조직 투명화 기술에 있어, 종래의 기술인 CLARITY는 조직 내 하이드로겔(Hydrogel)을 추가하여 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 중요 물질들을 붙잡아주는 일종의 조직 내 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법이다. CLARITY 방법은 지질의 제거 및 지지체의 침투를 위하여 전기영동 및 스터링(stirring)과 같은 기계적인 방법이 사용된다. 이에, CLARITY 방법은 전술한 바와 같이 기계적인 방법이 수행되어야 함에 따라, 오가노이드에 손상을 야기할 수 있다. 나아가, CLARITY 방법은 하이드로겔을 지지체로 사용함에 따라, 하이드로겔이 단백질과 결합하여 조직이 단단해지고, 이로 인하여 지질이 빠져나가기 어려워져 투명화의 시간이 길어진다. In terms of tissue transparency technology, CLARITY, a conventional technology, is a method of adding hydrogel to the tissue to create a network support within the tissue that holds important substances important for diagnosis, such as DNA and proteins, and then selectively removing only the lipids. The CLARITY method uses mechanical methods such as electrophoresis and stirring to remove lipids and penetrate the support. Accordingly, the CLARITY method may cause damage to the organoids as it must be performed mechanically as described above. Furthermore, as the CLARITY method uses hydrogel as a support, the hydrogel binds to protein and the tissue becomes hard, which makes it difficult for lipids to escape, prolonging the time for transparency.

한편, 본 발명의 발명자들은 종래의 조직 투명화 기술들이 주로 단일 성분을 이용하여, 지질을 제거하거나 대체한다는 것을 주목하였다. 보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 조직 투명화에 있어, 단일 성분의 구성이 아닌 보다 다양한 구성의 계면활성제 및 지질 대체체가 조성물로서 조합될 경우, 전술한 CLARITY처럼 기계적인 방법이 수행되지 않고도, 조직의 지질을 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. Meanwhile, the inventors of the present invention noted that conventional tissue clearing technologies mainly use a single component to remove or replace lipids. More specifically, the inventors of the present invention have discovered that, in tissue transparency, when a more diverse composition of surfactants and lipid substitutes, rather than a single component, are combined as a composition, tissue transparency can be achieved without performing a mechanical method like the CLARITY described above. It was discovered that lipids can be removed.

특히, 본 발명의 발명자들은 전술한 다양한 구성의 계면활성제 및 지질 대체체를 특정 비율로 조합할 경우, 세포, 스페로이드 및 생체 조직뿐만 아니라 오가노이드에서도 효과적으로 투명화시킬 수 있다는 것을 발견하였다.In particular, the inventors of the present invention discovered that when the above-described various compositions of surfactants and lipid substitutes are combined in a specific ratio, it is possible to effectively make transparent not only cells, spheroids, and biological tissues, but also organoids.

이에, 본 발명의 발명자들이 해결하고자 하는 과제는, 고가의 전기 영동 장치와 같은 기계가 필요하지 않으며, 또한, 기계적인 방법이 수행되지 않아도 됨에 따라, 오가노이드를 포함하는 다양한 시료를 손상 없이 투명화시킬 수 있는 투명화 조성물 및 이를 이용한 투명화 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, the problem to be solved by the inventors of the present invention is to make various samples, including organoids, transparent without damage, without requiring a machine such as an expensive electrophoresis device and without performing a mechanical method. The aim is to provide a transparent composition and a transparent method using the same.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. The problems of the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 포함하는 계면활성제(detergent) 및 지질 대체제(lipid replacement)를 포함하는, 오가노이드용 투명화 조성물을 제공한다.In order to solve the problems described above, according to one embodiment of the present invention, the present invention provides transparency for organoids, including a surfactant (detergent) containing EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and a lipid replacement (lipid replacement). A composition is provided.

본 발명의 특징에 따르면, 오가노이드용 투명화 조성물은, 라피클리어(Rapiclear)를 더 포함할 수 있으며, 이때 라피클리어는 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 0 내지 10 w/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 오가노이드의 크기 및 종류에 따라, 다양하게 설정될 수 있다.According to a feature of the present invention, the clarifying composition for organoids may further include Rapiclear, and in this case, Rapiclear may be 0 to 10 w/v % of the clarifying composition for organoids, but is limited thereto. This does not mean that it can be set in various ways, depending on the size and type of organoid.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 계면활성제는, SDS(N,N,N′′Triton X-100 또는 쿼드롤(Quadrol) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포 투명화에 사용되어 지질을 제거할 수 있는 다양한 계면활성제를 모두 포함할 수 있다. 이때, SDS는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 15 내지 25 w/v %이고, Triton X-100는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 15 내지 25 w/v %이고, 쿼드롤(Quadrol)는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 15 내지 25 w/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to another feature of the present invention, the surfactant may further include, but is not limited to, at least one of SDS (N,N,N′′Triton It may contain all of a variety of surfactants that can be used to remove lipids. At this time, SDS is 15 to 25 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids, and Triton 15 to 25 w/v %, and Quadrol may be 15 to 25 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 지질 대체체는, 아크릴아마이드(Acrylamide), 우레아(urea) 또는 글리세롤(glycerol) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포 투명화에 사용되어 지질을 대신하여, 구조를 유지할 수 있는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다. 이때, 아크릴아마이드(Acrylamide)는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 0 내지 5 w/v %이고, 우레아(urea)는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 10 내지 30 w/v %이고, 글리세롤(glycerol)는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 5 내지 10 w/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the lipid substitute may include at least one of acrylamide, urea, or glycerol, but is not limited thereto, and is used for cell transparency to remove lipids. Instead, it can contain a variety of substances that can maintain their structure. At this time, acrylamide is 0 to 5 w/v % based on the clearing composition for organoids, urea is 10 to 30 w/v % based on the clearing composition for organoids, and glycerol ) may be 5 to 10 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 계면활성제는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 46 내지 80 w/v %이고, 지질 대체체는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 15 내지 45 w/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 계면활성제 및 지질 대체체는, 수용성일 수 있다.According to another feature of the present invention, the surfactant may be in an amount of 46 to 80 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids, and the lipid substitute may be in an amount of 15 to 45 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids. However, it is not limited thereto, and the surfactant and lipid substitute may be water-soluble.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 오가노이드용 투명화 조성물은, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 메탄올, 아세톤, 단당류, 이당류 또는 다당류 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 투명화처리 이전에, 오가노이드를 포함하는 다양한 생물학적 시료에 대하여 고정할 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.According to another feature of the present invention, the clearing composition for organoids may further include at least one of glutaraldehyde, formaldehyde, methanol, acetone, monosaccharide, disaccharide, or polysaccharide, but is limited thereto. This does not mean that it can be used, and it can contain all materials that can be fixed to various biological samples, including organoids, before the transparency treatment.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, EDTA는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 1 내지 5 w/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, EDTA may be in an amount of 1 to 5 w/v % based on the clarifying composition for organoids, but is not limited thereto.

