KR102571131B1 - Biomarker composition for periodontitis disease diagnosis, biomarker composition for severity of periodontitis disease diagnosis and diagnostic kit thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치주염 진행 과정에서 억제되는 miRNA와 snoRNA 유전자를 측정하여 치주염 유무, 중증도 및 치료 후 예후 판정에 대한 객관적 지표 제시할 수 있는 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물, 이를 이용한 진단 키트 및 이를 이용한 치추질환 치료제에 관한 것이다.
본 발명은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 유무 및 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물이다.
본 발명은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.The present invention is a biomarker composition for determining the severity of periodontitis, which can provide objective indicators for determining the presence, severity and prognosis of periodontitis by measuring miRNA and snoRNA genes that are inhibited in the course of periodontitis, a diagnostic kit using the same, and periodontal disease using the same It's about a cure.
The present invention is characterized by comprising any one or more genes selected from hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus or saliva in a biological sample. It is a biomarker composition for determining the presence or absence of periodontitis and the severity of periodontitis.
In the present invention, the expression level of any one or more genes selected from hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus fluid or saliva in a biological sample was compared to that of a normal control group. It is characterized in that it includes the step of comparing with the expression level.
Description
본 발명은 치주염 진행 과정에서 억제되는 miRNA 및 snoRNA 유전자를 측정하여 치주염 유무, 중증도 및 치료 후 예후 판정에 대한 객관적 지표 제시할 수 있는 치주염 감별용 바이오마커 조성물, 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물, 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것이다. The present invention measures miRNA and snoRNA genes that are inhibited in the process of periodontitis to provide objective indicators for determining the presence, severity, and prognosis of periodontitis, a biomarker composition for discriminating periodontitis severity, and a biomarker composition for discriminating the severity of periodontitis. It relates to the diagnostic kit used.
치주염은 숙주의 구강 미생물 세균 불균형(dysbiosis)과 면역반응의 상호 작용으로 인한 치주 조직의 만성 염증성 질환으로, 조절되지 않으면 치조골 손실과 더불어 치아 손실을 유발할 수 있다. 2016년 글로벌 질병 부담 연구에 따르면, 치주염은 전 세계적으로 11 번째로 가장 흔한 질병으로, 나이가 들수록 치주염 유병률은 점점 증가한다. 치주염은 전신 건강과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있으며, 심혈관 질환, 당뇨병, 자가 면역 질환 등과 같은 다양한 비 감염성 질환(NCD)과 상호 작용하며 공통 위험 요소를 공유한다. 치주염의 진행은 결국 치아 상실을 유발하여 발음 및 저작과 관련된 기능적 문제뿐만 아니라 개인의 삶의 질을 저하시킬 수 있는 심미적 문제를 초래할 수 있다.Periodontitis is a chronic inflammatory disease of the periodontal tissue caused by the interaction of the host's oral microbial dysbiosis and the immune response. If not controlled, it can cause alveolar bone loss and tooth loss. According to the 2016 Global Burden of Disease Study, periodontitis is the 11th most common disease worldwide, and the prevalence of periodontitis increases with age. Periodontitis is known to be closely related to systemic health, and interacts with various non-infectious diseases (NCDs), such as cardiovascular disease, diabetes, and autoimmune diseases, and shares common risk factors. Progression of periodontitis eventually causes tooth loss, which can lead to functional problems related to pronunciation and chewing, as well as aesthetic problems that can reduce the quality of life of an individual.
박테리아 군집 세균 불균형(dysbiotic) 변화가 치주염 발생 및 진행에 필수적으로 필요하지만, 궁극적으로 치주 조직에 손상을 입힐 수 있는 것은 주로 이 미생물에 대한 숙주 유래 면역 및 염증 반응이다. 따라서 치주염에 대한 감수성 또는 내성은 개인마다 다르며 질병 진행률은 환경(흡연, 스트레스, 식이 요법, 사회 경제적), 숙주 관련 전신(당뇨병, 기타 NCD) 및 유전적(후생적) 인자를 포함한 여러 요인에 의해 결정된다. 치주 병원체를 인식한 후 Toll 유사 수용체(TLR)는 인터루킨(IL)-6, IL-1β 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor, TNF)-α를 상향 조절하여 염증 반응을 시작한다. 이러한 TLR 매개 전 염증성 사이토카인은 주요 전 염증성 전사 인자, 활성화 된 B 세포의 핵 인자 카파-B (kappa-light-chain-enhancer, NF-κB)의 활성화를 유도하고, 그 후 IL-6, IL-8 및 CCL-5와 같은 용해 효소 및 케모카인(chemokines)의 생성을 유도하는 염증 반응이 더욱 증폭된다. 마지막으로, 전 염증 인자의 이러한 불균형 및 조절 장애 생산은 결국 파골 세포 형성을 활성화하고, 골 흡수를 유발하여 치주염 과정에서 필수적인 역할을 한다. 따라서 전 염증성 사이토카인과 파골 세포 형성 매개체를 조절하는 것은 치주염 관련 치조골 손실을 예방하고 복원하는 근본적인 접근법이 될 수 있다.Although dysbiotic changes in the bacterial community are essential for the development and progression of periodontitis, it is primarily the host-derived immune and inflammatory responses to these microbes that can ultimately damage periodontal tissue. Thus, susceptibility or resistance to periodontitis varies among individuals, and the rate of disease progression is dependent on several factors, including environmental (smoking, stress, diet, socioeconomic), host-related systemic (diabetes, other NCDs) and genetic (epigenetic) factors. It is decided. After recognizing periodontal pathogens, Toll-like receptors (TLRs) initiate an inflammatory response by upregulating interleukin (IL)-6, IL-1β, and tumor necrosis factor (TNF)-α. These TLR-mediated pro-inflammatory cytokines induce activation of a key pro-inflammatory transcription factor, the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer (NF-κB) of activated B cells, followed by IL-6, IL The inflammatory response leading to the production of lytic enzymes and chemokines such as -8 and CCL-5 is further amplified. Finally, this imbalanced and dysregulated production of pro-inflammatory factors play an essential role in the periodontitis process by in turn activating osteoclastogenesis and triggering bone resorption. Therefore, modulating pro-inflammatory cytokines and mediators of osteoclastogenesis could be a fundamental approach to prevent and restore periodontitis-related alveolar bone loss.
