KR102539080B1 - nc886을 포함하는 암살상 바이러스 활성 증진 또는 생산 증진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 nc886을 포함하는 암살상(oncolytic) 바이러스 활성증진용 조성물 및 이를 포함하는 바이러스 생산 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

nc886을 포함하는 암살상 바이러스 활성 증진 또는 생산 증진용 조성물 {A composition for promoting oncolytic virus activity or enhancing virus production comprising nc886}
본 발명은 nc886을 포함하는 암살상(oncolytic) 바이러스 활성증진용 조성물 및 이를 포함하는 바이러스 생산 증진용 조성물에 관한 것이다.
암살상 바이러스(Oncolytic virus)는 살아있는 바이러스(virus)의 유전자를 조작해 정상세포에서는 작용하지 않으며, 암세포 특이적으로 증식하여 암세포를 파괴하는 특징을 가지고 있다. 또한, 직접적으로 암세포를 공격하는 것 외에도 인체의 적응면역반응을 촉진 시키는 기능(Immune stimulation)과 더불어 종양 혈관내피세포를 특이적으로 감염시켜 파괴하여 신생혈관 생성을 억제하는 기능도 가지고 있다. 1904년 Dock G 연구팀이 광견병바이러스를 이용하여 자궁경부암 환자에서 항암작용을 확인 및 보고한 것을 시작으로 조류바이러스, 감기바이러스 등의 바이러스에서 항암 연구가 진행, 보고되고 있다. 2015년 10월 미국 암젠이 미국식품의약국에서 처음 허가를 받고 시판된 흑생종 치료제 임리직(lmlygic, talimogene laherparepvec)을 시작으로 많은 암살상 바이러스(Oncolytic virus)의 연구와 임상시험이 주목 받고 있다. 그러나 암살상 바이러스의 대량생산이 어려우며, 임상 적용 시에 활성이 미비한 문제가 있다. 또한, 암살상 바이러스가 실제로 세포에 들어가게 되면 감염율이 낮아 치료가 안 되는 문제가 있다. 따라서 임상효과가 제한적으로 나타나 현재 기존 면역관문 억제제와 병용 치료가 시도되고 있다.
C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)는 전 세계적으로 1억 8천여 명 이상이 감염되었을 것으로 생각되는 병원체이며, 효과적으로 치료되지 않을 경우, 간 섬유화, 간경화, 간암과 같은 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. HCV 바이러스는 6개의 유전형을 가지며 세계적으로 고르게 분포되어 있고, 지역과 인종에 따라 다르게 분포된다. 병원성 HCV 감염은 유전 1형, 2형, 3형 순으로 감염자가 많고, 유전 1형이 유럽과 북아메리카에 많이 분포하며 치료가 가장 어렵고 유전 2형과 3형은 극동 아시아 지역에 많이 발병한다. 특히 치료하기 어려운 유전 1형 HCV 환자가 HCV 감염자의 대다수를 차지하고 있다. 전 세계 인구의 1~2%가 이 바이러스에 감염되어 있지만, 바이러스는 매우 낮은 역가(titer)로 생체 내에 존재하고 있기 때문에 진단하기가 매우 힘들고, HCV 바이러스에 대한 효과적인 치료제나 백신이 없는 상태이다. 현재 HCV 증식을 억제함으로써 HCV로 인한 질병에 어느 정도 효과를 보이는 α-인터페론과 리바비린(ribavirin)을 동시에 투여하는 방법이 있지만, 이 방법은 바이러스의 균주마다 그 효과가 다르게 보고되어 있으며, 단지 40%의 HCV 감염 환자에서만 지속적인 효과가 있으며 많은 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기의 문제를 해결하기 위해 많은 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 한국공개특허번호 제 10-2012-0131864호에는 표적 물질 특이적으로 siRNA를 방출하는 RNA간섭용 조성물 및 이를 이용한 HCV 관련 질환 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개번호 제 10-2011-0046321호에는 인돌 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 그러나 기존 바이러스 치료제의 치료효능이 미비하여, 보다 효과적인 바이러스 치료제에 대한 요구가 지속적으로 있어 왔다.
본 발명자들은 최근 발견된 non-coding RNA인 nc886을 연구하던 중에, nc886이 바이러스 복제를 촉진하여 바이러스의 생산을 돕고, pro-viral한 환경을 제공하여 바이러스의 활성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다. nc886이 knock-down될 때 바이러스의 mRNA 및 단백질의 유의한 감소가 된다는 것을 확인하였다. 이와 같이, nc886 길항제를 사용할 경우, 바이러스 예방 및 치료 효과가 있음을 확인하였다. 이와 같이, 본 발명은 nc886을 포함하는 암살상 바이러스 활성증진용 조성물, 이를 포함하는 바이러스 생산 증진용 조성물과 바이러스 생산방법; 및 nc886 길항제를 포함하는 바이러스 치료 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 바이러스 감염의 초기단계에서는 nc886 길항제를 투여함으로서 바이러스의 증식을 억제한다. 그리고 오히려 역으로 바이러스를 이용한 암치료에서는 nc886을 삽입한 바이러스가 암치료 효율을 증가시킬 수 있는 조성물을 제공한다.