전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 오가노이드(organoid)를 오가노이드용 투명화 조성물과 접촉시켜 투과(permeabilization)시키는 단계를 포함할 수 있다.In order to solve the problems described above, according to one embodiment of the present invention, the present invention may include a step of permeabilizing an organoid by contacting it with a transparent composition for organoids.

본 발명의 특징에 따르면, 오가노이드는, 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 중 적어도 하나로부터 유래하여 분화되거나, 뇌, 혈관, 간, 폐, 신장, 췌장, 심장 또는 장 중 적어도 하나의 장기로부터 유래한 세포로부터 분화될 수 있다.According to a feature of the present invention, the organoid is derived from at least one of adult stem cells (ASC), embryonic stem cells (ESC), and induced pluripotent stem cells (iPSC). or can be differentiated from cells derived from at least one organ of the brain, blood vessels, liver, lung, kidney, pancreas, heart, or intestine.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 투과시키는 단계는, 35 내지 45 ℃에서 10 내지 30 시간동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 오가노이드를 포함하는 다양한 생물학적 시료에 대한 크기 및 종류에 따라, 다양하게 설정될 수 있다.According to another feature of the present invention, the permeabilization step may be performed at 35 to 45 ° C. for 10 to 30 hours, but is not limited thereto, depending on the size and type of various biological samples including organoids, It can be set in various ways.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 오가노이드용 투명화 조성물은, EDTA를 포함하는 계면활성제(detergent) 또는 지질 대체제(lipid replacement)를 포함하고, 지질 대체체는, 아크릴아마이드(Acrylamide), 우레아(urea) 또는 글리세롤(glycerol) 중 적어도 하나를 포함하고, 계면활성제는, SDS(N,N,N′′Triton X-100 또는 쿼드롤(Quadrol) 중 적어도 하나를 더 포함하고, EDTA는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 1 내지 5 w/v %일 수 있다.According to another feature of the present invention, the clarifying composition for organoids includes a surfactant or lipid replacement including EDTA, and the lipid replacement includes acrylamide or urea. ) or glycerol, the surfactant further includes at least one of SDS (N,N,N′′Triton X-100 or Quadrol), and EDTA is used for organoids. It may be 1 to 5 w/v % relative to the clarifying composition.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 오가노이드 투명화 방법은, 투과시키는 단계 이전에, 오가노이드를 고정액과 접촉시켜 고정시키는 단계를 더 포함하고, 고정액은, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 메탄올, 아세톤, 단당류, 이당류 또는 다당류 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the organoid transparency method further includes the step of fixing the organoid by contacting it with a fixative before the permeabilization step, and the fixative is glutaraldehyde, formaldehyde, etc. ), methanol, acetone, monosaccharide, disaccharide, or polysaccharide, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since these examples are only for illustrative purposes of the present invention, the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.

본 발명은 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 오가노이드의 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다. The present invention provides a transparent composition for organoids and a method for transparentizing organoids using the same, which has the effect of evaluating drugs in organoids, that is, evaluating effectiveness, side effects, and toxicity in the development of new drugs.

즉, 본 발명은 고가의 전기 영동 장치와 같은 기계 및 용액이 요구되지 않음에 따라, 보다 경제적일 수 있으며, 기계적인 방법이 수행되지 않아도 됨에 따라, 오가노이드에 손상을 최소화시킬 수 있다. That is, the present invention can be more economical as it does not require machines and solutions such as expensive electrophoresis devices, and damage to organoids can be minimized because mechanical methods do not need to be performed.

또한, 본 발명은 종래의 투명화 방법과 달리 버블 형성, 변식 및 퇴적물이 나타나지 않고, 오가노이드에 대한 투명성이 향상되어, 투명한 오가노이드 내 항체 염색이 가능하며, 이에 따른 구조적 이미지화를 통하여 다양한 약물에 대한 검증 또는 질환의 원인을 규명하고 치료법을 도출할 수 있다.In addition, unlike conventional transparency methods, the present invention does not cause bubble formation, deformation, or sediment, improves transparency of the organoid, enables antibody staining in transparent organoids, and allows for the detection of various drugs through structural imaging. It is possible to verify or identify the cause of a disease and derive a treatment.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다. The effects according to the present invention are not limited to the contents exemplified above, and further various effects are included in the present specification.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물을 이용한 오가노이드 투명화 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물에 대한 구성을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 의하여 투명화가 수행된 조직에 대한 가시적 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 의하여 투명화가 수행된 오가노이드의 형광 염색 및 이의 이미지 사진을 도시한 것이다.Figure 1 illustrates the procedure of an organoid clearing method using a clearing composition for organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 exemplarily shows the configuration of a transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention.
Figures 3a and 3b show the visible results of tissue cleared by the clearing composition for organoids and the organoid clearing method using the same according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 shows fluorescent staining and an image of an organoid that has been made transparent by a transparent composition for organoids and an organoid transparent method using the same according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms, but the present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and are within the scope of common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.

