KR102536297B1 - 식물체의 오메가 3 지방산 함량 증가 방법 - Google Patents

식물체의 오메가 3 지방산 함량 증가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열에서 서열번호 1의 서열에서 123번 및 124번 위치에 대응되는 위치의 세린이 각각 아르기닌 및 류신으로 치환되거나, 서열번호 1의 서열에서 416번 위치에 대응되는 위치의 트립토판이 시스테인으로 치환되고 419번 위치에 대응되는 위치의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계; 또는 대상 식물체의 DGAT1 유전자에서 서열번호 2의 서열에서 146번 내지 226번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키거나; 서열번호 2의 서열에서 147번 내지 212번 위치 또는 156번 내지 212번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키고, 그 위치에 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계를 포함하여 오메가 3 지방산의 함량을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물체의 오메가 3 지방산 함량 증가 방법 {METHOD FOR INCREASING THE CONTENT OF OMEGA 3 FATTY ACIDS IN PLANTS}
본 발명은 식물체의 오메가 3 지방산 함량 증가 방법에 관한 것이다.
오메가 3 지방산은 탄소 사슬 끝에서 세 번째 탄소 원자에 이중 결합을 갖는 다중 불포화지방산 (polyunsaturated fatty acid)으로, 주로 생선류의 기름에 존재하고 들깨 등의 식물에도 존재하는 것으로 알려져 있다. 인간 생리에 관여하는 주요 오메가 3 지방산은 알파-리놀레산 (α-linoleic acid), 에이코사펜타엔산 (eicosapentaenoic acid ; EPA), 도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid ; DHA)이며, 지단백질 대사 개선 (혈중 지질 수치 개선), 심혈관 질환 억제 및 개선, 고혈압 개선, 면역계 조절, 안구·생식기 및 신경계 발달 및 기능에 작용 등의 생리활성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
Diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)은 식물 종자 내 endoplasmic reticulum membrane 에서 TAG 합성을 담당하는 마지막 효소로, diacylglycerol (DAG)에 Acyl기를 하나 추가하여 TAG를 합성한다. 기존에는 DGAT1를 식물에 과발현시켜 종자 지방함량을 증진시켜 왔다.
지구 온난화에 대항하여 대체에너지와 탄소 배출량 감소가 동시에 요구되는 현대 사회의 특성에 따라서 농경지 증가가 아닌 식물 지방생성 효율 증대가 필요하다. 이에 따라 효율이 증대된 DGAT1과 관련된 연구 개발이 요구된다.
한국공개특허 제 10-1701129호
본 발명의 목적은 DGAT1은 식물 종자 지방 합성에 관여하는 마지막 단계의 효소라고 할 수 있는 것으로, 식물 간에 보존된 영역이 존재하는 DGAT1의 특성상 다른 식물, 특히 유지 작물에서도 동일하게 적용하여 종자 지방의 지방산 조성을 변화시키거나 지방 함량 증진에 활용하기 위함에 있다.
1. 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열에서 서열번호 1의 서열에서 123번 및 124번 위치에 대응되는 위치의 세린이 각각 아르기닌 및 류신으로 치환되거나, 서열번호 1의 서열에서 416번 위치에 대응되는 위치의 트립토판이 시스테인으로 치환되고 419번 위치에 대응되는 위치의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계; 또는
대상 식물체의 DGAT1 유전자에서 서열번호 2의 서열에서 146번 내지 226번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키거나; 서열번호 2의 서열에서 147번 내지 212번 위치 또는 156번 내지 212번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키고, 그 위치에 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계;를 포함하는,
식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 치환은 유전자 가위를 사용하여 수행되는 식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 결실은 유전자 가위를 사용하여 수행되는 식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법.
4. 위 1의 식물체의 형질전환된 종자.
본 발명의 식물체의 오메가 3 지방산 함량을 증가시키는 방법을 통해, 기존의 오메가 3 지방산 함량보다 더 높은 함량으로 오메가 3 지방산을 포함하도록 하는 식물을 개발할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법을 통해 오메가 3 지방산 함량이 증가된 식물체의 형질전환된 종자를 얻을 수 있다.
도 1은 애기장대 DGAT1의 단백질 서열을 이용하여 구조를 예측하고, 7개의 주요 Domain들을 표시한 것이다. 빨간 박스는 효소의 기능적 측면을 담당하는 것이고, 녹색으로 표시된 부분은 효소의 조절을 담당하는 것이다.
도 2A는 sgRNA insert를 만드는데 사용한 Annealing method와 CBE, ABE 벡터에 Ligation하기까지 과정을 간략하게 나타낸 것이고, 도 2B는 클로닝이 완료된 52개의 콜로니를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Cas9 매개 DGAT1 N-terminal in-frame deletion의 과정을 간략하게 그림으로 나타낸 것이다. 사용된 벡터는 pHEE401E_UBQ_Bar로 단일 Cas9 벡터에서 두 개의 서로 다른 sgRNA를 클로닝하고, 두 개의 sgRNA-scaffold 복합체를 식물체 내에서 적용하였다.
도 4A는 DGAT1 염기교정(BE) 및 N-terminal in-frame deletion 개체의 선별과정을 그림으로 나타낸 것이고, 도 4B는 세대 진전에 따른 DNA 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. 도 4A의 마지막 단계인 가스 크로마토그래피는 homozygous line이 출현한 마지막 세대에서만 진행되었다.
도 5A는 애기장대 DGAT1과 염기가 치환된 돌연변이 DGAT1의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 순서대로 AtDGAT1(야생형 애기장대), D1-1 개체, D1-2 개체, D3-1 개체, D5-1 개체, D5-2 개체, CsDGAT1-A(양구슬냉이), CsDGAT1-B(양구슬냉이), CsDGAT1-C(양구슬냉이), BnDGAT1(유채), GmDGAT1C(대두), AhDGAT1(땅콩), RcDGAT1(피마자) 개체의 DGAT1 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 이를 통해, 돌연변이에서 치환된 모든 부위의 아미노산 서열이 식물 DGAT1에서 모두 보존되어 있음을 알 수 있다. 도 5B는 정성적 분석 결과를 지방산 조성의 비교 그래프로 나타낸 것이고, 도 5C는 정량적 분석 결과를 지방(Fatty acid methyl esters (FAME)) 함량 비교 그래프로 나타낸 것이다.
도 6A는 야생형(WT) 염기서열과 D5-1 염기 치환 부위를 비교한 것이고, 도 6B는 야생형(WT) 염기서열과 D5-2 염기 치환 부위를 비교한 것이다. 도 6C는 야생형 애기장대 DGAT1의 DAG binding motif를 포함하는 일부 아미노산 서열을 비교한 것이다. D5-1 및 D5-2은 염기치환으로 아미노산 치환된 라인이고, CsDGAT1-A-C은 양구슬냉이 DGAT1, BnDGAT1은 유채 DGAT1, GmDGAT1C은 대두 DGAT1, AhDGAT1은 땅콩 DGAT1, RcDGAT1은 피마자 DGAT1 서열을 나타낸 것이다.
도 7은 각 개체 별 DGAT1의 유전자의 일부 서열을 비교한 것으로, 왼쪽과 오른쪽에 쓰여진 숫자는 각 개체 DGAT1 유전자 서열의 전체 길이에서 표시된 부분 서열의 양 끝을 나타내는 것이다. D5-1 및 D5-2은 염기치환 라인이고, CsDGAT1-A-C은 양구슬냉이 DGAT1, BnDGAT1은 유채 DGAT1, GmDGAT1C은 대두 DGAT1, AhDGAT1은 땅콩 DGAT1, RcDGAT1은 피마자 DGAT1 염기서열을 나타낸 것이다.또한, CBE6은 해당 부위를 치환하는데 사용한 sgRNA의 이름을 의미한다 (표1 참고).
