KR102557258B1

KR102557258B1 - Bio-glucose quantitative sensor and manufacturing method thereof

Info

Publication number: KR102557258B1
Application number: KR1020210026814A
Authority: KR
Inventors: 이종일; 정홍명
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2023-07-20
Also published as: KR20220122326A

Abstract

본 발명은 산소 검출용 비율 형광 센서막 및 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체 포도당 정량 센서는 신뢰도 95%의 생체 포도당농도 선형검출범위, 0.1 내지 2mM의 고민감도 검출이 확인되어, 생체 포도당검출을 효과적으로 정확하게 검출하는데 유용하게 활용될 수 있다. The present invention relates to a bio-glucose quantitative sensor including a ratio fluorescence sensor membrane for oxygen detection and a glucose oxidase membrane. The bio-glucose quantitative sensor according to the present invention has a linear detection range of 95% reliability and a high sensitivity of 0.1 to 2 mM, so it can be usefully used to effectively and accurately detect bio-glucose.

Description

Bio-glucose quantitative sensor and manufacturing method thereof {Bio-glucose quantitative sensor and manufacturing method thereof}

본 발명은 비율적인 방식에 의한 산소센서막의 제조와 이 위에 포도당 산화 효소를 고정화하여 포도당 센서를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for manufacturing a glucose sensor by manufacturing an oxygen sensor membrane in a ratiometric manner and immobilizing glucose oxidase thereon.

체액에는 혈액(blood), 요(urine), 간질액(interstitial fluid), 땀, 및 타액 등의 성분이 있으며, 특히 혈액, 및 요(당, 단백질) 등의 체액 내 성분의 농도는 건강 상태를 알려주는 매우 중요한 변수이다. 또한 혈액 내 존재하는 포도당(glucose), 헤모글로빈, 빌리루빈, 콜레 스테롤, 알부민, 크레아티닌, 단백질, 또는 요소(urea)의 농도 측정은 중요한 대상이 된다. 그러나 생체가 어떠한 질환에 걸리게 되면 체액 성분의 조성이나 량에 변화가 일어나 위험한 상황에 직면할 수 있다. 예를 들어, 정상인의 혈당(blood glucose)농도는 식전에 80mg/dl정도이고 식후에 120mg/dl정도인데, 생체는 이와 같은 혈당 농도를 유지하기 위해 식전 또는 식후에 췌장에서 적정량의 인슐린을 분비하게 하여 간장과 골격근 세 포로 흡수되도록 한다. 그런데 질환적 원인이나 기타 다른 원인으로 췌장으로부터 정상 혈당 유지에 필요한 만큼의 인슐린이 생산되지 않는 경우, 혈액 내 과도한 양의 포도당이 존재하게 되고, 이것이 원인이 되어 심장과 간 질환, 동맥경화증, 고혈압, 백내장, 망막출혈, 신경손상, 청력 손실, 또는 시력 감퇴가 나타날 수 있고 심하면 사망할 수도 있다. 이러한 극단적인 결과가 나타나기 전에 생체 내 체액 성분의 변화를 측정하는 것은 중요한 기술적 과제이다. Body fluids include components such as blood, urine, interstitial fluid, sweat, and saliva. In particular, the concentration of components in body fluids such as blood and urine (sugar, protein) determines health conditions. This is a very important variable to tell. In addition, measuring the concentration of glucose, hemoglobin, bilirubin, cholesterol, albumin, creatinine, protein, or urea present in the blood is an important subject. However, when a living body suffers from a disease, a change in the composition or amount of body fluid components may cause a dangerous situation. For example, the blood glucose concentration of a normal person is about 80 mg/dl before a meal and about 120 mg/dl after a meal. so that it is absorbed into the liver and skeletal muscle cells. However, when insulin is not produced from the pancreas as much as needed to maintain normal blood sugar due to disease or other causes, an excessive amount of glucose exists in the blood, which causes heart and liver diseases, arteriosclerosis, hypertension, Cataracts, retinal hemorrhage, nerve damage, hearing loss, or blurred vision may occur, and in severe cases, death may occur. It is an important technical challenge to measure changes in body fluid composition in vivo before these extreme results appear.

기존의 혈당 측정은 혈액을 채취하여 진단 시약(reagent)과 반응을 일으키고, 이를 임상분석 기기를 이용하거나 시약과 반응된 테스트 스트립(strip)의 변색을 정량화하여 진단하고 있다. 그러나, 혈액의 채취는 당뇨 환자에게 매일 검사해야 할 경우 큰 고통을 느끼게 되며, 질병에 감염될 소지도 높아지며, 또한 연속적인 모니터가 어려워 긴급 상황의 경우 대처가 곤란하게 된다. 또한 스트립이나 시약의 경우 소모품을 다량 사용해야 하기 때문에 사용자에게는 경제적 부담이 되고, 환경오염 물질이기 때문에 처리해야 하는 문제점이 있다. Existing blood glucose measurement is performed by collecting blood, reacting with a diagnostic reagent, and quantifying the discoloration of a test strip reacted with the reagent using a clinical analysis device. However, blood sampling causes a diabetic patient to feel great pain if he or she needs to be examined every day, increases the possibility of being infected with a disease, and also makes it difficult to cope with an emergency because continuous monitoring is difficult. In addition, in the case of strips or reagents, since a large amount of consumables must be used, it becomes an economic burden for users, and since they are environmental pollutants, they must be disposed of.

체액 성분의 농도 측정 방식은 대상 물질의 일부를 직접 채취하여 측정하는 침습적(invasive) 방식과 대상 물질을 채취하지 않고 측정하는 비침습적(non-invasive) 방식이 있다. 침습적 방식이 가지는 여러 문제점 때문에 비침습적으로 방식이 선호되고 있다. 이와 관련하여 포도당 농도에 대한 민감도의 개선을 위해, 비침습성 광학 포도당 센서, 이중에서도 형광 기반 센서에 대한 기술 개발이 요구되고 있다. Methods for measuring the concentration of bodily fluid components include an invasive method in which a part of a target substance is directly collected and measured, and a non-invasive method in which a target substance is not collected and measured. Because of the various problems of the invasive method, the non-invasive method is preferred. In this regard, in order to improve the sensitivity to glucose concentration, the development of a technology for a non-invasive optical glucose sensor, especially a fluorescence-based sensor, is required.

본 발명의 목적은 생체 포도당 정량 센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 비율적인 방식에 의한 산소 센서막의 제조와 이 위에 포도당 산화 효소를 고정화 하여 포도당 센서를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention relates to a bio-glucose quantitative sensor and a manufacturing method thereof. Specifically, an object of the present invention is to provide a method for manufacturing an oxygen sensor membrane by a ratiometric method and immobilizing glucose oxidase thereon to manufacture a glucose sensor.

또한 졸 겔 매트릭스(Sol-gel matrix)에 형광 염료로 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 및 쿠마린-6(Coumarin-6, C6)이 도핑된 폴리스티렌 입자(Polystyrene particles, PS)를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막 층; 및 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다. In addition, platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and Coumarin-6 (C6) are added as fluorescent dyes in the sol-gel matrix. A ratio fluorescence sensor film layer for detecting oxygen including doped polystyrene particles (PS); and a glucose oxidase sensing film including a glucose oxidase (GOD) immobilized film layer, and a bio-glucose quantitative sensor including the glucose oxidase sensing film.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention

졸 겔 매트릭스(Sol-gel matrix)에 형광 염료로 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 및 쿠마린-6(Coumarin-6, C6)이 도핑된 폴리스티렌 입자(polystyrene particles, PS)를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막 층; 및 The sol-gel matrix is doped with platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and Coumarin-6 (C6) as fluorescent dyes. a ratio fluorescence sensor film layer for oxygen detection including polystyrene particles (PS); and

포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막 층;을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서를 제공한다. A glucose oxidase (GOD) immobilized membrane layer; and a glucose oxidase sensor including the glucose oxidase sensor are provided.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 폴리스티렌 입자의 직경이 0.1 내지 10um 일 수 있다. In one example of the present invention, the diameter of the polystyrene particles may be 0.1 to 10um.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 졸 갤 매트릭스는 알콕시실란계 화합물 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the sol gall matrix may be an alkoxysilane-based compound.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 고정화 막은 고분자 또는 졸-겔을 포함 할 수 있다. In one example of the present invention, the immobilized membrane may include a polymer or sol-gel.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 고분자는 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌텔레프탈레이트(PET), 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 나피온, 폴리비닐아세테이트, 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리우레탄(PU), 폴리부틸렌텔 레프탈레이트(PBT), 폴리비닐부틸랄, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌이민, 폴리올레핀, 폴리락트산(Polylatic acid, PLA), 폴리초산비닐(PVAc), 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN), 폴리아미드(PA), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리에틸렌이미드(PEI), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리유산글리롤산(PLGA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 실크, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상 일 수 있다.In one example of the present invention, the polymer is polypropylene (PP), polyethylene terephthalate (PET), polyvinylidene fluoride, nylon, Nafion, polyvinyl acetate, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile ( PAN), polyurethane (PU), polybutylene terephthalate (PBT), polyvinyl butyral, polyvinyl chloride, polyethyleneimine, polyolefin, polylactic acid (PLA), polyvinyl acetate (PVAc), polyethylene or Phthalate (PEN), polyamide (PA), polyvinyl alcohol (PVA), polyethyleneimide (PEI), polycaprolactone (PCL), polylactic acid glycerolic acid (PLGA), polyethylene (PE), silk, cellulose , It may be any one or two or more selected from the group consisting of cellulose derivatives and chitosan.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 폴리우레탄은 폴리우레탄 하이드로겔 일 수 있다. In one example of the present invention, the polyurethane may be a polyurethane hydrogel.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 셀룰로오스는 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이드, 스테아릴 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cellulose is selected from the group consisting of methyl cellulose, ethyl cellulose, carboxy methyl cellulose, cellulose acetate phthalate, stearyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose Any one or more can be.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 센서는 광섬유 또는 멀티-웰마이크로타이터 플레이트 형태 일 수 있다.In one example of the present invention, the sensor may be in the form of an optical fiber or a multi-well microtiter plate.

본 발명은 형광 염료가 도핑된 폴리스티렌 입자를 준비하는 단계; The present invention comprises the steps of preparing polystyrene particles doped with a fluorescent dye;

상기 폴리스티렌 입자와 졸 겔 매트릭스를 혼합하여, 산소 검출용 비율 형광 센서막 층을 제조하는 단계; 및mixing the polystyrene particles and the sol-gel matrix to prepare a ratiometric fluorescence sensor film layer for detecting oxygen; and

제1고분자, 제2고분자 또는 알콕시실란계 화합물을 포함하는 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 제조하는 단계; 를 포함하는 생체 포도당 정량 센서 제조방법을 제공한다. Preparing a glucose oxidase sensing film including a film layer of immobilized glucose oxidase (GOD) including a first polymer, a second polymer, or an alkoxysilane-based compound; It provides a method for manufacturing a bio-glucose quantitative sensor comprising a.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제1고분자는 셀룰로오스계 고분자 일 수 있다.In one example of the present invention, the first polymer may be a cellulose-based polymer.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제2고분자는 폴리우레탄계 고분자 일 수 있다. In one example of the present invention, the second polymer may be a polyurethane-based polymer.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 알콕시실란계 화합물은 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 및 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 중 적어도 하나 이상을 포함 할 수 있다.In one example of the present invention, the alkoxysilane-based compound may include at least one or more of 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS).

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 졸 겔 매트릭스는 상기 알콕시실란계 화합물 20 내지 50 중량%, 에탄올 50 내지 80 중량%를 포함하는 것 일 수 있다. In one example of the present invention, the sol-gel matrix may include 20 to 50% by weight of the alkoxysilane-based compound and 50 to 80% by weight of ethanol.

본 발명은 the present invention

상기 센서에 생물학적 시료인 눈물을 주입하여 반응을 수행하는 단계;및Performing a reaction by injecting tears, which are biological samples, into the sensor; And

상기 반응으로부터 발산된 파장에서 형광 광도 비율에 기초하여, 생체 포도당을 검출하는 단계;를 포함하는, 생체 포도당 검출방법을 제공한다. Based on the fluorescence luminance ratio at the wavelength emitted from the reaction, detecting the biological glucose; provides a biological glucose detection method comprising a.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 파장은 475nm 내지 635nm의 방출파장(emission wavelengths) 또는 350nm 내지 450nm의 여기 파장(excitation wavelength) 일 수 있다.In one example of the present invention, the wavelength may be an emission wavelength of 475 nm to 635 nm or an excitation wavelength of 350 nm to 450 nm.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 검출방법은 pH 5 내지 9 범위, 또는 온도 25 내지 37℃에서, 수행 될 수 있다.In one example of the present invention, the detection method may be performed at a pH in the range of 5 to 9, or at a temperature of 25 to 37 ° C.

본 발명에 따른 생체 포도당 정량 센서는 0.1 내지 10mM의 포도당 농도 범위에서 매우 높은 민감도가 확인되었다. 또한 0.1mM 내지 2mM의 높은 민감도 선형 검출 범위가 확인되어, 비침습성 광학 포도당 센서로서 유용하게 활용될 수 있다. The bio-glucose quantification sensor according to the present invention was confirmed to have very high sensitivity in the glucose concentration range of 0.1 to 10 mM. In addition, a high sensitivity linear detection range of 0.1 mM to 2 mM was confirmed, and it can be usefully utilized as a non-invasive optical glucose sensor.