본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다As used herein, the term “or” means “and/or” unless otherwise stated.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 은 문맥으로부터 달리 언급되거나 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 10 % 내에 해당하는 값의 범위를 나타낸다.As used herein, the term “about” refers to a range of values that fall within 10% in either direction (above or below) of the stated reference value, unless otherwise stated or otherwise clear from the context.

본 명세서에서 사용되는 용어 "조직 투명화(tissue clearing)"는 조직 또는 조직 절편을 삼차원 상태에서 광학 현미경으로 관찰하기 위해 빛이 통과할 수 있도록 투명화시키는 기술을 의미한다.The term “tissue clearing” used herein refers to a technique of making tissue or tissue sections transparent so that light can pass through them for observation with an optical microscope in a three-dimensional state.

본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.The term "medium" used within the specification refers to the in vitro growth of stem cells, etc., which contains essential elements for the growth and proliferation of cells, such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. It refers to a mixture for the growth and proliferation of cells.

본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법Transparency composition for organoids and method for organoid transparency using the same according to an embodiment of the present invention

이하에서는 도 1을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 대하여 상세히 설명하도록 한다.Hereinafter, with reference to FIG. 1, a clearing composition for organoids and a method for clearing organoids using the same according to an embodiment of the present invention will be described in detail.

먼저, 도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물을 이용한 오가노이드 투명화 방법의 절차가 도시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법은, 오가노이드(organoid)를 오가노이드용 투명화 조성물과 접촉시켜 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)을 포함한다. First, referring to FIG. 1, a procedure for a method of clearing organoids using a clearing composition for organoids according to an embodiment of the present invention is shown. The organoid transparency method according to an embodiment of the present invention includes a step (S110) of permeabilizing the organoid by contacting it with a transparency composition for organoids.

투과(permeabilization)시키는 단계는, 세포막이나 핵막(nuclear enveleop)의 지질층을 녹임으로써, 세포의 다양한 구조 및 기능을 확인가능하도록 투명화시키는 단계를 의미할 수 있다. The permeabilization step may mean a step of making the cell transparent so that various structures and functions of the cell can be confirmed by dissolving the lipid layer of the cell membrane or nuclear envelope.

보다 구체적으로, 조직 및 다양한 세포들이 불투명하게 보이는 이유는, 조직을 구성하고 있는 미세한 입자들이 빛의 직진을 막고 흡수 또는 산란 및 굴절을 야기시키기 때문이다. 조직의 빛 투과를 막는 가장 큰 요인은 지질 성분에 의한 빛의 산란이다. 더욱이, 조직 내 서로 다른 성분 사이에 의한 다양한 굴절률에 의하여, 빛은 여러 번 꺾이게 됨에 따라, 조직이 불투명하게 보인다. 이와 같은 이유로 빛의 산란과 굴절을 적절히 제어한다면, 조직을 보다 투명하게 할 수 있다.More specifically, the reason why tissues and various cells appear opaque is because the fine particles that make up the tissues block the passage of light and cause absorption, scattering, or refraction. The biggest factor that blocks light penetration through tissues is the scattering of light by lipid components. Moreover, due to the various refractive indices between different components in the tissue, light is bent several times, making the tissue appear opaque. For this reason, if the scattering and refraction of light is appropriately controlled, the tissue can be made more transparent.

이러한, 조직 투명화에 있어, 가장 중요한 요소는 조직을 투명하게 만들 뿐만 아니라 단백질 변성 등에 의해 조직 내 원하는 정보가 손실 또는 왜곡되지 않아야 한다. 특히, GFP 단백질 등과 같은 다양한 형광원(Fluorophore)은 조직 내 정보 검출에 사용되어야 함에 따라, 조직 투명화에 이용되는 조성물은 조직 투명과 과정에서 형광 신호의 유지 및 취득에 문제를 일으키지 않아야 한다. In tissue transparency, the most important factor is not only to make the tissue transparent, but also to ensure that the desired information in the tissue is not lost or distorted due to protein denaturation, etc. In particular, as various fluorophores such as GFP protein must be used to detect information in tissues, the composition used for tissue transparency must not cause problems in maintaining and acquiring fluorescent signals during the tissue transparency process.

한편, 조직 내 지질을 제거하는 조성물은 유기 용매(organic solvent) 및 계면활성제(detergent)가 이용될 수 있다. 그러나, 유기 용매의 경우, 조직 내 세포의 탈수(degydration)를 일으킴에 따라, 조직의 크기가 작아져, 구조적 변성을 야기시키고, 이에 따른 주요 단백질들의 특성이 감소된다는 단점이 있다.Meanwhile, organic solvents and surfactants may be used as compositions for removing lipids in tissues. However, in the case of organic solvents, there is a disadvantage in that they cause degydration of cells in the tissue, thereby reducing the size of the tissue, causing structural degeneration, and thereby reducing the properties of major proteins.

