KR102544277B1 - 세포외 기질 및 항암제로 이루어진 접합체 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

세포외 기질 및 항암제로 이루어진 접합체 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어진 세포외 기질(REP)과 항암제 접합체 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 상기 세포외 기질(REP)-독소루비신 접합체는 독소루비신 또는 REP 및 독소루비신 혼합물과 비교하여 매우 향상된 항암활성을 나타내었으며, 독소루비신 저항성을 나타내는 암세포의 약물 저항성을 억제시키는 효과가 확인됨에 따라, 상기 세포외 기질(REP)-독소루비신 접합체는 암질환 치료를 위한 효과적인 항암치료제 및 항암제에 대한 약물내성을 나타내는 암세포의 약제내성 억제용 약학조성물로 제공될 수 있다.

Description

세포외 기질 및 항암제로 이루어진 접합체 및 이의 의학적 용도{Extracellular matrix and anticancer drug conjugates and medical use thereof}
본 발명은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어진 세포외 기질과 항암제 접합체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
암이란 일반적으로 인체 조직을 이루고 있는 세포 주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고 세포분열을 계속하는 질환으로, 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생한다. 암의 원인은 환경이나 음식물 속에 포함된 발암 물질에 의해 정상적인 세포의 유전자나 암 억제 유전자에 돌연변이가 일어나고 이러한 세포들이 발암 물질의 계속적인 자극을 받으면서 비정상적으로 증식하여 암 조직을 형성하는 것으로 알려져 있으나, 암의 발생 원인에 대해서는 아직도 명확하게 밝혀진 바가 없다.
암은 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)로 구분되어지는데, 양성종양은 비교적 성장속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되어지는 전이(metastasis)가 나타나지 않는 것에 반해 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특징을 가짐으로써 생명을 위협하며 사망에 이르는 아주 중요한 원인이 된다.
이러한 암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있으나 많은 연구에도 불구하고 암 환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망하는 것으로 보고된다. 그에 따른 이유는 외과적으로 절제를 하였다 하더라도 미세하게 전이된 암 세포를 제거하지 못하여 암이 재발하거나, 다양한 항암제의 개발에도 불구하고 항암제를 이용한 암 치료 시, 항암제에 대한 암세포 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료도중이나 치료가 끝난 후 항암제에 대한 내성이 생긴 암세포들이 급격히 증식하기 때문이다.
화학요법인 저분자량 항암제 치료는 다양한 유형의 암 치료에 널리 사용되어왔으나, 암세포와 정상세포간의 차이점을 구별할 수 없는 항암제의 비특이성으로 인하여 화학요법의 임상적 효능은 제한적이다.
또한, 항암제의 임상적 효과를 위해 부작용을 유발시키는 최대 허용량으로 투여되는 데, 화학요법의 장기적인 부작용 중 하나는 다제내성으로, P-당 단백질이 암세포에서 항암제를 펌핑시켜 다제내성을 유도하는 것으로 알려져 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, P-당 단백질 매개 약물 유출 메커니즘 또는 암세포에 특이적으로 약물을 전달하기 위해 항암제를 선택적으로 변형시키는 치료 전략이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2006-0093554호 (2006.08.25. 공개)
본 발명은 종양 조직에 대한 항암제의 접근성을 크게 높여 정상 조직에 대한 부작용을 최소화하고 암세포에 대한 항암치료 효과를 향상시키기 위해 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어진 세포외 기질과 항암제로 이루어진 접합체를 항암치료용 약학조성물 또는 약제내성 억제용 약학조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 세포외 기질(REP) 및 항암제로 이루어진 접합체에 있어서,
상기 세포외 기질은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어지고,
상기 세포외 기질 및 항암제는 링커에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 항암 치료용 세포외 기질 및 항암제 접합체를 제공한다.
본 발명은 상기 세포외 기질 및 항암제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 기질 및 항암제 접합체를 유효성분으로 함유하는 약제내성 억제용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어진 세포외 기질(REP)-독소루비신 접합체가 독소루비신 또는 REP 및 독소루비신 혼합물과 비교하여 매우 향상된 항암활성을 나타내었으며, 독소루비신 저항성을 나타내는 암세포의 약물 저항성을 억제시키는 효과가 확인됨에 따라, 상기 세포외 기질(REP)-독소루비신 접합체는 암질환 치료를 위한 효과적인 항암치료제 및 항암제에 대한 약물내성을 나타내는 암세포의 약제내성 억제용 약학조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 REP-약물 접합체의 약물 및 수용체 간의 비 특이적 내재화를 설명하는 모식도로, REP-약물 접합체는 암세포 밖으로 펌프 아웃되지 않으므로 다중 약물 내성을 피할 수 있다.