비 코딩 작은 RNA에 해당되는 miRNA와 snoRNA 중 MicroRNA(miR)는 표적 유전자의 전사를 저하 시키거나 침묵시킴으로써 염증, 골 형성 및 파골 세포 형성에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에 치주염의 발병 기전에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 최근 여러 연구에서 치주염에 따른 miR의 발현 패턴을 조사하고 특정 종류의 miR이 치주 염증에서 차별적으로 발현된다는 사실이 밝혀졌다. 치주염과 함께 증가하거나 감소하는 것으로 밝혀진 miR은 일련의 사건의 여러 단계에서 기능하여 파골 세포 형성을 일으켜 전 염증성 사이토카인의 불균형과 생산 조절 장애로 이어진다. 예를 들어, 치주염과 관련된 대표적인 하향 조절된 miR인 miR-200c는 IL-6, IL-8 및 CCL-5와 같은 전 염증성 사이토카인을 억제할 뿐만 아니라 NF-κB / osteoprotegerin의 수용체 활성화제의 비율을 감소시킴으로써 염증과 골 흡수를 억제하는 것으로 알려져 있다.Among miRNAs and snoRNAs corresponding to non-coding small RNAs, microRNAs (miRs) play an important role in the pathogenesis of periodontitis because they are known to be involved in inflammation, bone formation, and osteoclastogenesis by reducing or silencing the transcription of target genes. It is expected. Recently, several studies have investigated miR expression patterns according to periodontitis and found that certain types of miRs are differentially expressed in periodontal inflammation. miRs, which have been shown to increase or decrease with periodontitis, function at different stages of the cascade of events, resulting in osteoclastogenesis, leading to pro-inflammatory cytokine imbalance and dysregulation of their production. For example, miR-200c, a representative downregulated miR associated with periodontitis, inhibits pro-inflammatory cytokines such as IL-6, IL-8 and CCL-5 as well as increasing the NF-κB/receptor activator ratio of osteoprotegerin. It is known to inhibit inflammation and bone resorption by reducing
치주 조직 항상성과 치주염 발병기전에서 miR의 역할에 대한 인식은 이제 막 시작되었으며 많은 부분이 밝혀 져야한다. 한편 snoRNA의 역할에 대한 연구는 전무한 상태이다. 종래의 경우, 치주 치료 전 치료와 치주 치료 후 치료를 비교하는 연구는 없다. 치주염에 따라 차별적으로 발현 된 miRs와 snoRNA가 치주 치료 후 건강한 수준으로 회복되면 치주 조직의 항상성 및 불균형 상태에 대한 관여를 보다 명확하게 증명할 수 있다. Recognition of the role of miRs in periodontal tissue homeostasis and periodontitis pathogenesis is just beginning and much remains to be elucidated. Meanwhile, there is no study on the role of snoRNA. Conventionally, there is no study comparing treatment before periodontal treatment with treatment after periodontal treatment. If miRs and snoRNAs differentially expressed according to periodontitis are restored to healthy levels after periodontal treatment, their involvement in periodontal tissue homeostasis and imbalance can be demonstrated more clearly.
또한, 현재까지의 치주염 진단 및 치료 후 효과 평가는 객관적인 지표에 기반을 둔 것이라기보다는 치은 부종 및 발적과 같은 주관적 판단에 근거하고 있다. 치주염 발생과 진행에 기여하는 인자 측정에 기반 한 평가 기법이 없어 치주염 진행 및 중증도에 대한 객관적 판단 근거가 부족하다. 또한, 치주탐침(periodontal probe)을 활용하는 경우 치주염 유무 및 진행도를 객관적으로 판단할 수 있으나 다소 침습적인 수단이며, 비침습적인 객관적 판단 수단인 방사선 촬영의 경우 비가역적으로 파괴된 치조골 양을 기준으로 치주염 유무 및 중증도를 판정하므로 치료 후 치주조직 건강도 판정 수단이 될 수 없다. In addition, so far, periodontitis diagnosis and treatment effect evaluation have been based on subjective judgments such as gingival swelling and redness rather than objective indicators. As there is no evaluation technique based on the measurement of factors contributing to the development and progression of periodontitis, there is a lack of objective evidence for determining the progression and severity of periodontitis. In addition, if a periodontal probe is used, the presence and progress of periodontitis can be objectively determined, but it is somewhat invasive. Since periodontitis is determined by the presence and severity of periodontitis, it cannot be used as a means to determine the health of periodontal tissue after treatment.
따라서 본 발명의 목적은 건강한 상태에 대해 차별적으로 발현되는 치주염의 miR와 snoRNA를 프로파일링하고 치주 치료에 따른 변화를 비교하는 것이다.Therefore, the purpose of the present invention is to profile the miRs and snoRNAs of periodontitis that are differentially expressed in healthy conditions and compare the changes according to periodontal treatment.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 건강한 상태와 비교해 차별적으로 발현되는 치주염의 miRNA와 snoRNA 유전자를 프로파일링하고 치주 치료에 따른 변화를 비교하는 것이다.The present invention was made to solve the above problems, and an object of the present invention is to profile miRNA and snoRNA genes of periodontitis that are differentially expressed compared to healthy conditions and compare changes according to periodontal treatment.
또한, 본 발명의 목적은 치주염 진행 과정에서 억제되는 miRNA와 snoRNA 유전자를 측정하여 치주염 유무, 중증도 및 치료 후 예후 판정에 대한 객관적 지표 제시하는 것이다. In addition, an object of the present invention is to measure miRNA and snoRNA genes that are suppressed in the course of periodontitis to present objective indicators for determining the presence, severity, and prognosis of periodontitis after treatment.
또한, 본 발명의 목적은 치주염 발병 기전 관련 인자를 객관적 수치화함으로써 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시하고자 한다. In addition, an object of the present invention is to present criteria and grounds for establishing a treatment plan suitable for the characteristics of periodontitis progression by objectively quantifying factors related to the pathogenesis of periodontitis.
또한, 본 발명의 목적은 혈액 또는 치은열구액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주염 유무 및 중증도를 평가하는 키트로 활용하고자 한다. In addition, an object of the present invention is to configure a diagnostic composition for measuring the levels of hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in biological samples such as blood or gingival sulcus, thereby determining the presence or absence of periodontitis and It is intended to be used as a kit to evaluate severity.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems to be solved by the invention are not limited to the above-mentioned technical problems, and other technical problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below. You will be able to.
본 발명에 따른 치주염 유무 진단용 바이오마커 조성물은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 제조되는 것을 특징으로 한다. The biomarker composition for diagnosing periodontitis according to the present invention measures the levels of hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus or saliva in a biological sample. It is characterized in that it is manufactured by consisting of.