도 8A는 야생형(WT) 염기서열과 D1-1 염기 치환 부위를 비교한 것이고, 도 8B는 야생형(WT) 염기서열과 D1-2 염기 치환 부위를 비교한 것이다. 도 8C는 야생형 애기장대 DGAT1의 Acyl-CoA motif를 포함하는 일부 아미노산 서열을 비교한 것이다. D5-1 및 D5-2은 염기치환으로 아미노산 치환된 라인이고, CsDGAT1-A-C은 양구슬냉이 DGAT1, BnDGAT1은 유채 DGAT1, GmDGAT1C은 대두 DGAT1, AhDGAT1은 땅콩 DGAT1, RcDGAT1은 피마자 DGAT1 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 각 개체 별 DGAT1의 유전자의 일부 서열을 비교한 것으로, 왼쪽과 오른쪽에 쓰여진 숫자는 각 개체 DGAT1 유전자 서열의 전체 길이에서 표시된 부분 서열의 양 끝 위치를 의미한다. D1-1 및 D1-2은 염기치환 라인이고, CsDGAT1-A-C은 양구슬냉이 DGAT1, BnDGAT1은 유채 DGAT1, GmDGAT1C은 대두 DGAT1, AhDGAT1은 땅콩 DGAT1, RcDGAT1은 피마자 DGAT1 염기서열을 나타낸 것이다.또한, CBE2은 해당 부위를 치환하는데 사용한 sgRNA의 이름을 의미한다 (표 1 참고).
도 10A는 야생형(WT) 염기서열과 D3-1 염기 치환 부위를 비교한 것이고, 도 10B는 야생형 애기장대 DGAT1의 thioesterase 부위를 포함하는 일부 아미노산 서열을 비교한 것이다. D3-1은 염기치환으로 아미노산 치환된 라인이고, CsDGAT1-A-C은 양구슬냉이 DGAT1, BnDGAT1은 유채 DGAT1, GmDGAT1C은 대두 DGAT1, AhDGAT1은 땅콩 DGAT1, RcDGAT1은 피마자 DGAT1 서열을 나타낸 것이다.
도 11은 각 개체 별 DGAT1의 유전자의 일부 서열을 비교한 것으로, 왼쪽과 오른쪽에 쓰여진 숫자는 각 개체 DGAT1 유전자 서열의 전체 길이에서 표시된 부분 서열의 양 끝 위치를 의미한다. D3-1은 염기치환 라인이고, CsDGAT1-A-C은 양구슬냉이 DGAT1, BnDGAT1은 유채 DGAT1, GmDGAT1C은 대두 DGAT1, AhDGAT1은 땅콩 DGAT1, RcDGAT1은 피마자 DGAT1 염기서열을 나타낸 것이다.또한, ABE3은 해당 부위를 치환하는데 사용한 sgRNA의 이름을 의미한다 (표 1 참고).
도 12은 야생형 애기장대, D7c-1 개체, D7c-2h 개체에서 결실되는 부분 및 sgRNA가 작용하는 부분을 표시한 것이다. D7c-1 개체의 경우 서열번호 2의 146번 내지 226번에 해당하는 위치의 염기서열이 제거되었다. 이 제거는 해당 유전자의 번역 프레임에 영향을 주지 않아서 이후의 서열이 야생형 애기장대와 같다. 반면, D7c-2h 개체의 경우 이형 접합체로, 상동유전체 한 쌍에 포함된 각각의 DGAT1 유전자가 서열번호 2의 156번에 대응되는 위치와 147번에 대응되는 위치부터 결실되어 형태가 다르게 나타난다. 추가로 임의의 염기서열이 한 개 삽입되어 프레임에 변화가 일어나 얼리스탑되었다.
도 13는 D7c 개체들의 치환된 지방산 조성을 분석하여 비교 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 D7c 개체들의 지방 함량을 비교하여 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열에서 서열번호 1의 서열에서 123번 및 124번 위치에 대응되는 위치의 세린이 각각 아르기닌 및 류신으로 치환되거나, 서열번호 1의 서열에서 416번 위치에 대응되는 위치의 트립토판이 시스테인으로 치환되고 419번 위치에 대응되는 위치의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계; 또는 대상 식물체의 DGAT1 유전자에서 서열번호 2의 서열에서 146번 내지 226번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키거나; 서열번호 2의 서열에서 147번 내지 212번 위치 또는 156번 내지 212번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키고, 그 위치에 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계;를 포함하는 식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 대상 식물체는 DGAT1을 포함하는 식물체면 모두 해당되는 것이고, 예를 들어, 애기장대, 양구슬냉이, 유채, 카멜리나, 대두, 콩, 땅콩, 피마자 등의 오일 작물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 서열번호 1의 서열은 애기장대의 DGAT1 효소의 아미노산 염기 서열을 나타낸 것이고, 서열번호 2의 서열은 애기장대의 DGAT1 효소의 유전자 서열을 나타낸 것이다.
본 발명에서 서열번호 3는 AtDGAT1의 CDS sequence를, 서열번호 4은 D5-2의 CDS sequence를, 서열번호 5는 BnDGAT1의 CDS sequence를, 서열번호 6는 GmDGAT1C의 CDS sequence를, 서열번호 7은 RcDGAT1의 CDS sequence를, 서열번호 8은 AhDGAT1의 CDS sequence를, 서열번호 9은 CsDGAT1-A의 CDS sequence를, 서열번호 10는 CsDGAT1-B의 CDS sequence를, 서열번호 11은 CsDGAT1-C의 CDS sequence를 나타낸 것이다.
또한, 본 발명에서 서열번호 176은 AtDGAT1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 177은 D1-1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 178은 D1-2의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 179는 D3-1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 180은 D5-1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 181은 D5-2의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 182는 CsDGAT1-A의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 183은 CsDGAT1-B의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 184는 CsDGAT1-C의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 185는 BnDGAT1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 186은 GmDGAT1C의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 187은 AhDGAT1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것, 서열번호 188은 RcDGAT1의 DGAT1를 align한 서열을 나타낸 것이다.
본 발명은 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열에서 서열번호 1의 서열에서 123번 및 124번 위치에 대응되는 위치의 세린이 각각 아르기닌 및 류신으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 서열에서 416번 위치에 대응되는 위치의 트립토판이 시스테인으로 치환되고 419번 위치에 대응되는 위치의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열과 서열번호 1의 서열을 대응시키는 방법은 유전자를 자동으로 align하여 결과를 확인할 수 있는 컴퓨터 프로그램 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 염기를 치환하는 방법은 예를 들어, 염기 교정(Base Editing, BE) 에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염기 교정은 타겟 DNA의 염기 하나를 교정하여 결과적으로 단백질 번역 시 Frame-shift 없이 단백질의 아미노산 서열 치환을 유도하는 기술을 의미한다. 염기 교정은 예를 들면 유전자 가위를 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 가위는 CRISPR, 구체적으로 CRISPR-Cas9을 사용할 수 있다. 유전자 가위 사용시에는 sgRNA는 대상 식물체의 DGAT1 유전자의 상기 부위를 타겟팅 할 수 있는 서열을 사용할 수 있고, 이는 대상 식물체의 DGAT1 유전자에 맞추어 설계될 수 있다.
본 발명은 대상 식물체의 DGAT1 유전자에서 서열번호 2의 서열에서 146번 내지 226번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 결실은 일반적으로 유전자에서 염기를 결실시키는 방법이라면 모두 적용 가능한 것이고, 예를 들어 유전자 가위를 이용하여 수행하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 서열번호 2의 서열에서 147번 내지 212번 위치 또는 156번 내지 212번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키고, 그 위치에 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계는 구체적으로, 대상 개체의 DGAT1 유전자 서열 중, 상기 서열번호 2의 147번 위치 내지 212번 위치에 대응되는 위치에 있는 염기 구간이 결실이 되고, 상기 결실된 구간(위치)에 임의의 염기 하나가 추가되어 146번 위치에 대응되는 위치의 염기 다음에 임의로 추가된 염기가 나열되고, 그 다음에 213번 염기가 나열되어, 프레임 시프트가 발생할 수 있고, 얼리스탑될 수 있다. 예를 들어, 도 12의 D7c-2h(Hetero) β에 나타낸 그림과 같이, 147번 위치 내지 212번 위치에 대응되는 염기 구간을 결실시키고, 결실된 위치에 임의의 염기(도 12에서는 염기 C)를 추가하여 프레임 시프트가 발생하여 얼리스탑될 수 있다.
또한, 상기 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계는 구체적으로, 대상 개체의 DGAT1 유전자 서열 중, 상기 서열번호 2의 156번 위치 내지 212번 위치에 대응되는 위치에 있는 염기 구간이 결실이 되고, 상기 결실된 구간(위치)에 임의의 염기 하나가 추가되어 156번 위치에 대응되는 위치의 염기 다음에 임의로 추가된 염기가 나열되고, 그 다음에 213번 염기가 나열되어, 프레임 시프트가 발생할 수 있고, 얼리스탑될 수 있다. 예를 들어, 도 12의 D7c-2h(Hetero) α에 나타낸 그림과 같이, 156번 위치 내지 212번 위치에 대응되는 염기 구간을 결실시키고, 결실된 위치에 임의의 염기(도 12에서는 염기 T)를 추가하여 프레임 시프트가 발생하여 얼리스탑될 수 있다.
