KR102533978B1 - Method for preparing a composition for controlling weeds using Streptomyces sp. DS001 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 스트렙토마이세스 속 DS001 균주를 이용한 잡초 방제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a composition for controlling weeds using a DS001 strain of the genus Streptomyces.
잡초 혹은 잡풀은 절대적인 것이 아니고 상대적인 개념으로 인간이 농경생활을 시작하면서 발생한 것으로 때와 장소에 적절하지 않은 식물을 말한다. 잡초는 작물재배에서 광, 양분, 수분 등의 경합으로 작물의 생산성과 상품성을 크게 저하시키거나 병해충의 매개, 농작업을 곤란하게 하는 주요 방제 대상이다. 잡초는 장소, 계절, 환경 등에 상관없이 연중 발생하며, 방제에 많은 노력과 비용이 소요된다. 또한, 잡초는 많은 종류가 있고 다양하기 때문에 식물분류학적 분류, 형태학적 분류에 따라 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 방동사니과 잡초로 구분하며, 생활형에 따라 일년생잡초, 월년생잡초 및 다년생잡초로 나누고 있다. 그러므로 일반적으로 잡초는 화본과 일년생잡초·다년생잡초, 광엽 일년생잡초·다년생잡초 그리고 방동사니과 일년생잡초·다년생잡초 등으로 분류하거나, 반대로 일년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초 또는 다년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초로 구분한다. Weeds or weeds are not absolute, but relative concepts, and they are plants that are not appropriate for the time and place, which occurred when humans started agricultural life. Weeds are major control targets that greatly reduce the productivity and marketability of crops due to competition for light, nutrients, and moisture in crop cultivation, mediate pests, and make agricultural work difficult. Weeds occur throughout the year regardless of location, season, environment, etc., and a lot of effort and money are required to control them. In addition, since there are many types of weeds and they are diverse, they are divided into flower and weeds, broad-leaved weeds, and weeds according to plant taxonomic classification and morphological classification, and divided into annual weeds, monthly weeds and perennial weeds according to life type. Therefore, in general, weeds are classified into flowering plants, annual weeds, perennial weeds, broad-leaved annual weeds, perennial weeds, and panicle annual weeds, perennial weeds, etc., or conversely, annual flowers and weeds, broad-leaved weeds, panicle weeds, or perennial flowers and weeds, broad-leaved weeds, and fireflies weeds. separated by
화본과(grasses) 잡초의 줄기에는 잘 구분될 수 있는 마디와 마디 사이가 있고, 잎은 마디로부터 어긋나기로 나 있으며 잎은 줄기를 둘러싸서 보호하는 잎집(leaf sheath)과 잎몸(leaf blade)으로 나누어지는데 잎몸은 좁고 기다란 모양으로 잎맥(leaf vein)이 평행하게 형성된 것이 특징이다. 피, 바랭이, 뚝새풀, 강아지풀, 갈대, 억새 등이 이에 속한다. 방동사니과(sedges)에 속하는 잡초들은 화본과와 비슷한 점이 있으나 대부분 줄기 횡단면이 삼각형 모양이며 잎혀나 잎귀가 없다는 점으로 구분이 된다. 잎은 좁고 능선이 있으며 끝이 뾰족하고 소수에 작은 꽃이 달린다. 방동사니, 너도방동사니, 올방개, 매자기, 올챙이고랭이 등이 속한다. 광엽(broad leaves) 잡초란 화본과 잡초나 방동사니과 잡초에 속하지 않는 식물로서 말 그대로 잎이 비교적 넓은 잡초이다. 잎은 주로 타원형, 난형, 피침형이며 엽맥이 그물처럼 얽혀 있는 것이 특징이다. 우리 주변에서 흔히 발생하는 망초, 토끼풀, 쑥, 냉이, 비름, 물달개비, 가래, 가막사리 등 많은 잡초가 이 범주에 속한다. The stems of grasses and weeds have well-distinguished nodes and internodes, and leaves grow alternately from the nodes, and the leaves are divided into leaf sheaths and leaf blades that surround and protect the stems. The leaf body is narrow and long, and the leaf veins are formed in parallel. Blood, indica, foxtail, foxtail, reed, and silver grass belong to this category. Weeds belonging to the Sedges family have similarities with Sedges, but most of them are distinguished by the fact that the cross section of the stem is triangular and there is no ligule or leaf auricle. The leaves are narrow and ridged, with pointed tips, and a small number of small flowers. These include cockroaches, spiny spinners, olbanggae, barnacles, and tadpole gorillas. A broad leaf weed is a plant that does not belong to the herbaceous weeds or weeds of the family Dipperaceae, and is literally a weed with relatively wide leaves. The leaves are mainly elliptical, ovate, and lanceolate, and the leaf veins are intertwined like a net. Many weeds such as egret, shamrock, mugwort, shepherd's purse, amaranth, waterweed, sputum, and viburnum, which are common around us, belong to this category.