본 발명은 nc886 또는 이의 활성화제를 포함하는 바이러스 생산 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 nc886 또는 이의 활성화제를 추가하는 단계를 포함하는 바이러스 생산방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 nc886 또는 이의 활성화제를 포함하는 암살상 바이러스 치료제의 활성증진용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 nc886 또는 이의 활성화제; 및 암살상 바이러스 치료제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 암살상 바이러스 치료제에 있어서 암살상 바이러스 치료 보제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다:
(a) nc886를 발현하는 세포에 시험물질 및 항암 바이러스를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 nc886의 발현 정도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 상기 nc886의 발현을 증가시킨 시험물질을 항암 바이러스 보조제 후보물질로 판단하는 단계.
또한 본 발명은 nc886의 발현 억제제를 포함하는 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 바이러스 감염의 치료를 위한 후보물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
(a) nc886를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 nc886의 발현 정도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질이 상기 nc886의 발현을 감소시키는 경우, 바이러스 감염의 치료를 위한 후보물질로 판단하는 단계.
본 발명은, pro-viral한 환경을 제공하는 nc886의 약제학적 용도를 제공하며, 본 발명의 nc886 또는 이의 활성화제를 포함하는 조성물은 바이러스 복제를 촉진하여 바이러스의 생산을 돕고, 바이러스의 활성, 특히 암살성 바이로스치료제의 효능을 증진시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 nc886 길항제를 포함하는 조성물은 바이러스 예방 및 치료 효과가 있다.
도 1은 nc886이 바이러스 복제를 촉진한다는 것을 보여주는 결과로써, A는 지정된 간세포에서의 로딩 대조군으로서의 EtBr 염색된 지시된 ncRNA의 노던 블랏 결과이고, B 및 C는 HCV 감염 후 표시된 시점에서 nc886이 knock-down이 있거나 없는 HCV 및 숙주 인간 단백질의 웨스턴 블랏 결과이고, D는 지정된 시간에 HCV 바이러스 mRNA의 측정한 결과이고 (HCV 감염 24 시간 전에 nc886 (-886으로 기재) 또는 vtRNA1-1 (-con으로 기재)에 대한 항- 올리고제를 형질 감염 하였고, "none"은 anti-oligo가 없는 형질감염을 나타냄), E는 항-SeV 항체 (anti-SeV antibody)로 수행한 웨스턴 블랏 결과이고 (SeV는 표시된 세포주에 감염되었고, 감염 후 표시된 시간에 세포를 수확하고 웨스턴 블랏용으로 용해시킨 후 밴드를 정량화함), F는 nc886 과 발현이 있거나 없는 293 세포를 MOI 1로 RSV에 감염 후 다양한 시점에서, 총 세포용 용해물을 준비하고 바이러스 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이며, G는 AdV를 지시된 세포주에 감염시키고 AdV 입자를 측정한 결과이다.
도 2는 nc886이 IFN 반응을 억제하는 것을 보여주는 결과로서, A는 병원체 감염 시 IFN 반응을 보여주는 모식도이고, B는 Poly (I:C) 처리 시 IFNB1의 qRT-PCR 측정을 한 결과이고, (Poly (I:C) 형질 감염 후 표시된 시간에 RNA를 분리하고 qRT-PCR로 IFNB1과 18S rRNA를 측정을 하였고, 값을 18S rRNA로 정규화하고, 293T:vector의 0시간의 값을 1로 설정함), C는 IFN-β 프로모터 요소를 포함하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 내부 루시퍼라제 제어 플라스미드로 293 세포 (w/wo 886 과발현)를 동시 형질 감시킨 결과이고 (루시퍼라제 플라스미드를 0 시간의 시간에 형질 감염 시켰고, SeV 및 RSV은 9시간 형질 감염시켰고, assay는 24시간에 완료되었음), D 및 E는 293 세포, w/wo 886 과발현을 IFN ISRE 부위의 다량 화제 및 내부 루시퍼라제 제어 플라스미드를 함유하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 동시 형질 감염시키고, 형질 감염 15시간 후, 세포를 MOCK 또는 MOI의 1에서 RSV/SeV를 감염 시킨 후, 감염 24시간 후, 세포를 용해시켜 루시퍼라제 활성을 측정하거나 (D), 상층액을 수확하여 RANTES (또한 IRF-3 조절 매개체, E)의 유도를 측정한 결과이다.
도 3은 nc886이 IFN 프로모터의 여러 인자들을 통해 IFN 반응을 유도한다는 것을 보여주는 결과로서, A는 IFNB1 mRNA 발현을 보여주는 결과이고, B는 상기 NF-κB 표적 mRNA는 nc886 발현에 의해 약화되는 것을 보여주는 결과이고, C는 NF-κB의 활성을 보여주는 루시퍼라제를 이용하여 NF-κB의 활성을 확인한 결과이고, D는 IRF3/IRF7-결합 모티프 4개를 보유하는 리포터 플라즈미드를 사용하여 루시퍼라제를 확인한 결과이고, E 및 F는 IRF3의 활성형태인 phospho-IRF3를 측정한 결과 nc886을 발현시키는 경우 그 활성이 감소 nc886을 knock-down시킨 경우 그 활성이 증가함을 확인한 결과이다.