또한, 본 발명에 따른 치주염 중증도 판별용 바이오마커 조성물은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 제조되는 것을 특징으로 한다. In addition, the biomarker composition for determining the severity of periodontitis according to the present invention measures the levels of hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus fluid or saliva in biological samples. It is characterized in that it is prepared by configuring a composition for diagnosis.
또한, 본 발명에 따른 치주염 치료 후 예후 판정용 바이오마커 조성물은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 수준을 측정하는 진단용 조성물로 구성하여 제조되는 것을 특징으로 한다. In addition, the biomarker composition for determining the prognosis after periodontitis treatment according to the present invention is at the level of hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus or saliva in biological samples. It is characterized in that it is prepared by configuring a diagnostic composition for measuring.
상기 과제의 해결 수단에 의해, By means of solving the above problems,
본 발명은 건강한 상태에 대해 차별적으로 발현되는 치주염의 miRNA와 snoRNA 유전자를 프로파일링하고 치주 치료에 따른 변화를 비교하는 객관적인 자료를 제공할 수 있다. The present invention can profile miRNA and snoRNA genes of periodontitis that are differentially expressed in healthy conditions and provide objective data for comparing changes according to periodontal treatment.
또한, 본 발명은 치주염 진행 과정에서 억제되는 miRNA와 snoRNA 유전자를 측정하여 치주염 유무, 중증도 및 치료 후 예후 판정에 대한 객관적 지표 제시할 수 있다. In addition, the present invention can measure miRNA and snoRNA genes that are inhibited in the process of periodontitis, and present objective indicators for determining the presence, severity, and prognosis of periodontitis after treatment.
또한, 본 발명은 치주염 발병 기전 관련 인자를 객관적 수치화함으로써 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시할 수 있다. In addition, the present invention can present criteria and grounds for establishing a treatment plan suitable for the characteristics of periodontitis progression by objectively quantifying factors related to the pathogenesis of periodontitis.
또한, 본 발명은 혈액 또는 치은열구액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주염 유무 및 중증도를 평가하는 키트로 활용할 수 있다. In addition, the present invention constitutes a diagnostic composition for measuring the levels of hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in biological samples such as blood or gingival sulcus fluid, thereby determining the presence and severity of periodontitis. It can be used as an evaluation kit.
또한, 본 발명은 혈액 또는 치은열구액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자를 함유하는 치료제로 활용할 수 있다. In addition, the present invention can be used as a therapeutic agent containing hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in a biological sample such as blood or gingival sulcus fluid.
도 1은 본 발명의 치주염 유무 및 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물 확인을 위해 설계된 연구 설계 개요이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 엑소 좀에서 추출한 8 가지 유형의 RNA에 대한 분포 비율을 보여주는 누적 막대 플롯이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 차별적으로 발현된 miRNA 유전자 분석을 시각화 하여 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 도 2와 함께 차별적으로 발현된 miRNA 유전자 농축 분석을 시각화 하여 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 차별적으로 발현된 miRNA에 의해 조절되는 생물학적 과정(BP)에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 차별적으로 발현된 miRNA에 의해 조절되는 세포 구성 요소(CC)에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, 차별적으로 발현된 miRNA에 의해 조절되는 분자 기능(MF)에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 짝을 이루는 분석(Paired)에서 공통으로 차별적으로 표현 된 snoRNA의 상자그림(Boxplot)이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 짝을 이루지 않는 분석(Unpaired)에서 공통으로 차별적으로 표현 된 snoRNA의 상자그림(Boxplot)이다. 1 is an overview of the study design designed to confirm the biomarker composition for determining the presence or absence of periodontitis and the severity of periodontitis of the present invention.
2 is a cumulative bar plot showing distribution ratios for 8 types of RNAs extracted from exosomes according to an embodiment of the present invention.
3 is a diagram showing the visualization of differentially expressed miRNA gene analysis according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing the visualization of differentially expressed miRNA gene enrichment analysis together with FIG. 2 according to an embodiment of the present invention.
5 is a gene ontology (GO) analysis of biological processes (BP) regulated by differentially expressed miRNAs according to an embodiment of the present invention.
6 is a Gene Ontology (GO) analysis of cell components (CC) regulated by differentially expressed miRNAs according to an embodiment of the present invention.
7 is a Gene Ontology (GO) analysis of molecular functions (MF) regulated by differentially expressed miRNAs according to an embodiment of the present invention.
8 is a boxplot of commonly differentially expressed snoRNAs in paired analysis (Paired) according to an embodiment of the present invention.
9 is a boxplot of commonly differentially expressed snoRNAs in an unpaired analysis (Unpaired) according to an embodiment of the present invention.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.The terms used in this specification will be briefly described, and the present invention will be described in detail.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.The terms used in the present invention have been selected from general terms that are currently widely used as much as possible while considering the functions in the present invention, but these may vary depending on the intention of a person skilled in the art or precedent, the emergence of new technologies, and the like. Therefore, the term used in the present invention should be defined based on the meaning of the term and the overall content of the present invention, not simply the name of the term.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.In the entire specification, when a part is said to "include" a certain component, it means that it may further include other components, not excluding other components unless otherwise stated.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.The specific details, including the problem to be solved, the means for solving the problem, and the effect of the invention with respect to the present invention are included in the embodiments and drawings to be described below. Advantages and features of the present invention, and methods for achieving them, will become clear with reference to the embodiments described below in detail in conjunction with the accompanying drawings.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
치주염 감별용 및 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물Biomarker composition for discrimination of periodontitis and severity of periodontitis
본 발명은 정상인(대조군)의 체액 대비 치주 질환 환자의 혈액, 치은열구액 또는 타액에서 상대적으로 발현의 차이를 나타내는 대사물질을 포함하는 치주 질환 진단용 바이오마커를 제공한다.The present invention provides a biomarker for diagnosing periodontal disease comprising a metabolite showing a relative difference in expression in the blood, gingival sulcus fluid or saliva of a patient with periodontal disease compared to the body fluid of a normal person (control group).
본 발명에 사용된 용어 “정상인(대조군)”이란, 실험 결과가 제대로 도출되었는지 여부를 판단하기 위한 집단을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 “정상인(대조군)”이란 치주 질환을 앓고 있지 않은 개체를 의미한다.The term "normal person (control group)" used in the present invention means a group for determining whether or not the experimental results have been properly derived. For the purpose of the present invention, the "normal person (control group)" means an individual not suffering from periodontal disease.