현재 잡초 방제를 위하여 저렴한 비용으로 높은 제초 활성을 나타내는 여러 가지 유기합성 제초제를 사용하고 있으나, 저항성 잡초 출현, 환경에 대한 유해성 및 잔류 독성이 문제로 지적되고 있다. 특히 유기합성 제초제의 장기 사용으로 인한 저항성 잡초의 출현은 심각한 사회경제적 문제로까지 인식되고 있다(Riches 등 1996). 그러나 우수한 방제효과를 나타내는 벤조비사이클론(benzobicyclon)과 메조트리온(mesotrione), 테푸릴트리온(tefuryltrione) 등과 같은 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(DPPH) 저해제가 개발된 이후 새로운 작용점을 갖는 제초제의 개발 성과가 없는 실정이다(Prisbylla 등 1993; Schultz등 1993). 따라서 새로운 구조의 신규 작용점을 갖는 합성 제초제에 대한 개발이 요구되고 있지만, 합성 제초제가 환경이나 생태계에 미치는 영향이 심각한 수준은 아님에도 불구하고, 소득 향상과 삶의 질을 중시하는 풍토가 조성되면서 친환경 농업에 대한 관심이 높아지고 화학농약의 사용을 저감시키려는 각국의 강력한 규제 때문에 유기합성 제초제 개발 여건은 녹록하지 않은 것이 현실이다.Currently, various organic synthetic herbicides exhibiting high herbicidal activity at low cost are used for weed control, but the emergence of resistant weeds, environmental harm and residual toxicity are pointed out as problems. In particular, the emergence of resistant weeds due to the long-term use of synthetic organic herbicides is recognized as a serious socio-economic problem (Riches et al. 1996). However, after the development of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (DPPH) inhibitors such as benzobicyclon, mesotrione, and tefuryltrione, which exhibit excellent control effects, the development of herbicides with new points of action has begun. There is no current situation (Prisbylla et al. 1993; Schultz et al. 1993). Therefore, although the development of synthetic herbicides with a new structure and a new point of action is required, although the impact of synthetic herbicides on the environment or ecosystem is not serious, a climate that emphasizes income improvement and quality of life is created, making it eco-friendly. Due to growing interest in agriculture and strong regulations in each country to reduce the use of chemical pesticides, the reality is that the conditions for the development of organic synthetic herbicides are not easy.