이에, 유기 용매가 아닌 친수성인 동시에 지질 제거 능력을 지닌 용액을 이용하여 조직 투명화를 수행한 방법들이 제시되어 왔다. 그러나, 종래의 방법들은 지질이 제거되면서 수화되기 때문에 조직이 물러지는 문제점을 가지고 있으며, 상대적으로 시간이 오래 걸림에 따라, 시간을 다투는 연구 또는 임상 진단에 있어 사용성이 유용하지 못하였다. 나아가, 종래의 방법들은 지질 제거를 위하여 전기영동 및 스터링과 같은 기계적인 과정이 추가적으로 수행되어 왔으나, 이러한 방법은 핵산이 가진 전기적 성질에 의하여 조직 내 위치가 바뀔 수 있으며, 조직에 상처를 입힐 위험이 있다.Accordingly, methods of tissue transparency using solutions that are hydrophilic and have lipid removal ability, rather than organic solvents, have been proposed. However, conventional methods have the problem of tissue softening due to hydration while removing lipids, and because they take a relatively long time, they are not useful in time-sensitive research or clinical diagnosis. Furthermore, conventional methods have additionally performed mechanical processes such as electrophoresis and stirring to remove lipids, but these methods may change the location within the tissue due to the electrical properties of nucleic acids, and there is a risk of damaging the tissue. there is.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법에서는, 전술한 위험 요인들이 모두 제거되어 수용성의 화학적인 방법으로만 수행될 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, 계면활성제(detergent) 및 지질 대체제(lipid replacement)를 포함하고 있으며, 이때, 계면활성제 및 지질 대체제는 수용성(water soluble)이다. Accordingly, in the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention, all of the above-mentioned risk factors are eliminated and can be performed only by a water-soluble chemical method. That is, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention includes a surfactant (detergent) and a lipid replacement. , At this time, the surfactant and lipid substitute are water soluble.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미하고, 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 중 적어도 하나로부터 유래하여 분화되거나, 뇌, 혈관, 간, 폐, 신장, 췌장, 심장 및 장 중 적어도 하나의 장기로부터 유래한 세포로부터 분화될 수 있다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며, 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다. In addition, the organoid used in the permeabilization step (S110) of the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention refers to a small culture that reproduces both the form and function of a tissue or organ, and is an adult stem cell. Derived from and differentiated from at least one of (adult stem cell, ASC), embryonic stem cell (ESC), and induced pluripotent stem cell (iPSC), or brain, blood vessels, liver, lung, kidney, It can be differentiated from cells derived from at least one of the following organs: pancreas, heart, and intestine. More specifically, organoids must contain one or more cell types among the various types of cells that make up an organ or tissue, must be able to reproduce the special functions of each organ, and must be able to reproduce the special functions of each organ, and the cells must cluster together to form an organ spatially. It should be organized in a similar form. Organoids differ from spheroids in that they form a system rather than a simple collection of cells, and can be used as a patient-specific model for new drug development, artificial organs, disease treatments, and disease treatment.

이러한, 오가노이드는 인체로부터 유래한 기관, 조직, 세포 및 스페로이드와 달리, 더 작은 크기의 다양한 세포가 밀집된 구조체임에 따라, 각 세포들에 대한 응집력(결합력)이 더 강하게 나타날 수 있다. 이에, 종래의 조직 투명화 용액으로는 오가노이드의 내부까지 투명화시키지 못하였다. Unlike organs, tissues, cells, and spheroids derived from the human body, organoids are structures in which various cells of smaller size are densely packed, so the cohesion (bonding force) for each cell may be stronger. Accordingly, the interior of the organoid could not be made transparent using the conventional tissue transparency solution.

그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, 한 종류의 계면활성제가 아닌 다양한 계면활성제의 조합을 통하여, 오가노이드에 대한 침투력을 향상시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, EDTA 계면활성제를 포함할 수 있다. However, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention is a combination of various surfactants rather than one type of surfactant, Penetration into noids can be improved. That is, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention may include EDTA surfactant.

특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, 킬레이트 제(chelating reagent)인 EDTA를 일정 농도로 포함함으로써, 인체로부터 유래한 기관, 조직, 세포 및 스페로이드뿐만 아니라, 오가노이드까지 효과적으로 투명화시킬 수 있다. 보다 구체적으로, EDTA는 세포 내 2가의 금속 이온과 결합하여, 세포 간 또는 세포 내 결합력을 약하게 만들 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, 일정 농도의 EDTA를 포함함으로써 오가노이드 내 세포들간의 결합을 느슨하게 만들고, 이에 따라, 오가노이드 내부까지 투명화시킬 수 있다. 이때, EDTA의 농도는 오가노이드의 형상 즉, 구조가 무너지지 않고, 용액이 침투될 수 있을 정도의 간극만을 제공하여야 함에 따라, 1 내지 5 w/v %일 수 있으나, 가장 바람직한 EDTA의 농도는 5 w/v %일 수 있다. In particular, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention contains EDTA, a chelating reagent, at a certain concentration, so that the human body It can effectively make organs, tissues, cells, and spheroids derived from , as well as organoids, transparent. More specifically, EDTA can bind to divalent metal ions within cells, weakening the binding force between cells or within cells. Accordingly, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention contains a certain concentration of EDTA, thereby loosening the bonds between cells in the organoid. By making it, even the inside of the organoid can be made transparent. At this time, the concentration of EDTA may be 1 to 5 w/v%, as the shape of the organoid, that is, the structure, must not collapse and only a gap sufficient to allow the solution to penetrate must be provided, but the most preferred concentration of EDTA is 5%. It may be w/v%.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, 전술한 EDTA 뿐만 아니라 다양한 계면활성제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은, 계면활성제로서 SDS(N,N,N′′kis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine)), Triton X-100 및 쿼드롤(Quadrol) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있으며, 이때, 각각의 농도는 오가노이드 투명화 조성물에 대하여 15 내지 25 w/v %일 수 있으나, 가장 바람직한 각각의 농도는 20 w/v %일 수 있다. In addition, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention may include various surfactants in addition to the EDTA described above. More specifically, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention is SDS (N,N,N′′kis(2) as a surfactant. -hydroxypropyl)ethylenediamine)), Triton The most preferred concentration of each may be 20 w/v %.