본 발명에 사용된 용어 "치주염(periodontitis)" 이란, 풍치라고도 하며, 치태세균의 불균형 (dysbiosis)에 의해 개시되어 치주조직을 손상시키는 만성염증성질환을 의미하는데, 병증의 심도 (stage Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ )와 진행속도 (grade A,B,C)에 따라 세분화된다. 치주염의 발병시 염증 및 면역반응이 진행되는데 이 과정에서 치주낭(periodontal pocket)이 형성된다. 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 하부의 결합조직 파괴를 초래하게 되어 최종적으로는 골소실이 유발된다고 알려져 있다.The term "periodontitis" used in the present invention, also called periodontitis, refers to a chronic inflammatory disease that is initiated by dysbiosis of plaque bacteria and damages periodontal tissue, and the severity of the disease (stage I, II, III, IV ) and progression speed (grade A, B, C). During the onset of periodontitis, inflammatory and immune responses proceed, during which periodontal pockets are formed. As periodontitis is severe, the depth of the periodontal pocket becomes deeper. As the periodontal pocket deepens, it is known that as the periodontal pocket becomes deeper, destruction of the lower connective tissue is caused, and finally bone loss is induced.
본 발명에 사용된 용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 치주염의 발병 여부, 병의 진전 정도 또는 이로 인한 위험군 여부를 확인하는 것이다.As used herein, the term “diagnosis” means confirming the presence or character of a pathological condition. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to determine whether periodontitis has occurred, the degree of progression of the disease, or whether there is a risk group due to it.
본 발명은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 RNA 수준을 측정하는 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물이다. The present invention measures the RNA level of any one or more genes selected from hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus or saliva in a biological sample for periodontitis It is a biomarker composition for discrimination of severity.
상기 hsa-miR-1304-3p 및 has-miR-200c-3p 유전자는 miRNA 인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 SNORD57 및 SNODB1771 유전자는 snoRNA인 것을 특징으로 한다. The hsa-miR-1304-3p and has-miR-200c-3p genes are miRNAs. In addition, the SNORD57 and SNODB1771 genes are characterized in that they are snoRNAs.
본 발명에 있어서, 상기 치주염(periodontitis)은 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치조골 파괴(alveolarbone destruction) 또는 치조골 소실(alveolar bone loss)과 같은 증상과 징후로 표현될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the periodontitis is characterized by symptoms and signs such as gingival bleeding, gingival retraction, periodontal pocket, alveolarbone destruction or alveolar bone loss. It may be expressed as, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 치조골 소실은 치조골에서 골형성과 골흡수의 균형이 깨어져 골흡수가 골형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면서 나타나는 치주 질환의 일종으로, 치조골 흡수(alveolar bone resorption)가 나타날 수 있다.In the present invention, the loss of alveolar bone is a kind of periodontal disease that occurs when the balance between bone formation and bone resorption is broken in the alveolar bone, bone resorption exceeds bone formation, and the amount of bone decreases below the limit, and alveolar bone resorption is can appear
치주염 중증도 감별용 진단 키트Diagnostic kit for determining the severity of periodontitis
본 발명은 상기 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공한다. The present invention provides a diagnostic kit comprising the biomarker composition for determining the severity of periodontitis.
상기 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물은 앞서 기재한 바와 같다.The biomarker composition for determining the severity of periodontitis is as described above.
본 발명에 있어서, 상기 진단 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the diagnostic kit is a microarray, an aptamer chip kit, an ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kit, a blotting kit, an immunoprecipitation kit, an immunofluorescence test kit, a protein chip kit, or these kits. It may be selected from the group consisting of a combination of, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 진단 키트는 시퀀싱(sequencing), PCR 기법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, in the present invention, the diagnostic kit may be selected from the group consisting of sequencing, PCR techniques, or combinations thereof, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 진단 키트는 대사물질과 특이적으로 결합하는 분자를 포함하며, 특히, 치주 질환을 진단하는데 보다 바람직하다.In the present invention, the diagnostic kit includes a molecule that specifically binds to a metabolite, and is particularly preferable for diagnosing periodontal disease.
본 발명에 있어서, 상기 특이적으로 결합하는 분자는 항체, 기질, 리간드 단백질, 펩타이드, 핵산, 화학물질, 고분자 또는 보조인자(cofactor) 등 일 수 있으며, 구체적으로는 각 마커를 인식하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 각 마커에 상호작용하는 특정 단백질, 펩타이드, 핵산, 고분자 또는 화학물질, 또는 각 마커와 화학반응을 일으켜 특정 화학 물질로 변환되도록 가능한 화학물질 또는 화합물, 또한 추가적으로 항체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 고분자 또는 화학물질에 수식(modification) 가능한 나노입자, 형광 염료(fluorescent dyes) 등의 측정 시약을 포함할 수 있다.In the present invention, the specifically binding molecule may be an antibody, substrate, ligand protein, peptide, nucleic acid, chemical substance, polymer or cofactor, etc., specifically, a monoclonal Or a polyclonal antibody, a specific protein, peptide, nucleic acid, polymer or chemical substance that interacts with each marker, or a chemical substance or compound capable of causing a chemical reaction with each marker to be converted into a specific chemical substance, also additionally an antibody, protein, Measurement reagents such as peptides, nucleic acids, nanoparticles that can be modified in polymers or chemicals, and fluorescent dyes may be included.
본 발명에 있어서, 상기 진단 키트는 검체로서 혈액, 치은열구액 또는 타액을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the diagnostic kit preferably uses blood, gingival sulcus fluid or saliva as a sample.
본 발명은 생물학적 시료 내 혈액, 치은열구액 또는 타액에 분포한, hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 RNA 수준을 측정하는 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물이다. The present invention measures the RNA level of any one or more genes selected from hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in blood, gingival sulcus or saliva in a biological sample for periodontitis It is a biomarker composition for discrimination of severity.
상기 hsa-miR-1304-3p 및 has-miR-200c-3p 유전자는 miRNA 인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 SNORD57 및 SNODB1771 유전자는 snoRNA인 것을 특징으로 한다. The hsa-miR-1304-3p and has-miR-200c-3p genes are miRNAs. In addition, the SNORD57 and SNODB1771 genes are characterized in that they are snoRNAs.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해 질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하 게 알려 주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention, and methods of achieving them, will become clear with reference to the embodiments described below in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various different forms, and only the embodiments make the disclosure of the present invention complete, and common knowledge in the art to which the present invention belongs. It is provided to fully inform the person who has the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
1) 실험 설계 및 모집단1) Experimental Design and Population
본 발명은, 도 1에 나타난 바와 같이, 건강한 그룹과 치주염 그룹 사이의 혈청 miR의 차이와 치주 치료 후 miR의 변화 패턴을 설명하기 위한 관찰 횡단면 연구이며, 적절한 경우 STROBE 지침을 따랐다. 모든 피험자는 본 연구에 참여하기 위해 서면 동의를 제공했으며 프로토콜은 부산 대학교 치과 병원 기관 심의위원회 (PNUDH-2020-001)의 승인을 받았다.The present invention, as shown in Figure 1, is an observational cross-sectional study to explain the difference in serum miR between the healthy group and the periodontitis group and the change pattern of miR after periodontal treatment, and followed the STROBE guidelines when appropriate. All subjects provided written consent to participate in this study and the protocol was approved by the Institutional Review Board of Pusan National University Dental Hospital (PNUDH-2020-001).