또한 발명에 따른 생체 포도당 정량 센서는 눈물 내 포도당 측정에서 높은 민감도와 정확도의 우수한 효과가 확인되어, 고감도, 저렴한 비용 및 최소 샘플링으로 생체 포도당 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다. In addition, the bio-glucose quantification sensor according to the present invention has been confirmed to have excellent effects of high sensitivity and accuracy in measuring glucose in tears, and thus can be usefully used for bio-glucose monitoring with high sensitivity, low cost, and minimal sampling.

도 1 a는 본 발명의 제조예 1에 따른 폴리스티렌 입자를 SEM으로 확인한 것을 나타낸 것이다. 도 1b는 본 발명의 제조예 1에 따른 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린과 쿠마린-6로 도핑된 폴리스티렌 입자의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도 1 c는 실시예 1에 따른 산소 검출용 비율 형광 센서막을 산소 농도별로 형광반응을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2 a는 본 발명의 제조예 1에 따른 졸-겔 매트릭스 또는 실시예 1의 센서막의 AFM 및 SEM 이미지 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽은 졸-겔 매트릭스 이미지이며, 오른쪽 상기 센서막의 이미지 결과를 나타낸 것이다. 도 2b는 본 발명의 실시예 1에 따른 산소 검출용 비율 형광 센서막의 산소 가스 0 내지 100%에 노출되었을 때의 반복적인 검출의 정확성에 대해 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 2c는 각 다른 산소 가스 0, 2, 5, 15, 18, 21, 100%에 따른 산소 검출용 비율 형광 센서막의 형광 이미지 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 고분자 또는 졸-겔 매트릭스의 고정화 막의 특성을 SEM를 통하여 확인한 것을 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 3a는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 도 3b는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 도 3c는 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 본 발명의 실시예 2에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 고분자 또는 졸-겔 의 고정화 막에 대한 포도당 산화 효소 고정 정밀도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 EC는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, GA는 실시예 2-3의 졸-겔 (GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서에 따른 포도당 산화 효소 고정 정밀도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 5a는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 도 5b는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 도 5c는 실시예 2-3의 졸-겔 (GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 센서의 포도당 농도에 따른 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이며 FI₆₃₅/FI₄₇₅의 비율에 따라 결정되는 포도당 보정 곡선눈금(calibration)에 따라 반응성 결과를 확인한 것이다. 또한 도 5d는 비교예 1의 센서에 대한 포도당 농도에 따른 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 가역성(Reversibility)을 확인한 결과를 나타낸 것으로 구체적으로는 EC는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, GA는 실시예 2-3의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에 따른 가역성을 포도당 농도 0 내지 2mM의 반복적인 노출에 대한 가역성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 pH 5내지 9에서, 포도당 농도에 따른 발명의 실시예 2 센서의 포도당 산화 효소 감지막의 반응성을 확인 한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 실시예 2-3 센서의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에 대한 pH 5 내지 9에서의 포도당 농도에 따른 반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 온도 25 내지 37℃에서 포도당 농도에 따른 발명의 실시예 2 센서에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 반응성을 확인을 한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 실시예 2-3의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에 대한 결과로, 온도 25 내지 37℃에서의 포도당 농도에 따른 반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 2 센서에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 상대 반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 106mM/L의 Cl^-, 30mM/L의 HCO₃ ^-, 1.625mg/L의 Fe³⁺, 145mM/L의 Na⁺ 및 5g/dL의 BSA의 유무에 따른 1mM 포도당 농도의 상대 반응성 검출을 확인한 것이다. 구체적으로는 EC는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, GA는 실시예 2-3의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에 따른 상대 반응성 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 2에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 포도당 농도에 따른 수명(life time)에 관한 것으로 구체적으로는 1개월 연속 측정에 따른 포도당 검출에 있어 상기 포도당 산화 효소 감지막의 민감성 또는 감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 10a에서 EC는 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC), D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4), 도 GA는 실시예 2-3 센서의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서의 결과를 나타낸 것이다. 또한 도 10b는 비교예 1 센서의 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 시료로 눈물을 사용하여 발명의 실시예 2에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 EC는 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC), D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4), 도 GA는 실시예 2-3 센서의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서의 결과를 나타낸 것이다.Figure 1a shows the polystyrene particles according to Preparation Example 1 of the present invention confirmed by SEM. Figure 1b shows a fluorescence image of polystyrene particles doped with platinum-meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin and coumarin-6 according to Preparation Example 1 of the present invention. Figure 1c shows the result of measuring the fluorescence response for each oxygen concentration of the ratio fluorescence sensor film for oxygen detection according to Example 1.
Figure 2a shows the AFM and SEM image results of the sol-gel matrix according to Preparation Example 1 of the present invention or the sensor film of Example 1, the left side shows the sol-gel matrix image, and the right side shows the image result of the sensor film . Figure 2b shows the result of measuring the accuracy of repeated detection when the ratiometric fluorescence sensor film for detecting oxygen according to Example 1 of the present invention is exposed to 0 to 100% oxygen gas. Figure 2c shows the fluorescence image results of the ratio fluorescence sensor film for oxygen detection according to each different oxygen gas 0, 2, 5, 15, 18, 21, 100%.
Figure 3 shows the characteristics of the immobilized membrane of the polymer or sol-gel matrix of the glucose oxidase sensing membrane according to Example 2 of the present invention confirmed through SEM. Specifically, FIG. 3A is a glucose oxidase sensing membrane including an ethyl-cellulose (EC) immobilized membrane of the sensor of Example 2-1, and FIG. 3B is a polyurethane hydrogel (D4) immobilized membrane of the sensor of Example 2-2. Glucose oxidase sensing film, FIG. 3c shows the result of a sensor including a glucose oxidase sensing film including a sol-gel (GA) immobilized film.
4 shows the result of confirming the fixation accuracy of glucose oxidase to the polymer or sol-gel immobilized membrane of the glucose oxidase sensing membrane according to Example 2 of the present invention. Specifically, EC is a glucose oxidase sensing membrane comprising an ethyl-cellulose (EC) immobilized membrane of the sensor of Example 2-1, and D4 is a glucose oxidation membrane comprising a polyurethane hydrogel (D4) immobilized membrane of the sensor of Example 2-2. The enzyme sensing film, GA, shows the result of confirming the glucose oxidase fixation accuracy according to the sensor including the glucose oxidase sensing film including the sol-gel (GA) immobilized film of Example 2-3.
5 shows the result of confirming the reactivity of the glucose oxidase sensing film according to Example 2 of the present invention. Specifically, 5a is a glucose oxidase sensing membrane including an ethyl-cellulose (EC) immobilized membrane of the sensor of Example 2-1, and FIG. 5B is a glucose membrane including a polyurethane hydrogel (D4) immobilized membrane of the sensor of Example 2-2. Oxidation enzyme sensing film FIG. 5c shows the result of confirming the reaction according to the glucose concentration of the glucose oxidase sensing film sensor including the sol-gel (GA) immobilized film of Example 2-3, and the ratio of FI ₆₃₅ /FI ₄₇₅ The reactivity result was confirmed according to the glucose calibration curve determined according to the 5d shows the result of confirming the response according to the glucose concentration for the sensor of Comparative Example 1.
Figure 6 shows the results of confirming the reversibility of the glucose oxidase sensor film according to Example 2 of the present invention. Enzyme sensing film, D4 is a glucose oxidase sensing film including a polyurethane hydrogel (D4) immobilized film of the sensor of Example 2-2, GA is glucose containing a sol-gel (GA) immobilized film of Example 2-3 The reversibility according to the oxidase membrane is shown as a result of confirming the reversibility of repeated exposure to glucose concentration of 0 to 2 mM.
7 shows the results of confirming the reactivity of the glucose oxidase sensing film of the sensor of Example 2 of the present invention according to the glucose concentration at pH 5 to 9. Specifically, the glucose oxidase sensing film including the ethyl-cellulose (EC) immobilized film of the sensor of Example 2-1, the glucose oxidase sensing film including the polyurethane hydrogel (D4) immobilized film of the sensor of Example 2-2, Example 2-3 shows the result of confirming the reactivity according to the glucose concentration at pH 5 to 9 for the glucose oxidase membrane including the sol-gel (GA) immobilized membrane of the sensor.
8 shows the results of confirming the reactivity of the glucose oxidase sensor according to Example 2 of the present invention according to the glucose concentration at a temperature of 25 to 37 ° C. Specifically, the glucose oxidase sensing film including the ethyl-cellulose (EC) immobilized film of the sensor of Example 2-1, the glucose oxidase sensing film including the polyurethane hydrogel (D4) immobilized film of the sensor of Example 2-2, As a result of the glucose oxidase sensing membrane including the sol-gel (GA) immobilized membrane of Example 2-3, the result of confirming the reactivity according to the glucose concentration at a temperature of 25 to 37 ° C is shown.
9 shows the result of confirming the relative reactivity of the glucose oxidase sensing film according to Example 2 of the present invention. Specifically, relative reactivity detection of 1 mM glucose concentration with or without 106 mM/L Cl ^- , 30 mM/L HCO ₃ ^- , 1.625 mg/L Fe ³⁺ , 145 mM/L Na ⁺ and 5 g/dL BSA will confirm Specifically, EC is a glucose oxidase sensing membrane comprising an ethyl-cellulose (EC) immobilized membrane of the sensor of Example 2-1, and D4 is a glucose oxidation membrane comprising a polyurethane hydrogel (D4) immobilized membrane of the sensor of Example 2-2. The enzyme sensing film, GA, shows the relative reactivity detection result according to the glucose oxidase sensing film including the immobilized sol-gel (GA) film of Example 2-3.
10 illustrates the life time of the glucose oxidase sensing film according to Example 2 of the present invention according to the glucose concentration, and specifically, the sensitivity or sensitivity of the glucose oxidase sensing film in detecting glucose according to continuous measurement for one month It shows the result of checking . Specifically, in FIG. 10a, EC is the ethyl-cellulose (EC) of the 2-1 sensor, D4 is the polyurethane hydrogel (D4) of the sensor of Example 2-2, and FIG. GA is the sol-gel of the sensor of Example 2-3. It shows the result of the sensor including the glucose oxidase membrane including the immobilized membrane of (GA). 10B shows the results of the sensor of Comparative Example 1.
11 shows the results of confirming the reactivity of the glucose oxidase sensing film according to Example 2 of the present invention using tears as a sample. Specifically, EC is the ethyl-cellulose (EC) of the 2-1 sensor, D4 is the polyurethane hydrogel (D4) of the sensor of Example 2-2, and GA is the sol-gel (GA) of the sensor of Example 2-3 It shows the result of the sensor including the glucose oxidase membrane including the immobilized membrane of .

이하 첨부된 도면들을 포함한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples including the accompanying drawings. However, the following examples are only one reference for explaining the present invention in detail, but the present invention is not limited thereto, and may be implemented in various forms. At this time, unless there is another definition in the technical terms and scientific terms used, they have meanings commonly understood by those of ordinary skill in the art to which this invention belongs, and the gist of the present invention is described in the following description and accompanying drawings. Descriptions of well-known functions and configurations that may be unnecessarily obscure are omitted.

또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. In addition, singular forms used in the specification of the present invention may be intended to include plural forms as well unless otherwise indicated in the context.

또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.Also, in the specification of the present invention, units used without particular notice are based on weight, and for example, % or a unit of ratio means weight% or weight ratio.

또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다, “함유한다, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.In addition, in the specification of the present invention, the expression "comprising" is an open description having a meaning equivalent to expressions such as "comprises," "includes," "has" or "characterized by", and is not further listed. It does not exclude any element, material or process. Also, “actually… The expression "consists of" means that the specified element, material or process together with other elements, materials or processes not listed do not significantly affect at least one basic and novel technical idea of the invention in an unacceptably significant manner. It means that it can exist in quantity. Also, the expression “consisting of” means that only the described elements, materials or processes are present.

또한 본 발명의 명세서 도핑 또는 캡슐화는 상호 교환적, 동일한 의미로 사용되었다. Also in the context of the present invention, doping or encapsulation are used interchangeably and interchangeably.

본 발명에서 용어 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)은 산화환원 반응을　촉매작용 하는　효소이다. 또한　전자수용체로　산소(O₂)를 포함하는 반응을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로, β-D-Glucose를 산화시켜서 Glucono-δ-lactone으로 만들고, β-D-Glucose + O₂ Glucono-δ-lactone + H₂O₂.; 또는 Glucose + O₂ --(GOD)→ Oxidized products + H₂O₂ 의 반응에 사용되는 산소를 과산화수소로 환원시키게 된다. 또한 상기 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)는 산화 효소로서 산소 선택성이 좋으며 위와 같이 혈액 중 포도당(glucose)은 산화효소인 Glucose oxidase(GOD)와 반응하여 글루콘산과 과산화수소를 생성한다. 이 반응에서 생체 내 산소가 소모되는데, 소모된 산소의 농도를 측정함으로써 포도당의 농도를 분석 할 수 있다. In the present invention, the term glucose oxidase (Glucose oxidase, GOD) is an enzyme that catalyzes a redox reaction. It also means an enzyme that catalyzes a reaction involving oxygen (O ₂ ) as an electron acceptor. It oxidizes β-D-Glucose to make Glucono-δ-lactone, β-D-Glucose + O ₂ Glucono-δ- lactone + H ₂ O ₂ .; Or, oxygen used in the reaction of Glucose + O ₂ --(GOD)→ Oxidized products + H ₂ O ₂ is reduced to hydrogen peroxide. In addition, the glucose oxidase (GOD) is an oxidizing enzyme and has good oxygen selectivity. As described above, glucose in the blood reacts with the oxidizing enzyme, Glucose oxidase (GOD) to produce gluconic acid and hydrogen peroxide. Oxygen is consumed in the body in this reaction, and the concentration of glucose can be analyzed by measuring the concentration of oxygen consumed.