본 발명은 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열에서 서열번호 1의 서열에서 123번 및 124번 위치에 대응되는 위치의 세린이 각각 아르기닌 및 류신으로 치환되거나, 서열번호 1의 서열에서 416번 위치에 대응되는 위치의 트립토판이 시스테인으로 치환되고 419번 위치에 대응되는 위치의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계; 또는 대상 식물체의 DGAT1 유전자에서 서열번호 2의 서열에서 146번 내지 226번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키거나; 서열번호 2의 서열에서 147번 또는 156번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키고, 상기 147번 또는 156번 위치에 대응되는 위치 중 결실된 위치와 서열번호 2의 서열에서 212번에 대응되는 위치 사이에 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계;를 포함하여 오메가 3 지방산의 함량을 증가시킨 식물체의 형질전환된 종자에 관한 것이다.
본 발명에서 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미하는 것으로, 형질전환 방법은 반드시 재생 또는 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 숙주로 선택한 식물의 특성을 고려하여 특정 식물에 적절한 공지의 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리아를 이용한 형질전환 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 식물 요소로의 입자충격법 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 재료 및 방법
(1) DGAT1 단백질의 구조와 주요 도메인의 기능 및 위치 분석(도 1)
DGAT1의 구조의 주요 도메인에 대하여 염기교정을 진행하였다. 해당 부위들은 acyl-CoA binding site, SnRK2 target site, thieosterase, fatty acid signature protein, diacylglycerol (DAG) binding site, 9번째 transmembrane domain의 6가지이다. 마지막으로 N-terminal부분은 folding되지 않은 flexible한 구간으로 regulatory motif를 포함하고 있다 (그림 1). 총 7개의 domain들을 DGAT1에서 중요하게 작용하는 domain이라고 생각했으며 이를 타겟하는 52개의 sgRNA를 디자인 하였다.
(2) DGAT1 Base Editing 벡터 제작
52개의 sgRNA (표 2)는 base editing 벡터에 클로닝할 때 annealing method를 사용하였다. 이는 단일가닥의 형태로 되어있는 sgRNA 타겟 시퀀스 를 이중가닥으로 만들기 위하여 원래 타겟하고자 디자인한 시퀀스와 이에 상보적인 시퀀스를 제작하여 annealing시 dimer를 형성하며 추가적으로 본래의 sgRNA 5’말단에 ATTG, 상보적 sgRNA 5'말단에는 AAAC를 더하여 벡터에 삽입할 때 필요한 sticky end를 유도할 수 있다. 벡터의 완성 유무는 PCR로 확인하였으며 벡터에 존재하는 U6 promoter에 결합하는 forward primer (5'-ACCCTTCAAGAATTTGATTGAATA)와 각 sgRNA의 insert를 만들 때 사용한 complimentary oligo를 reverse로 사용하였다. PCR 결과 밴드 사이즈는 약 200bp로 확인된 벡터는 E. coli, Agrobacterium tumefaciens를 거쳐 애기장대 식물에 형질전환 시키는데 사용되었다(도 2). 이때 사용된 벡터는 cytosine에서 thymine으로 전환시키는 CBE벡터와 adenine에서 guanine으로 전환시키는 ABE 벡터 두 가지가 사용되었다.
52개 sgRNA의 DNA서열, 변화 부위 및 방향
서열번호 sgRNA sequence Predicted edition Direction
12 TCTCTCGCCCTCCGATGAGCTGG AGA/GAG (Arg118 / Glu119) -> AAA/AAG (Lys118 / Lys119) Rev
13 CTCCGACGCAATCTTCAAACAGG TCC (Ser124) -> TTT (Phe124) For
14 ATCCAGTTTACGTCACCCTAAGG CCA (Pro224) -> TTA (Leu224) For
15 TGCTCCTCACTTGCATTGTGTGG CTC (Lue243) -> TTT (Phe243) For
16 CTGCCAATATGTTTAACCTTTGG GCA (Ala382) -> ACA (Thr382) Rev
17 CGAACCATCCATTTATGAACAGG GTT (Val418) -> ATT (Ile418) Rev
18 CTTGCGCAGCAAGATACCAAAGG CGC (Arg427) -> TGC (Cys427) Rev
19 TGCGATGCATAGCTGTCAAAAGG GCA (Ala452) -> ACA (Thr452) Rev
20 TTGTCGTCTCTTCAAGCTATGGG CGT (Ala456) -> TGT (Cys456) For
21 ACCTACTCAAACAAATTGGTTGG GTG (Val470) -> ATG (Met470) Rev
22 TCACAAACTATCTACAGGAAAGG ACA (Thr476) -> ATA (Ile476) For
23 CTCCGACGCAATCTTCAAACAGG GAC (Asp125) -> GGC (Gly125) For
24 TGGATACAAAACCTCTGTCATGG TAT (Tyr223) -> CAC (His223) Rev
25 CACCTTAGGGTGACGTAAACTGG CTA (Leu229) -> CCA (Pro229) Rev
26 CTGCCAATATGTTTAACCTTTGG TTG (Leu381) -> CCG (Pro381) Rev
27 TGGCAGAGCTTCTCTGCTTCGGG GAG (Glu383) -> GGG (Gly383) For
28 ATCGTGAATTCTACAAAGATTGG GAA (Glu391) -> GGG (Gly391) Rev
29 TGGTGGAATGCAAAAAGTGTGGG AAT (Asn398) -> GGT (Asp398) For
30 CGAACCATCCATTTATGAACAGG ATG (Met417) -> ACG (Thr417) Rev
31 CATGAAAGACTGCAGAGACTAGG TTT (Phe446) -> CCC (Pro446) Rev
32 TGCGATGCATAGCTGTCAAAAGG ATC (Ile451) -> ACC (Thr451) Rev
33 AGGCACCTACTCAAACAAATTGG GTG (Val470) -> GCG (Ala470) Rev
34 CTTCATCACAAACTATCTACAGG ATC (Ile475) -> GTC (Val475) For
35 TCACAAACTATCTACAGGAAAGG AAC (Asn477) -> GGC(Gly477) For
36 AACTATCTACAGGAAAGGTTTGG TAT (Tyr478) -> TGT (Cys478) For
37 TGCTGGCGTTACTACGGTGACGG GCT (Ala7) -> GTT (Val7) For
38 GTTACTACGGTGACGGAGAACGG ACT (Thr10) -> AGT (Ile10) For
39 ACTACGGTGACGGAGAACGGTGG ACT / ACG (Thr10 / Thr11) -> AGT / AGG (Ile10 / Met11) For
40 ACGGTGACGGAGAACGGTGGCGG ACG (Thr11) -> AGG (Met11) For
41 ATCTTGATAGGCTTCGTCGACGG CTT (Leu23) -> GTT (Phe23) For
42 TCGAGATCGGATTCTTCTAACGG TCG (Ser31) -> TGG (Leu31) For
43 TCTAACGGACTTCTTCTCTCTGG TCT (Ser36) -> TGT (Phe36) For
44 TTCCGATAATAATTCTCCTTCGG TCC (Ser44) -> TGG (Phe44) For
45 AATTCTCCTTCGGATGATGTTGG TCT (Ser48) -> TGT (Phe48) For
46 ATCCGAAGGAGAATTATTATCGG GAT (Asp51) -> AAT (Asn51) Rev
47 CTCCCGCCGACGTTAGGGATCGG CCC (Pro56) -> TTT (Phe56) For
48 ATCCGATCCCTAACGTCGGCGGG CGG (Arg62) -> CAA (Gln62) Rev
49 ATCAATCCGATCCCTAACGTCGG GAT (Asp64) -> CAT (Asn64) Rev
50 TTGGCCGGAGATAATAACGGTGG GCC (Ala78) -> GTT (Val78) For
51 GCCACCACCGTTATTATCTCCGG GGC (Gly85) -> AAC (Asn85) Rev
52 GTTACTACGGTGACGGAGAACGG ACG (Thr11) -> GCG (Ala11) For
53 ACGGTGACGGAGAACGGTGGCGG ACG (Thr13) -> GCG (Ala13) For