도 4은 PKR이 knock-out되는 경우에는 아데노바이러스 감염시 바이러스 유전자의 발현이 증가하며, 이 유전적 배경하에서 nc886도 knock-out되면 발현이 감소한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 5은 nc886 존재 하에 암세포를 죽이는 활성(oncolytic effect)이 증가한다는 것을 보여주는 결과이다.
이하에서 본 발명을 더 자세하게 설명한다.
본 발명의 nc886은 바이러스 복제를 촉진하며, 예컨대, 암살상 바이러스를 이용하여 암을 치료함에 있어서, 이의 치료효과를 증진시키는 효과가 있다.
본 발명은 nc886; 또는 이의 활성화제를 이용하여, 바이러스 생산 증진시킬 수 있다. 특히, 바이러스의 생산에 있어서, nc886; 또는 이의 활성화제를 추가하여, 바이러스를 안정적으로 생산할 수 있다.
C형 간염 바이러스의 복제는 일부 간세포주에서 이루어진다. 본 발명자들은 C형 간염 바이러스 (HCV)의 복제가 가능한 Huh7 계열의 간세포주 (Huh7, Huh7.5, FT3-7)의 경우 nc886의 발현 수준이 1차 간세포에서만큼 높은 반면에 HCV 복제가 되지 않은 간 세포주인 HepG2 및 Hep3B에서는 침묵한다는 것을 발견하였다 (도 1A). 이에 HCV 복제에서 nc886의 역할을 확인하기 위해, 안티 센스 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 Huh7.5 세포주에서 nc886을 knock-down 시킨 결과, nc886이 knock-down된 세포에서는 PKR이 활성화 되었다. HCV의 mRNA 및 단백질량 또한 감소한다는 것을 관찰하였고, 이 결과로부터 nc886이 HCV의 복제에 필수적임을 확인하였다 (도 1B 및 도 1D). nc886이 다른 종류의 바이러스에도 효과가 있는지 확인하기 위해, 센다이 바이러스 (SeV), 호흡기 세포 바이러스 (RSV), 아데노바이러스를 이용하여 추가로 실험하였다. nc886를 발현하도록 한 293T 세포에 RSV 및 SeV를 감염시킨 결과, 바이러스의 증식이 증가하는 것을 확인하였다 (도 1E-F). 나아가 nc886을 CRISPR-Cas 기술로 결실시킨 Nthy-ori 3-1 세포에서 아데노바이러스의 증식이 유의하게 감소한다는 것을 확인하였다 (도 1G).
HCV는 positive-sense RNA 바이러스, SeV와 RSV는 negative sense RNA 바이러스, 아데노바이러스는 이중나선 DNA 바이러스이며, 따라서 바이러스 유전자 발현 및 복제 기작이 모두 다 다르다. 다양한 바이러스들의 증식이 모두 nc886에 의해 촉진되었음을 관찰했으며 따라서 nc886이 광범위한 범위의 바이러스들의 복제를 촉진할 가능성이 높으므로, 숙주의 타고난 면역 반응 억제가 nc886의 pro-viral의 역할을 위한 기작이라는 가설을 세웠다. 이를 확인하기 위해 1차 숙주 방어에 중요한 인터페론-β (interferon-β; IFN-β) 신호에 대한 nc886의 효과를 조사하였다. IFN-β는 3개의 AP-1, IRF 및 NF-κB라는 3가지의 조절 요소에 대한 결합 부위를 포함 한다 (도 2A). 폴리 IC (인터페론 생산을 촉진하는 합성 리보핵산)의 형질감염은 IFN-β의 mRNA 발현을 유도하는 반면에 nc886이 존재할 때에는 IFN-β의 mRNA 발현이 감소하였다 (도 2B). IFN-β 프로모터는 nc886을 발현하지 않는 대조군 세포주인 293T에서 폴리 IC, SeV, RSV의 감염에 의해 활성화되며, 활성화되는 정도가 nc886을 발현하도록 제작한 293T세포에서는 감소하였다 (도 2C). IFN-β 신호 경로에서 ISGs의 전사 활성화는 인터페론-자극 응답 요소 (ISRE)에 의해 매개되었다. ISRE를 이용하여 루시퍼라제 발현을 측정한 결과, IRSE 루시퍼라제는 IFN-β 루시퍼라제와 유사한 결과를 보였다 (도 2D). 이를 통해 nc886이 IFN-β 의 신호를 억제하는 것을 확인하였다. IFN-β이외에도 RANTES와 같은 케모카인 생산에 상기 IFN-β 프로모터의 3개의 조절 요소인 AP-1, IRF 및 NF-κB이 필요하고, nc886은 RSV의 감염 시 RANTES의 유도를 억제하는 것을 확인하였다 (도 2E).