피험자는 2020 년 6 월부터 12 월까지 부산 대학교 치과 병원 치주과에서 모집되었다. 피험자의 일반 선정 기준은 다음과 같다. Subjects were recruited from the Department of Periodontics, Pusan National University Dental Hospital from June to December 2020. The general selection criteria for subjects are as follows.
1) 치주 상태에 영향을 미칠 수 있는 전신 질환이 없었고 임심 또는 모유 수유 중이 아니었다.1) She had no systemic disease that could affect her periodontal status and was not pregnant or breastfeeding.
2) 6 개월 이내에 전신 항생제, 항염증제 또는 구강 소독제를 복용하지 않았거나 지난 6 개월 동안 치주 요법을 받지 않았다. 2) Has not taken systemic antibiotics, anti-inflammatory drugs or oral antiseptics within 6 months or has not received periodontal therapy in the past 6 months.
3) 구강의 급성 감염이나 만성 점막 병변이 없었다. 3) There was no acute oral infection or chronic mucosal lesion.
4) 피험자는 적어도 20 개의 치아를 가지고 있었다. 4) Subjects had at least 20 teeth.
5) 비 흡연자이다. 5) I am a non-smoker.
6) 그들은 사전 동의에 서명했다.6) They signed an informed consent.
연구 참여에 동의 한 피험자는 치주 조직의 상태에 따라 건강한 그룹과 치주염 그룹으로 나눴다. 피험자의 연구 참여는 다음과 같다. Subjects who agreed to participate in the study were divided into a healthy group and a periodontitis group according to the condition of periodontal tissue. The subject's participation in the study was as follows.
1) 기준선 - 임상 치주 매개 변수의 기록 및 혈액 샘플 채취가 모든 피험자로부터 수행되었다. 치주염 그룹은 치주 전문의에게 당일 전체 구강 치은하 스케일링 및 치근활택술 또는 소파술을 받았다. 1) Baseline - Recording of clinical periodontal parameters and blood sampling were performed from all subjects. The periodontitis group underwent same-day total oral subgingival scaling and root planing or curettage by a periodontist.
2) 1 개월 후 - 재 수행 된 치주 임상 검사 및 치주염 그룹에서 혈액 샘플 수집했다.2) 1 month later - Re-performed periodontal clinical examination and blood samples were collected from the periodontitis group.
2) 치주 검사2) periodontal examination
치주 전문의가 치주 검사 깊이, 임상 부착 수준, 플라크 지수 및 치은 지수를 사용하여 치주 상태를 평가했다.A periodontist assessed periodontal status using periodontal examination depth, clinical attachment level, plaque index, and gingival index.
이 발명에서는 2 기(Ⅱ) 또는 3 기(Ⅲ) 치주염이 있는 피험자가 포함되었으며, 치주 진단은 2017 년 세계 치주 및 임플란트 주변 질환 및 상태 분류 워크숍에서 제시 한 지침을 따랐다. 단계는 아래 분류 된 심각도가 기준이 된다.In this study, subjects with stage 2 (II) or 3 (III) periodontitis were included, and periodontal diagnosis followed the guidelines presented by the 2017 World Classification of Periodontal and Peri-Implant Diseases and Conditions Workshop. The level is based on the severity classified below.
1) 2 기(Ⅱ) a) 3 ~ 4 mm의 치간 임상 부착 손실; b) 뿌리 길이의 15 %에서 33 % 사이의 방사선학적 골 손실; c) 최대 프로빙 깊이 ≤ 5mm; d) 치주염으로 인한 치아 손실 없음.1) stage 2 (II) a) interdental clinical attachment loss of 3 to 4 mm; b) radiographic bone loss between 15% and 33% of root length; c) maximum probing depth ≤ 5 mm; d) No tooth loss due to periodontitis.
2) 3 기(Ⅲ) a) 치간 임상 부착 손실 ≥ 5 mm; b) 뿌리의 중간 3 분의 1 이상까지 연장되는 방사선 학적 골 손실; c) 최대 프로빙 깊이 ≥ 6mm; d) 치아 4 개 이하의 치주염으로 인한 치아 손실.2) Stage 3 (III) a) Clinical interdental attachment loss ≥ 5 mm; b) radiographic bone loss extending to more than the middle third of the root; c) maximum probing depth ≥ 6 mm; d) tooth loss due to periodontitis of no more than 4 teeth.
3) 샘플 수집 및 엑소좀 정제3) Sample collection and exosome purification
정맥혈 샘플(5 ml)을 채취하여 별도의 멸균 EDTA 처리 튜브에 넣었다. 시료를 1,000 g에서 10 분간 원심 분리 한 후 혈장은 -20 ℃에서 보관하여 후속 처리 했다. 엑소좀 이외의 소포를 제거하기 위해 원심 분리 여과 장치(Pall Life Sciences, NY, USA)를 사용하여 혈장을 여과했다. 엑소좀은 100,000 g에서 1 시간 동안 초 원심 분리에 의해 분리하고, 이어서 PBS에 펠렛을 재현탁 한 후 100,000 g에서 1 시간 동안 추가로 초 원심 분리하여 세척했다.Venous blood samples (5 ml) were taken and placed in separate sterile EDTA treated tubes. After the samples were centrifuged at 1,000 g for 10 minutes, the plasma was stored at -20 °C for subsequent processing. Plasma was filtered using a centrifugal filtration device (Pall Life Sciences, NY, USA) to remove vesicles other than exosomes. Exosomes were isolated by ultracentrifugation at 100,000 g for 1 hour, followed by washing by resuspending the pellet in PBS followed by further ultracentrifugation at 100,000 g for 1 hour.