도 2는 REP 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
도 3은 REP 단백질의 아미노산 서열이다.
도 4는 REP-약물 접합체의 일반적인 구조이다.
도 5는 온도에 의해 유도된 전이에 의한 REP-독소루비신 정제 결과를 확인한 것이다.
도 6은 490 nm에서 최대 흡광도를 갖는 REP-독소루비신의 UV-가시 스펙트럼 (UV-visible spectra)을 나타낸 결과이다.
도 7은 REP-독소루비신의 역 온도 전이를 확인한 결과로, PBS 내 단백질 농도는 20 μM (독소루비신 접합체 비율은 0.867)이며, 냉각 속도는 1℃/mim 이다.
도 8은 24시간 배양 후 PANC-1 세포에서 REP-독소루비신의 농도의존적 축적을 확인한 결과이다.
도 9는 REP-독소루비신 5 μM과 PANC-1 세포를 1 및 3 시간동안 배양한 후 시간 의존적으로 PANC-1 세포 내 REP-독소루비신 축적을 확인한 결과이다.
도 10은 REP-독소루비신 5 μM과 PANC-1 세포를 3시간 동안 배양하고 REP-독소루비시의 내재화 위치를 확인한 결과로, REP-독소루비신은 세포질 (노란색 화살표), 핵 (녹색 화살표) 및 세포질과 핵 (파란색 화살표) 모두에 내재화되는 것을 확인한 결과이다.
도 11은 PANC-1 세포에서 REP-독소루비신의 내재화에 대한 엔도사이토시스 (endocytosis) 억제 효과를 확인한 결과로, REP-독소루비신은 인테그린 수용체 매개 메커니즘을 통하여 암세포로 내재화되는 것을 확인한 결과이다.
도 12는 PANC-1 세포에서 REP-독소루비신과 LysoTracker Green DND-26의 동일 위치(localization)를 확인한 결과이다.
도 13은 PANC-1 세포에서 MitoTracker Green FM으로 REP-독소루비신의 동일위치를 확인한 결과이다.
도 14는 PANC-1 세포에서 독소루비신, REP 및 독소루비신 혼합물 및 REP-독소루비신 접합체의 세포독성을 비교한 결과로, 독소루비신의 항암효과는 REP 병용처리시 4배 증가한 반면, REP-독소루비신 접합체를 독소루비신과 비교하여 20배 이상 높은 항암활성을 나타낸 것을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 세포 표면의 인테그린 수용체 리간드를 통하여 암세포 내로 효율적으로 내재화되어 암세포의 사멸을 유도하며, 암세포의 P-당단백질 매개 다제 내성을 극복하기 위해 열 반응성 펩타이드 서열로 이루어지는 세포외 기질 단백질-약물 접합체를 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 세포외 기질(RGD-containing Elastin-Like Polypeptide, REP) 및 항암제로 이루어진 접합체에 있어서,
상기 세포외 기질은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어진 폴리펩타이드이고, 상기 세포외 기질 및 항암제는 링커에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 항암 치료용 세포외 기질 및 항암제 접합체를 제공할 수 있다.
상기 세포외 기질은 발린(valine)-글리신(glycine)-발린(valine)-프롤린(proline)-글리신(glycine) (VGVPG) 폴리펩타이드이며, 상기 인테그린 수용체 리간드는 아르기닌(arginine)-글리신(glycine)-아스파르테이트(aspartate) (RGD) 일 수 있다.
보다 상세하게는 상기 세포외 기질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열인 [VGRGD(VGVPG)6]n 으로 구성되고, 상기 n은 서열번호 3의 반복횟수로 5 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는 항암 치료용 세포외 기질 및 항암제 접합체일 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 세포외 기질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]nWPC 로 구성되고, 상기 n은 [VGRGD(VGVPG)6]의 반복횟수로 5, 10, 12, 15 또는 20의 정수일 수 있다.
상기 링커는 OH-, NH2- 및 SH-로 이루어진 군으로부터 각각 상이한 2개 이상의 작용기를 가지는 C2 내지 C5의 화합물인 것일 수 있다.