바랭이(Digitaria ciliaris)는 한해살이 풀로서 밭, 밭둑, 과원, 도로변 및 공한지에 발생하는 대표적인 밭잡초이고 여름 밭작물 재배포장에서 가장 문제되는 잡초중의 하나로 일년생 화본과 잡초이다. 땅 위를 기면서 줄기 밑 부분의 마디에서 새 뿌리가 나와 아주 빠르게 퍼져 나가며 줄기의 윗 부분은 곧게 서는데 키는 30~70 cm 정도이다. 줄기 아래에 나는 잎은 길이 8~20 cm, 너비 5~15 mm 정도이며 털이 있다. 꽃차례의 길이는 4~8 mm 정도로 아주 가늘고 곧은데 줄기에서 3~8개의 가지로 갈라지고 꽃차례는 불그스레하거나 자줏빛을 띠며 가는 이삭이 열린다. 토양이 건조하거나 습한 조건이 번갈아 나타나는 시기에 발아를 많이 하며 특히 봄철에 토양 온도 12~15℃에서 최적의 발아조건이 형성된다. 경작지에 침범하게 되면 주로 영양분과 공간을 두고 농작물과 경쟁하여 농작물의 생장을 저해하는 문제가 있다.Indica ( Digitaria ciliaris ) is an annual grass and is a representative field weed that occurs in fields, field embankments, orchards, roadsides and empty areas, and is one of the most problematic weeds in summer field crop cultivation and is an annual flower and weed. Crawling on the ground, new roots come out from the node at the bottom of the stem and spread very quickly. The leaves growing under the stem are 8-20 cm long and 5-15 mm wide and have hairs. The length of the inflorescence is about 4-8 mm, very thin and straight, and the stem splits into 3-8 branches, and the inflorescence is reddish or purple with thin ears. It germinates a lot when the soil is dry or wet conditions alternate, and the optimum germination condition is formed especially in spring at a soil temperature of 12~15℃. When it invades farmland, there is a problem of inhibiting the growth of crops by competing with crops mainly for nutrients and space.
이에, 본 발명자들은 새로운 개념의 제초제로 친환경적인 천연물 유래 제초제를 찾고자 노력하던 중 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) DS001 균주 또는 이의 배양액이 잡초 방제 활성을 가지며 특히 바랭이(Digitaria ciliaris)에 대해 살초 활성을 나타냄을 확인하고, 이 균주를 배양하여 우수한 제초 활성을 나타내는 잡초 방제용 조성물을 제조하는 방법을 개발하였다.Accordingly, the present inventors, while trying to find an eco-friendly natural product-derived herbicide as a new concept herbicide, found that the novel Streptomyces sp. DS001 strain or its culture medium has weed control activity, especially against Digitaria ciliaris. After confirming the herbicidal activity, a method for preparing a weed control composition exhibiting excellent herbicidal activity by culturing this strain was developed.
본 발명의 목적은, 스트렙토마이세스 속 DS001 균주를 이용한 잡초 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for controlling weeds using the Streptomyces genus DS001 strain.
본 발명의 다른 목적은, 바랭이(Digitaria ciliaris)에 대한 제초 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 DS001 균주를 이용한 잡초 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for controlling weeds using a DS001 strain of the genus Streptomyces having herbicidal activity against indica ( Digitaria ciliaris ).
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem (s), and another problem (s) not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) DS001 균주(KCTC15136BP)를 배양하는 것을 특징으로 하는, 잡초 방제용 조성물의 제조방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for producing a composition for controlling weeds, characterized in that culturing the Streptomyces sp. DS001 strain (KCTC15136BP).
상기 조성물은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) DS001 균주(KCTC15136BP) 또는 이의 배양액을 포함할 수 있다.The composition may include Streptomyces sp. DS001 strain (KCTC15136BP) or a culture solution thereof.
상기 조성물은 잡초 발아율을 억제하고 제초 활성을 가지는 것 일 수 있다.The composition may inhibit weed germination and have herbicidal activity.
상기 잡초 방제용 조성물의 제조방법은 상기 균주를 온도 25 내지 30℃에서 배양하는 것 일 수 있다. Method for producing the composition for controlling weeds may be to incubate the strain at a temperature of 25 to 30 ℃.
상기 잡초 방제용 조성물의 제조방법은 상기 균주를 교반 속도 150 내지 200 rpm에서 배양하는 것 일 수 있다. The manufacturing method of the weed control composition may be to culture the strain at an agitation speed of 150 to 200 rpm.