54 ATCTTGATAGGCTTCGTCGACGG GAT (Asp24) -> GGT (Gly24) For
55 TCTAACGGACTTCTTCTCTCTGG AAC (Asn37) -> AGC (Ser37) For
56 TTCCGATAATAATTCTCCTTCGG GAT (Asp45) -> GGT (Gly45) For
57 ATCCGAAGGAGAATTATTATCGG ACG (Ser50) -> CCG (Pro50) Rev
58 ATCAATCCGATCCCTAACGTCGG AGT (Ile63) -> ACT (Thr63) Rev
59 GTTGTTAACGATGACGCTCAGGG AAC (Asn68) -> GAC (Asp68) Rev
60 CGCTCAGGGAACAGCCAATTTGG CAG (Gln72) -> CGG (Arg72) For
61 CAGGGAACAGCCAATTTGGCCGG ACA(Thr74) -> GCA (Ala74) For
62 GATAATAACGGTGGTGGAAGAGG AAT / AAC (Asn81 / Asn82) -> AGT / GAC (Ser81 / Asp82) For
63 AATAACGGTGGTGGAAGAGGCGG AAC (Asn82) -> AGC (Ser82) For
52개 sgRNA의 insert 제작을 위한 서열과 각 타겟 도메인
Target group Name 서열
번호		 Forward 서열
번호		 Reverse
Domain 1 AID1 64 ATTGTCTCTCGCCCTCCGATGAGC 116 AAACGCTCATCGGAGGGCGAGAGA
AID2 65 ATTGCTCCGACGCAATCTTCAAAC 117 AAACGTTTGAAGATTGCGTCGGAG
ABE1 66 ATTGCTCCGACGCAATCTTCAAAC 118 AAACGTTTGAAGATTGCGTCGGAG
Domain 3 AID3 67 ATTGATCCAGTTTACGTCACCCTA 119 AAACTAGGGTGACGTAAACTGGAT
AID4 68 ATTGTGCTCCTCACTTGCATTGTG 120 AAACCACAATGCAAGTGAGGAGCA
ABE2 69 ATTGTGGATACAAAACCTCTGTCA 121 AAACTGACAGAGGTTTTGTATCCA
ABE3 70 ATTGCACCTTAGGGTGACGTAAAC 122 AAACGTTTACGTCACCCTAAGGTG
Domain 4 AID5 71 ATTGCTGCCAATATGTTTAACCTT 123 AAACAAGGTTAAACATATTGGCAG
ABE4 72 ATTGCTGCCAATATGTTTAACCTT 124 AAACAAGGTTAAACATATTGGCAG
ABE5 73 ATTGTGGCAGAGCTTCTCTGCTTC 125 AAACGAAGCAGAGAAGCTCTGCCA
ABE6 74 ATTGATCGTGAATTCTACAAAGAT 126 AAACATCTTTGTAGAATTCACGAT
Domain 5 AID6 75 ATTGCGAACCATCCATTTATGAAC 127 AAACGTTCATAAATGGATGGTTCG
AID7 76 ATTGCTTGCGCAGCAAGATACCAA 128 AAACTTGGTATCTTGCTGCGCAAG
AID8 77 ATTGTGCGATGCATAGCTGTCAAA 129 AAACTTTGACAGCTATGCATCGCA
AID9 78 ATTGTTGTCGTCTCTTCAAGCTAT 130 AAACATAGCTTGAAGAGACGACAA
ABE7 79 ATTGTGGTGGAATGCAAAAAGTGT 131 AAACACACTTTTTGCATTCCACCA
ABE8 80 ATTGCGAACCATCCATTTATGAAC 132 AAACGTTCATAAATGGATGGTTCG
ABE9 81 ATTGCATGAAAGACTGCAGAGACT 133 AAACAGTCTCTGCAGTCTTTCATG
ABE10 82 ATTGTGCGATGCATAGCTGTCAAA 134 AAACTTTGACAGCTATGCATCGCA
Domain 6 AID10 83 ATTGACCTACTCAAACAAATTGGT 135 AAACACCAATTTGTTTGAGTAGGT
AID11 84 ATTGTCACAAACTATCTACAGGAA 136 AAACTTCCTGTAGATAGTTTGTGA
ABE11 85 ATTGAGGCACCTACTCAAACAAAT 137 AAACATTTGTTTGAGTAGGTGCCT
ABE12 86 ATTGCTTCATCACAAACTATCTAC 138 AAACGTAGATAGTTTGTGATGAAG
ABE13 87 ATTGTCACAAACTATCTACAGGAA 139 AAACTTCCTGTAGATAGTTTGTGA
ABE14 88 ATTGAACTATCTACAGGAAAGGTT 140 AAACAACCTTTCCTGTAGATAGTT
Domain 7 nAID1 89 ATTGTGCTGGCGTTACTACGGTGA 141 AAACTCACCGTAGTAACGCCAGCA
nAID2 90 AAACTTCTCCGTCACCGTAGTAAC 142 AAACTTCTCCGTCACCGTAGTAAC
nAID3 91 ATTGACTACGGTGACGGAGAACGG 143 AAACCCGTTCTCCGTCACCGTAGT
nAID4 92 ATTGACGGTGACGGAGAACGGTGG 144 AAACCCACCGTTCTCCGTCACCGT
nAID5 93 ATTGATCTTGATAGGCTTCGTCGA 145 AAACTCGACGAAGCCTATCAAGAT
nAID6 94 ATTGTCGAGATCGGATTCTTCTAA 146 AAACTTAGAAGAATCCGATCTCGA
nAID7 95 ATTGTCTAACGGACTTCTTCTCTC 147 AAACGAGAGAAGAAGTCCGTTAGA
nAID8 96 ATTGTTCCGATAATAATTCTCCTT 148 AAACAAGGAGAATTATTATCGGAA
nAID9 97 ATTGAATTCTCCTTCGGATGATGT 149 AAACACATCATCCGAAGGAGAATT
nAID10 98 ATTGATCCGAAGGAGAATTATTAT 150 AAACATAATAATTCTCCTTCGGAT
nAID11 99 ATTGCTCCCGCCGACGTTAGGGAT 151 AAACATCCCTAACGTCGGCGGGAG
nAID12 100 ATTGATCCGATCCCTAACGTCGGC 152 AAACGCCGACGTTAGGGATCGGAT
nAID13 101 ATTGATCAATCCGATCCCTAACGT 153 AAACACGTTAGGGATCGGATTGAT
nAID14 102 ATTGTTGGCCGGAGATAATAACGG 154 AAACCCGTTATTATCTCCGGCCAA
nAID15 103 ATTGGCCACCACCGTTATTATCTC 155 AAACGAGATAATAACGGTGGTGGC
nABE1 104 ATTGGTTACTACGGTGACGGAGAA 156 AAACTTCTCCGTCACCGTAGTAAC
nABE2 105 ATTGACGGTGACGGAGAACGGTGG 157 AAACCCACCGTTCTCCGTCACCGT
nABE3 106 ATTGATCTTGATAGGCTTCGTCGA 158 AAACTCGACGAAGCCTATCAAGAT
nABE4 107 ATTGTCTAACGGACTTCTTCTCTC 159 AAACGAGAGAAGAAGTCCGTTAGA
nABE5 108 ATTGTTCCGATAATAATTCTCCTT 160 AAACAAGGAGAATTATTATCGGAA
nABE6 109 ATTGATCCGAAGGAGAATTATTAT 161 AAACATAATAATTCTCCTTCGGAT
nABE7 110 ATTGATCAATCCGATCCCTAACGT 162 AAACACGTTAGGGATCGGATTGAT
nABE8 111 ATTGGTTGTTAACGATGACGCTCA 163 AAACTGAGCGTCATCGTTAACAAC
nABE9 112 ATTGCGCTCAGGGAACAGCCAATT 164 AAACAATTGGCTGTTCCCTGAGCG
nABE10 113 ATTGCAGGGAACAGCCAATTTGGC 165 AAACGCCAAATTGGCTGTTCCCTG
nABE11 114 ATTGGATAATAACGGTGGTGGAAG 166 AAACCTTCCACCACCGTTATTATC
nABE12 115 ATTGAATAACGGTGGTGGAAGAGG 167 AAACCCTCTTCCACCACCGTTATT
(3) DGAT1 N-terminal의 In-frame deletion vector 제작
애기장대 DGAT1의 N-terminal에 해당하는 domain7번에 In-frame deletion을 유도하기 위해 sgRNA를 디자인하고 CRISPR/Cas9 기반의 벡터를 제작하였다. In-frame deletion이란 DNA 일부를 deletion 할 때 3배수의 개수를 deletion하여 DNA 서열상에 존재하는 단백질 번역 frame을 변형시키지 않는 기술을 뜻한다. 이를 위하여 DGAT1의 DNA 서열에서 146~226번의 81bp를 deletion하는 sgRNA 2개와 156~212번의 57bp를 deletion하는 sgRNA 2개를 디자인하였다(도 3). 각각의 sgRNA는 pHEE401E 벡터에 클로닝 되었으며 E. coli에 형질전환 되어 kanamycin 저항성을 통해 선별되었다. 선별된 콜로니는 U-6 promoter forward primer (5'-ACCCTTCAAGAATTTGATTGAATA)와 두 번째 sgRNA의 서열을 활용하여 PCR하여 확인하였다. 콜로니 PCR까지 확인된 벡터는 plasmid extraction과 transfromation을 통하여 Agrobacterium tumefaciens에 형질전환되어 cell stock으로 보관되었다.