한편, 전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물의 계면활성제로 인하여, 세포 내 지질이 제거되면, 이에 대한 공간이 비어짐에 따라, 오가노이드의 형상(구조)가 무너질 수 있다. 이에, 전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은 지질이 제거된 공간을 채울 수 있는 지질 대체제(lipid replacement)를 포함할 수 있다. On the other hand, when intracellular lipids are removed due to the surfactant of the clarifying composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to the above-described embodiment of the present invention, the space for this is removed. As this becomes empty, the shape (structure) of the organoid may collapse. Accordingly, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention described above is a lipid replacement that can fill the space from which lipids have been removed. may include.

지질 대체제는 DNA 및 단백질 등의 진단에 중요한 주요 물질들은 붙잡아주며 제거된 지질 영역만을 채워줄 수 있는 지지체를 의미할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물의 지질 대체제는 아크릴아마이드(Acrylamide), 우레아(urea) 및 글리세롤(glycerol) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. A lipid substitute may refer to a support that can hold key substances important for diagnosis, such as DNA and proteins, and fill only the removed lipid region, and is a permeabilization step in the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention. The lipid substitute for the clarifying composition for organoids used in (S110) may include at least one of acrylamide, urea, and glycerol.

나아가, 이러한 지질 대체체들은 특정 농도이상 함유될 경우, 오가노이드를 포함하는 다양한 조직 시료의 크기가 커지거나, 수축되는 구조적 손상을 야기할 수 있음에 따라, 일정 농도로 투명화 조성물에 포함되어야 한다. 보다 구제적으로, 아크릴아마이드(Acrylamide)의 농도는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 0 내지 5 w/v %일 수 있으며, 우레아(urea)의 농도는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 10 내지 30 w/v %일 수 있으며, 글리세롤(glycerol)의 농도는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 5 내지 10 w/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 측정하고자 하는 오가노이드의 크기 및 종류에 따라 다양하게 결정될 수 있다.Furthermore, these lipid substitutes, when contained above a certain concentration, may cause structural damage such as size increase or shrinkage of various tissue samples including organoids, so they must be included in the clearing composition at a certain concentration. More specifically, the concentration of acrylamide may be 0 to 5 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids, and the concentration of urea may be 10 to 30 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids. It may be w/v %, and the concentration of glycerol may be 5 to 10 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids, but is not limited thereto and depends on the size and type of organoid to be measured. It can be decided in various ways depending on the situation.

결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은 전술한 바와 같이, 계면활성제 및 지질 대체제를 포함할 수 있으며, 계면활성제의 농도는 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 46 내지 80 w/v %이고, 지질 대체제의 농도는 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 15 내지 45 w/v %일 수 있다.Ultimately, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention may include a surfactant and a lipid substitute, as described above, and the interface The concentration of the active agent may be 46 to 80 w/v % of the clarifying composition for organoids, and the concentration of the lipid substitute may be 15 to 45 w/v % of the clarifying composition for organoids.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)에서 사용되는 오가노이드용 투명화 조성물은 종래의 상업적으로 사용되고 있는 조직 투명화 용액인 라피클리어(Rapiclear)를 더 포함할 수 있다. 이때, 라피클리어(Rapiclear)의 농도는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 0 내지 10 w/v %일 수 있다.Meanwhile, the clearing composition for organoids used in the permeabilization step (S110) of the organoid clearing method according to an embodiment of the present invention is Rapiclear, a conventional tissue clearing solution used commercially. It can be included. At this time, the concentration of Rapiclear may be 0 to 10 w/v % based on the clarifying composition for organoids.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)는 35 내지 45 ℃에서 10 내지 30 시간동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 오가노이드의 크기 및 종류에 따라 다양하게 설정될 수 있다.Furthermore, the permeabilization step (S110) of the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention may be performed at 35 to 45 ° C. for 10 to 30 hours, but is not limited to this, and the size of the organoid and can be set in various ways depending on the type.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 투과(permeabilization)시키는 단계(S110)는 전기영동 및 스터링과 같은 전기 및/또는 기계적인 방법이 수행되지 않고, 단지 일정 온도 조건만 구비된 채, 배양함으로써 수행될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법은 핵산의 위치가 바뀌거나, 오가노이드에 손상이 되고, 특정 단백질의 기능이 소실되는 위험이 없으며, GFP(Green Fluorescent Protein), 마커 및 다양한 항체에 대한 형광 염색이 우수할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법은 전술한 바와 같이 구조적 및 기능적으로 전혀 손상을 끼치지 않음에 따라, 온전한 오가노이드를 3차원으로 이미지화하여 관찰할 수 있으며, 복잡한 구조를 가지는 다양한 오가노이드에 대하여 하나의 완전한 구조로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로, 다양한 약물 및 질병에 대한 유용한 정보를 취득할 수 있다.That is, the permeabilization step (S110) of the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention is performed without electrical and/or mechanical methods such as electrophoresis and stirring, but only with a certain temperature condition. It can be performed by harvesting and culturing. Accordingly, the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention has no risk of changing the location of nucleic acids, damaging the organoid, or losing the function of a specific protein, and contains GFP (Green Fluorescent Protein), markers, and various Fluorescent staining for antibodies can be excellent. Furthermore, as described above, the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention does not cause any structural or functional damage, allowing intact organoids to be imaged and observed in three dimensions, and has a complex structure. Since observational studies can be performed on various organoids with one complete structure, useful information about various drugs and diseases can be obtained.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법은 전술한 투과(permeabilization)시키는 단계(S110) 이전에, 오가노이드를 고정액과 접촉시켜 고정(Fixation)시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 고정하는 단계는 오가노이드의 세포 구조를 보존하기 위하여, 화학적인 처리를 수행하여 오가노이드 내에 존재하는 모든 효소과정이나 대사과정을 중지시키는 것을 의미할 수 있으며, 이에 따라 고정 후 변화(postfixation change)를 최소화할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법은 전술한 고정하는 단계를 통하여, 오가노이드 내 세포의 형태나 위치를 있는 그대로 유지하고, 특정 분자물질들의 손실을 방지할 수 있으며, 오가노이드 내 항원성(antigenicity)을 유지할 수 있으며, 대사로 인한 조직 내 물질의 확산이나 재배열을 방지할 수 있다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 투명화 방법의 고정시키는 단계에서 사용되는 고정액은 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 메탄올, 아세톤, 단당류, 이당류 및 다당류 중 적어도 하나의 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포내외 물질의 파괴를 최소화하며, 세포를 고정시킬 수 있는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다.Meanwhile, the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention may further include the step of fixing the organoid by contacting it with a fixative before the permeabilization step (S110) described above. The fixing step may mean stopping all enzymatic or metabolic processes existing within the organoid by performing chemical treatment to preserve the cell structure of the organoid, thereby causing postfixation change. It can be minimized. Accordingly, the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention can maintain the shape or position of cells in the organoid as is and prevent the loss of specific molecular substances through the above-mentioned fixing step, and can prevent the loss of specific molecular substances. It can maintain its antigenicity and prevent the spread or rearrangement of substances in tissues due to metabolism. At this time, the fixative used in the fixing step of the organoid transparency method according to an embodiment of the present invention is at least one substance selected from the group consisting of glutaraldehyde, formaldehyde, methanol, acetone, monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides. It may include, but is not limited to, various substances capable of minimizing destruction of internal and extracellular substances and fixing cells.