IFN-β 프로모터의 결합하는 세 개의 유전자인 NF-κB, AP-1 및 IRF (도 2A)의 기여도를 평가하였다. 폴리 IC를 형질 감염시킨 결과, IFN-β 프로모터를 활성화 시켰고, 상기 활성화는 nc886에 의해 상당히 약화됨. 이와 비교하여 구조적으로 활성화 상태인 phospho-mimetic IRF3 [= IRF3(5D)] 돌연변이를 형질 감염시킨 경우에도 IFN-β 프로모터가 활성되었고, 상기 활성화도 역시 nc886에 의해 역시 감소되었다. 활성화 상태의 IRF3를 도입하였으므로, 이 조건에서 nc886에 의해 감소된 결과는 nc886이 NF-kB와 AP-1를 억제해서라고 해석해야 하며, 따라서 NF-kB와 AP-1의 기여도가 있음을 증명하였다 (도 3A). 이를 뒷받침하는 실험으로서 NF-κB 표적 mRNA의 발현을 폴리 IC로 유도하였고, 상기 NF-κB 표적 mRNA는 nc886 발현에 의해 약화됨을 관찰하였다 (도 3B). NF-κB의 활성을 보여주는 루시퍼라제를 이용하여, RSV를 293T:벡터 (대조군 세포주) 및 293T:nc886 (nc886을 발현하는 세포)에 감염시킨 결과, 293T:nc886 (nc886을 발현하는 세포)의 NF-κB의 활성이 감소하는 것으로 확인되었다 (도 3C). nc886이 IRF3 요소도 억제하는지 확인하기 위해, IRF3/IRF7-결합 모티프 4개를 보유하는 리포터 플라즈미드를 사용하여 루시퍼라제를 측정하였다. 상기 플라즈미드는 폴리 IC에 의해 활성화 되고, 상기 활성화는 nc886에 의해 감소되었다 (도 3D). IRF3 (5D)에 의해 상기 프로모터를 활성화한 결과, 이미 활성화 상태의 돌연변이인 IRF3(5D)는 nc886의 영향을 받지 않아 293T:벡터와 293T:886 사이에서 똑같이 유도하는 것을 확인하였다. IRF3의 활성형태인 phospho-IRF3를 측정한 결과, nc886을 발현시키는 경우 그 활성이 감소, nc886을 knock-down시킨 경우 그 활성이 증가함을 확인하였다 (도 3E 및 3F). 따라서 IRF 경로도 nc886이 억제함을 증명하였다. 결론적으로 NF-kB, AP-1, IRF 세가지 요소가 모두 nc886에 의해 조절된다는 것을 증명하였으며 이들은 PKR 이외에도 여러 경로에 의하여 조절된다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서 상기 바이러스는 아데노바이러스(Adenoviridae), 플라비비리데(Flaviviridae), 뉴모비리데 (Pneumoviridae) 또는 파라믹소바이러스 (Paramyxoviridae) 과에 속하는 바이러스일 수 있고, 바람직하게는 아데노바이러스(Adeno virus), 센다이 바이러스(Sendai virus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus) 또는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)일 수 있다.
본 발명은 nc886; 또는 이의 활성화제를 포함하는, 암살상 바이러스 치료제의 활성증진용 조성물을 제공할 수 있다.
Adenovirus의 증식에서 PKR 및 nc886의 역할을 조사하였다. 야생형의 adenovirus를 감염시킨 뒤, 8시간 후 세포를 수확하고 RNA를 분리한 후 adenovirus로 부터 전사된 RNA 중 early gene인 E1B와 intermediate phase gene인 VA I을 측정하였으며, 세포에서 발현되는 18S rRNA를 loading control로 함께 측정하였다. PKR을 CRISPR-Cas 방법으로 결실시킨 (lane 1-2) 세포는 야생형 (lane 5-6) 세포와 비교하였을 때 E1B과 VA I의 발현이 증가하는 것을 관찰하였으며, PKR이 항바이러스 단백질임을 확인하였다. nc886이 PKR을 억제하여 adenovirus 증식을 촉진시키는지 알아보기 위하여 PKR이 결실된 상태에서 nc886을 결실시켜서 관찰하였으며, 위 가설이 사실이라면 PKR 결실된 세포에서는 nc886이 PKR을 억제할 필요가 없으므로, nc886이 결실되어도 영향이 없으리라 예측하였다. 하지만 nc886까지 결실된 경우에는 E1B과 VA I의 발현이 확연히 감소하는 것을 확인하였다 (도 4) 이는 nc886이 adenovirus 증식에 필요함을 증명한 결과이며, 그 기전이 PKR 억제활성과는 별개임을 보여주는 결과이다.