(4) DGAT1 유전자의 염기가 편집되거나 DGAT1 N-terminal이 In-frame deletion 된 식물체 선발
DGAT1의 base editing을 위하여 52개의 벡터를 7개의 domain별로 묶어 Agrobacterium 형질전환을 통해 T0 plant를 제작하였다. 이때 ABE, CBE 벡터는 식물에서 hygromycine 저항성을 가지므로 해당 항생제가 포함된 배지에서 T1 종자를 발아시켜 형질전환이 되었다고 판단되는 개체들을 일반 MS배지로 옮겨 회복 후, 일정 크기까지 성장시켜 흙으로 옮겨 심었다. 흙에서 다시 일정크기 이상으로 성장하면, gDNA를 추출하기 위한 sampling을 진행하였으며 추출된 gDNA는 해당 개체의 target domain에 따라 PCR primer set을 적용하였다. 1,7 번 domain은 For1 (CCGACGCTGTTTCGTCAAAC, 서열번호 168), Rev1 (TTCGATGATGAGTCTACTGTTT, 서열번호 169)를 사용했으며, 3번 Domain은 For3 (TGCTCAAGGTTGTCATCTTTC, 서열번호 170), Rev3 (CAGGATTGGCCTAAAGTTCA, 서열번호 171)를 사용하였다. 이어서 4번 Domain은 For4 (CCTTTGGTATGCTGTGATCC, 서열번호 172)와 Rev4 (AAGACAGTGAATACATGAATTTGG, 서열번호 173), 5번과 6번 domain은 For5 (CTGGAGAATGTGGAATATGGT, 서열번호 174), Rev5 (CCCATTCCAAAACAGATCAC, 서열번호 175)를 사용하여 PCR하였다. DNA 시퀀싱 또한 해당 동일한 프라이머를 사용하였다.
T1세대에서 DNA 시퀀싱 결과를 확인하였을 때 크로마토그래피의 그래프가 깔끔하지 않고 다른 염기와 비교하였을 때 야생형에서 보여준 피크의 높이보다 작게 다른 피크가 동시에 섞여 나온 개체들을 선별하였다. 이는 염기교정이 실제로 일어나긴 했지만 부분적으로만 일어나 아직 기존의 야생형에서 존재하는 염기가 남아있다는 의미이다.
이후 세대를 진전해 가면서 동일하게 항생제 저항성 선별과 그 이후에 이어지는 DNA 시퀀싱으로 homozygous한 개체의 출현까지 진행하였다 (도 4). T4세대까지 진전하고 나서야 5개의 개체를 확보하였으며, 각각 domain1에서 2개, domain3에서 1개, domain5에서 2개의 개체를 얻었다. domain7의 in-frame deletion 또한 hygromycin저항성과 DNA서열분석을 통하여 확인하였고, 1개의 호모화된 개체와 1개의 헤테로 개체를 얻었다.
2. 실험 결과
(1) DGAT1 염기치환 돌연변이체 종자의 지방산 분석
1) DGAT1 염기치환 돌연변이체는 총 5개로 target한 domain의 이름을 붙여 각각 D1-1, D1-2, D3-1, D5-1, D5-2로 명명하였다(도 5A).
2) D1-1 개체는 124번 serine이 phenylalanine으로 치환되었고 D1-2개체는 123, 124번 serine이 각각 arginine과 leucine으로 치환되었다. 두 치환된 부위 모두 다른 종의 DGAT1 서열분석을 통해 의도한 domain1 내의 보존된 서열에서 돌연변이가 일어난 것을 확인하였다. 이에 따른 지방산 변화는 D1-1개체에서 1% 증가한 18:1 지방산, 2.8% 감소한 18:2 지방산과 1.6% 감소한 20:1 지방산을 보였다. D1-2개체는 1.3% 증가한 18:1 지방산, 4.8% 증가한 18:3 지방산, 3.9% 감소한 20:1 지방산을 보였다. 총량은 D1-1, D1-2개체 모두 야생형 애기장대와 비교하였을 때 1% 미만의 차이를 보였다(도 5A, 5B, 5C).
3) D3-1개체는 229번 leucine이 proline으로 치환되었고 다른 DGAT1과의 서열 비교를 통하여 의도한 domain3 내의 보존된 서열에서 돌연변이가 일어난 것을 확인하였다. 해당 부위의 단백질 치환은 애기장대 야생형과 비교하였을 때 각 지방산 별 조성의 측면에서 1.7% 감소한 20:1 지방산을 제외하고 모두 1% 미만의 증감을 보여 큰 변화가 없었다. 하지만 지방산 총량은 애기장대 야생형 대비 12.5% 감소하였다 (도 5A, 5B, 5C).
4) D5-1개체는 416번 tryptophan이 cysteine으로 치환되었으며 419번 arginine이 glutamine으로 치환되었다. 다른 종의 DGAT1과 서열 비교를 통해 의도한 domain5 내의 보존된 서열에서 돌연변이가 일어난 것을 확인했다. D5-1개체는 4.5% 감소한 18:1 지방산, 8.4% 증가한 18:3 지방산, 3.7% 감소한 20:1 지방산을 보이며 정량적으로도 13% 감소한 총량을 나타냈다(도 5A, 5B, 5C).
5) D5-2개체는 418번 valine이 isoleucine으로 치환되었으며 다른 종의 DGAT1 단백질 서열과 비교하였을 때 의도한 domain5 내의 보존된 서열에서 돌연변이가 발생한 것을 확인하였다. 해당 부위의 치환은 애기장대 야생형과 조성적 측면에서 20:1 지방산이 1.5% 증가한 것 외에 큰 차이를 보이지 않았지만, 정량분석에서 야생형 애기장대보다 8.1% 증가한 지방산 총량을 보였다 (도 5A, 5B, 5C).
6) D7c 개체의 in-frame deletion은 호모화 개체인 D7c-1와 헤테로 개체인 D7c-2h가 있으며 D7c-1은 18:1 지방산 1.1% 감소, 18:3 지방산 8.4% 증가, 20:1 지방산 7% 감소를 보였으며 총량에서 8.6% 감소하였다. 헤테로 개체인 D7c-2h는 18:1 지방산 8.2% 감소, 18:3 지방산 24.8% 증가, 20:1 지방산 14.7% 감소를 보였고 총량에서 19.7% 감소하였다 (도 12, 도 13 및 도 14).
(2) DGAT1 염기교정 돌연변이체의 아미노산 치환과 종자 지방산 조성의 함량 변화 비교
DGAT1 아미노산 치환 변이 치환 개수 야생형(wild-type) 대비 아미노산 치환 부위 야생형 대비 종자
지방산 조성 변화		 야생형 대비 종자 지방함량 변화
D1-1 1 124번
Serine->Phenylalanine		 18:1 지방산 2% 증가
18:3 지방산 1% 감소
20:1 지방산 1.6% 감소		 차이 없음
D1-2 2 123번
Serine->Arginine
124번
Serine->Leucine		 18:1 지방산 2.2% 감소
18:3 지방산 4.8% 증가
20:1 지방산 3.9% 감소		 차이 없음
D3-1 1 229번
Leucine->Proline		 차이 없음 총량 12% 감소
D5-1 2 416번
Tryptophan->Cysteine
419번
Arginine->Glutamine		 18:1 지방산 4.5% 감소
18:3 지방산 8.4% 증가
20:1 지방산 3.7% 감소		 총량 13% 감소
D5-2 1 418번
Valine->Isoleucine		 차이 없음 총량 8.1% 증가
DGAT1
in-frame deletion 라인		 DNA deletion 범위 frame shift 종류 야생형 대비 종자
지방산 조성 변화		 야생형 대비 종자
지방함량 변화
D7c-1 146
~226		 0 18:1 지방산 1.1% 감소
18:3 지방산 8.4% 증가
20:1 지방산 7% 감소		 총량 8.6% 감소
D7c-2h ~212 -1 18:1 지방산 8.2% 감소
18:3 지방산 24.8% 증가
20:1 지방산 14.7% 감소		 총량 17.9% 감소
상기 표 3는 DGAT1 치환 변이에 따른 특성을 나타낸 것이고, 표 4는 in-frame deletion 변이 특성을 나타낸 것이다. D1-2, D5-1, D7c-1, D7c-2h 개체에서 오메가 3 지방산에 해당하는 18:3 지방산의 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다.