4) RNA 추출 및 RNA 시퀀싱4) RNA extraction and RNA sequencing
miRNeasy 키트 (Quiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 엑소좀에서 RNA를 추출하고 SMARTer smRNA-Seq 키트 (Clontech Laboratoreis, San Diego, CA, USA)를 사용하여 라이브러리를 구축했다. 작은 RNA 시퀀싱은 Macrogen (대한민국 서울)에서 수행했다.RNA was extracted from exosomes using the miRNeasy kit (Quiagen, Hilden, Germany) and libraries were constructed using the SMARTer smRNA-Seq kit (Clontech Laboratoreis, San Diego, CA, USA). Small RNA sequencing was performed by Macrogen (Seoul, Korea).
5) 생물 정보학 분석, 통계 분석 및 시각화5) Bioinformatics analysis, statistical analysis and visualization
모든 표현식 데이터에 대해 log2 변환 RPM으로 정규화 된 값을 사용하였다. "Limma 3.46.0"R 패키지를 사용하여 그룹 간에 차별적으로 발현 된 miRNA (DEmiR)를 확인했다([Ritchie, 2015 # 27]). 플롯을 그리기 위해 "tidyr 1.1.3", "ggplot2 3.3.3", "gplots 3.1.1"및 "pheatmap 1.0.12"R 패키지를 사용했다. DEmiR간에 공유되는 공통 특수 기능을 찾기 위해 DIANA-mirPath v.3 소프트웨어 (http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr/)를 사용하여 GO 분석을 수행했다 ([Vlachos, 2015 # 26] ). p-value 임계값을 1e-02로 설정하고 DEmiR을 병합하는 방법으로 범주 교차를 선택했다.For all expression data, values normalized to log 2 transformed RPM were used. The “Limma 3.46.0” R package was used to identify differentially expressed miRNAs (DEmiR) between groups ([Ritchie, 2015 #27]). The R packages "tidyr 1.1.3", "ggplot2 3.3.3", "gplots 3.1.1" and "pheatmap 1.0.12" were used to draw the plots. GO analysis was performed using DIANA-mirPath v.3 software (http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr/) to find common special functions shared among DEmiRs ([Vlachos, 2015 #26 ]). We chose category crossing by setting the p-value threshold to 1e -02 and merging the DEmiRs.
6) 엑소좀의 작은 RNA 추가 분석6) Additional small RNA analysis of exosomes
본 발명은 또한, 엑소좀에 존재하는 다른 작은 RNA (운반 RNA; tRNA, 소핵소체 RNA; snoRNA, 소핵 RNA; snRNA, yRNA, 소조건부 RNA; scRNA 및 vault RNA; vRNA)를 분석하여 다음을 사용하여 차별적으로 발현 된 작은 RNA를 식별했다. “Limma 3.46.0”R 패키지. 분석은 DEmiR을 찾는데 사용 된 방법과 동일한 방식으로 수행되었다. RNA 정보는 GeneCards (https://www.genecards.org/) [참조 : https://doi.org/10.1093/database/baq020] 및 RNAcentral 데이터베이스 (https://rnacentral.org/)에서 검색되었다 [참조 : 10.1093 / nar / gkw1008].The present invention also analyzes other small RNAs (transport RNA; tRNA, micronucleus RNA; snoRNA, micronucleus RNA; snRNA, yRNA, small conditional RNA; scRNA and vault RNA; vRNA) present in exosomes using the following Differentially expressed small RNAs were identified. “Limma 3.46.0” R package. The assay was performed in the same way as the method used to find DEmiR. RNA information was retrieved from GeneCards (https://www.genecards.org/) [reference: https://doi.org/10.1093/database/baq020] and the RNAcentral database (https://rnacentral.org/) [ Reference: 10.1093/nar/gkw1008].
아래는 상기 실시예를 통한 실험 결과를 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 시퀀싱 절차 이전에 총 14 개의 샘플 (건강 샘플 : 4, 전처리 샘플 : 5, 후 처리 샘플 : 5)이 본 발명에서 획득되었지만 마지막으로 12 개의 샘플(건강한 샘플 : 3, 전처리 샘플 : 4, 후 처리 샘플 : 5)이 RNA 양 및 품질 문제로 인해 건강한 샘플 1 개와 전처리 샘플 1 개를 제외한 RNA 시퀀싱에 사용되었다. 치주염 그룹의 치료에 따른 RNA 프로파일을 비교하기 위해 서로 다른 그룹으로 두 가지 분석을 수행했다. 치료 전/후로 그룹화 하여 짝을 이루지 않은 분석을 수행하고 동일한 피험자에서 치료 전과 후를 일치시켜 짝을 이루는 분석을 수행했다.The experimental results through the above examples are shown below. As shown in Fig. 1, a total of 14 samples (healthy samples: 4, pre-treatment samples: 5, post-treatment samples: 5) were obtained in the present invention before the sequencing procedure, but finally 12 samples (healthy samples: 3, pre-treatment samples: 3) Sample: 4, post-treatment sample: 5) were used for RNA sequencing except for 1 healthy sample and 1 pre-treatment sample due to RNA quantity and quality issues. Two analyzes were performed with different groups to compare the RNA profiles of the periodontitis groups according to treatment. We performed unpaired analyzes by grouping before/after treatment and performed paired analyzes matching before and after treatment in the same subjects.
1) 8 가지 유형의 엑소좀 RNA에 대한 시퀀싱 결과1) Sequencing results for 8 types of exosomal RNA
엑소좀에는 miRNA를 제외한 여러 개의 작은 RNA가 포함되어 있기 때문에 매핑 된 시퀀스 읽기 수를 사용하여, 도 2에 나타난 바와 같이, 각 샘플에 엑소좀 RNA의 상대적인 양이 얼마나 많이 존재하는지 확인했다. 도 2에서 볼 수 있듯이 tRNA와 snRNA가 가장 큰 비율을 차지하는 반면, scRNA와 vRNA는 매우 적은 비율을 차지했다.Since exosomes contain several small RNAs excluding miRNAs, the number of mapped sequence reads was used to determine how much relative amount of exosomal RNA was present in each sample, as shown in Fig. 2. As can be seen in Figure 2, tRNA and snRNA accounted for the largest proportion, while scRNA and vRNA accounted for a very small proportion.