adenovirus는 세포에서 증식 후 밖으로 방출될 때 세포를 죽이는 암살상 바이러스 (oncolytic virus) 중에 하나이다. nc886과 암살상 바이러스인 adenovirus와의 관계를 확인하기 위해, nc886을 발현하지 않는 대조군 세포주인 293T.U6와 nc886을 발현하는 세포주인 293T.U6:nc886에 야생형의 adenovirus를 감염시킨 결과, nc886을 발현하는 세포에서 세포 생존률이 더 낮은 것을 확인하였다 (도 5). 이를 통해 nc886 존재 하에 종양 용해(oncolysis)가 더 많이 일어나는 것을 확인하였고, 이를 이용하여 암살상 바이러스의 활성 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암살상 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 레오바이러스(reovirus) 또는 뉴캐슬병바이러스(newcastle disease virus)일 수 있다. 암살상 바이러스(oncolytic virus)는 암세포에서 잘 증식하며, 세포를 파괴한다. 지만 일부 세포에서는 nc886이 침묵되어 있으며, 본 발명에서 얻어진 정보에 의하면 이러한 암세포에서는 바이러스 증식이 감소되므로 암살상 바이러스가 잘 작동하지 않는다. 이 경우 nc886을 바이러스와 같이 투여하면 oncolytic 효율을 증대시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 nc886; 또는 이의 활성화제; 및 바이러스 치료제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이러스 치료제는 암살상 바이러스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 모든 바이러스 및 이의 용도가 본 발명의 권리범위에 속함은 명확하다. 상기 암살상 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 레오바이러스(reovirus), 또는 뉴캐슬병바이러스(newcastle disease virus)일 수 있다. 상기 암은 유방암, 피부암, 골암, 전립선암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암 또는 기관지암일 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 암살상 바이러스 치료제에 있어서 암살상 바이러스 치료 보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다:
(a) nc886를 발현하는 세포에 시험물질 및 항암 바이러스를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 nc886의 발현 정도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 상기 nc886의 발현을 증가시킨 시험물질을 항암 바이러스 보조제 후보물질로 판단하는 단계.
상기 암살상 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 레오바이러스(reovirus) 또는 뉴캐슬병바이러스(newcastle disease virus)일 수 있다.
본 발명은 nc886의 발현 억제제를 포함하는 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스는 Adenoviridae, 플라비비리데(Flaviviridae), 뉴모비리데 (Pneumoviridae) 또는 파라믹소바이러스 (Paramyxoviridae) 과에 속하는 바이러스과에 속하는 바이러스 일 수 있고, 상기 바이러스는 센다이 바이러스(Sendai virus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus) 또는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)일 수 있다. nc886는 이중가닥 DNA 바이러스, positive strand 단일가닥 RNA 바이러스 및 negative strand 단일 가닥 RNA 바이러스에서 모두 바이러스 증식을 촉진 시켰다. 상기 nc886의 발현 억제제는 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 nc886의 발현 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 nc886에 대한 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1의 염기서열은 5‘UCGAACCCCAGCACAGAGAU-3’일 수 있다. 상기 5‘UCGAACCCCAGCACAGAGAU-3’중에 각각의 말단 5nt는 2′-O-methoxy기로 치환된 뉴클레오티드일 수 있다. 즉 5‘UCGAACCCCAGCACAGAGAU-3’는 ribonucleotide이고, 5‘UCGAACCCCAGCACAGAGAU-3’은 deoxy-ribonucleotide일 수 있다. 염기와 염기 사이는 phosphorothioate backbone 으로 변형되었다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 바이러스 감염의 치료를 위한 후보물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다:
(a) nc886를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 nc886의 발현 정도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질이 상기 마이크로RNA의 발현을 감소시키는 경우, 바이러스 감염의 치료를 위한 후보물질로 판단하는 단계.
본 발명에 있어서 상기 바이러스는 플라비비리데(Flaviviridae), 뉴모비리데 (Pneumoviridae) 또는 파라믹소바이러스 (Paramyxoviridae) 과에 속하는 바이러스일 수 있고, 상기 바이러스는 센다이 바이러스(Sendai virus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus) 또는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 세포주, 바이러스 및 항체
HEp-2 cells은 ATCC에서 구입하였으며, 문헌[Bao,X. et al., Virology., 408, 224-231 (2010)]에서 설명한 바와 같이 유지하였다. 센다이 바이러스는 harles River Laboratories, Inc에서 구입하였다. RST long strain은 HEp-2 세포에서 37℃에서 증식 시켰고, 문헌[Ren,J. et al., J. Gen. Virol., 92, 2153-2159 (2011)]에서 기재되어 있는 방법과 같이 설탕 기울기(sucrose gradient)로 정제하였다. Nthy-ori-3-1로부터 PKR과 nc886의 발현을 CRISPR-cas 기술로 결실시킨 세로주를 제작하고 (Oncotarget. 2016 Nov 15;7(46):75000-75012. doi: 10.18632/oncotarget.11852. LEE EK et al.) 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin 항생제를 포함한 RPMI 배지에서 유지하였다. 바이러스 역가 (Viral titer)는 앞에서 설명한 바와 같이, polyclonal biotin-conjugated goat anti-RSV 항체 (Cat #: 7950-0104, Bio-rad)와 스트렙타아비딘 퍼옥시다아제 폴리머 (streptavidin peroxidase polymer; Cat#: S2438, Sigma-Aldrich)를 순차적으로 사용하여 HEp-2 세포에서 면역 염색으로 결정하였다. β-actin에 대한 단일 클론 항체(Cat # A1978)는 Sigma에서 구입하였다. HEK-293T 세포 (American Type Culture Collection)를 10% 소 태아 혈청 및 1% Antibiotic-Antimycotic을 포함하는 DMEM 배지을 이용하여 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다. 상기 HEK-293T 세포에 pLPCX 벡터에서 U6 프로모터를 삽입하여 플라스미드 "pLPCX-U6" 및 nc886 발현 플라스미드 "pLPCX-U6-pre-886"를 제조하였다. 293T세포는 nc886 발현이 침묵한 세포주이며, 이 세포주에 nc886을 인위적으로 발현시킨 세포주가 293T.U6:nc886이며 이 세포주를 만들 때 empty vector로 제작한 대조군 세포주가 293T.U6이다 (RNA. 2011 Jun;17(6):1076-89. doi: 10.1261/rna.2701111. Epub 2011 Apr 25. PMID:21518807. Lee K. et al.) 아데노바이러스는 type 5 야생형 바이러스이며 스페인의 Dr. Alemany 실험실에서 분양받았으며, HEK-293 세포에서 증식시킨 후 표준의 염화세슘방법 (https://bio-protocol.org/bio101/e201)으로 정제하였다. 바이러스 역가 (Viral titer)는 HEK-293 및 HEK-293FT 세포에 감염시킨 후 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 염색방법으로 결정하였다.