보다 상세하게는 상기 링커는 3-설포닐프로판하이드라지드 (3-Sulfanylpropanehydrazide) 및 3-멀캅토프로피오닉산 (3-Mercaptopropionic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 접합체는 세포외 기질과 링커의 SH- 작용기가 결합하고, 항암제와 링커의 OH- 또는 NH2- 작용기가 결합하여 접합체를 이루는 것일 수 있다.
상기 항암제는 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cis-platin), 도데탁셀(docetaxel), 타목시펜(tamoxifen), 캄토세신(camtothecin), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec), 모노메칠 오리스타틴 E(MMAE), 머탄신(DM1), 소라브탄신(DM4) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 세포외 기질 및 항암제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 암질환은 간암, 신장암, 폐암, 유방암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 위암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 약학조성물은 종양세포의 세포사멸을 증가시키고 항암제 약제내성을 저해하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 세포외 기질 및 항암제 접합체를 유효성분으로 함유하는 약제내성 억제용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 약제내성은 종양세포의 항암제 내성일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 세포외 기질 및 항암제 접합체의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> REP (RGD-containing Elastin-Like Polypeptide) 단백질 준비
1. REP 유전자 클로닝 및 발현
단위 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 (5’- aattcatatgggccacggcgtgggtcgtggcgatgtaggtgtcccaggtgtgggcgtaccgggcgttggtgttcctggtgtcggcgtgccgggcgtaggtgtcccaggtgtgggcgtgccgggctggca-3’)를 화학적으로 합성하여 pUC19 벡터의 EcoRI 및 HidIII 부위에 삽입하였다. REP 유전자 생성을 위해 RDL (recursive directional ligation) 방식으로 단위 유전자의 올리고머화를 수행하였다. 발현 벡터 pET-25b(+)를 NdeI 및 HinDIII으로 분해하고 CIP로 탈인산화시켰다.
올리고뉴클레오티드 (5’- tatgaccgggccgggctggccgtgctgata-3’)와 선형 pET-25b(+)를 연결하여 신규한 발현 벡터 pET-25b(+)-1을 생성하였다. REP 유전자를 pET-25b(+)-1 플라스미드 벡터에 클로닝하고 열충격 방법으로 E. coli BLR(DE3)으로 형질전환시켰다.
스타터 배양액 (250 mL flasks containing 50 mL of medium supplemented with 100 μg/mL ampicillin)에 -80℃에서 보관한 형질전환된 E. coli 세포를 접종하고 37℃에서 하룻밤동안 교반하며 배양하였다. 스타터 배양액을 3,000g으로 4℃에서 15분간 원심분리하고 신선한 배지 10 mL로 재현탁시켰다. 발현 배양액 (4 L flasks containing 1 L of medium with 100 μg/mL ampicillin)에 현탁된 스타터 배양액 5 mL를 접종하고 37℃에서 교반하여 배양하였다.
OD600이 약 0.8에 도달하면 IPTG (최종농도 1 mM)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 유도 3시간 후 3,000g로 4℃에서 20분간 원심분리하여 세포를 수집하였다.
2. REP 단백질 정제
수집된 E. coli 세포를 차가운 PBS 완충액 (pH 7.4) 35 mL에 재현탁시키고 4℃에서 음파 파괴하였다. 세포 용해물을 15,000g로 4℃에서 15분간 원심분리하고, 용해되지 않은 세포 잔해를 제거하였다. 세포 용해물에 NaCl (0.5M)을 첨가한 후 42℃로 가열하여 REP를 응집시켰다.
응집된 단백질을 10,000g으로 40℃에서 15분간 원심분리하여 용액으로부터 분리하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 차가운 PBS 완충액에 용해시키고, 고순도의 REP 단백질을 얻기 위해 추가적으로 ITC(inverse transition cycling)를 수행하였다.
<실시예 2> REP 단백질-약물 접합체 제조
1. 독소루비신 하이드라존 (Doxorubicin hydrazone) 합성
독소루비신 하이드로클로라이드 (58.0 mg, 0.1 mmol)을 둥근 바닥 플라스크 내 무수 메탄올 (10 mL)에 용해시켰다. 무수 메탄올(2 mL)에 용해시킨 3-(2-피리디닐디티오)프로파노익 산 하이드라지드 [3-(2-pyridinyldithio)propanoic acid hydrazide, 27.5 mg, 0.12 mmole]를 독소루비신 용액에 첨가하였다. 트리플로오로아세틱산 (trifluoroacetic acid) 3 방울을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 하룻밤동안 반응물을 교반하였다.