본 발명의 발명자는 졸 겔 매트릭스(Sol-gel matrix)에 형광 염료로 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 및 쿠마린-6(Coumarin-6, C6)이 도핑된 폴리스티렌 입자(Polystyrene particles, PS)를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막 층과 고분자 또는 졸-겔 매트릭스을 포함하는 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막 층;을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막이 포도당 산화효소를 고정시켜, 포도당 산화효소(GOD) 촉매에 따른 포도당 산화 반응의 산소 소비 기반으로 포도당을 매우 민감하게 검출이 가능함을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention use platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and Coumarin-6 as fluorescent dyes in a sol-gel matrix. , C6), a ratiometric fluorescence sensor film layer for oxygen detection containing polystyrene particles (PS) doped with, and a glucose oxidase (GOD) immobilized film layer containing a polymer or sol-gel matrix; The present invention was completed by discovering that a glucose oxidase sensing film capable of immobilizing glucose oxidase and detecting glucose very sensitively based on the oxygen consumption of the glucose oxidation reaction according to the glucose oxidase (GOD) catalyst.

상기 포도당 산화 효소 감지막은 앞에서 전술한 바와 같이 포도당 산화효소 촉매작용 중 포도당 산화반응 중 산소 소비량 또는 과산화수소 생산량을 이용한 것이다. 또한 산소에 민감한 형광 소광 효과를 통해 포도당이 검출을 할 수 있다. As described above, the glucose oxidase sensing membrane uses oxygen consumption or hydrogen peroxide production during glucose oxidation during glucose oxidase catalysis. In addition, glucose can be detected through an oxygen-sensitive fluorescence quenching effect.

상기 형광 염료는 상기 포도당 산화 효소(Glucose oxidase, GOD)와 결합하여, 포도당 측정 중 포도당 산화 효소(GOD)의 플라빈 그룹(Flavin group, FAD)과 fluorescein-5 (6)-carboxamidocaproic acid n-succinimidyl ester 간의 에너지 전달을 통해 형광 상태 변경을 이용한 것이다. The fluorescent dye binds to the glucose oxidase (GOD), and during glucose measurement, the flavin group (FAD) of the glucose oxidase (GOD) and fluorescein-5 (6)-carboxamidocaproic acid n-succinimidyl It uses the fluorescence state change through energy transfer between esters.

이하 본 발명에 따른 산소 검출용 비율 형광 센서막 및 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서에 대해 상술한다.Hereinafter, a biological glucose quantitative sensor including a ratio fluorescence sensor film for detecting oxygen and a glucose oxidase sensing film according to the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 생체 포도당 정량 센서는 졸 겔 매트릭스(Sol-gel matrix)에 형광 염료로 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 및 쿠마린-6(Coumarin-6, C6)이 도핑된 폴리스티렌 입자(Polystyrene particles, PS)를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막 층 및; 및 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막 층;을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 것을 특징으로 한다. In vivo glucose quantification sensor according to the present invention is platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and coumarin-6 as fluorescent dyes in a sol-gel matrix. (Coumarin-6, C6) doped polystyrene particles (Polystyrene particles, PS) for oxygen detection ratio fluorescence sensor film layer and; And glucose oxidase (Glucose oxidase, GOD) immobilized film layer; characterized in that it comprises a glucose oxidase sensing film, including the glucose oxidase sensing film.

상기 산소 검출용 비율 형광 센서막은 산소가 없을 경우, 상기 형광염료인 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 및 쿠마린-6(Coumarin-6, C6)이 도핑된 폴리스티렌 입자(polystyrene particles, PS)가 여기상태(excited state)가 되고, 그 에너지 수준은 여기상태(excited state)로 변한다. 일정 시간이 지나면, 상기 에너지는 접지 상태로 돌아가고, 그 시간 동안 형광발광을 방출한다. 반면 산소가 존재 할 경우, 상기 형광 염료가 산소 중 형광 분자가 여기 상태에 있고, 산소가 기저 상태(ground state)가 되고, 산소와 형광 염료 분자 사이에 충동이 일어나고 에너지 전달이 일어나 형광 광도 및 형광 분자의 수명 감소 및 기저 상태(triplet ³O₂)에서 여기 상태 singlet ¹O₂)로 산소의 변환이 일어난다. In the absence of oxygen, the ratiometric fluorescence sensor film for detecting oxygen is the fluorescent dye, Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and Coumarin-6 (Coumarin-6, C6)-doped polystyrene particles (PS) enter an excited state, and their energy level changes to the excited state. After a period of time, the energy returns to the ground state, during which time fluorescence is emitted. On the other hand, when oxygen is present, the fluorescent dye is in an excited state, and oxygen becomes a ground state, and an impulse occurs between the oxygen and the fluorescent dye molecule, and energy transfer occurs, resulting in fluorescence luminance and fluorescence. A reduction in the lifetime of the molecule and a conversion of oxygen from the ground state (triplet ³ O ₂ ) to the excited state (singlet ¹ O ₂ ) occur.

상기 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린은 매우 뛰어난 광안정성으로 장기간 산소의 모니터링의 센서 프로브로 매우 적합하며, 상기 쿠마린-6는 높은 형광 양자 수율, 큰 파장 변이, 우수한 광 안정성 및 낮은 독성을 가지는 장점이 있다. The platinum-meso-tetra(pentafluorophenyl)porphyrin is very suitable as a sensor probe for long-term oxygen monitoring due to its excellent photostability, and the coumarin-6 has a high fluorescence quantum yield, large wavelength shift, excellent photostability and low It has the advantage of being toxic.

상기 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린은 상기 폴리스티렌 입자 100 중량부에 대하여 1 내지 30부 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 20 중량부 포함할 수 있으며 더욱 바람직하게는 12 내지 18 중량부 포함 할 수 있다. The platinum-meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin may be included in an amount of 1 to 30 parts by weight, preferably 10 to 20 parts by weight, more preferably 12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the polystyrene particles. to 18 parts by weight.

상기 조건을 만족할 경우 포도당 검출에 높은 민감성을 가질 수 있으며, 폴리스텐 입자의 도핑 또는 캡슐화와 관련하여, 포도당 검출 시 형광 염료의 누출을 방지하고 안정적인 센서막을 형성 할 수 있다. When the above conditions are satisfied, it is possible to have high sensitivity to glucose detection, and in connection with doping or encapsulation of polysten particles, leakage of fluorescent dye can be prevented and a stable sensor film can be formed during glucose detection.

상기 쿠마린-6는 상기 폴리스티렌 입자 100 중량부에 대하여 0.001 내지 3 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량부, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량부 포함할 수 있다. 상기 조건을 만족할 경우 포도당 검출에 높은 민감성을 가질 수 있으며, 폴리스텐 입자의 캡슐화와 관련하여, 포도당 검출시 형광 염료의 누출을 방지하고 안정적인 센서막을 형성 할 수 있다. The coumarin-6 may be included in an amount of 0.001 to 3 parts by weight, preferably 0.001 to 1 part by weight, more preferably 0.001 to 0.1 parts by weight, based on 100 parts by weight of the polystyrene particles. When the above conditions are satisfied, it is possible to have high sensitivity to glucose detection, and in relation to the encapsulation of polysten particles, leakage of fluorescent dye can be prevented and a stable sensor film can be formed during glucose detection.

이와 같이 본 발명은 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린과 쿠마린-6의 형광 염료 도핑된 폴리스티렌 입자를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막으로, 상기 조건에 의해 고도핑된 코어-쉘 형 나노 입자를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막일 수 있다. 이러한 조건으로 인하여 포도당 검출 시 형광 염료의 누출을 방지하고 안정적인 센서막을 형성할 수 있다. As described above, the present invention is a ratiometric fluorescence sensor film for oxygen detection comprising polystyrene particles doped with a fluorescent dye of platinum-meso-tetra(pentafluorophenyl)porphyrin and coumarin-6, a core-shell highly doped by the above conditions. It may be a ratiometric fluorescence sensor film for detecting oxygen containing type nanoparticles. Due to these conditions, leakage of the fluorescent dye can be prevented and a stable sensor film can be formed during glucose detection.

상기 폴리스티렌 입자의 직경은 0.1 내지 10um 일 수 있으나, 바람직하게는 0.1 내지 5 일 수 있으며, 상기 조건일 경우 센서막 또는 포도당 산화 효소 감지막의 박막화 및 균일화 고정화가 매우 용이하여 색상 및 형광의 균일한 감지에 용이하다. The diameter of the polystyrene particles may be 0.1 to 10 um, but may be preferably 0.1 to 5, and under the above conditions, it is very easy to thin and homogenize and fix the sensor film or glucose oxidase sensing film to uniformly detect color and fluorescence. easy to

상기 폴리스티렌은 산소의 허용 가능한 투과성 및 용해성과 함께 우수한 광학 특성을 가진다. 산소 계수 투과성은 0.88이며, 퀸칭 상수(quenching constant)는 실리콘보다 10 내지 100배 작아, 형광 염료 방지 보조재로서 매우 우수하다. The polystyrene has excellent optical properties along with acceptable oxygen permeability and solubility. The oxygen coefficient permeability is 0.88, and the quenching constant is 10 to 100 times smaller than that of silicon, making it excellent as an auxiliary material for preventing fluorescent dyes.

상기 졸 겔 매트릭스는 알콕시실란계 화합물 일 수 있다. 상기 알코올시실란계 화합물은 졸-겔 매트릭스에 적용 또는 졸-겔 법에 사용되는 물질로, 일 예로서, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 페닐트리메톡시실란, 비닐트리메톡시실란, 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트, 메틸트리메톡시실란, 테트라메톡시실란, 디메틸디메톡시실란, 테트라에톡시실란, 메틸트리에톡시실란, 디메틸디에톡시실란, 페닐트리메톡시실란, 디페닐디메톡시실란, 페닐트리에톡시실란, 디페닐디에톡시실란, 데실트리메톡시실란, 이소부틸트리메톡시실란, 비닐트리메톡시실란, 비닐트리에톡시실란, 글리시도옥시프로필트리메톡시실란 또는 머캡토프로필트리메톡시실란 일 수 있으며, 바람직하게는 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 또는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 일 수 있으며, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 또는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 일 경우 외래물질의 침투를 방지하여 오염의 가능성을 감소시키며 시료 측정 시 별도의 시료 채취의 과정이 필요치 않다는 장점을 가진다. The sol-gel matrix may be an alkoxysilane-based compound. The alcohol silane-based compound is a material applied to a sol-gel matrix or used in a sol-gel method, for example, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, phenyltri Methoxysilane, vinyltrimethoxysilane, 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, methyltrimethoxysilane, tetramethoxysilane, dimethyldimethoxysilane, tetraethoxysilane, methyltriethoxysilane, Dimethyldiethoxysilane, phenyltrimethoxysilane, diphenyldimethoxysilane, phenyltriethoxysilane, diphenyldiethoxysilane, decyltrimethoxysilane, isobutyltrimethoxysilane, vinyltrimethoxysilane, vinyltri It may be ethoxysilane, glycidooxypropyltrimethoxysilane or mercaptopropyltrimethoxysilane, preferably 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) or 3-aminopropyltrimethoxysilane ( APTMS), and in the case of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) or 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), it reduces the possibility of contamination by preventing the penetration of foreign substances, and separate It has the advantage that it does not require the process of collecting samples.

또한 졸 겔 매트릭스는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 및 에탄올을 각각 6.5%:25%:68.5% 중량비의 비율적인 방식으로 제조될 수 있다. 이와 같이 비율적인 방식의 산소 검출용 비율 형광 센서막일 경우 포도당 산화 효소를 매우 민감하게 검출할 수 있는 장점이 있다. In addition, the sol gel matrix can be prepared in a ratiometric manner of 6.5%:25%:68.5% weight ratio of 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) and ethanol, respectively. can In the case of a ratiometric fluorescent sensor film for detecting oxygen in a ratiometric manner as described above, there is an advantage in that glucose oxidase can be detected very sensitively.

상기 고정화 막에 있어, 상기 고정화 막은 고분자 또는 졸-겔을 포함할 수 있다.In the immobilized membrane, the immobilized membrane may include a polymer or a sol-gel.

상기 고분자는 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌텔레프탈레이트(PET), 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 나피온, 폴리비닐아세테이트, 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리우레탄(PU), 폴리부틸렌텔 레프탈레이트(PBT), 폴리비닐부틸랄, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌이민, 폴리올레핀, 폴리락트산(polylatic acid, PLA), 폴리초산비닐(PVAc), 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN), 폴리아미드(PA), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리에틸렌이미드(PEI), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리유산글리롤산(PLGA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 실크, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상 수 있다. The polymer is polypropylene (PP), polyethylene terephthalate (PET), polyvinylidene fluoride, nylon, Nafion, polyvinyl acetate, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile (PAN), polyurethane (PU) , polybutylene terephthalate (PBT), polyvinyl butyral, polyvinyl chloride, polyethyleneimine, polyolefin, polylactic acid (PLA), polyvinyl acetate (PVAc), polyethylene naphthalate (PEN), polyamide ( PA), polyvinyl alcohol (PVA), polyethyleneimide (PEI), polycaprolactone (PCL), polylactic acid glycerolic acid (PLGA), polyethylene (PE), silk, cellulose, cellulose derivatives and chitosan Can be any one or more than one selected from.