상기 잡초 방제용 조성물의 제조방법은 상기 균주를 pH 5.5 내지 7에서 배양하는 것 일 수 있다. The manufacturing method of the weed control composition may be to culture the strain at pH 5.5 to 7.
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) DS001 균주를 이용한 잡초 방제용 조성물은 잡초 방제 활성을 나타내므로, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) DS001 균주를 배양함으로써 화본과 잡초, 특히 바랭이(Digitaria ciliaris)에 대한 방제 활성이 우수한 잡초 방제용 조성물을 제조할 수 있는 효과가 있다.According to the present invention, the weed control composition using the Streptomyces sp. DS001 strain exhibits weed control activity, so by culturing the Streptomyces sp. DS001 strain, flowers and weeds, especially indica ( Digitaria ciliaris ) has the effect of preparing a composition for controlling weeds with excellent control activity.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 16개 균주의 바랭이 생장에 대한 제초 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 균주 DS001 배양액을 온실 조건에서 바랭이에 경엽처리 7일 후 생장 억제 효과를 대조군과 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 균주 DS001의 16S rRNA의 유전자 염기서열 분석에 근거한 계통수를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 균주 DS001를 다양한 온도에서 배양 시 배양 7일 후 제초 활성을 나타낸 그래프이고, 도 4b는 스트렙토마이세스 균주 DS001를 다양한 교반 속도에서 배양 시 배양 7일 후 제초 활성을 나타낸 그래프이며, 도 4c는 스트렙토마이세스 균주 DS001를 다양한 pH에서 배양 시 배양 7일 후 제초 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 파라콰트(paraquat), 글루포시네이트 암모늄(glufosinate ammonium) 및 스트렙토마이세스 속 균주 DS001 배양액을 바랭이(Digitaria ciliaris)에 처리할 때 처리 농도에 따른 엽록소 함량을 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 파라콰트(paraquat), 글루포시네이트 암모늄(glufosinate ammonium) 및 스트렙토마이세스 속 균주 DS001 배양액을 오이(C. sativus)에 처리할 때 시간에 따른 전해질 누출을 비교한 그래프이다.1 is a graph comparing herbicidal activity against indica growth of 16 strains of the genus Streptomyces according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 compares the growth inhibitory effect of the Streptomyces genus strain DS001 culture medium according to an embodiment of the present invention with that of the control group after 7 days of foliar treatment in indica in greenhouse conditions.
Figure 3 shows a phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence analysis of Streptomyces genus strain DS001 according to an embodiment of the present invention.
Figure 4a is a graph showing the herbicidal activity after 7 days of culturing Streptomyces strain DS001 according to an embodiment of the present invention at various temperatures, Figure 4b is cultured when Streptomyces strain DS001 is cultured at various stirring speeds It is a graph showing herbicidal activity after 7 days, and FIG. 4c is a graph showing herbicidal activity after 7 days of culture when Streptomyces strain DS001 is cultured at various pHs.
Figure 5 compares the chlorophyll content according to the treatment concentration when treating paraquat, glufosinate ammonium and Streptomyces genus strain DS001 culture medium according to an embodiment of the present invention to indica ( Digitaria ciliaris ) it is a graph
Figure 6 compares electrolyte leakage over time when paraquat, glufosinate ammonium and Streptomyces genus strain DS001 culture medium are treated with cucumber ( C. sativus ) according to an embodiment of the present invention. it is a graph
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.Before describing the present invention in detail, the terms or words used in this specification should not be construed as unconditionally limited in a conventional or dictionary sense, and in order for the inventor of the present invention to explain his/her invention in the best way It should be noted that concepts of various terms may be appropriately defined and used, and furthermore, these terms or words should be interpreted as meanings and concepts corresponding to the technical idea of the present invention.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.That is, the terms used in this specification are only used to describe preferred embodiments of the present invention, and are not intended to specifically limit the contents of the present invention, and these terms represent various possibilities of the present invention. It should be noted that it is a defined term.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.In addition, in this specification, it should be noted that singular expressions may include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise, and similarly, even if they are expressed in plural numbers, they may include singular meanings. do.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.Throughout this specification, when a component is described as "including" another component, it does not exclude any other component, but further includes any other component, unless otherwise stated. It can mean you can do it.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.In addition, in the following description of the present invention, a detailed description of a configuration that is determined to unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, for example, the known technology including the prior art, may be omitted.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 기탁번호 KCTC15136BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) DS001 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는, 잡초 방제용 조성물의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a composition for controlling weeds, characterized by culturing the Streptomyces sp. DS001 strain deposited with Accession No. KCTC15136BP.