회전증발농축기를 이용하여 과량의 MeOH를 제거하고 무수 아세토나이트릴로 용매 침전시켜 시료를 정제하였다.
2. REP 단백질-독소루비신 접합체의 합성 및 정제
도 4와 같은 구조의 REP 단백질-독소루비신 접합체를 제조하였다.
먼저, 20 mM PBS 완충액 (pH 7.4)에 REP를 최종 농도 10 mg/ml이 되도록 용해시켰다. 15배 몰의 과량의 독소루비신 하이드라존을 디메틸포름아마이드에 용해시키고 REP 단백질 용액을 첨가한 후 실온에서 하룻밤동안 반응시켰다.
결합 후, 반응용액을 42℃로 가열하고 3,000 rpm으로 35℃에서 10분간 원심분리하여 REP-독소루비신 접합체를 다른 반응물로부터 분리하고, 온도에 따라 가역적으로 상변화가 나타는 특징을 이용하여 ITC를 1회 수행하여 도 5와 같이 REP-독소루비신 접합체를 정제하였다.
또한, PBS로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하였으며, 정제된 REP-독소루비신 접합체의 최종 농도를 100 μM 로 농축시키고 -80℃에 보관하였다.
3. 2'-[3-(2-피리디닐디티오)프로판오일]-파클리탁셀 {2'-[3-(2-pyridinyldithio)propanoyl]-Paclitaxel} 합성
파클리탁셀 (1.28 g, 1.5 mmol), 3-(2-피리디닐디티오)프로파노익 산[3-(2-pyridinyldithio)propanoic acid, 64.6 mg, 3.0 mmol] 및 DMAP (cat.)를 디클로로메탄에 용해시킨 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, 41.6 mg, 3.3 mmol]를 처리하고, 상기 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반시켰다.
유기층을 물로 세척하고 무수 MgSO4를 이용하여 건조시킨 후 생산물을 얻기 위해 진공 농축하였다.
4. REP 단백질-파클리탁셀 접합체 합성 및 정제
도 4와 같은 구조의 REP 단백질-파클리탁셀 접합체를 제조하였다.
먼저, 최종 농도가 10 mg/ml이 되도록 REP (60 mg, 0.001 mmol)를 1 mM EDTA와 함께 100 mM PBS 완충액(pH 7.4)에 용해시켰다. 15배 몰 과량의 2'-[3-(2-피리디닐디티오)프로판오일]-파클리탁셀을 디메틸포름아미드 (2 ml)에 용해시키고 REP 용액을 첨가하여 실온에서 하룻밤동안 반응시켰다. PBS-EDTA가 포함된 제염 컬럼을 PBS-EDTA 용액으로 평형화시키고 REP-파클리탁셀 접합체의 반응완충액으로 교환하여 부산물과 과량의 미반응 시약을 제거하였다.
REP-파클리탁셀 접합체를 1회 ITC 수행하여 정제한 후 PBS로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하였다.
정제된 REP-파클리탁셀 접합체를 최종 100 μM 농도로 농축하고 -80℃에 보관하였다.
<실시예 3> 독소루비신 접합체 비율 확인
REP의 몰 흡광계수 5,690 Lmol-1cm-1 를 이용하여 REP 농도를 결정하였으며, 독소루비신 농도는 495 nm에서 독소루비신 흡광도 및 흡광 계수 9,250 Lmol-1cm-1 를 이용하여 결정하였다.
REP-독소루비신 접합체의 REP 농도를 결정하기 위해, 280 nm에서의 독소루비신 흡광도를 제외하고 하기 식에 따라 280 nm 흡광도를 이용하여 REP 농도를 계산하였다.
[REP] = [Abs280 - (0.9 x Abs495)]/5,690 Lmol-1cm-1·cm
[REP]는 REP-독소루비신 접합체 내 REP의 농도이다.
독소루비신 접합체 비율은 독소루비신의 농도를 REP 농도로 나누어 계산하였다.
<실시예 4> REP-약물 접합체의 분광학적 특성 확인
실시예 3에서 합성한 REP-독소루비신 접합체의 분광학적 특성을 확인하기 위해, Cary 100 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 15℃에서 800 nm에서 200 nm까지 REP-독소루비신 접합체의 UV-vis 스펙트럼을 확인하였다.