상기 폴리우레탄은 폴리우레탄 하이드로겔 일 수 있다. The polyurethane may be a polyurethane hydrogel.

상기 폴리우레탄은 중합체 백본(polymer backbone)에 연결된 카복사마이드그룹, 하이드록실, 아민과 같은 수소 결합 기능을 가져, 센서의 친수성 지지체 또는 고정화 막으로 유용하다. 특히 폴리우레탄 하이드로겔 일 경우, 형광염료와 분석 대상 물질 사이의 일시적인 결합이 쉽게 깨지기 때문에 높은 가역성을 가질 수 있는 장점이 있다. The polyurethane has a hydrogen bond function such as a carboxamide group, hydroxyl, or amine connected to a polymer backbone, and is useful as a hydrophilic support or immobilized membrane of a sensor. In particular, polyurethane hydrogel has the advantage of having high reversibility because the temporary bond between the fluorescent dye and the analyte is easily broken.

상기 셀룰로오스는 상기 셀룰로오스는 메틸 셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, C1~6알킬셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이드, 스테아릴 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 및 히드록시프로필 셀룰로오스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있으나, 바람직하게는 에틸 셀룰로오스 일 수 있다. 상기 에틸 셀룰로오스는 에틸화 포도당 단위체가 반복되는 하이드록실기의 셀룰로오스 유도체로, 우수한 산소 투과성, 높은 광학 투명성, 높은 기계적 강도, 우수한 광, 열 안정성의 장점을 센서의 고정화 막으로 유용하다. The cellulose is methyl cellulose, alkyl cellulose, C 1 ~ 6 alkyl cellulose, ethyl cellulose, carboxy methyl cellulose, cellulose acetate phthalate, stearyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose It may be any one or more selected from the group consisting of, but may be preferably ethyl cellulose. The ethyl cellulose is a cellulose derivative having a hydroxyl group in which ethylated glucose units are repeated, and is useful as a sensor immobilization film due to its excellent oxygen permeability, high optical transparency, high mechanical strength, and excellent light and thermal stability.

상기 졸-겔은 알콕시실란계 화합물 일 수 있다. 상기 알코올시실란계 화합물은 졸-겔 매트릭스에 적용 또는 졸-겔 법에 사용되는 물질로, 일 예로서, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 페닐트리메톡시실란, 비닐트리메톡시실란, 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트, 메틸트리메톡시실란, 테트라메톡시실란, 디메틸디메톡시실란, 테트라에톡시실란, 메틸트리에톡시실란, 디메틸디에톡시실란, 페닐트리메톡시실란, 디페닐디메톡시실란, 페닐트리에톡시실란, 디페닐디에톡시실란, 데실트리메톡시실란, 이소부틸트리메톡시실란, 비닐트리메톡시실란, 비닐트리에톡시실란, 글리시도옥시프로필트리메톡시실란 또는 머캡토프로필트리메톡시실란 일 수 있으며, 바람직하게는 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 또는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 일 수 있다. 상기 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 또는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS)을 졸-겔 매트릭스로 하여, 고정화 막으로 사용할 경우 형광염료에 고정화하여 사용할 경우, 장시간 사용이 가능하며 형광염료의 활성저하를 감소시켜 형광센서막의 정밀도를 증가시킬 수 있다The sol-gel may be an alkoxysilane-based compound. The alcohol silane-based compound is a material applied to a sol-gel matrix or used in a sol-gel method, for example, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, phenyltri Methoxysilane, vinyltrimethoxysilane, 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, methyltrimethoxysilane, tetramethoxysilane, dimethyldimethoxysilane, tetraethoxysilane, methyltriethoxysilane, Dimethyldiethoxysilane, phenyltrimethoxysilane, diphenyldimethoxysilane, phenyltriethoxysilane, diphenyldiethoxysilane, decyltrimethoxysilane, isobutyltrimethoxysilane, vinyltrimethoxysilane, vinyltri It may be ethoxysilane, glycidooxypropyltrimethoxysilane or mercaptopropyltrimethoxysilane, preferably 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) or 3-aminopropyltrimethoxysilane ( APTMS). When the 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) or 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) is used as a sol-gel matrix and used as an immobilized membrane, long-term use is possible when immobilized in a fluorescent dye It is possible to increase the precision of the fluorescent sensor membrane by reducing the decrease in activity of the fluorescent dye.

상기 생체 포도당정량 센서에 있어, 포도당 산화 효소 감지막을 지지할 수 있는, 지지체를 더 포함할 수 있다. In the bio-glucose assay sensor, a support capable of supporting the glucose oxidase membrane may be further included.

상기 포도당 산화 효소 감지막을 위한 지지체로서 당업계에서 알려진 통상적인 것들 중 어느 것이라도 사용할 수 있으나, 석영 유리판, 유리판, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 등의 투명 고분자 또는 마이크로타이터 플레이트 일 수 있다. As a support for the glucose oxidase sensing membrane, any of conventional materials known in the art may be used, but may be a quartz glass plate, a glass plate, a transparent polymer such as polystyrene, polyethylene terephthalate (PET), or a microtiter plate.

또한 상기 센서는 광섬유 또는 멀티-웰마이크로타이터 플레이트 형태 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 마이크로타이터 플레이트, 또는 멀리-웰 마이크로마이터 플레이트 일 경우 소량의 샘플과 많은 수의 샘플을 동시에 측정할 수 있는 장점이 있으며, 많은 수의 샘플을 동시에 측정할 경우 흡광도나 형광의 변화를 빠르고 정확하게 정량적 검출이 가능한 장점이 있다. 또한 광섬유 일 경우 검출신호를 빛의 형태로 전송함으로써 분석환경 주위의 전자기적 영향을 받지 않고, 원거리 측정이 가능하여 많은 분야에 응용할 수 있으며, 형광염료 또는 형광 물질을 광섬유 말단에 고정화하여 시료 용액 내의 생화학 물질이 산화 효소에 의해 산화될 때까지 산소가 소모되는 반응 원리를 이용할 수 있는 장점을 가진다. 또한 지속적으로 포도당을 모니터링 할 수 있으며 센서의 소형화가 가능하다. In addition, the sensor may be in the form of an optical fiber or a multi-well microtiter plate, but is not limited thereto. A microtiter plate or a multi-well micromiter plate has the advantage of being able to simultaneously measure a small amount of samples and a large number of samples. It has the advantage of being quantitatively detectable. In addition, in the case of an optical fiber, the detection signal is transmitted in the form of light, so it is not affected by the electromagnetic influence around the analysis environment and can be measured at a distance, so it can be applied to many fields. It has the advantage of being able to use the reaction principle in which oxygen is consumed until the biochemical substance is oxidized by an oxidizing enzyme. In addition, glucose can be continuously monitored and the sensor can be miniaturized.

이하 본 발명에 따른 생체 포도당 정량 센서 제조방법에 대해 상술한다. Hereinafter, a method for manufacturing a bio-glucose quantitative sensor according to the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 생체 포도당 정량 센서 제조방법은 형광 염료가 도핑된 폴리스티렌 입자를 준비하는 단계; 상기 폴리스티렌 입자와 졸 겔 매트릭스를 혼합하여, 산소 검출용 비율 형광 센서막 층을 제조하는 단계; 및 제1고분자, 제2고분자 또는 알콕시실란계 화합물을 포함하는 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다. A method for manufacturing a bio-glucose quantitative sensor according to the present invention includes preparing polystyrene particles doped with a fluorescent dye; mixing the polystyrene particles and the sol-gel matrix to prepare a ratiometric fluorescence sensor film layer for detecting oxygen; and a glucose oxidase (GOD) immobilized film layer including a first polymer, a second polymer, or an alkoxysilane-based compound; It is characterized in that it includes.

상기 제1고분자는 셀룰로오스계 고분자 일 수 있으며, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이드, 스테아릴 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 및 히드록시프로필 셀룰로오스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있으나, 바람직하게는 에틸 셀룰로오스 일 수 있다.The first polymer may be a cellulose-based polymer, and is a group consisting of methyl cellulose, ethyl cellulose, carboxy methyl cellulose, cellulose acetate phthalate, stearyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose. It may be any one or more selected from, but preferably may be ethyl cellulose.

상기 제2고분자는 폴리우레탄계 고분자 일 수 있으며, 구체적으로는 폴리우레탄 하이드로겔 일 수 있다.The second polymer may be a polyurethane-based polymer, and specifically may be a polyurethane hydrogel.

상기 알콕시실란계 화합물은 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 및 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. The alkoxysilane-based compound may include at least one of 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS).

상기 졸 겔 매트릭스는 상기 알콕시실란계 화합물이 20 내지 50 중량%, 에탄올이 50 내지 80 중량% 포함 할 수 있다. 바람직하게는 상기 알콕시실란계 화합물이 25 내지 45 중량%, 에탄올 55 내지 75 중량%를 포함할 수 있다. The sol-gel matrix may include 20 to 50% by weight of the alkoxysilane-based compound and 50 to 80% by weight of ethanol. Preferably, the alkoxysilane-based compound may include 25 to 45% by weight and 55 to 75% by weight of ethanol.

더욱 구체적으로 상기 알콕시실란계 화합물은 상기 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 가 10 내지 50 중량%, 상기 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS)가 50 내지 90 중량%, 바람직하게는 상기 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS) 가 15 내지 35 중량%, 상기 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS)가 65 내지 85 중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. More specifically, the alkoxysilane-based compound includes 10 to 50% by weight of 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and 50 to 90% by weight of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS), preferably Preferably, the 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) may include 15 to 35% by weight and the 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) may include 65 to 85% by weight, but are limited thereto It is not.

상기 조건을 만족할 경우 상분리를 막아 조밀한 막을 형성할 수 있으며, 포도당 산화효소(GOD) 고정 및 안정성을 높일 수 있는 장점이 있다. When the above conditions are satisfied, a dense film can be formed by preventing phase separation, and there are advantages in that glucose oxidase (GOD) fixation and stability can be improved.

상기 제 2고분자는 하기 반응식 (a)에 의해 포도당 산화효소(GOD)를 고정화 할 수 있다. The second polymer may immobilize glucose oxidase (GOD) according to the following reaction equation (a).

반응식 (a)Scheme (a)

또한 상기 알콕시실란계 화합물은 하기 반응식 (b) 및 반응식 (c) 에 의해 포도당 산화효소(GOD)를 고정화 할 수 있다.In addition, the alkoxysilane-based compound may immobilize glucose oxidase (GOD) by the following reaction formula (b) and reaction formula (c).

반응식 (b)Scheme (b)

반응식 (c)Scheme (c)

이하 본 발명에 따른 생체 포도당검출방법에 대해 상술한다. Hereinafter, the biological glucose detection method according to the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 생체 포도당 검출방법은 상기 센서에 생물학적 시료인 눈물을 주입하여 반응을 수행하는 단계;및In vivo glucose detection method according to the present invention comprises the steps of performing a reaction by injecting tears, a biological sample, into the sensor; and

상기 반응으로부터 발산된 파장에서 형광 광도 비율에 기초하여, 생체 포도당을 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. Based on the fluorescence intensity ratio at the wavelength emitted from the reaction, detecting biological glucose; characterized in that it comprises a.

상기 시료는 혈액, 눈물, 소변 또는 땀 등의 생물학적 시료 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 눈물이다. 시료가 눈물일 경우 비침습적으로 장기간 쉽고 편리하게 포도당 모니터링이 가능하다. The sample may be a biological sample such as blood, tears, urine or sweat, but is not limited thereto, and is specifically tears. If the sample is tears, glucose monitoring is possible easily and conveniently for a long period of time non-invasively.

상기 생체 포도당 검출방법에 있어, 상기 파장은 475 nm 내지 635 nm의 방출파장(emission wavelengths) 또는 350nm 내지 450nm의 여기 파장(excitation wavelength)인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the biological glucose detection method, the wavelength may be emission wavelengths of 475 nm to 635 nm or excitation wavelengths of 350 nm to 450 nm, but is not limited thereto.

상기 생체 포도당검출방법은 포도당 농도에 따른 방출 파장 또는 여기 파장에서의 형광강도의 비율을 계산하여, 상기 비율에 기초하여, 상기 포도당 농도가 측정 가능할 수 있다.The biological glucose detection method calculates a ratio of fluorescence intensity at an emission wavelength or an excitation wavelength according to glucose concentration, and based on the ratio, the glucose concentration can be measured.

상기 생체 포도당 검출방법에 있어, pH 5 내지 9 범위, 또는 온도 25 내지 37℃에서, 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 pH 5.5 내지 7.5 범위 또는 온도 28 내지 34℃ 일 수 있다. 상기 조건 일 경우, 비침습적인 방식으로 포도당을 더욱 민감하게 검출 할 수 있다. In the biological glucose detection method, it may be performed at a pH in the range of 5 to 9 or at a temperature of 25 to 37 ° C, but is not limited thereto. Specifically, the pH may be in the range of 5.5 to 7.5 or the temperature may be 28 to 34 °C. In the case of the above conditions, glucose can be more sensitively detected in a non-invasive manner.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to aid understanding of the present invention, but the following examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.