(3) DGAT1 In-frame 돌연변이체 종자의 지방산 분석
1) Domain 7에서 inframe-deletion이 일어난 D7c-1 호모 개체는 49~76번 아미노산이 제거되었고 D7c-2h 헤테로 개체는 두 allele 모두 212번 DNA 서열부터 -1 frame shift가 일어나 9개의 아미노산 이후 early stop 되었다(도 12). 해당 부위의 돌연변이는 D7c-1개체에서 애기장대 야생형과 비교하였을 때 조성적 측면에서 1% 감소한 18:1 지방산, 8.4% 증가한 18:3 지방산, 7% 감소한 20:1 지방산을 보였으며 지방산 총량에선 8.6% 감소하였다(도 13 및 도 14).
2) 헤테로 개체이지만 결핍 돌연변이로 보이는 D7c-2h 개체의 경우 야생형 애기장대와 비교하였을 때 8% 감소한 18:1 지방산, 24.8% 증가한 18:3 지방산, 14.7% 감소한 20:1 지방산을 보이며 정량적으로 17.9% 감소한 지방산 총량을 보였다(도 13 및 도 14).
(4) D7c-1, D7c-2h의 DNA, protein 서열 비교(도 12)
1) D7c-1의 경우 DNA 서열에서 146번 내지 226번 위치의 DNA가 제거되었고, 제거되고 남은 3개의 염기가 모여 Histidine을 새롭게 생성했다. frame shift는 일어나지 않아 49번 Proline부터 76번 Asparagine이 제거되었고, 이후의 단백질은 DGAT1 야생형과 동일하게 나타났다.
2) D7c-2h의 경우 DNA상으론 hetero이다. DNA 서열에서 156번 내지 212번 위치의 DNA가 제거되었고 Asparagine이 생성되었지만, Thymine 하나가 insertion되어 frame shift가 일어났다. 그로 인해 얼리스탑된 알파 가닥과 147번 ~ 212번 위치의 DNA가 제거되고 Proline이 생성되었지만 Cytocine 하나가 insertion되어 역시 같은 부위에서 얼리스탑된 베타 가닥이 있다. 따라서 D7c-2h의 경우 DGAT1 결핍 돌연변이에 해당한다.
D7c-1 및 D7c-2 돌연변이는 다른 식물의 DGAT1의 전략과는 조금 다르게 작용한다. 구체적으로, 원래 DGAT1의 활성이 저해된 돌연변이는 18:3 지방산이 증가하는 특성이 있지만, D7c-1, D7c-2h 돌연변이들은 각각 의미하는 바가 다르다.
D7c-1의 경우 DGAT1의 folding된 부분이 그대로 존재 하지만 N-terminal의 일부가 제거되어 활성이 감소 했고, D7c-2h의 경우 기존에 사용되던 DGAT1 활성저하 돌연변이인 DGAT1-1보다 훨씬 강하게 DGAT1 결핍현상을 보이며 더 많은 18:3 지방산 축적으로 이어졌다.
<110> SEJONG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> METHOD FOR INCREASING THE CONTENT OF OMEGA 3 FATTY ACIDS IN PLANTS <130> 21P01016 <160> 188 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 528 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Ile Leu Asp Ser Ala Gly Val Thr Thr Val Thr Glu Asn Gly 1 5 10 15 Gly Gly Glu Phe Val Asp Leu Asp Arg Leu Arg Arg Arg Lys Ser Arg 20 25 30 Ser Asp Ser Ser Asn Gly Leu Leu Leu Ser Gly Ser Asp Asn Asn Ser 35 40 45 Pro Ser Asp Asp Val Gly Ala Pro Ala Asp Val Arg Asp Arg Ile Asp 50 55 60 Ser Val Val Asn Asp Asp Ala Gln Gly Thr Ala Asn Leu Ala Gly Asp 65 70 75 80 Asn Asn Gly Gly Gly Asp Asn Asn Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Glu 85 90 95 Gly Arg Gly Asn Ala Asp Ala Thr Phe Thr Tyr Arg Pro Ser Val Pro 100 105 110 Ala His Arg Arg Ala Arg Glu Ser Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ile Phe 115 120 125 Lys Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile 130 135 140 Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr Gly Trp 145 150 155 160 Leu Ile Arg Thr Asp Phe Trp Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp Trp 165 170 175 Pro Leu Phe Met Cys Cys Ile Ser Leu Ser Ile Phe Pro Leu Ala Ala 180 185 190 Phe Thr Val Glu Lys Leu Val Leu Gln Lys Tyr Ile Ser Glu Pro Val 195 200 205 Val Ile Phe Leu His Ile Ile Ile Thr Met Thr Glu Val Leu Tyr Pro 210 215 220 Val Tyr Val Thr Leu Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly Val Thr 225 230 235 240 Leu Met Leu Leu Thr Cys Ile Val Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala 245 250 255 His Thr Ser Tyr Asp Ile Arg Ser Leu Ala Asn Ala Ala Asp Lys Ala 260 265 270 Asn Pro Glu Val Ser Tyr Tyr Val Ser Leu Lys Ser Leu Ala Tyr Phe 275 280 285 Met Val Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Ala 290 295 300 Cys Ile Arg Lys Gly Trp Val Ala Arg Gln Phe Ala Lys Leu Val Ile 305 310 315 320 Phe Thr Gly Phe Met Gly Phe Ile Ile Glu Gln Tyr Ile Asn Pro Ile 325 330 335 Val Arg Asn Ser Lys His Pro Leu Lys Gly Asp Leu Leu Tyr Ala Ile 340 345 350 Glu Arg Val Leu Lys Leu Ser Val Pro Asn Leu Tyr Val Trp Leu Cys 355 360 365 Met Phe 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ggaaaccttc tatatggctt cgagagaact 1080 ctaaagcttt ctgttcccaa tgtatatgtg tggctttgca tgttctattg cttctttcac 1140 ctttggttaa atatacttgc agaacttgtt cagtttggtg atcgtgagtt ctacaaggat 1200 tggtggaatg ctaaaactgt tgatgagccc gtgcacaaat ggatggttcg tcatatatat 1260 tttccttgca ttaggcatgg tatgtctaag aatgctgctg tattaattgc tttcctgatt 1320 tctgccgtgt tccatgagct ttgcattgct gttccctgcc acaagttcaa gttgtgggct 1380 tttattggaa ttatgtttca ggttcctcta tccattgtca ctaacttcct acaaaagaaa 1440 tgcaaaagct caatggttgg aaacatggtg ttttggttca cattttgtat tctgggtcag 1500 cctatgtgcg tactactata ctaccatgac tggatgaaca ggcacaggga acataactaa 1560 1560 <210> 9 <211> 1563 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Camelina sativa <400> 9 atggcgattt tggattctgg aggcggcggc gttagcaccg cgacggcgac agagaacggt 60 ggcggagagt ttgtggatct tcgtcgacgg aaatcgagat cggattccaa cggagttctt 120 tctggttccg ataatccacc gtctgttgat gttggagctc ccgccgacgt tagggatcgg 180 attgattccg ttgttaacga tgacgctcag gggacgactg ccaatttggc cggagatacc 240 gaaattaggg aaaccggtgg tggtggaaga ggcgccggcg gagaaggagg aagaggtaac 300 gccgagacta cgtatgcgta tcgaccgtcg gttcctgctc atcggagagc tagggagagt 360 ccactcagct ccgacgcaat cttcaaacag agccatgccg gattattcaa cttgtgcgta 420 gtagttctta ttgctgtaaa cagtagactc atcatcgaaa atctgatgaa gtatggttgg 480 ttgatcagaa cggatttctg gtttagttca agatcgttgc gggattggcc gcttttcatg 540 tgttgtctct ccctttcaat ctttcctttg gctgccttta ccgtcgagaa attggttctt 600 cagaaatgca tttctgaacc tgttgtcatc attcttcata ttattatcac catgacagag 660 gttttgtatc cagtttacgt caccctaagg tgtgattctg ccttcttatc aggtgtcaca 720 ttgatgctcc tcacttgcat tgtgtggcta aagttggttt cttatgctca tactaactac 780 gacataagaa ctctagccaa ttcagctgat aaggccaatc ctgaagtctc ctactacgtt 840 agcttgaaga gcttggcata ttttatggtt gctcccacat tgtgttatca gccaagctat 900 ccacgttctc catgtatacg gaagggttgg gtggctcgtc aatttgcaaa actggtcata 960 ttcactggat tcatgggatt tataatagaa caatatataa atcctattgt cagaaactca 1020 aagcatcctc tgaaagggga tcttctatat gctattgaaa gagtgttgaa gctttcagtt 1080 ccaaatttat atgtgtggct ctgcatgttc 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tcgaccgtcg gttcctgctc atcggagagc tagggagagt 360 ccactcagct ccgacgcaat cttcaaacag agccatgccg gattattcaa cttgtgtgta 420 gtagttctta ttgctgttaa cagtagactc atcatcgaaa acctgatgaa gtatggttgg 480 ttgatcagaa cggatttctg gtttagttca agatcgttgc