그 결과, 도 6과 같이 UV-가시 스펙트럼에서 REP는 가시영역에서 흡수 피크가 나타나지 않은 반면, 최대 흡수인 280 nm에서 UV 흡수 광선이 확인되었다.
<실시예 5> REP-약물 접합체의 열적 특성 확인
REP-약물 접합체의 열전이 특성은 온도 구배가 1 ℃/min인 Cary 100 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 온도 함수로 350 nm에서의 접합체 용액의 탁도를 관찰하여 확인하였다. 전이 온도(Tt)를 최대 탁도의 50% 지점으로 정의하였으며, REP-약물 전이 온도는 하기 방정식에 적합하였다.
Tt = a · Ln([REP-Drug]) + b
상기 식에서 [REP-Drug]은 REP-약물 농도이며, a는 기울기, b는 REP-약물 1 μM의 Tt 이다.
그 결과, 도 7과 같이 REP-독소루비신 접합체의 역 온도 전이가 확인되었다. PBS 내 단백질 농도는 20 μM (독소루비신 접합체 비율은 0.867)였으며, 냉각 속도는 1℃/mim 였다.
<실시예 6> REP-약물 접합체 내재화 확인
PCNA-1 사람 췌장암 세포를 96-웰 플레이트 내 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 웰당 2×104 세포 밀도로 분주하고, 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 부착시킨 후, 배양 배지를 다양한 농도의 REP-독소루비신이 포함된 DMEM (100 μL, without FBS) 배지로 교환하였다.
지정된 시간마다 세포를 차가운 PBS (pH 7.4)로 두 번 세척하고, 세포를 4′,6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride로 1시간 동안 염색한 후 REP-독소루비신의 내재화를 Leica DMI3000B fluorescence microscope에서 확인하였다.
상기 과정으로 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 μM 농도의 REP-독소루비신 접합체를 PCNA-1 세포에 처리한 결과, 도 8과 같이 농도의존적으로 REP-독소루비신 접합체의 세포내 축적이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 과정으로 REP-독소루비신 5 μM를 PANC-1 세포에 처리하고 1 및 3 시간동안 배양한 후 PANC-1 세포 내 REP-독소루비신 축적을 확인한 결과, 도 9와 같이 시간 의존적으로 PANC-1 세포 내 REP-독소루비신 축적이 증가하는 것이 확인되었다.
REP-독소루비신 5 μM과 PANC-1 세포를 3시간 동안 배양하고 REP-독소루비신의 내재화 위치를 확인하였다.
그 결과, 도 10과 같이 REP-독소루비신은 세포질 (노란색 화살표), 핵 (녹색 화살표) 및 세포질과 핵 (파란색 화살표) 모두에 내재화되는 것을 확인할 수 있었다.
REP-독소루비신 엔도시토시스(endocytosis)를 측정하기 위해, REP-독소루비신 처리 전 GRGDNP (100 μM), 아밀로라이드 하이드로클로라이드 (amiloride hydrochloride, 1 mM), 클로로프로마진 (chlorpromazine, 50 μM), dynasore (80 μM) 및 제니스테인 (genistein, 200 μM)을 30분간 PANC-1 세포에 전처리하고, PANC-1 세포에서 REP-독소루비신 접합체의 내재화에 대한 엔도사이토시스 (endocytosis) 억제 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 11과 같이 REP-독소루비신 접합체는 인테그린 수용체 매개 메커니즘을 통하여 암세포로 내재화되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 대조 염색법을 이용하여 세포내 특정 소기관을 염색하여 REP-독소루비신의 내재화 기전, 세포내 이동과정 및 작용위치를 확인하였다.