본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법의 검증Verification of the transparency composition for organoids and the organoid transparency method using the same according to an embodiment of the present invention

이하에서는, 도 2 내지 4를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법을 검증하도록 한다. Hereinafter, with reference to FIGS. 2 to 4, the transparency composition for organoids and the organoid transparency method using the same according to an embodiment of the present invention will be verified.

먼저, 도 2를 참조하여, 이하에서 설명될 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물의 구성 성분에 대하여 설명하도록 한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물은 실시예 1 및 실시예 2이며, 실시예 1은 지질 대체제로서 전체 조성물에 대하여 30 w/v %의 우레아, 5 w/v %의 글리세롤을 포함하고 있으며, 계면 활성제로서 전체 조성물에 대하여 5 w/v %의 EDTA, 20 w/v %의 SDS, 20w/v %의 Triton-X 100, 20 w/v %의 쿼드롤을 포함하고 있다. 또한, 실시예 2는 지질 대체제로서 전체 조성물에 대하여 5w/v %의 아크릴아마이드, 10 w/v %의 우레아, 10 w/v %의 글리세롤을 포함하고 있으며, 계면 활성제로서 전체 조성물에 대하여 5 w/v %의 EDTA, 20 w/v %의 SDS, 20w/v %의 Triton-X 100, 20 w/v %의 쿼드롤을 포함하고 있으며, 실시예 2는 실시예 1과 달리 전체 조성물에 대하여 10 w/v %의 농도로 라피클리어를 더 포함하고 있다.First, with reference to FIG. 2, the components of the transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention to be described below will be described. The clarifying composition for organoids according to an embodiment of the present invention is Example 1 and Example 2, and Example 1 contains 30 w/v % of urea and 5 w/v % of glycerol relative to the entire composition as a lipid substitute. It contains 5 w/v % of EDTA, 20 w/v % of SDS, 20 w/v % of Triton-X 100, and 20 w/v % of Quadrol as surfactants based on the total composition. In addition, Example 2 contains 5 w/v % of acrylamide, 10 w/v % of urea, and 10 w/v % of glycerol as a lipid substitute, and 5 w/v % of glycerol as a surfactant relative to the entire composition. /v % of EDTA, 20 w/v % of SDS, 20 w/v % of Triton-X 100, and 20 w/v % of Quadrol, and Example 2, unlike Example 1, has a It further contains Rapiclear at a concentration of 10 w/v %.

이에, 전술한 실시예 1 및 실시예 2에 대한 검증 결과인, 도 3a 및 3b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 의하여 투명화가 수행된 조직에 대한 가시적 결과가 도시된다. Accordingly, referring to FIGS. 3A and 3B, which are the verification results for Example 1 and Example 2 described above, transparency was performed by the transparency composition for organoids and the organoid transparency method using the same according to an embodiment of the present invention. Visible results for the generated tissue are shown.

먼저, 도 3a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 의하여 투명화가 수행된 마우스 간에 대한 가시적 결과가 도시된다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물에 대한 검증을 위하여, 마우스의 간을 이용하였으며, 대조군은 투명화 처리가 안된 마우스 간을 의미하며, 비교예 1은 라피클리어를 통하여 조직 투명화가 수행된 마우스 간을 의미한다.First, referring to FIG. 3A, visible results are shown for a mouse liver in which transparency was performed by the transparent composition for organoids and the organoid transparency method using the same according to an embodiment of the present invention. At this time, in order to verify the transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention, mouse liver was used, the control group refers to mouse liver that has not been transparent, and Comparative Example 1 refers to tissue transparency through Rapiclear. refers to the mouse liver in which it was performed.