상기 조성물은 스트렙토마이세스 속 DS001 균주[이하, 'DS001 균주' 또는 '균주 DS001' 라고 함] 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 한다.The composition is characterized in that it comprises a DS001 strain of the genus Streptomyces [hereinafter referred to as 'DS001 strain' or 'strain DS001'] or a culture solution thereof.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 DS001 균주는 경기도, 강원도, 충청북도, 충청남도, 경상북도, 경상남도 및 전라북도의 13개 장소의 다양한 산림, 비농경지로부터 분리 배양을 통해 동정하였다.The DS001 strain of the genus Streptomyces according to the present invention was identified through isolation and culture from various forests and non-agricultural lands in 13 locations in Gyeonggi-do, Gangwon-do, Chungcheongbuk-do, Chungcheongnam-do, Gyeongsangbuk-do, Gyeongsangnam-do and Jeollabuk-do.
상기 DS001 균주는 16S rRNA 유전자 상동성 검색에서, 스트렙토마이세스 포미카에와 99%의 상동성을 나타내는 신규한 균주로 확인되었는 바, 이는 스트렙토마이세스 포미카에(Streptomyces formicae) 균주로 분류되었다.The DS001 strain was identified as a new strain showing 99% homology with Streptomyces formicae in a 16S rRNA gene homology search, and was classified as a Streptomyces formicae strain.
본 발명자들은 상기 신규한 균주를 스트렙토마이세스 속 DS001(Streptomyces sp. DS001) 균주로 명명하여 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2022년 10월 17일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC15136BP를 부여받았다.The present inventors named the novel strain as Streptomyces sp. DS001 ( Streptomyces sp. DS001) strain and deposited it at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) on October 17, 2022, and was given accession number KCTC15136BP.
상기 배양액은 미생물 균주를 배지에서 배양한 결과물로서 미생물의 대사산물을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 균주를 배양한 액체 배지일 수 있으나 이에 제한되지 않으며 통상의 미생물 배양 배지에 균주를 배양한 것 일 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양한 배양액 또는 상기 배양액을 물리적으로 여과한 배양여액일 수 있으며, 상기 배양액은 희석하지 않거나 희석하여 잡초에 처리할 수 있다. 상기 배양액은 잡초에 제초 활성을 나타내는 한, 여과, 농축, 희석 등의 처리 과정을 거쳐 잡초에 처리될 수 있다.The culture solution is a result of culturing a microbial strain in a medium and may include metabolites of the microorganism. The culture medium may be a liquid medium in which the strain is cultured, but is not limited thereto, and the strain may be cultured in a conventional microbial culture medium. In addition, the culture solution may be a culture solution in which the strain is cultured or a culture filtrate obtained by physically filtering the culture solution, and the culture solution may be undiluted or diluted to treat weeds. As long as the culture broth exhibits herbicidal activity against weeds, it can be treated with weeds through treatment processes such as filtration, concentration, and dilution.