실시예 2. 리포터 유전자 분석법 (Reporter gene assay)
IFN-β 프로모터를 포함하는 플라스미드, 루시퍼라제 리포터 유전자에 연결 되어 있는 IFN-β 프로모터의 ISRE 부위의 다중 카피본을 포함하는 플라스미드를 문헌[Jeon SH et al., FEBS Lett., 21; 586(19) : 3477-84 2012 Sep]에 전술한 바와 같이 세포내로 형질 감염시켰다. 대수적으로 성장하는 293 세포를 문헌 [Lee K et al. RNA., 17(6):1076-89., 2011 Jun]에 기술된 바와 같이 FuGene 6((Roche, Indianapolis, IN)을 사용하여 리포터 플라스미드로 3 배 형질 감염시켰다. 형질 도입 15 시간 후, 세포를 폴리 IC로 처리하거나 SeV 또는 RSV로 2시간 및 15시간 동안 각각 감염시켰다. 루시퍼라제는 내부 대조군 Rr 활성(internal control Rr activity)에 대해 정상화되었다.
실시예 3. HCV 실험
Huh7.5 세포를 10 % FBS, 1 % MEM 비 필수 아미노산 용액, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎎/㎖ 스트렙토마이신(GIBCO)으로 보충된 DMEM에서 성장시켰다. Huh7.5 세포를 6웰 플레이트에 3 x 105/웰로 접종하고 밤새 배양 하였다. Huh7.5 세포를 HCV JFH1(104 FFU/ml) 상등액으로 감염시키고, PBS로 4시간 동안 2번 PBS로 세척한 후에, HCV JFH1을 제거하기 위해 신선한 배지로 교환하였다. 세포에 100 nM anti-nc886 또는 anti-vtRNA를 15 ul RNAi-MAX으로 형질 감염하였다. 12, 24 및 48 시간의 형질 감염 후에, 세포를 프로테아제/포스파타제 억제제(Thermofisher)를 포함하는 RIPA 완충액(Thermofisher)으로 용해시키고, 13,000 rpm에서 15 분 동안 원심 분리하여 단백질을 포함하는 상등액을 수집하였다. BCA 단백질 분석 키트(23225, Thermofisher)를 사용하여 세포 추출물의 단백질 농도를 측정 하였다. 각각의 샘플에 대해 총 단백질 25㎍을 10 % SDS-PAGE 겔에서 전기 천공(electroporated)시킨 다음 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 멤브레인(membrane)을 5 % 탈지유(skin milk)로 1시간동안 블로킹(blocking)하고, anti-HCV core (MA1-080, Thermo scientific), anti-NS3 (ab65407, abcam), anti-NS5A from Charles Rice, anti-PKR (ab32052, abcam), anti-phpspho-PKR (ab32036) 및 beta-actin (A2228, Sigma)의 1차 항체를 4℃에서 블로킹(blocking)하였다. 다른 바이러스 클론인, Jc1 (107 FFU / ml)을 사용한 것 이외에 상기 서술한 방법과 같이 수행하였다. anti-886 oligo으로 형질감염하고 12, 24, 48 및 72 시간 후,제조자의 지시에 따라 QIAmp 바이러스 RNA 미니 키트 (QIAmp viral RNA mini kit , 52904, Qiagen) 를 사용하여 HCV RNA를 분리 하였다. 정량 실시간 PCR (qRT-PCR) 실험은 IQ5 다중 색상 실시간 PCR 검출 시스템 (IQ5 multicolor Real-time PCR detection system; Bio-rad Laboratories)을 사용하여 수행되었다. 정방향 프라이머:5'-TGCACGGTCTACGAGAC-3' 및 프로브:FAM-5'-CCGGGGCACTCGCAAGCACCC-3'-GMBH 및 역방향 프라이머:5'-GACCCCCCCTCCCGGGAGAG-3' (target siz: 222bp).
실시예 4. RANTES ELISA
ANTES 농도는 상업적 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 제조자의 지침 (R & D system)에 따라 결정되었다.