gggattggcc gcttttcatg 540 tgttgtctat ccctttcgtt ctttcctttg gctgccttta ccgtcgagaa attggtactt 600 cagaaatgca tatctgaacc tgttgtcatc tttcttcata ttattatcac catgacagag 660 gttttatatc cagtttacgt caccctaagc tgtgattctg ccttcttatc aggtgtcacg 720 ttgatgctcc tcacttgcat tgtgtggcta aagttggttt cttatgctca tactaactac 780 gacataagaa ctctagccaa ttcagctgat aaggccaatc ctgaagtctc ctactacgtt 840 agcttgaaga gcttggcata ttttatggtt gctcccacat tgtgttatca gccaagctat 900 ccacgttctc cgtgtatacg gaagggttgg gtggctcgtc aatttgcaaa actggtcata 960 ttcactggat tcatgggatt tataatagaa caatatataa atcctattgt cagaaactca 1020 aagcatcctc tgaaagggga tcttctatat gctattgaaa gagtgttgaa gctttcagtt 1080 ccaaatttat atgtgtggct ctgcatgttc tactgcttct tccacctttg gttaaacata 1140 ttggcagagc ttctctgctt cggggatcgt 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cttcaaacag agccatgccg gattattcaa cttgtgcgta 420 gtagttctta ttgctgtaaa cagtagactc atcatcgaaa atctgatgaa gtatggttgg 480 ttgatcagaa cggatttctg gtttagttca agatcgttgc gggattggcc gcttttcatg 540 tgttgtctct ccctttcaat ctttcctttg gctgccttta ccgtcgagaa attggttctt 600 cagaaatgca tttctgaacc tgttgtcatc attcttcata ttattatcac catgacagag 660 gttttgtatc cagtttacgt caccctaagg tgtgattctg ccttcttatc aggtgtcaca 720 ttgatgctcc tcacttgcat tgtgtggcta aagttggttt cttatgctca tactaactac 780 gacataagaa ctctagccaa ttcagctgat aaggccaatc ctgaagtctc ctactacgtt 840 agcttgaaga gcttggcata ttttatggtt gctcccacat tgtgttatca gccaagctat 900 ccacgttctc catgtatacg gaagggttgg gtggctcgtc aatttgcaaa actggtcata 960 ttcactggat tcatgggatt tataatagaa caatatataa atcctattgt cagaaactca 1020 aagcatcctc tgaaagggga tcttctatat gctattgaaa gagtgttgaa gctttcagtt 1080 ccaaatttat atgtgtggct ctgcatgttc tactgcttct tccacctttg gttaaacata 1140 ttggcagagc ttctctgctt cggggatcgt gaattctaca gagattggtg gaatgcaaaa 1200 agtgtgggag actattggag aatgtggaat 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Ser Ser Asp Ala Ile Phe 115 120 125 Lys Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile 130 135 140 Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr Gly Trp 145 150 155 160 Leu Ile Arg Thr Asp Phe Trp Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp Trp 165 170 175 Pro Leu Phe Met Cys Cys Leu Ser Leu Ser Ile Phe Pro Leu Ala Ala 180 185 190 Phe Thr Val Glu Lys Leu Val Leu Gln Lys Cys Ile Ser Glu Pro Val 195 200 205 Val Ile Ile Leu His Ile Ile Ile Thr Met Thr Glu Val Leu Tyr Pro 210 215 220 Val Tyr Val Thr Leu Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly Val Thr 225 230 235 240 Leu Met Leu Leu Thr Cys Ile Val Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala 245 250 255 His Thr Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Leu Ala Asn Ser Ala Asp Lys Ala 260 265 270 Asn Pro Glu Val Ser Tyr Tyr Val Ser Leu Lys Ser Leu Ala Tyr Phe 275 280 285 Met Val Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Pro 290 295 300 Cys Ile Arg Lys Gly Trp Val Ala Arg Gln Phe Ala Lys Leu Val Ile 305 310 315 320 Phe Thr Gly Phe Met Gly Phe Ile Ile Glu 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Ser Gly Gly Val Ala Val Pro Pro Thr Glu Asn 1 5 10 15 Gly Val Ala Asp Leu Asp Arg Leu His Arg Arg Lys Ser Ser Ser Asp 20 25 30 Ser Ser Asn Gly Leu Leu Ser Asp Thr Ser Pro Ser Asp Asp Val Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Glu Arg Asp Arg Val Asp Ser Ala Ala Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Gln Gly Thr Ala Asn Leu Ala Gly Gly Asp Ala Glu Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Ala Gly Gly Asp Val Arg Phe Thr Tyr Arg Pro Ser Val Pro Ala 85 90 95 His Arg Arg Thr Arg Glu Ser Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ile Phe Lys 100 105 110 Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Val Ala 115 120 125 Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr Gly Trp Leu 130 135 140 Ile Arg Thr Asp Phe Trp Phe Ser Ser Thr Ser Leu Arg Asp Trp Pro 145 150 155 160 Leu Phe Met Cys Cys Leu Ser Leu Ser Val Phe Pro Leu Ala Ala Phe 165 170 175 Thr Val Glu Lys Met Val Leu Gln Lys Phe Ile Ser Glu Pro Val Ala 180 185 190 Ile Ile Leu His Val Ile Ile Thr Met Thr Glu Val Leu Tyr Pro Val 195 200 205 Tyr Val Thr Leu Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly Val Thr Leu 210 215 220 Met Leu Leu Thr Cys Ile Val Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala His 225 230 235 240 Thr Ser Tyr Asp Ile Arg Thr Leu Ala Asn Ser Ala Asp Lys Val Asp 245 250 255 Pro Glu Ile Ser Tyr Tyr Val Ser Leu Lys Ser Leu Ala Tyr Phe Met 260 265 270 Val Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Pro Cys 275 280 285 Ile Arg Lys Gly Trp Val Ala Arg Gln Leu Ala Lys Leu Val Ile Phe 290 295 300 Thr Gly Leu Met Gly Phe Ile Ile Glu Gln Tyr Ile Asn Pro Ile Val 305 310 315 320 Arg Asn Ser Lys His Pro Leu Lys Gly Asp Leu Leu Tyr Ala Ile Glu 325 330 335 Arg Val Leu Lys Leu Ser Val Pro Asn Leu Tyr Val Trp Leu Cys Met 340 345 350 Phe Tyr Cys Phe Phe His Leu Trp Leu Asn Ile Leu Ala Glu Leu Leu 355 360 365 Cys Phe Gly Asp Arg Glu Phe Tyr Lys Asp Trp Trp Asn Ala Lys Ser 370 375 380 Val Gly Asp Tyr Trp Arg Met Trp Asn Met Pro Val His Lys Trp Met 385 390 395 400 Val Arg His Val Tyr Phe Pro Cys Leu Arg Ile Lys Ile Pro Lys Val 405 410 415 Pro Ala Ile Ile Ile Ala Phe Leu Val Ser 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Phe Asn Leu Cys 115 120 125 Ile Val Val Leu Val Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu 130 135 140 Met Lys Tyr Gly Trp Leu Ile Lys Tyr Gly Phe Trp Phe Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Leu Arg Asp Trp Pro Leu Phe Met Cys Cys Leu Ser Leu Ala Ile 165 170 175 Phe Pro Leu Ala Ala Phe Val Val Glu Arg Leu Ala Gln Gln Lys Cys 180 185 190 Ile Ser Glu Pro Val Val Val Leu Leu His Leu Ile Ile Ser Thr Val 195 200 205 Glu Leu Cys Tyr Pro Val Leu Val Ile Leu Arg Cys Asp Ser Ala Phe 210 215 220 Val Ser Gly Val Thr Leu Met Leu Leu Thr Cys Ile Val