[제조예 1] 형광 염료가 도핑된 폴리스티렌(polystyrene) 입자 제조 [Preparation Example 1] Preparation of polystyrene particles doped with fluorescent dye

25ml의 에탄올, 정제수 5ml 및 0.25g의 폴리비닐피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone, PVP)를 콘데서가 장착된 100ml의 3구 플라스크에 넣은 다음, 혼합한 다음, 상기 혼합한 용액을 80℃에서 가열하였다. 그 다음 2.5ml의 스티렌(styrene)과 100L의 AIBN을 순차적으로 첨가하였다. 그 다음 중합(polymerization)은 전체 합성에 걸쳐서 적용되는 자기 교반과 함께 80℃에서 6시간 동안 자석 교반으로 진행되도록 하여, 폴리스티렌 입자를 제조하였으며, 상기 폴리스티렌(Polystyrene, PS) 입자의 현탁액을 실온으로 냉각하였다. 상기 PS 입자는 입자는 5000rpm에서 15분간 원심분리 후 에탄올로 세 번 세척한 후 실온에서 건조시켰다.25 ml of ethanol, 5 ml of purified water, and 0.25 g of polyvinyl pyrrolidone (PVP) were put into a 100 ml three-necked flask equipped with a condenser, mixed, and then the mixed solution was heated at 80°C. Then, 2.5 ml of styrene and 100 L of AIBN were sequentially added. Then, polymerization was allowed to proceed with magnetic stirring at 80 ° C. for 6 hours with magnetic stirring applied throughout the entire synthesis to prepare polystyrene particles, and cooling the suspension of the polystyrene (PS) particles to room temperature did The PS particles were centrifuged at 5000 rpm for 15 minutes, washed three times with ethanol, and then dried at room temperature.

그 다음 200mg의 PS 입자에 2% SDS용액 10mL이 첨가되었으며, 입자의 균질한 분산을 달성하기 위해 약 4시간 동안 교반하였다. Then, 10 mL of 2% SDS solution was added to 200 mg of PS particles and stirred for about 4 hours to achieve a homogeneous dispersion of the particles.

그 다음, TMF에 용해된 0.2mM의 쿠마린-6(C6) 1ml를 상기 PS 입자의 현탁액에 적하하였으며, 12시간 동안 강하게 교반하였다. 쿠마린-6(C6)가 도핑된 PS 입자((PS@C6))의 현탁액을 15분 동안 5000rpm으로 원심 분리하여 수집하였으며 멸균 증류수로 3번 워싱(washing) 하였으며, 실온에서 건조하였다. 상기 쿠마린-6(C6)가 도핑된 PS 입자((PS@C6))에 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP)을 로딩(loading)하기 위하여, TMF에 용해된 10mM의 PtP 2.5ml을 10ml의 SDS용액의 C6가 도핑된 PS 입자((PS@C6)의 현탁액에 적하하였다. 그 다음, 12시간 동안 강하게 교반 하였으며, 멸균 증류수로 워싱 및 실온에서 건조함으로써, C6와 PtP가 도핑된 PS 입자(PS@C6PtP particles)를 제조하었다. Then, 1 ml of 0.2 mM coumarin-6 (C6) dissolved in TMF was added dropwise to the PS particle suspension, and vigorously stirred for 12 hours. A suspension of coumarin-6 (C6)-doped PS particles ((PS@C6)) was collected by centrifugation at 5000 rpm for 15 minutes, washed three times with sterile distilled water, and dried at room temperature. Loading Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) on the coumarin-6 (C6) doped PS particles ((PS@C6)) To do this, 2.5 ml of 10 mM PtP dissolved in TMF was added dropwise to a suspension of C6-doped PS particles (PS@C6) in 10 ml of SDS solution. Then, it was vigorously stirred for 12 hours, washed with sterile distilled water, and By drying at room temperature, C6 and PtP-doped PS particles (PS@C6PtP particles) were prepared.

상기 PS 입자를 SEM을 확인한 결과는 도 2와 같다. 도 2 a는 상기 제조예 1에 따른 졸-겔 매트릭스 또는 실시예 1의 센서막의 AFM 및 SEM 이미지 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽은 졸-겔 매트릭스 이미지이며, 오른쪽 상기 센서막의 이미지 결과를 나타낸 것이다. The results of confirming the PS particles by SEM are shown in FIG. 2. 2a shows AFM and SEM image results of the sol-gel matrix according to Preparation Example 1 or the sensor film of Example 1, the left side shows the sol-gel matrix image, and the right side shows the image result of the sensor film.

도 2a의 졸-갤 매트릭스 결과에서 AFM 결과는 졸-갤 매트릭스의 고정화 막(membrane)이 3.588nm의 표면 거칠기(Ra)와 4.33nm의 평균 평균 제곱근 거칠기 (Rq)의 가진 얇고 매끄러운 막(membrane) 특성을 나타내고 있다. 또한 도 2a의 센서막의 결과에서 상기 센서막은 4.991 nm의 표면 평균 거칠기(Ra)와 6.315 nm의 제곱 평균 제곱근 거칠기 (Rq)를 가지고 있는 것이 확인되어 상기 졸-갤 매트릭스의 표면 형태보다 훨씬 더 거친 것을 확인하였다. 도 2b는 상기 실시예 1에 따른 산소 검출용 비율 형광 센서막의 산소 가스 0 내지 100%에 노출되었을 때의 반복적인 검출의 정확성에 대해 측정한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 2b의 결과에서 0에서 상대 표준 편차(RSD)가 2.64 내지 3.85%이기 ?문에 산소의 유무에 있어 우수한 가역성과 함께 다양한 산소 농도에 따른 높은 민감성이 확인되었다. 이는 C6 및 PtP 형광 염료를 모두 포함하는 상기 실시예 1의 센서막에서 PtP 염료의 형광 방출이 높은 산소 농도에서 켄칭되기 때문에 C6 염료의 형광 방출을 명확하게 관찰 할 수 있는 것이다. 도 2c는 각 다른 산소 가스 0, 2, 5, 15, 18, 21, 100%에 따른 산소 검출용 비율 형광 센서막의 형광 이미지 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 2c에서 상기 실시에 1의 센서막의 C6 및 형광 염료의 주황색은 특히 산호가 없을 때 낮은 산소 농도에서 명확하게 보이며, 대조적으로 C6 염료의 녹색은 산소 농도가 증가함에 따라 나타나며 100% 산소에서 명확하게 볼 수 있는 것으로 확인되었다. 이와 같이 다른 산소 농도에 노출되었을 때 발생하는 상기 실시예 1의 센서막의 색상 변화는 100 내지 200초 이내로 빠르게 인식 할 수 있다는 것을 나타낸다. In the sol-gal matrix result of FIG. 2a, the AFM result shows that the immobilized membrane of the sol-gal matrix is a thin and smooth membrane with a surface roughness (Ra) of 3.588 nm and a root mean square roughness (Rq) of 4.33 nm. represents a characteristic. In addition, from the result of the sensor film of FIG. 2a, it was confirmed that the sensor film had a surface average roughness (Ra) of 4.991 nm and a root mean square roughness (Rq) of 6.315 nm, which is much rougher than the surface morphology of the sol-gal matrix. Confirmed. FIG. 2B shows the measurement results of the repeated detection accuracy of the ratiometric fluorescence sensor film for oxygen detection according to Example 1 when exposed to 0 to 100% oxygen gas. In the results of FIG. 2B, since the relative standard deviation (RSD) at 0 was 2.64 to 3.85%, high sensitivity according to various oxygen concentrations was confirmed with excellent reversibility in the presence or absence of oxygen. This is because the fluorescence emission of the PtP dye in the sensor film of Example 1 including both C6 and PtP fluorescent dye is quenched at a high oxygen concentration, so that the fluorescence emission of the C6 dye can be clearly observed. Figure 2c shows the fluorescence image results of the ratio fluorescence sensor film for oxygen detection according to each different oxygen gas 0, 2, 5, 15, 18, 21, 100%. In FIG. 2C, the orange color of the C6 and fluorescent dye of the sensor film of Example 1 is clearly visible at low oxygen concentrations, especially in the absence of coral, whereas the green color of the C6 dye appears as the oxygen concentration increases and is clear at 100% oxygen. It was confirmed that it can be seen clearly. As such, the color change of the sensor film of Example 1, which occurs when exposed to different oxygen concentrations, indicates that it can be rapidly recognized within 100 to 200 seconds.

[실시예 1] 포르피린 및 쿠마린-6를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막 제조[Example 1] Preparation of ratiometric fluorescence sensor membrane for oxygen detection containing porphyrin and coumarin-6

3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 및 에탄올을 각각 6.5%:25%:68.5% 중량비의 비율로 혼합한 후, 여기에 37%의 HCL을 4%(v/v)으로 첨가함으로써, 가수분해(hydrolyzation) 및 중합(polymerization)을 진행시킨 다음, 그 다음 4시간 동안 실온 건조함으로써, 졸-겔 용액을 제조하였다. After mixing 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) and ethanol at a weight ratio of 6.5%:25%:68.5%, respectively, 37% A sol-gel solution was prepared by adding 4% (v/v) of HCL to allow hydrolysis and polymerization to proceed, followed by drying at room temperature for 4 hours.

그 다음 5mg의 C6와 PtP가 도핑된 PS 입자 (PS@C6PtP particles)를 1ml의 졸-겔 매트릭스를 혼합 후, 2시간 동안 쉐이큰(shaken) 하였으며, 그 다음 멀티-웰마이크로타이터 플레이트의 플레이트(96well 마이크로타이터 플레이트)에 각 well(직경 8mm)당 10ul로 코팅한 다음, 60℃에서 12시간 건조시켰다. 이로써, 졸 겔 매트릭스(Sol-gel matrix)에 형광 염료로 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra(pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 및 쿠마린-6(Coumarin-6, C6)이 도핑된 폴리스티렌 입자(polystyrene particles, PS)를 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막을 제조하였다. Then, 5 mg of C6 and PtP-doped PS particles (PS@C6PtP particles) were mixed with 1 ml of sol-gel matrix, shaken for 2 hours, and then plated in a multi-well microtiter plate. (96-well microtiter plate) was coated with 10 ul per well (8 mm in diameter), and then dried at 60 ° C for 12 hours. Thus, Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and Coumarin-6 (Coumarin-6, C6) were used as fluorescent dyes in the sol-gel matrix. A ratiometric fluorescence sensor film for oxygen detection including the doped polystyrene particles (PS) was prepared.

[실시예 2] 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막을 포함하는 포도당 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서 제조 [Example 2] Preparation of a bio-glucose quantification sensor including a glucose enzyme sensing membrane including an immobilized membrane of glucose oxidase (GOD)

포도당 산화효소를 고정화 하기 위하여 고분자 또는 졸-겔을 사용하여 96well 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 상기 실시예 1의 산소 검출용 비율 형광 센서막 위에 코팅하여 포도당 산화효소(Glucose oxidase, GOD)의 고정화 막을 포함하는 포도당 효소 감지막, 상기 포도당 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당정량 센서를 제조하였다. 또한 상기 포도당 산화 효소 감지막을 본 발명에서 GOD = PS@C6^PtP로 명명하였다.In order to immobilize glucose oxidase, a polymer or sol-gel was used to coat the oxygen detection ratio fluorescence sensor film of Example 1 coated on a 96-well microtiter plate to form a glucose oxidase (GOD) immobilized film. A glucose enzyme sensing film comprising a glucose enzyme sensing film and a bio-glucose quantification sensor including the glucose enzyme sensing film were manufactured. In addition, the glucose oxidase membrane was named GOD = PS@C6^PtP in the present invention.

[실시예 2-1] 에틸-셀룰로오스(Ethyl cellulose (EC)) 고정화 막을 포함하는 포도당 효소 감지막, 상기 포도당 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당정량 센서 제조[Example 2-1] Manufacturing of a glucose enzyme sensing film including an ethyl cellulose (EC) immobilized film and a bio-glucose quantification sensor including the glucose enzyme sensing film

상기 실시예 1의 96well 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 산소 검출용 비율 형광 센서막 위에 에탄올에 용해된 10wt% 에틸-셀룰로오스(Ethyl cellulose (EC)) 20ul를 코팅함으로써 포도당 산화 효소의 고정화 막을 제조하였다. 이와 같이 산소 검출용 비율 형광 센서막 층 및 상기 에틸-셀룰로오스(Ethyl cellulose (EC)) 고정화 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당정량 센서를 제조하였다. An immobilized membrane of glucose oxidase was prepared by coating 20 ul of 10wt% ethyl cellulose (EC) dissolved in ethanol on the ratiometric fluorescence sensor membrane for oxygen detection coated on the 96-well microtiter plate of Example 1. Thus, a glucose oxidase sensing film including a ratio fluorescence sensor film layer for oxygen detection and the ethyl cellulose (EC) immobilized film layer, and a bio glucose quantification sensor including the glucose oxidase sensing film were prepared.

[실시예 2-2] 폴리우레탄 하이드로겔 고정화 막을 포함하는 포도당 효소 감지막, 상기 포도당 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당정량 센서 제조[Example 2-2] Preparation of a glucose enzyme sensing membrane including a polyurethane hydrogel immobilized membrane and a bioglucose quantification sensor including the glucose enzyme membrane

상기 실시예 1의 96well 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 산소 검출용 비율 형광 센서막 위에 증류수 혼합용액(에탄올 90%(v/v), 증류수 10%(v/v))에 용해된 10 wt% 폴리우레탄 하이드로겔(Polyurethane hydrogel(D4)) 20ul를 코팅함으로써 포도당 산화 효소의 고정화 막을 제조하였다. 이와 같이 산소 검출용 비율 형광 센서막 층 및 상기 폴리우레탄 하이드로겔(Polyurethane hydrogel(D4)) 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서를 제조하였다. 10 wt% poly dissolved in distilled water mixed solution (ethanol 90% (v/v), distilled water 10% (v/v)) on the ratiometric fluorescence sensor membrane for oxygen detection coated on the 96-well microtiter plate of Example 1 above. An immobilized membrane of glucose oxidase was prepared by coating 20ul of polyurethane hydrogel (D4). As such, a glucose oxidase sensing film including a ratio fluorescence sensor film layer for oxygen detection and a polyurethane hydrogel (D4) film layer, and a bio-glucose quantitative sensor including the glucose oxidase film were manufactured.