인테그린 수용체 매개 메커니즘을 통해 REP-독소루비신을 포집한 소포체가 종양세포 내부로 이동한 후 REP-독소루비신을 리소솜으로 운반한 것을 확인하기 위하여 REP-독소루비신을 처리한 세포에 리소좀에만 특이적으로 반응하는 리소트래커(LysoTracker Green)를 처리하여 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 12와 같이 REP-독소루비신이 염색된 적색 형광과 췌장암 세포의 리소좀 내부를 염색한 소트래커(LysoTracker Green)의 초록색 형광, 췌장암 세포 핵을 염색한 파란색 형광이 다섯번째 이미지에서 모두 합쳐져 노란색 형광으로 확인됨에 따라, 내재화된 REP-독소루비신이 리소솜 내부에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 내재화된 REP-독소루비신이 종양세포내 특정소기관에 존재하는 것을 확인하기 위해 REP-독소루비신을 처리한 종양세포에 미토콘드리아에만 특이적으로 반응하는 미토트래커(MitoTracker Green)를 처리하여 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 13과 같이 REP-독소루비신이 염색된 적색 형광과 췌장암 세포의 세포질을 염색한 미토트래커(MitoTracker Green)의 초록색 형광, 췌장암 세포 핵을 염색한 파란색 형광을 확인하였으며, 다섯번째 이미지에서 빨간색 형광과 초록색 형광이 합쳐져 노란생 형광과 보라색 형광으로 나타나는 것이 확인됨에 따라, 내재화된 REP-독소루비신은 미토콘드리아와 핵 내부에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 인테그린 수용체 매개 메커니즘을 통해 REP-독소루비신을 포집한 소포체가 췌장암 세포 내부로 이동한 후 리소솜과 융합하여 REP-독소루비신을 리소솜으로 운반하고, 리소솜 내부의 단백질 분해 효소들은 REP-독소루비신을 소분자의 펩타이드-독소루비신으로 가수분해하여 펩타이드-독소루비신를 세포질로 배출하고, 배출된 소분자 펩타이드-독소루비신 접합체가 핵과 미토콘드리아로 침투하여 항암효과를 나타내는 것이 확인되었다.
<실시예 7> 사람 암 세포에 대한 REP-약물 접합체의 세포독성 효과 확인
A549 사람 폐암 세포, Hep G2 사람 간암 세포, HT-29 사람 대장암 세포, MDA-MB-231 사람 유방암 세포 및 PANC-1 사람 췌장암 세포를 이용하여 다양한 타입의 사람 암에 대한 REP-독소루비신의 세포독성을 확인하였다.
암세포에 대한 IC50 값을 확인하기 위해, PANC-1 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민(glutamine), 50 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 50 U/mL 페니실린 (penicillin)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.
세포를 37℃, 95% 상대 습도 및 5% CO2 조건의 배양 챔버에서 배양하였다. PANC-1 세포를 96 웰 플레이트 내 1% FBS가 포함된 배지에 웰당 2×104 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 세포를 부착시킨 후 배양 배지를 신선한 DMEM 배지(100 μL, no FBS)로 교체하였다.
REP-독소루비신을 독소루비신의 농도가 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2.5, 5 및 10 μM 이 되도록 웰에 첨가하거나, 파클리탁셀의 농도가 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 50 및 100 nM이 되도록 REP-파클리탁셀을 웰에 첨가하였다.
48시간 동안 배양한 후, 배양 배지를 제거하고 세포를 차가운 DMEM 배지 100 μL로 두 번 세척하였다. 각 웰에 CCK-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium] 10 μL를 첨가하고 37℃, 95% 상대 습도 및 5% CO2 조건 하에서 1시간 동안 배양하였다.
배양 후, 450 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도(OD)를 측정하였다. 세포 생존 곡선은 GraphPad Prism 8.3.1을 이용한 sigmoidal four PL-Sigmoidal function에 적합하였다.
그 결과, 표 1 및 표 2와 같이 각 암세포에 대한 REP-독소루비신 접합체(μM)와 REP-파클리탁셀 접합체(nM)의 IC50 값을 확인할 수 있었다.
Drug A549 HepG2 HT-29 MDA-MB-231 PANC-1
Doxorubicin 0.46 0.62 1.46 0.54 15.3
REP-Doxorubicin 0.57 0.32 1.0 0.79 0.73
Drug A549 HepG2 HT-29 MDA-MB-231 PANC-1
Paclitaxel 7.77 8.27 8.51 6.15 3.54
REP-Paclitaxel 6.88 7.82 9.15 6.68 4.27
<실시예 8> 독소루비신, REP 및 독소루비신 혼합물 및 REP-독소루비신 접합체의 세포독성 확인
독소루비신, REP 및 독소루비신 혼합물 및 REP-독소루비신 접합체의 세포독성을 비교하기 위해, 실시예 7과 같은 방법으로 독소루비신, REP 및 독소루비신 혼합물 및 REP-독소루비신 접합체를 PANC-1 세포에서 처리하여 IC50 값을 확인하였다.