실시예 5. PCR
nc886은 아데노바이러스 증식을 촉진한다는 것을 확인하기 위해, 세포의 전사 단계에 따른 대표 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 아데노바이러스를 MOI (multiplicity of infection)=5 로 감염시키고 8시간 후 전체 RNA를 TRIzol (15596018, Invitrogen)방법으로 추출하였고, cDNA를 제작하기 위하여 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (R5600, Gendepot)을 사용하였다. 제작된 cDNA에 바이러스 유전자인 E1B 55K, VAI RNA와 대조군으로 사용한 사람의 유전자 18S rRNA을 하기 표 1에 개시된 프라이머 염기서열로 amfiSure PCR Master Mix (2X) (P0311, Gendepot)을 이용하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 하고, agarose gel에 전기 영동하여 확인하였다.
프라이머 염기서열 프라이머 이름
CTGCGAGTGTGGCGGTAAACATAT E1B_55k_3377-400
CTTCATCGCTAGAGCCAAACTCAG E1B_55k_3498-75
GGGCACTCTTCCGTGGTC VAI_10620-37
TTGTCTGACGTCGCACACCTG Ad_VAI_142-22
CGGCTTTGGTGACTCTAGAT 18S rRNA 281-300
GCGACTACCATCGAAAGTTG 18S rRNA 381-362
실시예 6. 세포의 생존 능력 측정
아데노바이러스를 그림에 표시된 세포주에 MOI (multiplicity of infection) = 5 로 감염시키고 42시간 후 세포의 생존을 측정하였다. 생존 정도는능력 분석은 CellTiter 96®One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (G3581, Promega)를 이용하여 분석하였다
실시예 7. nc886은 바이러스 복제를 촉진한다
C형 간염 바이러스의 복제는 일부 간세포주에서 이루어진다. 본 발명자들은 C형 간염 바이러스 (HCV)의 복제가 가능한 Huh7 계열의 간세포주 (Huh7, Huh7.5, FT3-7)의 경우 nc886의 발현 수준이 1차 간세포에서만큼 높은 반면에 HCV 복제가 되지 않은 간 세포주인 HepG2 및 Hep3B에서는 침묵한다는 것을 발견하였다 (도 1A). 이에 HCV 복제에서 nc886의 역할을 확인하기 위해, 안티 센스 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 Huh7.5 세포주에서 nc886을 knock-down 시킨 결과, nc886이 knock-down된 세포에서는 PKR이 활성화 되었다. HCV의 mRNA 및 단백질량 또한 감소한다는 것을 관찰하였고, 이 결과로부터 nc886이 HCV의 복제에 필수적임을 확인하였다 (도 1B 및 도 1D). nc886이 다른 종류의 바이러스에도 효과가 있는지 확인하기 위해, 센다이 바이러스 (SeV), 호흡기 세포 바이러스 (RSV), 아데노바이러스를 이용하여 추가로 실험하였다. nc886를 발현하도록 한 293T 세포에 RSV 및 SeV를 감염시킨 결과, 바이러스의 증식이 증가하는 것을 확인하였다 (도 1E-F). 나아가 nc886을 CRISPR-Cas 기술로 결실시킨 Nthy-ori 3-1 세포에서 아데노바이러스의 증식이 유의하게 감소한다는 것을 확인하였다 (도 1G).
실시예 8. nc886은 인터페론 반응을 길항 한다
HCV는 positive-sense RNA 바이러스, SeV와 RSV는 negative sense RNA 바이러스, 아데노바이러스는 이중나선 DNA 바이러스이며, 따라서 바이러스 유전자 발현 및 복제 기작이 모두 다 다르다. 다양한 바이러스들의 증식이 모두 nc886에 의해 촉진되었음을 관찰했으며 따라서 nc886이 광범위한 범위의 바이러스들의 복제를 촉진할 가능성이 높으므로, 숙주의 타고난 면역 반응 억제가 nc886의 pro-viral의 역할을 위한 기작이라는 가설을 세웠다. 이를 확인하기 위해 1차 숙주 방어에 중요한 인터페론-β (interferon-β; IFN-β) 신호에 대한 nc886의 효과를 조사하였다. IFN-β는 3개의 AP-1, IRF 및 NF-κB에 대한 결합 부위를 포함 한다 (도 2A). 폴리 IC (인터페론 생산을 촉진하는 합성 리보핵산)의 형질감염은 IFN-β의 mRNA 발현을 유도하는 반면에 nc886이 존재할 때에는 IFN-β의 mRNA 발현이 감소하였다 (도 2B). IFN-β 프로모터는 nc886을 발현하지 않는 대조군 세포주인 293T에서 폴리 IC, SeV, RSV의 감염에 의해 활성화되며, 활성화되는 정도가 nc886을 발현하도록 제작한 293T세포에서는 감소하였다 (도 2C). IFN-β 신호 경로에서 ISGs의 전사 활성화는 인터페론-자극 응답 요소 (ISRE)에 의해 매개되었다. ISRE를 이용하여 루시퍼라제 발현을 측정한 결과, IRSE 루시퍼라제는 IFN-β 루시퍼라제와 유사한 결과를 보였다 (도 2D). 이를 통해 nc886이 IFN-β 의 신호를 억제하는 것을 확인하였다. IFN-β이외에도 RANTES와 같은 케모카인 생산에 상기 IFN-β 프로모터의 3개의 조절 요소인 AP-1, IRF 및 NF-κB이 필요하고, nc886은 RSV의 감염 시 RANTES의 유도를 억제하는 것을 확인하였다 (도 2E).