[실시예 2-3] 졸-겔 고정화 막을 포함하는 포도당 효소 감지막, 상기 포도당 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당정량 센서 제조[Example 2-3] Preparation of a glucose enzyme sensing membrane including a sol-gel immobilized membrane and a bioglucose quantification sensor including the glucose enzyme membrane

3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 및 에탄올을 각각 6.5%:25%:68.5% 중량비로 혼합 후, 여기에 37%의 HCL을 4%(v/v)으로 첨가함으로써, 가수분해(hydrolyzation) 및 중합(polymerization)을 진행시킨 다음, 그 다음 4시간 동안 실온 건조함으로써, 졸-겔 용액을 제조하였다. 그 다음 상기 실시예 1의 96well 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 산소 검출용 비율 형광 센서막 위에 상기 졸-겔 용액을 10ul를 코팅함으로써 포도당 산화 효소의 고정화 막을 제조하였다. 이와 같이 산소 검출용 비율 형광 센서막 층 및 상기 졸-겔 고정화 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서를 제조하였다. After mixing 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) and ethanol in a weight ratio of 6.5%:25%:68.5%, respectively, 37% HCL was added to 4 A sol-gel solution was prepared by adding % (v/v) to allow hydrolysis and polymerization to proceed, followed by drying at room temperature for 4 hours. Next, an immobilized membrane of glucose oxidase was prepared by coating 10 ul of the sol-gel solution on the ratiometric fluorescence sensor membrane for oxygen detection coated on the 96-well microtiter plate of Example 1. Thus, a glucose oxidase sensing film including a ratio fluorescence sensor film layer for oxygen detection and the sol-gel immobilized film layer, and a bio-glucose quantitative sensor including the glucose oxidase sensing film were manufactured.

[비교예 1] 실리카를 포함하는 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막, 상기 센서막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서 제조 [Comparative Example 1] Production of ratiometric fluorescence sensor film for detecting oxygen containing silica, bio-glucose quantitative sensor including the sensor film

콘덴서가 장착된 3구 플라스크(100 mL)에 에탄올 25 mL와 탈이온수 5 mL, 폴리비닐피롤리돈 0.25 g을 넣었다. 80℃에서 30분간 가열한 후, 2.5 mL의 스티렌과 100 μL의 AIBN을 순차적으로 첨가하였다. 중합은 80℃에서 6시간 동안 진행되었고 전체 합성 중에 자석 교반 작용이 자석 교반으로 진행되도록 하여, 폴리스티렌(PS) 입자를 제조하였으며, 상기 폴리스티렌(polystyrene, PS) 입자의 현탁액을 실온으로 냉각하였다. 또한 상기 폴리스티렌 입자를 원심분리기를 통해 15분간 채취한 뒤 에탄올로 세 번 세척하고 실온에서 건조하였다. 그 다음 PS 입자 200mg을 2% SDS용액 10mL에 넣어 균질분산을 위해 약 4시간 동안 교반하였다. 그 후 12시간 동안 강하게 휘저은 조건에서 PS 입자 용액에 10 mM 백금-메소-테트라(펜타플루오로페닐)포르피린(Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin, PtP) 2.5 mL를 수직으로 적하하였다. 포르피린(PtP)이 (PtP(PS@PtP))가 도핑된 PS 입자는 원심분리기를 통해 15분간 채취한 뒤 증류수로 세 번 세척하고 실온에서 건조했다. 그 다음 쿠마린-6 포획 실리카 입자를 준비하였다. 상기 쿠마린-6 포획 실리카 입자는 변형된 슈테버 방법으로 준비되었다. DMSO 1 mL에 용해된 C6(3.5 mg)을 에탄올(10 mL)과 증류수(1 mL) 용액에 첨가하였다. 다음 단계에서 TEOS(4 mL)와 수산화 암모니아(2 mL)를 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반함으로써, 쿠마린-6 포획 실리카 입자를 제조하였다. 상기 C6 포획 실리카 입자(Si@C6)는 12분간 12,000rpm에서 원심분리하여 수집되었으며, 증류수와 에탄올로 몇 차례 더 세척한 후 실온에서 건조되었다.25 mL of ethanol, 5 mL of deionized water, and 0.25 g of polyvinylpyrrolidone were placed in a three-necked flask (100 mL) equipped with a condenser. After heating at 80° C. for 30 minutes, 2.5 mL of styrene and 100 μL of AIBN were sequentially added. Polymerization was carried out at 80 ° C. for 6 hours, and during the entire synthesis, magnetic stirring was performed by magnetic stirring to prepare polystyrene (PS) particles, and the suspension of the polystyrene (PS) particles was cooled to room temperature. In addition, the polystyrene particles were collected through a centrifuge for 15 minutes, washed three times with ethanol, and dried at room temperature. Then, 200 mg of PS particles were put into 10 mL of 2% SDS solution and stirred for about 4 hours for homogeneous dispersion. Thereafter, 2.5 mL of 10 mM platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) was added dropwise to the PS particle solution under vigorous stirring conditions for 12 hours. PS particles doped with porphyrin (PtP) (PtP(PS@PtP)) were collected through a centrifuge for 15 minutes, washed three times with distilled water, and dried at room temperature. Then, coumarin-6 entrapped silica particles were prepared. The coumarin-6 entrapped silica particles were prepared by a modified Stever method. C6 (3.5 mg) dissolved in 1 mL of DMSO was added to a solution of ethanol (10 mL) and distilled water (1 mL). In the next step, coumarin-6 entrapped silica particles were prepared by adding TEOS (4 mL) and ammonia hydroxide (2 mL) and stirring at room temperature for 24 hours. The C6 captured silica particles (Si@C6) were collected by centrifugation at 12,000 rpm for 12 minutes, washed several times with distilled water and ethanol, and then dried at room temperature.

상기 포르피린이 도핑된 PS 입자(PS@PtP 입자) 50mg과 1.2mg 쿠마린 6 포획 실리카 입자(Si@C6)를 에탄올에 10% 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose (EC)) 6 mL와 혼합하여 4시간 동안 저은 후 96 well 마이크로티터 플레이트(20μL/well)의 바닥에 코팅한 후 60℃에서 12시간 동안 건조시킴으로써 산소 검출용 비율 형광 센서막을 제조하였다. 50 mg of the porphyrin-doped PS particles (PS@PtP particles) and 1.2 mg coumarin 6 captured silica particles (Si@C6) were mixed with 6 mL of 10% ethyl cellulose (EC) in ethanol and stirred for 4 hours. After coating on the bottom of a 96-well microtiter plate (20 μL/well), a ratiometric fluorescence sensor film for oxygen detection was prepared by drying at 60° C. for 12 hours.

그 다음 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 및 에탄올을 각각 6.5%:25%:68.5% 중량비의 비율로 혼합 후, 여기에 37%의 HCL을 4%(v/v)으로 첨가함으로써, 가수분해(hydrolyzation) 및 중합(polymerization)을 진행시킨 다음, 그 다음 4시간 동안 실온 건조함으로써, 제조된 졸-겔 용액을 상기 96well 마이크로타이터 플레이트에 10ul 코팅함으로써 포도당 산화 효소의 고정화 막을 제조하였다. 이와 같이 산소 검출용 비율 형광 센서막 층 및 상기 졸-겔 고정화 막 층을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 상기 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 실리카를 포함하는 포함하는 산소 검출용 비율 형광 센서막, 상기 센서막을 포함하는 생체 포도당 정량 센서를 제조하였다. Then, after mixing 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS) and ethanol at a weight ratio of 6.5%:25%:68.5%, respectively, 37% By adding 4% (v / v) of HCL to proceed with hydrolysis and polymerization, and then drying at room temperature for 4 hours, the prepared sol-gel solution was placed in the 96-well microtiter An immobilized membrane of glucose oxidase was prepared by coating 10ul on a plate. As described above, a glucose oxidase sensing film including a ratio fluorescent sensor film layer for oxygen detection and the sol-gel immobilized film layer, a ratio fluorescence sensor film for oxygen detection including silica containing the glucose oxidase sensing film, the A bio-glucose quantitative sensor including a sensor membrane was manufactured.

[실험예 1] 포도당 산화 효소 감지막 (GOD = PS@C6^PtP)특성 확인 [Experimental Example 1] Confirmation of glucose oxidase sensing film (GOD = PS@C6^PtP) characteristics

[실험예 1-1] 포도당 산화효소(GOD) 고정 확인 [Experimental Example 1-1] Check glucose oxidase (GOD) fixation

상기 실시예 2 센서의 포도당 산화 효소 감지막의 특성과 관련하여 포도당 산화효소(GOD)의 고정화를 도3과 같이 확인하였다. 도 3a는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서의 포도당 산화효소(GOD)의 고정을 확인한 것으로 상기 포도당 산화효소가 파동으로 인한 롤 같이 고정이 되어 있는 것을 확인하였다. 도 3b는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서 상기 포도당 산화효소(GOD) 고정화를 확인한 것으로, 고정화 막 표면에서 움직이지 않는 포도당 산화효소가 확인되었다. 도 3c는 졸-겔 (GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서, 상기 포도당 산화효소(GOD)를 확인한 것으로, 포도당 산화효소(GOD)의 고정이 매우 잘 이루어진 것을 보여주며 상기 포도당 산화효소를 명확하게 배열되어짐을 확인하였다. In relation to the characteristics of the glucose oxidase membrane of the sensor of Example 2, the immobilization of glucose oxidase (GOD) was confirmed as shown in FIG. 3. Figure 3a confirms the fixation of glucose oxidase (GOD) on the glucose oxidase sensing membrane including the ethyl-cellulose (EC) immobilized membrane of the sensor of Example 2-1, and the glucose oxidase is fixed like a roll due to wave confirmed that it is. Figure 3b confirms the immobilization of glucose oxidase (GOD) in the glucose oxidase sensing membrane including the polyurethane hydrogel (D4) immobilized membrane of the sensor of Example 2-2, and the glucose oxidase immobilized on the surface of the immobilized membrane Confirmed. FIG. 3c confirms the glucose oxidase (GOD) in the glucose oxidase-sensing membrane including a sol-gel (GA) immobilized membrane, showing that the glucose oxidase (GOD) is immobilized very well and the glucose oxidation It was confirmed that the enzymes were clearly arranged.

[실험예 1-2] 포도당 산화효소(GOD) 고정 정밀도 확인 [Experimental Example 1-2] Determination of glucose oxidase (GOD) fixed precision

상기 실시예 2의 센서의 포도당 산화효소(GOD) 고정 정밀도를 확인하기 위하여, 상기 포도당 산화효소의 10U, 20U, 40U, 50U 및 100U에 대하여 테스트를 하였으며, Bradford 방법 기반으로 정밀도가 계산되었다. 도 4에서의 결과와 같이 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 및 실시예 2-3 센서의 졸-겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서 포도당의 0.1 내지 2mM 범위에서 매우 민감한 것을 확인하였다. 또한 사용된 포도당 산화효소(GOD)양이 증가함에 따라 기울기 값이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 기울기 값(SI) 값이 0.1436 또는 0.1163 일 경우, 정확도가 매우 높은 것을 확인하였다.In order to confirm the glucose oxidase (GOD) fixation accuracy of the sensor of Example 2, 10U, 20U, 40U, 50U, and 100U of the glucose oxidase were tested, and the accuracy was calculated based on the Bradford method. As shown in FIG. 4, the glucose oxidase sensing film of the sensor of Example 2-1 including an ethyl-cellulose immobilized film, the glucose oxidase sensing film of the sensor of Example 2-2 including a polyurethane hydrogel immobilized film, and It was confirmed that the glucose oxidase membrane of Example 2-3 including the sol-gel immobilized membrane was very sensitive to glucose in the range of 0.1 to 2 mM. It was also confirmed that the slope value increased as the amount of glucose oxidase (GOD) used increased. In addition, when the slope value (SI) value was 0.1436 or 0.1163, it was confirmed that the accuracy was very high.

[실험예 2] 형광 측정[Experimental Example 2] Fluorescence measurement

0.1mM~10mM 범위의 다양한 포도당 농도에 대한 상기 실시예 2 또는 비교예 1의 생체 포도당센서의 형광 측정을 다기능 형광 마이크로타이터 판 판독기(Safire2, Tecan Austria GmbH, Wien, Austria)를 사용하여 측정하었다. 데이터는 여가 파장이 400nm(μex = 400nm)인 두 개의 방출 파장(λem = 475nm 및 λem = 635nm)에서 실시예2의 포도당 산화 효소 감지막의 형광 강도로부터 확인하였다. Fluorescence measurement of the biological glucose sensor of Example 2 or Comparative Example 1 for various glucose concentrations in the range of 0.1 mM to 10 mM was measured using a multifunctional fluorescence microtiter plate reader (Safire2, Tecan Austria GmbH, Wien, Austria) was The data was confirmed from the fluorescence intensity of the glucose oxidase sensing membrane of Example 2 at two emission wavelengths (λem = 475 nm and λem = 635 nm) with an excitation wavelength of 400 nm (μex = 400 nm).