그 결과, 도 14와 같이 독소루비신과 비교하여, REP 및 독소루비신 혼합물의 항암 효과가 4배 증가한 반면, REP-독소루비신 접합체를 20배 이상 증가된 항암활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 독소루비신 민감성 MDA-MB-231 세포 및 독소루비신 저항성 MDA-MB-231 세포에서 독소루비신, REP 및 독소루비신 혼합물 및 REP-독소루비신 접합체의 IC50 (μM) 값과 독소루비신의 약물 저항성 지수를 확인하였다.
그 결과, 표 3과 같이 REP-독소루비신 접합체가 처리된 독소루비신 저항성 MDA-MB-231 세포에서 약물 저항성 극복 효과가 나타나는 것이 확인되었다.
Drug MDA-MB-231 MDA-MB-231/Dox resistant Drug resistance index
Doxorubicin 0.54 9.36 17.3
REP + Doxorubicin mixture 1.18 15.9 13.5
REP-Doxorubicin 0.79 1.02 1.3
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Extracellular matrix and anticancer drug conjugates and medical use thereof <130> ADP-2020-0387 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2124 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> REP <400> 1 atgaccgggc cgggcgtggg tcgtggcgat gtaggtgtcc caggtgtggg cgtaccgggc 60 gttggtgttc ctggtgtcgg cgtgccgggc gtaggtgtcc caggtgtggg cgtgccgggc 120 gtgggtcgtg gcgatgtagg tgtcccaggt gtgggcgtac cgggcgttgg tgttcctggt 180 gtcggcgtgc cgggcgtagg tgtcccaggt gtgggcgtgc cgggcgtggg tcgtggcgat 240 gtaggtgtcc caggtgtggg cgtaccgggc gttggtgttc ctggtgtcgg cgtgccgggc 300 gtaggtgtcc caggtgtggg cgtgccgggc gtgggtcgtg gcgatgtagg tgtcccaggt 360 gtgggcgtac cgggcgttgg tgttcctggt gtcggcgtgc cgggcgtagg tgtcccaggt 420 gtgggcgtgc cgggcgtggg tcgtggcgat gtaggtgtcc caggtgtggg cgtaccgggc 480 gttggtgttc ctggtgtcgg cgtgccgggc gtaggtgtcc caggtgtggg cgtgccgggc 540 gtgggtcgtg gcgatgtagg tgtcccaggt gtgggcgtac cgggcgttgg tgttcctggt 600 gtcggcgtgc cgggcgtagg tgtcccaggt gtgggcgtgc 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Gly Val Gly Arg Gly Asp Val Gly Val 35 40 45 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 50 55 60 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 85 90 95 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 100 105 110 Arg Gly Asp Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 115 120 125 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 130 135 140 Gly Val Gly Arg Gly Asp Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 145 150 155 160 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 165 170 175 Gly Val Pro Gly Val Gly Arg Gly Asp Val Gly Val Pro Gly Val Gly 180 185 190 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 195 200 205 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Arg Gly Asp Val Gly Val Pro 210 215 220 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 225 230 235 240 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 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Claims (11)

  1. 세포외 기질(REP) 및 독소루비신(doxorubicin)으로 이루어진 접합체를 포함하는 암질환 치료용 약학조성물로써,
    상기 세포외 기질은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드와 인테그린 수용체 리간드로 이루어진 것으로, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열인 [VGRGD(VGVPG)6]n(n은 서열번호 3의 반복횟수로 5 내지 20의 정수임)으로 구성되거나, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]nWPC(n은 [VGRGD(VGVPG)6]의 반복횟수로 5, 10, 12, 15 또는 20의 정수임)로 구성되고,
    상기 세포외 기질 및 독소루비신(doxorubicin)은 링커에 의해 서로 연결되고, 상기 링커는 OH-, NH2- 및 SH-로 이루어진 군으로부터 각각 상이한 2개의 작용기를 가지는 C2 내지 C5의 화합물이며,
    상기 암질환은 간암, 대장암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 접합체는 세포외 기질과 링커의 SH- 작용기가 결합하고, 독소루비신(doxorubicin)과 링커의 OH- 또는 NH2- 작용기가 결합하여 접합체를 이루는 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 종양세포의 세포사멸을 증가시키는 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
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