Trp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Val Ser Tyr Ala His Thr Asn Tyr Asp Met Arg Ala Leu Thr Val 245 250 255 Ser Asn Glu Lys Gly Glu Thr Leu Pro Asn Thr Leu Ile Met Glu Tyr 260 265 270 Pro Tyr Thr Val Thr Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Phe Met Val Ala Pro 275 280 285 Thr Leu Cys Tyr Gln Thr Ser Tyr Pro Arg Thr Pro Ser Val Arg Lys 290 295 300 Gly Trp Val Phe Arg Gln Leu Val Lys Leu Ile Ile Phe Thr Gly Val 305 310 315 320 Met Gly Phe Ile Ile Glu Gln Tyr Met Asn Pro Ile 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Val Ala Gly Asp Gly Ala 1 5 10 15 Asn His Ser Ser Leu Arg Arg Arg His Ser Arg Val Ala Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Asn Met Phe Asp Glu Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ala Val Met Ile 35 40 45 Asp Ser Ser Gly Ser Asp Asp Ser Leu Asn Glu Arg Ile Gly Ala Ala 50 55 60 Arg Glu Glu Lys Val Lys Glu Lys Gln Lys Gln Lys Glu Glu Asp Arg 65 70 75 80 Lys Pro Pro Asp His Ala Ser Arg Asn Glu Val Gln Asp Gly Glu Arg 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Asp Asn Phe Thr Tyr Arg Ala Ser Val Pro Val His 100 105 110 Arg Arg Ile Lys Asp Ser Pro Leu Ser Ser Arg Asn Ile Phe Lys Gln 115 120 125 Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile Ala Val 130 135 140 Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Ile Met Lys Tyr Gly Trp Leu Ile 145 150 155 160 Asn Ser Gly Phe Trp Phe Ser Ser Lys Ser Leu Arg Asp Trp Pro Leu 165 170 175 Leu Met Cys Cys Ile Ser Leu Asn Leu Phe Pro Leu Ala Ala Phe Met 180 185 190 Val Glu Lys Leu Ala Gln Lys Lys Arg Ile Ser Glu Pro Val Ile Phe 195 200 205 Leu Leu His Thr Ile Ile Met Thr Gly Glu Ile Ser Phe Pro Val Leu 210 215 220 Val Ile Leu Ser Cys Asp Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Thr Leu Met 225 230 235 240 Met Val Ala Cys Ile Ile Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala His Thr 245 250 255 Ser His Asp Leu Arg Ser Leu Ser Leu Ser Ile Glu Lys Gly Glu Thr 260 265 270 Leu Pro Asn Asn Leu Asn Met Glu His Pro Tyr Arg Val Ser Phe Arg 275 280 285 Ser Met Ala Tyr Phe Met Val Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Gln Pro Ser 290 295 300 Tyr Pro Arg Thr Pro Ser Val Arg Lys Gly Trp Val Phe Arg Gln Leu 305 310 315 320 Ile Lys Leu Val Ile Phe Thr Gly Leu Met Gly Phe Ile Ile Glu Gln 325 330 335 Tyr Met His Pro Ile Val Gln Asn Ser Gln His Pro Phe Lys Gly Asn 340 345 350 Leu Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Thr Leu Lys Leu Ser Val Pro Asn Val 355 360 365 Tyr Val Trp Leu Cys Met Phe Tyr Cys Phe Phe His Leu Trp Leu Asn 370 375 380 Ile Leu Ala Glu Leu Val Gln Phe Gly Asp Arg Glu Phe Tyr Lys Asp 385 390 395 400 Trp Trp Asn Ala Lys Thr Val Asp Glu Pro Val His Lys Trp Met Val 405 410 415 Arg His Ile Tyr Phe Pro Cys Ile Arg His Gly Met Ser Lys Asn Ala 420 425 430 Ala Val Leu Ile Ala Phe Leu Ile Ser Ala Val Phe His Glu Leu Cys 435 440 445 Ile Ala Val Pro Cys His Lys Phe Lys Leu Trp Ala Phe Ile Gly Ile 450 455 460 Met Phe Gln Val Pro Leu Ser Ile Val Thr Asn Phe Leu Gln Lys Lys 465 470 475 480 Cys Lys Ser Ser Met Val Gly Asn Met Val Phe Trp Phe Thr Phe Cys 485 490 495 Ile Leu Gly Gln Pro Met Cys Val Leu Leu Tyr Tyr His Asp Trp Met 500 505 510 Asn Arg His Arg Glu His Asn 515 <210> 188 <211> 520 <212> PRT <213> Ricinus communis <400> 188 Met Ala Ile Leu Asp Ser Gly Gly Gly Gly Val Ser Thr Ala Thr Ala 1 5 10 15 Thr Glu Asn Gly Gly Gly Glu Phe Val Asp Leu Arg Arg Arg Lys Ser 20 25 30 Arg Ser Asp Ser Asn Gly Val Leu Ser Gly Ser Asp Asn Pro Pro Ser 35 40 45 Val Asp Val Gly Ala Pro Ala Asp Val Arg Asp Arg Ile Asp Ser Val 50 55 60 Val Asn Asp Asp Ala Gln Gly Thr Thr Ala Asn Leu Ala Gly Asp Thr 65 70 75 80 Glu Ile Arg Glu Thr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Glu Gly 85 90 95 Gly Arg Gly Asn Ala Glu Thr Thr Tyr Thr Tyr Arg Pro Ser Val Pro 100 105 110 Ala His Arg Arg Ala Arg Glu Ser Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ile Phe 115 120 125 Lys Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile 130 135 140 Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr Gly Trp 145 150 155 160 Leu Ile Arg Thr Asp Phe Trp Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp Trp 165 170 175 Pro Leu Phe Met Cys Cys Leu Ser Leu Ser Phe Phe Pro Leu Ala Ala 180 185 190 Phe Thr Val Glu Lys Leu Val Leu Gln Lys Cys Ile Ser Glu Pro Val 195 200 205 Val Ile Ile Leu His Ile Ile Ile Thr Met Thr Glu Val Leu Tyr Pro 210 215 220 Val Tyr Val Thr Leu Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly Val Thr 225 230 235 240 Leu Met Leu Leu Thr Cys Ile Val Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala 245 250 255 His Thr Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Leu Ala Asn Ser Ala Asp Lys Ala 260 265 270 Asn Pro Glu Val Ser Tyr Tyr Val Ser Leu Lys Ser Leu Ala Tyr Phe 275 280 285 Met Val Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Pro 290 295 300 Cys Ile Arg Lys Gly Trp Val Ala Arg Gln Phe Ala Lys Leu Val Ile 305 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Claims (4)

  1. 대상 식물체의 DGAT1 단백질의 아미노산 서열에서 서열번호 1의 서열에서 123번 및 124번 위치에 대응되는 위치의 세린이 각각 아르기닌 및 류신으로 치환되거나, 서열번호 1의 서열에서 416번 위치에 대응되는 위치의 트립토판이 시스테인으로 치환되고 419번 위치에 대응되는 위치의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 단백질을 형성하도록 DGAT1 유전자의 염기를 치환하는 단계; 또는
    대상 식물체의 DGAT1 유전자에서 서열번호 2의 서열에서 146번 내지 226번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키거나; 서열번호 2의 서열에서 147번 내지 212번 위치 또는 156번 내지 212번 위치에 대응되는 위치의 염기를 결실시키고, 그 위치에 임의의 염기 한 개를 추가하는 단계; 를 포함하는,
    식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 치환은 유전자 가위를 사용하여 수행되는 식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 결실은 유전자 가위를 사용하여 수행되는 식물체의 오메가 3 지방산의 함량을 증가시키는 방법.
  4. 청구항 1의 식물체의 형질전환된 종자.
KR1020210017565A 2021-02-08 2021-02-08 식물체의 오메가 3 지방산 함량 증가 방법 KR102536297B1 (ko)

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