또한 실험예 2에서, 실시예 2의 센서의 포도당 산화 효소 감지막의 포도당 농도 검출의 감도 또는 민감성(sensitivity)은 slop 값, 기울기 값은, SI로 나타내었으며, 두 방출 파장 (λem = 475 nm 및 λem = 635 nm)에서 형광 강도의 비율을 기준으로 측정되었으며, 포도당 산화효소(GOD) 고정과 관련한 최적의 포도당 산화 효소(GOD)양을 확인하였다. 또한 비율계 형광법 및 데이터 분석은 두 개의 방출 파장(λem = 635 nm (FI₆₃₅)과 λem = 475 nm (FI₄₇₅)에서 형광 강도의 비율, R = FI₆₃₅/ FI₄₇₅을 기초로 하였다. 또한 포도당 산화 효소(GOD) 선형 범위의 형광 감도 및 기울기 차이는 다른 간섭(Different interference)에서 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 데이터가 분석되었다. 또한 표본 간의 유의 수준은 InStat 소프트웨어(vers.3.01, 미국 캘리포니아주 샌디에이고, 그래프 패드 소프트웨어 Inc.)를 이용하여 분석한 결과, 모든 시험군에서 p-value < 0.05로 확인되어 신뢰도 95%로 유의수준으로 확인되었다. Also, in Experimental Example 2, the sensitivity or sensitivity of the glucose concentration detection of the glucose oxidase membrane of the sensor of Example 2 is represented by the slop value and the slope value, SI, and the two emission wavelengths (λem = 475 nm and λem = 635 nm), it was measured based on the ratio of fluorescence intensity, and the optimal amount of glucose oxidase (GOD) related to glucose oxidase (GOD) fixation was confirmed. In addition, the ratiometric fluorescence method and data analysis were based on the ratio of the fluorescence intensities at the two emission wavelengths, λem = 635 nm (FI ₆₃₅ ) and λem = 475 nm (FI ₄₇₅ ), R = FI ₆₃₅ / FI _475. In addition, glucose The difference in fluorescence sensitivity and slope in the linear range of oxidase (GOD) was analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) in different interferences, and the significance level between samples was determined by InStat software (vers.3.01, California, USA). As a result of analysis using San Diego, Graph Pad Software Inc.), p-value < 0.05 was confirmed in all test groups, and it was confirmed at a significance level with a reliability of 95%.

[실험예 2-1] 포도당 산화 효소 감지막의 포도당 반응성 확인 [Experimental Example 2-1] Confirmation of glucose reactivity of glucose oxidase membrane

상기 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서, 실시예 2-2 센서 폴리우레탄 하이드로겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서, 실시예 2-3 센서의 졸-겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막을 포함하는 센서, 및 비교예 1 센서의 반응성을 확인한 결과, 도 5에서와 같이 본 발명의 실시예 2 센서에서 포도당의 산화반응에서 산소가 소비되어 상기 고정화 막의 형광 강도가 증가하는 것을 확인하였다. 포도당 산화 효소 감지 막에 고정 된 포도당 산화 효소(GOD)의 활성은 Michaelis-Menten 역학을 통해 평가 및 확인되었다. Example 2-1 sensor including a glucose oxidase sensing film including an ethyl-cellulose immobilized film, Example 2-2 Sensor including a glucose oxidase sensing film including a polyurethane hydrogel immobilized sensor, Example Example 2-3 As a result of confirming the reactivity of the sensor including the glucose oxidase membrane including the immobilized sol-gel membrane and the sensor of Comparative Example 1, as shown in FIG. 5, the oxidation of glucose in the sensor of Example 2 of the present invention It was confirmed that the fluorescence intensity of the immobilized membrane increased as oxygen was consumed in the reaction. The activity of glucose oxidase (GOD) immobilized on glucose oxidase-sensing membranes was evaluated and confirmed through Michaelis-Menten kinetics.

실시예 2-1 센서의 형광 강도는 0.1~10mM 범위에서 포도당 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 선형 검출 범위는 포도당 농도 0.1-2mM이었고, 높은 회귀 계수 값은 r2 = 0.994였으며 검출 한계(LOD, S/N = 3)는 0.025mM이었다. 운동 파라미터는 λem = 635 nm 및 λem = 475 nm에서 두 방출 형광 강도의 비율로 계산되었다. 최대 반응 속도(Vmax)는 476.2 mM/min, Michaelis-Menten 상수(Km)는 0.286 mM 라인위버-버크 플롯에서 얻었다The fluorescence intensity of the sensor of Example 2-1 increased as the glucose concentration increased in the range of 0.1 to 10 mM. The linear detection range was 0.1–2 mM glucose concentration, the high regression coefficient value was r2 = 0.994, and the limit of detection (LOD, S/N = 3) was 0.025 mM. Kinetic parameters were calculated as the ratio of the two emission fluorescence intensities at λem = 635 nm and λem = 475 nm. The maximum reaction rate (Vmax) was 476.2 mM/min, and the Michaelis-Menten constant (Km) was obtained from a Lineweaver-Burk plot of 0.286 mM

실시예 2-2 센서의 형광 강도는 0.1~10mM 범위에서 포도당 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 선형 검출 범위는 0.1~2mM, LOD는 0.029mM이었다. 최대 반응 속도(Vmax)와 Michaelis-Menten 상수(Km)의 운동 파라미터는 각각 140.8 mM/min과 0.366mM이었다.The fluorescence intensity of the sensor of Example 2-2 increased with increasing glucose concentration in the range of 0.1 to 10 mM, the linear detection range was 0.1 to 2 mM, and the LOD was 0.029 mM. The kinetic parameters of maximum reaction rate (Vmax) and Michaelis-Menten constant (Km) were 140.8 mM/min and 0.366 mM, respectively.

실시예 2-3 센서의 형광 강도는 0.1~10mM 범위에서 포도당 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 선형 검출 범위는 0.1~2mM, LOD는 0.043mM이었다. 최대 반응 속도(Vmax)와 Michaelis-Menten 상수(Km)와 같은 운동 파라미터는 각각 73 mM/min과 0.364 mM으로 계산되었다.The fluorescence intensity of the sensor of Example 2-3 increased with increasing glucose concentration in the range of 0.1 to 10 mM, the linear detection range was 0.1 to 2 mM, and the LOD was 0.043 mM. Kinetic parameters such as maximum reaction rate (Vmax) and Michaelis-Menten constant (Km) were calculated as 73 mM/min and 0.364 mM, respectively.

비교예 1 센서의 형광 광도는 0.1~10mM 범위에서 포도당 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 선형 검출 범위는 0.1~2mM, LOD는 0.031mM이었다. The fluorescence intensity of the sensor of Comparative Example 1 increased as the glucose concentration increased in the range of 0.1 to 10 mM, the linear detection range was 0.1 to 2 mM, and the LOD was 0.031 mM.

상기 실시예 2 센서와 비교예 1의 센서의 포도당 반응성을 확인한 결과, 상기 실시예 2-1의 센서 및 실시예 2-2의 센서에서 포도당 반응성의 LOD 값이, 비교예 1의 센서보다 0.8 내지 0.9 배의 포도당 반응성이 우수함이 확인되었다. As a result of confirming the glucose reactivity of the sensor of Example 2 and the sensor of Comparative Example 1, the LOD value of the glucose reactivity of the sensor of Example 2-1 and the sensor of Example 2-2 was 0.8 to 0.8 to that of the sensor of Comparative Example 1. It was confirmed that the 0.9-fold glucose reactivity was excellent.

이와 같이 본 발명의 실시예 2의 센서는 포도당 반응성이 매우 우수함이 확인되었다. As such, it was confirmed that the sensor of Example 2 of the present invention had excellent glucose reactivity.

[실험예 2-2] 포도당 산화 효소 감지막의 가역성 확인 [Experimental Example 2-2] Confirmation of reversibility of glucose oxidase membrane

도6과 같이 실시예 2의 포도당 센서에 있어서, 포도당 산화효소(GOD)가 상기 실시예 2의 센서의 포도당 산화 효소 감지막에 고정되었을 때 포도당 감지 막의 가역성은 0 및 2mM의 반복된 포도당 농도에 노출되었을 때 우수한 것을 확인하였다. 가역성 결과를 통하여, 포도당 산화효소(GOD)를 포함하는 고정화 막의 두께가 상기 실시예 1의 산소 검출용 비율 형광 센서막과의 산소 사이의 접촉에 영향을 미치지 않음을 나타냈다. As shown in FIG. 6, in the glucose sensor of Example 2, when glucose oxidase (GOD) is immobilized on the glucose oxidase-sensing membrane of the sensor of Example 2, the reversibility of the glucose-sensing membrane is at repeated glucose concentrations of 0 and 2 mM. It was confirmed that it was excellent when exposed. Through the reversibility results, it was shown that the thickness of the immobilized membrane containing glucose oxidase (GOD) did not affect the contact between oxygen and the ratiometric fluorescent sensor membrane for oxygen detection of Example 1.

[실험예 2-3] pH 및 온도에 따른 포도당 산화 효소 감지막 반응성 확인 [Experimental Example 2-3] Confirmation of glucose oxidase membrane reactivity according to pH and temperature

효소를 사용하는 생체 센서의 경우 pH 및 온도는 측정 결과에 영향을 미치는 중요한 매개 변수로, 시료 또는 시료용액의 pH는 센서 내 효소의 활동을 증가시키거나 감소시킬 수 있으며, 결과적으로 촉매 반응의 효율을 증가시키거나 감소시킬 수 있어, 이와 관련하여 검정하였다. In the case of biosensors using enzymes, pH and temperature are important parameters that affect measurement results. The pH of a sample or sample solution can increase or decrease the activity of enzymes in the sensor, resulting in the efficiency of the catalytic reaction. can increase or decrease, so it was tested in this regard.

도 7과 같이 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스(EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 및 실시예 2-3 센서의 졸-겔 GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서, 포도당 산화 효소(GOD)는 pH 범위 5-7에서 pH 범위 8-9에서 더 나은 감지 성능을 보였다. 글루코오스 막의 λem = 475 nm 및 λem = 635 nm에서 형광 강도의 비율은 pH 5~7 범위의 0.1~10 mM 범위의 포도당 농도에서 크게 변하지 않는 것이 관찰되었다. 또한 pH가 pH 7일 경우 매우 민감성을 높은 것을 확인하였다. As shown in FIG. 7, glucose oxidase sensing film including an ethyl-cellulose (EC) immobilized film of the sensor of Example 2-1 and glucose oxidase sensing film including a polyurethane hydrogel (D4) immobilized film of the sensor of Example 2-2 and in the glucose oxidase sensing film including the immobilized film of the sol-gel GA) of the sensor of Example 2-3, glucose oxidase (GOD) showed better sensing performance in the pH range of 5-7 to 8-9. . It was observed that the ratio of fluorescence intensities at λem = 475 nm and λem = 635 nm of the glucose membrane did not change significantly at glucose concentrations ranging from 0.1 to 10 mM in the pH range of 5 to 7. In addition, it was confirmed that the sensitivity was very high when the pH was pH 7.

도 8은 온도 25 내지 37℃에서 포도당 농도에 따른 발명의 실시예 2 센서에 따른 포도당 산화 효소 감지막의 반응성을 확인 한 결과, 0.1~10mM의 포도당 농도 범위에서 25~37℃ 범위의 온도에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 8 is a result of confirming the reactivity of the glucose oxidase sensing film according to the sensor of Example 2 of the present invention according to the glucose concentration at a temperature of 25 to 37 ° C. found to be unaffected.

[실험예 2-4] 포도당 산화 효소 감지막의 선택성(selectivity)과 장기적 안정성 확인 [Experimental Example 2-4] Confirmation of Selectivity and Long-Term Stability of Glucose Oxidase Sensing Film

본 발명의 상기 실시예 2의 센서의 포도당 산화 효소 감지막은 0.1-10mM 포도당의 검출 범위가 확인 되었다. 상기 농도 범위는 비 당뇨병 환자의 경우 2.5-7.1 mM의 농도 범위에서 포도당이 변하는 경우, 당뇨병 환자의 경우 이 범위를 벗어나는 혈청 내 포도당 검출에 적합하다. 따라서 알부민, Cl-, HCO3-, Fe3 + 및 Na + 이온과 같은 일부 화합물은 일반적으로 혈청에 존재하므로, 혈청 내 이러한 성분의 정상 농도는 Cl-의 경우 96-106 mM/L, HCO3-의 경우 20-30 mM, Fe3 +의 경우 0.5-1.76 mg /L, Na +의 경우 135-145 mM/ L이며, 알부민의 경우 2.9-5.5/dL 일 수 있다. 이와 관련한 상기 실시예 2의 포도당의 선택성과 관련하여 106 mM/L의 Cl, 30 mM/L의 HCO₃, 1.625 mg/L의 Fe³⁺, 145 mM/L의 Na⁺, 및 5g/dL의 BSA의 유무에 따른 1mM 포도당 검출을 확인하였다.The glucose oxidase membrane of the sensor of Example 2 of the present invention was confirmed to have a detection range of 0.1-10 mM glucose. The above concentration range is suitable for detecting glucose in serum when glucose changes in the concentration range of 2.5-7.1 mM in the case of non-diabetic patients and outside this range in the case of diabetic patients. Therefore, since some compounds such as albumin, Cl-, HCO3-, Fe3 + and Na + ions are normally present in serum, the normal concentration of these components in serum is 96-106 mM/L for Cl- and for HCO3- 20-30 mM, 0.5-1.76 mg/L for Fe3+, 135-145 mM/L for Na+, and 2.9-5.5/dL for albumin. Regarding the glucose selectivity of Example 2, 106 mM/L of Cl, 30 mM/L of HCO ₃ , 1.625 mg/L of Fe ³⁺ , 145 mM/L of Na ⁺ , and 5 g/dL of 1 mM glucose detection was confirmed according to the presence or absence of BSA.