2) DEmiR의 프로필2) Profile of DEmiR
먼저 8 가지 RNA 유형 중 miR을 분석했다. |로그 접기 변경 (테스트 / 제어) | > 1.5 및 P <0.05는 miR을 유의하게 반영하는 것으로 간주할 때, 표 1에 나타난 바와 같이, 짝 분석을 위해 3 개의 miR가 선택되고 비 결합 분석을 위해 4 개의 miR가 선택되었다. 짝(paired) 분석은 miR 1304-3p, miR 200c-3p 및 miR 409-5p에 대해 유의하게 다른 표현을 보여주었다. 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 건강한 그룹에 비해 치주염 그룹의 모든 발현은 거의 0으로 급격히 감소했지만, 치료 후 건강한 수준과 유사한 수준으로 회복되었다.We first analyzed miRs among the eight RNA types. |Alter log folding (test/control) | Considering >1.5 and P<0.05 to reflect significant miRs, three miRs were selected for paired analysis and four miRs were selected for unpaired analysis, as shown in Table 1. Paired analysis showed significantly different expression for miR 1304-3p, miR 200c-3p and miR 409-5p. As shown in FIGS. 3 and 4 , compared to the healthy group, all expressions in the periodontitis group rapidly decreased to almost zero, but recovered to a level similar to the healthy level after treatment.
비 짝(unpaired) 분석에서 miR 122-5p, miR 1271-5p, miR 1304-3p 및 miR 200c-3p는 건강한 그룹과 치주염 그룹(치료 전/후)간에 유의 한 차이를 나타냈다. 치주염이 있는 경우 거의 발현되지 않는 3 개의 miR과 달리 miR-122-5p는 반대로 치주염으로 상대적인 발현이 증가했다. 치주염 군에서 치주 치료 후 miR-1271-5p, miR-1304-3p, miR200c-3p의 상대적 발현은 증가하였으나 miR-122-5p는 감소하여 모두 건강한 그룹과 유사한 수준을 보였다.In unpaired analysis, miR 122-5p, miR 1271-5p, miR 1304-3p and miR 200c-3p showed significant differences between the healthy group and the periodontitis group (before/after treatment). Unlike the three miRs, which were rarely expressed in patients with periodontitis, the relative expression of miR-122-5p increased with periodontitis. In the periodontitis group, the relative expression of miR-1271-5p, miR-1304-3p, and miR200c-3p increased after periodontal treatment, but miR-122-5p decreased, all showing similar levels to the healthy group.
짝을 이루는 분석과 짝을 이루지 않은 분석 모두에서 현저한 차이를 보이는 miR은 miR-1304-3p와 miR-200c-3p로 치주염이 있는 경우 감소하고 치료 후 건강한 수준으로 회복되었다.miR-1304-3p and miR-200c-3p, which showed significant differences in both paired and unpaired analyses, were reduced in patients with periodontitis and recovered to healthy levels after treatment.
2) miR의 유전자 온톨로지 (GO) 분석2) gene ontology (GO) analysis of miRs
짝을 이루는 분석과 짝을 이루지 않은 분석 사이에서 추출 된 공통 DEmiR의 기능적 특성을 더 잘 이해하기 위해, 도 5, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC) 및 분자 기능(MF)의 세 가지 독립 범주로 구성된 GO 분석을 수행했다. 도 5에 나타난 바와 같이, 생물학적 과정(BP)의 경우 총 12 개의 GO 기능 용어인 세포 단백질 변형 과정, 생합성 과정, 유전자 발현 및 세포 질소 화합물 대사 과정 등이 확인되었다. 도 6를 보면 세포 구성 요소(CC)는 핵질, 세포질, 세포 기관 및 단백질 복합체를 포함하고, 도 7에 나타난 바와 같이, 분자 기능(MF)에는 RNA 결합, 이온 결합, 효소 결합, 폴리(A) RNA 결합 및 단백질 결합 전사 인자 활성이 포함되었다.In order to better understand the functional properties of common DEmiRs extracted between paired and unpaired assays, as shown in Figures 5, 6 and 7, biological process (BP), cellular component (CC) ) and a GO analysis consisting of three independent categories of molecular function (MF). As shown in FIG. 5, in the case of biological process (BP), a total of 12 GO functional terms, such as cellular protein modification process, biosynthetic process, gene expression, and cellular nitrogen compound metabolism process, were identified. Referring to FIG. 6, cell components (CC) include nucleoplasm, cytoplasm, organelles, and protein complexes, and as shown in FIG. 7, molecular functions (MF) include RNA binding, ion binding, enzyme binding, poly(A) RNA-binding and protein-binding transcription factor activities were included.
3) 차별적으로 발현 된 snoRNA3) differentially expressed snoRNAs
그 후, 유의하게 차별적으로 발현 된 다른 RNA의 존재를 확인하기 위해 분석을 수행했다. 본 발명에서는 7 가지 RNA (tRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, yRNA, scRNA, vRNA)를 사용했으며, 그 중 snoRNA (DEsnoR)에서 현저하게 차별적으로 발현 된 RNA가 발견되었다. 표 2에 나타난 바와 같이, 짝을 이루는 분석 (12 개의 DEsnoR)과 짝을 이루지 않은 분석 (7 개의 DEsnoR)에서 발견 된 두 개의 일반적인 DEsnoR을 식별했다. 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 건강한 그룹에 비해 치주염 그룹의 모든 발현은 감소했지만 치료 후 건강한 그룹과 유사한 수준으로 회복된다. 일반적인 DEmiR 및 DEsonR의 정보는 표 3에 설명되어 있다.Analysis was then performed to confirm the presence of other significantly differentially expressed RNAs. Seven RNAs (tRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, yRNA, scRNA, vRNA) were used in the present invention, and among them, a significantly differentially expressed RNA was found in snoRNA (DEsnoR). As shown in Table 2, we identified two common DEsnoRs found in paired assays (12 DEsnoRs) and unpaired assays (7 DEsnoRs). As shown in Figures 8 and 9, all expressions in the periodontitis group decreased compared to the healthy group, but recovered to a level similar to that of the healthy group after treatment. Information of general DEmiR and DEsonR is described in Table 3.
(GeneCards)(GeneCards)
SNORA36CSNORA36C
- 게놈 위치 : 11 번 염색체 (93,733,691-93,733,712), 역 가닥- 22 nucleotides
- Genomic location: chromosome 11 (93,733,691-93,733,712), reverse strand
- 게놈 위치 : 12 번 염색체 (6,963,742-6,963,764), 전방 가닥- 23 nucleotides
- Genomic location: chromosome 12 (6,963,742-6,963,764), forward strand
- 72 개 뉴클레오티드
- 게놈 위치 : 20 번 염색체 (2,656,939-2,657,010), 전방 가닥
- RNA 유전자 (snoRNA 클래스에 속함)
- 관련 질환 : Exanthema Subitum- Homo sapiens micronucleus RNA, C/D box 57
- 72 nucleotides
- Genomic location: chromosome 20 (2,656,939-2,657,010), forward strand
- RNA genes (belonging to the snoRNA class)
- Related disease: Exanthema Subitum
- 82 개 뉴클레오티드
- 게놈 위치 : 14 번 염색체 (102,374,238-102,374,319), 역 가닥
- RNA 유전자 (snoRNA 클래스에 속함)- Homo sapiens micronucleus RNA U3
- 82 nucleotides
- Genomic location: chromosome 14 (102,374,238-102,374,319), reverse strand
- RNA genes (belonging to the snoRNA class)
Database: RNA central, GeneCards Database: RNA central, GeneCards
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 건강한 상태에 대해 차별적으로 발현되는 치주염의 miRNA와 snoRNA 유전자를 프로파일링하고 치주 치료에 따른 변화를 비교하는 객관적인 자료를 제공할 수 있다. By means of solving the above problems, the present invention can profile miRNA and snoRNA genes of periodontitis that are differentially expressed for healthy conditions and provide objective data for comparing changes according to periodontal treatment.