상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물은 잡초 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물의 잡초 방제 활성은 잡초의 발아율을 억제하고 잡초에 독성을 가져 제초 활성을 가지는 것 일 수 있다. 상기 잡초 방제 활성은 잎이 황갈색으로 변하고 식물의 생장이 멈춰 고사에 이르게 한다. 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예로서 DS001 균주의 배양액 처리 시 바랭이의 생장을 감소시켜 고사에 이르게 함을 확인하였다. 또한, 표 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예로서 토양에 DS001 균주의 배양액 처리 시 바랭이 종자에 효과적인 발아 억제 및 제초 활성을 보여주었다. The composition containing the DS001 strain or its culture medium is characterized in that it has weed control activity. In addition, the weed control activity of the composition may inhibit the germination rate of weeds and have herbicidal activity by being toxic to weeds. The weed control activity causes the leaves to turn yellowish brown and stop plant growth leading to death. Referring to FIG. 2, as an example of the present invention, it was confirmed that the growth of indica was reduced to lead to death when the culture solution of the DS001 strain was treated. In addition, referring to Table 1, as an example of the present invention, when soil was treated with a culture solution of strain DS001, effective germination inhibition and herbicidal activity were shown on indica seeds.
상기 조성물은 상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 25% 내지 100% 함유한 희석액을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 50% 내지 100% 함유한 희석액을 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 75% 내지 100% 함유한 희석액을 포함할 수 있다. 구체적으로는 표 1에 따르면, DS001 균주 또는 이의 배양액을 25% 내지 100% 함유한 희석액은 잡초의 발아율을 30% 미만으로 억제하고, 50% 내지 100% 함유한 희석액은 잡초의 발아율을 10% 미만으로 억제하며, 75% 내지 100% 함유한 희석액은 잡초의 발아율을 0%로 억제하는 효과가 있다. 또한 DS001 균주 또는 이의 배양액을 25% 내지 100% 함유한 희석액은 잡초를 30% 이상 제거하고, 50% 내지 100% 함유한 희석액은 잡초의 발아율을 40% 이상으로 억제하며, 75% 내지 100% 함유한 희석액은 잡초의 발아율을 75% 이상으로 억제하는 효과가 있다.The composition may include a diluent containing 25% to 100% of the DS001 strain or a culture thereof, preferably a dilution containing 50% to 100% of the DS001 strain or a culture thereof, more preferably Preferably, it may include a diluted solution containing 75% to 100% of the DS001 strain or its culture medium. Specifically, according to Table 1, the dilution solution containing 25% to 100% of the DS001 strain or its culture medium suppresses the germination rate of weeds to less than 30%, and the dilution solution containing 50% to 100% suppresses the germination rate of weeds to less than 10%. , and the diluted solution containing 75% to 100% has the effect of suppressing the germination rate of weeds to 0%. In addition, the diluted solution containing 25% to 100% of the DS001 strain or its culture medium removes weeds by 30% or more, and the diluted solution containing 50% to 100% suppresses the germination rate of weeds by 40% or more, and contains 75% to 100% One diluted solution has the effect of suppressing the germination rate of weeds by more than 75%.
상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물은 화본과 잡초에 대한 방제 활성을 나타낼 수 있고, 특히 바랭이(Digitaria ciliaris)에 대하여 잡초 방제 활성을 나타낼 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The composition containing the DS001 strain or its culture may exhibit control activity against flowers and weeds, and in particular, may exhibit weed control activity against indica ( Digitaria ciliaris ), but is not limited thereto.
상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물은 잡초의 엽록소 손실을 일으켜 광합성을 억제할 수 있다. 광합성 억제는 엽록체에서 빛 의존 반응과 전자 전달 시스템을 억제하여 활성 산소를 축적하고 세포막을 산화시켜 괴사시키므로 엽록소 손실은 제초 활성의 지표로 사용된다. 도 5는 파라콰트, 글루포시네이트 암모늄 및 균주 DS001 배양액을 바랭이에 처리할 때 처리 농도에 따른 엽록소 함량을 비교한 것으로, 이를 참조하면 균주 DS001의 배양액은 농도가 증가함에 따라 엽록소 함량이 점차 감소하였고, 잡초의 엽록소 함량을 감소시켜 광합성을 억제하는 것으로 확인되었다.The composition containing the DS001 strain or its culture medium can inhibit photosynthesis by causing loss of chlorophyll in weeds. Photosynthesis inhibition inhibits light-dependent reactions and electron transport systems in chloroplasts, accumulates active oxygen, oxidizes cell membranes, and causes necrosis, so chlorophyll loss is used as an indicator of herbicidal activity. Figure 5 compares the chlorophyll content according to the treatment concentration when paraquat, glufosinate ammonium, and strain DS001 culture medium were treated with indica. Referring to this, the culture medium of strain DS001 gradually decreased in concentration as the concentration increased, It has been found to inhibit photosynthesis by reducing the chlorophyll content of weeds.