도 9는 이에 대한 결과를 확인한 것으로, 106 mM/L의 Cl-, 30 mM/L의 HCO₃-, 1.625 mg/L의 Fe³⁺, 145 mM/L의 Na⁺, 및 5 g/dL의 BSA의 유무에 따른 1mM 포도당 농도의 상대 반응성 검출을 확인한 것이다. 9 confirms the results thereof, 106 mM/L of Cl-, 30 mM/L of HCO ₃ -, 1.625 mg/L of Fe ³⁺ , 145 mM/L of Na ⁺ , and 5 g/dL of It was confirmed that the relative reactivity was detected at 1 mM glucose concentration according to the presence or absence of BSA.

EC는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, GA는 실시예 2-3 센서의 졸-겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서의 반응성 검출 결과를 나타낸 것이다. 높은 수준의 농도 임계 값에서 간섭의 존재는 실시예 2-1, 실시예 2-2 및 실시예 2-3에서 포도당 감지 막에 미치는 영향이 적은 것으로 확인되었고, 또한 샘플간에 유의 한 차이가 없었고 요인의 유의한 영향도 없음을 확인하였다. EC is a glucose oxidase sensing film including an ethyl-cellulose immobilized film of the sensor of Example 2-1, D4 is a glucose oxidase sensing film including a polyurethane hydrogel immobilized film of the sensor of Example 2-2, and GA is an embodiment Example 2-3 Shows the results of detecting reactivity in the glucose oxidase sensing membrane including the sol-gel immobilized membrane of the sensor. The presence of interference at a high level of concentration threshold was confirmed to have a small effect on the glucose sensing membrane in Example 2-1, Example 2-2 and Example 2-3, and there was no significant difference between the samples and the factor It was confirmed that there was no significant effect of

또한 본 발명의 상기 실시예 2의 센서의 포도당 산화 효소 감지막의 장기 안정성과 비교예 1의 센서와 같이 확인하였다. 결과는 도 10과 같다. 도 10은 1개월 연속 측정에 따른 포도당 검출에 있어 상기 포도당 산화 효소 감지막의 민감성 또는 감도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, EC는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, GA는 실시예 2-3 센서의 졸-겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서의 결과를 나타낸 것이다. In addition, the long-term stability of the glucose oxidase sensing film of the sensor of Example 2 of the present invention and the sensor of Comparative Example 1 were confirmed. The results are shown in FIG. 10 . 10 shows the result of confirming the sensitivity or sensitivity of the glucose oxidase membrane in detecting glucose according to continuous measurement for one month, and EC is the glucose oxidase detection membrane comprising an ethyl-cellulose immobilized membrane of the sensor of Example 2-1 Membrane D4 is a glucose oxidase sensing film including a polyurethane hydrogel immobilized film of the sensor of Example 2-2, GA is a glucose oxidase sensing film including a sol-gel immobilized film of the sensor of Example 2-3 that showed the result.

실시예 2의 센서의 포도당 산화 효소 감지막을 1 개월 연속 측정 한 결과 모든 포도당 산화 효소 감지막의 감도가 상당히 좋은 것으로 나타났다. 0.1-2 mM의 포도당 농도 범위에서 선형 검량선의 기울기 값(SI)은 모든 경우에 크게 변하지 않았다. As a result of continuously measuring the glucose oxidase membranes of the sensor of Example 2 for one month, the sensitivity of all glucose oxidase membranes was found to be very good. In the range of 0.1-2 mM glucose concentration, the slope value (SI) of the linear calibration curve did not change significantly in all cases.

포도당 산화 효소 감지막의 고정화 막이 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스 (EC)일 경우, SI 값은 검출 첫날 기울기(SI initial)=0.0697 및 1개월 후 기울기(SI 1month)=0.0623 이였고, 첫날 기울기와 1개월 후 기울기 차이가 0.0074이였다. 포도당 산화 효소 감지막의 고정화 막이 실시예 2-2 센서의 고정화 막이 폴리우레탄 하이드로겔(D4)의 경우 검출 첫날 기울기(SI initial)=0.066 및 1개월 후 기울기(SI 1month)=0.0622이였으며, 첫날 기울기와 1개월 후 기울기 차이가 0.0038이였다. 포도당 산화 효소 감지막의 고정화 막이 실시예 2-3 센서의 졸-갤 매트릭스(GA)의 경우 검출 첫날 기울기(SI initial)=0.0598 및 1개월 후 기울기(SI 1month)=0.0545이였으며, 검출 첫날 기울기(SI initial)=0.066 및 1개월 후 기울기(SI 1month)=0.0622이였으며, 첫날 기울기와 1개월 후 기울기 차이가 0.0038이였다. 상기 실시예 2 센서의 포도당 산화 효소 감지막 모두 기울기의 변화가 거의 없고, 높은 안정성을 보여 장기간 사용하기에 적합함이 확인되었다. When the immobilized membrane of the glucose oxidase sensing membrane was ethyl-cellulose (EC) of the sensor of Example 2-1, the SI value was the slope on the first day of detection (SI initial) = 0.0697 and the slope after 1 month (SI 1 month) = 0.0623, and the first day The difference between the slope and the slope after 1 month was 0.0074. When the immobilized membrane of the glucose oxidase sensing membrane was polyurethane hydrogel (D4) in Example 2-2, the slope on the first day of detection (SI initial) = 0.066 and the slope after 1 month (SI 1month) = 0.0622, and the slope on the first day was and 1 month later, the difference in slope was 0.0038. In the case of the sol-gal matrix (GA) of the sensor of Example 2-3, the immobilized membrane of the glucose oxidase sensing film had a slope on the first day of detection (SI initial) = 0.0598 and a slope after 1 month (SI 1 month) = 0.0545, and the slope on the first day of detection ( SI initial) = 0.066 and slope after 1 month (SI 1 month) = 0.0622, and the difference between the slope on the first day and the slope after 1 month was 0.0038. All of the glucose oxidase sensing films of the sensor of Example 2 show little change in slope and high stability, confirming that they are suitable for long-term use.

반면 비교예 1의 센서의 포도당 산화 효소 감지막은 검출 첫날 기울기(SI initial) = 1.2238 및 1개월 후 기울기(SI 1month)=1.2084였으며, 첫날 기울기와 1개월 후 기울기 차이가 0.0154이였다.On the other hand, the glucose oxidase sensing film of the sensor of Comparative Example 1 had a slope on the first day of detection (SI initial) = 1.2238 and a slope after 1 month (SI 1 month) = 1.2084, and a difference between the slope on the first day and the slope after 1 month was 0.0154.

상기 실시예 2센서의 포도당 산화 효소 감지막은 비교예 포도당 산화 효소 감지막과 기울기의 변화가 2 내지 4의 배의 기울기 변화가 거의 없어, 비교예1의 센서와 비교하여, 높은 안정성을 보여 장기간 사용하기에 더욱 우수함을 확인하였다. The glucose oxidase sensing film of the sensor of Example 2 showed little change in the slope of the glucose oxidase sensing film of Comparative Example by a factor of 2 to 4, and compared to the sensor of Comparative Example 1, it exhibited high stability and was used for a long period of time. It was confirmed that the following was more excellent.

[실험예 2-5] 인공 눈물 시료에서 포도당 산화 효소 감지막 반응성 확인 [Experimental Example 2-5] Confirmation of Reactivity of Glucose Oxidase Sensing Film in Artificial Tear Samples

비침습적인 포도당 검출과 관련하여 인공 눈물 시료에서 도 11과 같이 포도당 산화 효소 감지막 반응성을 확인하였다. 표준 포도당 용액과 인공 눈물과의 포도당 농도 검출을 확인하였으며, 상기 도 11에서 EC는 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, D4는 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막, GA는 실시예 2-3 센서의 졸-겔의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막에서의 결과를 나타낸 것이다.Regarding non-invasive glucose detection, glucose oxidase membrane reactivity was confirmed in artificial tear samples as shown in FIG. 11 . The glucose concentration detection between the standard glucose solution and artificial tears was confirmed. In FIG. Glucose oxidase-sensing membrane comprising a polyurethane hydrogel immobilized membrane, GA shows the results of the glucose oxidase-sensing membrane comprising the sol-gel immobilized membrane of the sensor of Example 2-3.

도 11의 결과에서와 같이 눈물에 있는 특정 인자의 존재는 인공 눈물 용액에서 다른 포도당 농도에 대한 포도당 산화 효소 감지막의 반응에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 0.1-2mM의 포도당 농도 범위에서 선형 검량선의 기울기 값은 어떤 경우에도 크게 변하지 않았다. 포도당 산화 효소 감지막이 실시예 2-1 센서의 에틸-셀룰로오스 (EC) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 일 경우, SI 값은 표준 포도당 용액 0.0555 및 인공눈물 0.0503이였다. 포도당 산화 효소 감지막이 실시예 2-2 센서의 폴리우레탄 하이드로겔(D4) 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 일 경우 SI 값이 표준 포도당 용액 0.0821 및 인공 눈물 시료 0.0846 이였다. 또한 포도당 산화 효소 감지막이 실시예 2-3 센서의 졸-겔(GA)의 고정화 막을 포함하는 포도당 산화 효소 감지막 일 경우 SI 값이 표준 포도당 용액 0.0561 및 인공눈물 0.057이였다. 0.1~10mM 검출 범위에서 표준 포도당 용액과 인공눈물 사이의 포도당 농도의 비율적 형광 강도(R = FI₆₃₅/FI₄₇₅)는 (100 × (R_{std glucose} - R_{tear glucose})) 식의 백분율 편차 의해 검정된 결과, 실시예 2-1 센서, 실시예 2-2 센서 및 실시예 2-3 센서에서 모두 1.5%에서 9.0%까지 이였다.As shown in the results of FIG. 11 , it was confirmed that the presence of specific factors in tears did not significantly affect the response of the glucose oxidase membrane to different glucose concentrations in the artificial tear solution. In the range of 0.1–2 mM glucose concentration, the slope of the linear calibration curve did not change significantly in any case. When the glucose oxidase sensing film was the glucose oxidase sensing film including the ethyl-cellulose (EC) immobilized film of the sensor of Example 2-1, the SI values were 0.0555 for standard glucose solution and 0.0503 for artificial tears. When the glucose oxidase sensing film was the glucose oxidase sensing film including the polyurethane hydrogel (D4) immobilized film of the sensor of Example 2-2, the SI value was 0.0821 for the standard glucose solution and 0.0846 for the artificial tear sample. In addition, when the glucose oxidase sensing film including the sol-gel (GA) immobilized film of the sensor of Example 2-3, the SI values were 0.0561 for standard glucose solution and 0.057 for artificial tears. Fluorescence intensity as a percentage of glucose concentration between standard glucose solution and artificial tears in the detection range of 0.1~10mM (R = FI ₆₃₅ /FI ₄₇₅ ) was tested by the percentage deviation of the formula (100 × (R _{std glucose} - R _{tear glucose} )) As a result, the ratio was from 1.5% to 9.0% in the Example 2-1 sensor, Example 2-2 sensor, and Example 2-3 sensor.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As above, specific parts of the content of the present invention have been described in detail, and for those skilled in the art, these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. It will be clear. Accordingly, the substantial scope of the invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

Platinum meso-tetra (pentafluorophenyl) porphyrin (PtP) and Coumarin-6 (C6) are doped as fluorescent dyes in the sol-gel matrix. a ratio fluorescence sensor film layer for oxygen detection including polystyrene particles (PS); and
A glucose oxidase (GOD) immobilized membrane layer; including a glucose oxidase sensing membrane,
The immobilized membrane includes a polymer, and the polymer is any one or two or more selected from the group consisting of polyurethane, cellulose, and cellulose derivatives.

According to claim 1,
The polystyrene particle has a diameter of 0.1 to 10 um, a bio-glucose quantitative sensor.

According to claim 1,
The sol-gel matrix is an alkoxysilane-based compound, a bio-glucose quantitative sensor.

delete

According to claim 1,
The polyurethane is a polyurethane hydrogel, a bio-glucose quantitative sensor.

According to claim 1,
wherein the cellulose is at least one selected from the group consisting of methyl cellulose, ethyl cellulose, carboxy methyl cellulose, cellulose acetate phthalate, stearyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.

According to claim 1,
The sensor is an optical fiber or a multi-well microtiter plate form, a biological glucose quantitative sensor.

preparing polystyrene particles doped with a fluorescent dye;
mixing the polystyrene particles and the sol-gel matrix to prepare a ratiometric fluorescence sensor film layer for detecting oxygen; and
preparing a glucose oxidase sensing membrane including a membrane layer of immobilized glucose oxidase (GOD) including a first polymer or a second polymer; including,
Wherein the first polymer is a cellulose-based polymer and the second polymer is a polyurethane-based polymer.

delete

According to claim 9,
Wherein the sol-gel matrix comprises 20 to 50% by weight of an alkoxysilane-based compound and 50 to 80% by weight of ethanol.

Performing a reaction by injecting tears, a biological sample, into the sensor according to claim 1; And
Based on the fluorescence luminance ratio at the wavelength emitted from the reaction, detecting biological glucose; including, a biological glucose detection method.

According to claim 14,
Wherein the wavelength is an emission wavelength of 475 nm to 635 nm or an excitation wavelength of 350 nm to 450 nm.

According to claim 14,
The detection method is carried out in the pH range of 5 to 9, or at a temperature of 25 to 37 ° C., a biological glucose detection method.