또한, 본 발명은 치주염 진행 과정에서 억제되는 miRNA와 snoRNA 유전자를 측정하여 치주염 유무, 중증도 및 치료 후 예후 판정에 대한 객관적 지표 제시할 수 있다. In addition, the present invention can measure miRNA and snoRNA genes that are inhibited in the process of periodontitis, and present objective indicators for determining the presence, severity, and prognosis of periodontitis after treatment.
또한, 본 발명은 치주염 발병 기전 관련 인자를 객관적 수치화함으로써 치주염 진행 특성에 적합한 치료계획 수립 기준 및 근거를 제시할 수 있다. In addition, the present invention can present criteria and grounds for establishing a treatment plan suitable for the characteristics of periodontitis progression by objectively quantifying factors related to the pathogenesis of periodontitis.
또한, 본 발명은 혈액, 치은열구액과 또는 타액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자 수준을 측정하는 진단용 조성물 구성하여 치주염 유무 및 중증도를 평가하는 키트로 활용할 수 있다. In addition, the present invention constitutes a diagnostic composition for measuring the levels of hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in biological samples such as blood, gingival sulcus or saliva, and thus the presence or absence of periodontitis. And it can be used as a kit to evaluate the severity.
또한, 본 발명은 혈액, 치은열구액과 또는 타액과 같은 생물학적 시료내에 분포한 hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 유전자를 함유하는 치료제로 활용할 수 있다. In addition, the present invention can be used as a therapeutic agent containing hsa-miR-1304-3p, has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 genes distributed in a biological sample such as blood, gingival sulcus or saliva.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.As such, it will be understood that the technical configuration of the present invention described above can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention by those skilled in the art to which the present invention pertains.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative and not restrictive in all respects, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and their All changes or modified forms derived from equivalent concepts should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (15)
hsa-miR-1304-3p 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주염 감별용 바이오마커 조성물.
Distributed in blood, gingival sulcus or saliva in biological samples,
A biomarker composition for discrimination of periodontitis, characterized in that it comprises the hsa-miR-1304-3p gene.
has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주염 감별용 바이오마커 조성물.
According to claim 1,
A biomarker composition for discrimination of periodontitis, characterized in that it further comprises any one or more genes selected from has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 .
상기 hsa-miR-1304-3p 및 has-miR-200c-3p 유전자는 miRNA인 것을 특징으로 하는, 치주염 감별용 바이오마커 조성물.
According to claim 2,
The hsa-miR-1304-3p and has-miR-200c-3p genes are miRNAs, characterized in that, periodontitis biomarker composition for discrimination.
상기 SNORD57 및 SNODB1771 유전자는 snoRNA인 것을 특징으로 하는, 치주염 감별용 바이오마커 조성물.
According to claim 2,
The SNORD57 and SNODB1771 genes are characterized in that snoRNA, a biomarker composition for discrimination of periodontitis.
A biomarker composition for identifying periodontitis, comprising an agent for measuring the RNA of the biomarker composition according to any one of claims 1 to 4.
A kit for diagnosing periodontitis, comprising the composition of any one of claims 1 to 4.
상기 치주염 진단용 키트는,
마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘리사(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트, 블랏팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 침 키트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 치주염 진단용 키트.
According to claim 6,
The kit for diagnosing periodontitis,
A microarray, an aptamer chip kit, an ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kit, a blotting kit, an immunoprecipitation kit, an immunofluorescence test kit, a protein precipitation kit, or a combination thereof selected from the group consisting of Characterized in, a kit for diagnosing periodontitis.
상기 치주염 진단용 키트는,
시퀀싱, PCR 기법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 치주염 진단용 키트.
According to claim 6,
The kit for diagnosing periodontitis,
A kit for diagnosing periodontitis, characterized in that selected from the group consisting of sequencing, PCR techniques, or a combination thereof.
hsa-miR-1304-3p 유전자의 RNA를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주염 중증도 감별을 위한 정보제공방법.
Distributed in blood, gingival sulcus or saliva in biological samples,
Measuring the RNA of the hsa-miR-1304-3p gene; and
Comparing the measured expression level with the expression level of a normal control group; characterized in that it comprises, information providing method for determining the severity of periodontitis.
상기 유전자의 RNA를 측정하는 단계에서 has-miR-200c-3p 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주염 중증도 감별을 위한 정보제공방법.
According to claim 9,
In the step of measuring the RNA of the gene, the method for providing information for determining the severity of periodontitis, characterized in that it further comprises the has-miR-200c-3p gene.
hsa-miR-1304-3p 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물.
Distributed in blood, gingival sulcus or saliva in biological samples,
A biomarker composition for determining the severity of periodontitis, characterized in that it contains the hsa-miR-1304-3p gene.
has-miR-200c-3p, SNORD57 및 SNODB1771 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물.
According to claim 11,
A biomarker composition for determining the severity of periodontitis, characterized in that it further comprises any one or more genes selected from has-miR-200c-3p, SNORD57 and SNODB1771 .
상기 hsa-miR-1304-3p 및 has-miR-200c-3p 유전자는 miRNA인 것을 특징으로 하는, 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물.
According to claim 12,
The hsa-miR-1304-3p and has-miR-200c-3p genes are miRNAs, a biomarker composition for determining the severity of periodontitis.
상기 SNORD57 및 SNODB1771 유전자는 snoRNA인 것을 특징으로 하는, 치주염 중증도 감별용 바이오마커 조성물.
According to claim 12,
The SNORD57 and SNODB1771 genes are characterized in that snoRNA, a biomarker composition for determining the severity of periodontitis.
A biomarker composition for determining the severity of periodontitis, comprising an agent for measuring the RNA of the biomarker composition according to any one of claims 11 to 14.
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