실시예 9. Nc886은 PKR 억제를 통해 IFN-β 프로모터를 억제 한다
IFN-β 프로모터의 결합하는 세 개의 유전자인 NF-κB, AP-1 및 IRF (도 2A)의 기여도를 평가하였다. 폴리 IC를 형질 감염시킨 결과, IFN-β 프로모터를 활성화 시켰고, 상기 활성화는 nc886에 의해 상당히 약화됨. 이와 비교하여 구조적으로 활성화 상태인 phospho-mimetic IRF3 [= IRF3(5D)] 돌연변이를 형질 감염시킨 경우에도 IFN-β 프로모터가 활성되었고, 상기 활성화도 역시 nc886에 의해 역시 감소되었다. 활성화 상태의 IRF3를 도입하였으므로, 이 조건에서 nc886에 의해 감소된 결과는 nc886이 NF-kB와 AP-1를 억제해서라고 해석해야 하며, 따라서 NF-kB와 AP-1의 기여도가 있음을 증명하였다 (도 3A). 이를 뒷받침하는 실험으로서 NF-κB 표적 mRNA의 발현을 폴리 IC로 유도하였고, 상기 NF-κB 표적 mRNA는 nc886 발현에 의해 약화됨을 관찰하였다 (도 3B). NF-κB의 활성을 보여주는 루시퍼라제를 이용하여, RSV를 293T:벡터 (대조군 세포주) 및 293T:nc886 (nc886을 발현하는 세포)에 감염시킨 결과, 293T:nc886 (nc886을 발현하는 세포)의 NF-κB의 활성이 감소하는 것으로 확인되었다 (도 3C). nc886이 IRF3 요소도 억제하는지 확인하기 위해, IRF3/IRF7-결합 모티프 4개를 보유하는 리포터 플라즈미드를 사용하여 루시퍼라제를 측정하였다. 상기 플라즈미드는 폴리 IC에 의해 활성화 되고, 상기 활성화는 nc886에 의해 감소되었다 (도 3D). IRF3 (5D)에 의해 상기 프로모터를 활성화한 결과, 이미 활성화 상태의 돌연변이인 IRF3(5D)는 nc886의 영향을 받지 않아 293T:벡터와 293T:886 사이에서 똑같이 유도하는 것을 확인하였다. IRF3의 활성형태인 phospho-IRF3를 측정한 결과, nc886을 발현시키는 경우 그 활성이 감소, nc886을 knock-down시킨 경우 그 활성이 증가함을 확인하였다 (도 3E 및 3F). 따라서 IRF 경로도 nc886이 억제함을 증명하였다. 결론적으로 NF-kB, AP-1, IRF 세가지 요소가 모두 nc886에 의해 조절된다는 것을 증명하였으며 이들은 PKR 이외에도 여러 경로에 의하여 조절된다고 알려져 있다.
실시예 10. nc886은 아데노바이러스 증식을 촉진한다
아데노바이러스의 복제는 세포 표면에 Coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR)를 발현하는 거의 모든 세포에 감염이 되며, 복제가 일어날 수 있다. 일반적으로 아데노바이러스는 감염 후 바이러스 유전자를 발현시키는 반면에 숙주세포는 PKR이라는 방어체계를 이용하여 증식을 조절하는 것으로 알려져있다. PKR을 결실시킨 Nthy-ori-3-1세포에서 바이러스 감염 후 바이러스 유전자 E1B 55K와 VA I의 RNA발현이 모세포에 비하여 증가되는 결과를 얻었고 (도 4의 lane 6과 2를 비교). nc886/PKR 둘 다 KO된 세포에서는 E1B와 VAI의 발현이 현저히 감소하였다 (도 4의 lane 6과 4를 비교). 이 결과는 nc886이 AdV의 증식에 필요하다는 것을 증명한다. 더불어 이 세포주는 nc886 뿐 아니라 PKR도 KO되어 있으므로, nc886이 AdV의 증식에 필요한 이유가 PKR을 억제하는 것이 아닌 다른 기작에 의함을 나타낸다.
실시예 11. nc886은 아데노바이러스에 의한 세포사멸을 촉진한다
293T.U6:nc886는 정상적인 세포배양 상황에서 293T.U6보다 약간 늦게 성장한다. 아데노바이러스의 감염 후에는 nc886 발현 293T의 생존이 큰폭으로 감소된 것을 확인하였다 (도 5). 아데노바이러스는 증식 후 감염된 세포에서 나올때 때 세포용해(oncolysis)를 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 위 RT-PCR 결과와 더불어, nc886발현 세포에서 아데노바이러스 유전자의 발현이 증가하여, 바이러스 증식이 촉진되며, 따라서 세포사멸이 더 잘 된다는 결론을 내릴 수 있다.

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