보다 구체적으로, 비교예 1은 라피클리어가 접촉된 마우스 간의 겉표면만 투평화가 이루어진 것으로 나타난다. 이와 반면에, 실시예 1 및 실시예 2는 마우스 간의 내부까지 투명화가 이루어진 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물인 실시예 1 및 실시예 2는 종래의 기술인 비교예와 달리 조직 내부까지 침투하여 투명화시킬 수 있다는 것을 의미할 수 있다.More specifically, Comparative Example 1 shows that only the outer surface of the mouse liver contacted with Rapiclear was flattened. On the other hand, in Examples 1 and 2, it appears that even the inside of the mouse liver was made transparent. In other words, this may mean that Examples 1 and 2, which are the transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention, can penetrate into the inside of the tissue and make it transparent, unlike the comparative example, which is a conventional technology.

나아가, 도 3b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 의하여 투명화가 수행된 마우스 귀에 대한 가시적 결과가 도시된다. Furthermore, referring to FIG. 3B, the visible results of the mouse ear in which transparency was performed by the transparent composition for organoids and the organoid transparency method using the same according to an embodiment of the present invention are shown.

보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물인 실시예 1을 통하여 투명화가 수행된 마우스의 귀는, 귀의 구조적 변화 없이 투명화가 수행된 것으로 나타나며, 마우스 귀에 존재하는 모(hair) 또한, 변형 및 손실없이 그대로 유지된 것으로 나타난다. More specifically, the mouse ear that was made transparent through Example 1, which is a transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention, appears to have been made transparent without structural changes in the ear, and the hair present in the mouse ear ) In addition, it appears to have remained intact without deformation or loss.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물은 기관 및 조직의 변형을 야기시키기 않으며, 원형 그대로를 유지할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물은 기관 및 조직에 대한 지질만을 제거할 뿐, 지질이외의 단백질 및 기타 성분에 대한 손실을 발생시키지 않는 것으로 나타남에 따라, 기관 및 조직에 대한 구조적 및 기능적 특징이 그대로 유지한 채, 기관 및 조직을 투명화시킬 수 있다.That is, the transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention does not cause deformation of organs and tissues and can maintain their original form. Moreover, the clearing composition for organoids according to an embodiment of the present invention only removes lipids from organs and tissues and does not cause loss of proteins and other components other than lipids. Organs and tissues can be made transparent while maintaining their structural and functional characteristics.

나아가, 도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법에 의하여 투명화가 수행된 오가노이드의 형광 염색 및 이의 이미지 사진이 도시된다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물에 대한 검증을 위하여, 심장 오가노이드를 이용하였으며, 비교예 2는 cubic 방식을 통하여 조직 투명화가 수행된 심장 오가노이드를 의미한다. Furthermore, referring to FIG. 4, fluorescent staining and an image of an organoid that has been made transparent by a transparent composition for organoids and an organoid transparent method using the same according to an embodiment of the present invention are shown. At this time, to verify the transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention, heart organoids were used, and Comparative Example 2 refers to a heart organoid in which tissue transparency was performed through the cubic method.

보다 구체적으로, 심장 오가노이드는 수축운동이 수행되어야 함에 따라, 다른 기관의 오가노이드보다 각 세포들 간의 응집력이 더 강할 수 있음에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물의 침투력 확인을 위하여 심장 오가노이드가 이용되었다. More specifically, as cardiac organoids must perform contractile movements, the cohesion between individual cells may be stronger than organoids of other organs, so the penetration power of the clarifying composition for organoids according to an embodiment of the present invention Cardiac organoids were used for confirmation.

비교예 2는 면역 형광 염색에 대한 신호가 심장 오가노이드의 겉 표면에서만 확인되며, 심장 오가노이드의 내부에서는 확인이 되지 않는 것으로 나타난다. 즉, 비교예 2는 세포간 높은 응집력을 가지는 심장 오가노이드의 내부까지 침투하여 투명화시키지 못한다는 것을 의미할 수 있다.Comparative Example 2 shows that the signal for immunofluorescence staining is confirmed only on the outer surface of the cardiac organoid, and is not confirmed inside the cardiac organoid. In other words, this may mean that Comparative Example 2 does not penetrate into the interior of the cardiac organoid, which has high intercellular cohesion, and does not render it transparent.

이에 반해, 실시예 1은 심장 오가노이드 내부까지 Green fluorescence와 DAPI와 같은 형광 신호가 확인되는 것으로 나타난다. 보다 구체적으로, 내부에는 Green fluorescence에 의한 초록색 신호 및 외부에는 DAPI에 의한 파란색 신호가 뚜렷하게 측정되는 것으로 나타나며, 세포 하나하나의 모양과 핵의 모양이 3차원으로 명확하게 확인될 수 있는 것으로 나타난다. On the other hand, in Example 1, fluorescent signals such as green fluorescence and DAPI were confirmed even inside the cardiac organoid. More specifically, a green signal due to green fluorescence on the inside and a blue signal due to DAPI on the outside are clearly measured, and the shape of each cell and the shape of the nucleus can be clearly confirmed in three dimensions.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물인 실시예 1은 DAPI가 염색됨에 따라, 오가노이드를 포함하는 다양한 시료에 대하여, 지질 이외의 핵산, 면역 물질, 마커 및 단백질과 같은 세포 내 구성 물질의 변성 없이, 투명화시킬 수 있는 것으로 나타난다.That is, Example 1, which is a transparent composition for organoids according to an embodiment of the present invention, is stained with DAPI, and cells such as nucleic acids other than lipids, immune substances, markers, and proteins are used in various samples including organoids. It appears that it can be made transparent without denaturing its constituent materials.

이상의 결과에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법은 종래의 조성물 및 방법 보다 높은 침투력을 가짐에 따라, 안정적으로 응집력이 강한 오가노이드를 구조적 및 기능적으로 변화 없이, 원형 그대로 유지시키며, 지질 만을 제거하여 투명화시킬 수 있다.According to the above results, the clearing composition for organoids and the organoid clearing method using the same according to an embodiment of the present invention have a higher penetration power than the conventional composition and method, thereby providing stable and strong cohesive organoids structurally and functionally. It maintains its original form without change and can be made transparent by removing only the lipids.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and may be modified and implemented in various ways without departing from the technical spirit of the present invention. Accordingly, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention, but rather to explain it, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be interpreted in accordance with the claims below, and all technical ideas within the equivalent scope should be construed as being included in the scope of rights of the present invention.

Claims (20)

라피클리어(Rapiclear), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 포함하는 계면활성제(detergent) 및 지질 대체제(lipid replacement)를 포함하고,
상기 라피클리어(Rapiclear)는, 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 0% 초과 내지 10 w/v % 이하이며,
상기 계면활성제 및 지질 대체제는, 수용성이고,
상기 EDTA는, 상기 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 1 내지 5 w/v % 이며,
상기 계면활성제는, 상기 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 15 내지 25 w/v %, Triton X-100 15 내지 25 w/v % 및 쿼드롤(Quadrol) 15 내지 25 w/v % 를 포함하고,
상기 지질 대체제는, 상기 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 아크릴아마이드(acrylamide) 0% 초과 내지 5 w/v % 이하, 우레아(urea) 10 내지 30 w/v % 및 글리세롤(glycerol) 5 내지 10 w/v % 를 포함하는, 오가노이드용 투명화 조성물.Contains surfactants and lipid replacements including Rapiclear and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid),
The Rapiclear is greater than 0% to 10 w/v % or less relative to the clarifying composition for organoids,
The surfactant and lipid substitute are water-soluble,
The EDTA is 1 to 5 w/v% based on the clarifying composition for organoids,
The surfactant is 15 to 25 w/v % of SDS (Sodium dodecyl sulfate), 15 to 25 w/v % of Triton Contains %,
The lipid substitute contains more than 0% to 5 w/v% of acrylamide, 10 to 30 w/v% of urea, and 5 to 10 w/v of glycerol, relative to the transparent composition for organoids. A clarifying composition for organoids comprising v%. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 계면활성제는,
상기 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 46 내지 80 w/v %이고,
상기 지질 대체제는,
상기 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 15 내지 45 w/v %인, 오가노이드용 투명화 조성물.According to clause 1,
The surfactant is,
It is 46 to 80 w/v % with respect to the clarifying composition for organoids,
The lipid substitute is,
A clarifying composition for organoids, which is 15 to 45 w/v % based on the clarifying composition for organoids. 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 오가노이드용 투명화 조성물은,
글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 메탄올, 아세톤, 단당류, 이당류 또는 다당류 중 적어도 하나를 더 포함하는, 오가노이드용 투명화 조성물.According to clause 1,
The transparent composition for organoids is,
A clarifying composition for organoids, further comprising at least one of glutaraldehyde, formaldehyde, methanol, acetone, monosaccharide, disaccharide, or polysaccharide. 삭제delete 오가노이드(organoid)를 오가노이드용 투명화 조성물과 접촉시켜 투과(permeabilization)시키는 단계를 포함하고,
상기 오가노이드용 투명화 조성물은, 상기 오가노이드용 투명화 조성물에 대하여 라피클리어(Rapiclear) 0% 초과 내지 10 w/v % 이하, EDTA 1 내지 5 w/v %, SDS(sodium dodecyl sulfate) 15 내지 25 w/v %, Triton X-100 15 내지 25 w/v %, 쿼드롤(Quadrol) 15 내지 25 w/v %, 아크릴아마이드(acrylamide) 0% 초과 내지 5 w/v % 이하, 우레아(urea) 10 내지 30 w/v % 및 글리세롤(glycerol) 5 내지 10 w/v %를 포함하는, 오가노이드 투명화 방법.Permeabilizing the organoid by contacting it with a clarifying composition for organoids,
The clarifying composition for organoids contains more than 0% to 10 w/v% of Rapiclear, 1 to 5 w/v% of EDTA, and 15 to 25 w/v% of SDS (sodium dodecyl sulfate) with respect to the transparent composition for organoids. w/v %, Triton 10 to 30 w/v % and 5 to 10 w/v % glycerol. 삭제delete 제 16항에 있어서,
상기 투과시키는 단계는,
35 내지 45 ℃에서 10 내지 30 시간동안 수행되는, 오가노이드 투명화 방법. According to clause 16,
The permeation step is,
A method of clearing organoids, carried out at 35 to 45° C. for 10 to 30 hours. 삭제delete 제 16항에 있어서,
상기 오가노이드 투명화 방법은,
상기 투과시키는 단계 이전에,
상기 오가노이드를 고정액과 접촉시켜 고정시키는 단계를 더 포함하고,
상기 고정액은,
글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 메탄올, 아세톤, 단당류, 이당류 또는 다당류 중 적어도 하나를 포함하는, 오가노이드 투명화 방법.According to clause 16,
The organoid transparency method is,
Before the permeation step,
Further comprising the step of fixing the organoid by contacting it with a fixative solution,
The fixative solution is,
A method of clearing organoids, comprising at least one of glutaraldehyde, formaldehyde, methanol, acetone, monosaccharide, disaccharide, or polysaccharide.
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