상기 DS001 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물은 잡초의 세포막을 파괴할 수 있다. 도 6은 식물 세포막의 파괴를 알아보기 위해 균주 DS001 배양액, 파라콰트 및 글루포시네이트 암모늄 처리 후 전해질 누출 분석을 수행한 것으로, 이를 참조하면 균주 DS001 배양액은 처리 후 시간이 지남에 따라 잡초의 전해질 누출량이 점진적으로 증가했고 따라서 균주 DS001 배양액은 잡초의 세포막을 파괴했음을 알 수 있다.The composition containing the DS001 strain or its culture medium can destroy the cell membrane of weeds. 6 is an analysis of electrolyte leakage after treatment of strain DS001 culture medium, paraquat and glufosinate ammonium in order to determine the destruction of plant cell membranes. It was gradually increased, so it can be seen that the strain DS001 culture medium destroyed the cell membrane of the weed.
상기 DS001 균주는 잡초 방제 활성을 위하여 온도 20 내지 35℃에서 배양되는 것이 바람직하고, 온도 25 내지 30℃에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 도 4a를 참조하면, 온도 25 내지 30℃에서 DS001 균주의 제초활성이 가장 높게 나타나고 그 이후로는 제초활성이 낮아짐을 알 수 있다.The DS001 strain is preferably cultured at a temperature of 20 to 35 ° C., more preferably at a temperature of 25 to 30 ° C. for weed control activity. Referring to Figure 4a, it can be seen that the herbicidal activity of the DS001 strain is the highest at a temperature of 25 to 30 ° C, and the herbicidal activity decreases thereafter.
상기 DS001 균주는 잡초 방제 활성을 위하여 교반 속도 50 내지 200 rpm에서 배양될 수 있고, 교반 속도 100 내지 200 rpm에서 배양되는 것이 바람직하며, 교반 속도 150 내지 200 rpm에서 배양되는 것이 가장 바람직하다. 도 4b를 참조하면, 교반 속도 150 내지 200 rpm에서 DS001 균주의 제초활성이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있다.The DS001 strain can be cultured at an agitation speed of 50 to 200 rpm for weed control activity, preferably cultured at an agitation speed of 100 to 200 rpm, and most preferably cultured at an agitation speed of 150 to 200 rpm. Referring to Figure 4b, it can be seen that the herbicidal activity of the DS001 strain is the highest at an agitation speed of 150 to 200 rpm.
상기 DS001 균주는 잡초 방제 활성을 위하여 pH 3.0 내지 10에서 배양될 수 있고, pH 5.5 내지 10에서 배양될 수 있으며, pH 5.5 내지 8.5에서 배양되는 것이 바람직하며, pH 5.5 내지 7.0에서 배양되는 것이 가장 바람직하다. 도 4c를 참조하면, pH 5.5 내지 7.0에서 DS001 균주의 제초활성이 가장 높게 나타나고 그 이후로는 제초활성이 낮아짐을 알 수 있다.The DS001 strain may be cultured at pH 3.0 to 10, pH 5.5 to 10, preferably cultured at pH 5.5 to 8.5, and most preferably cultured at pH 5.5 to 7.0 for weed control activity. do. Referring to Figure 4c, it can be seen that the herbicidal activity of the DS001 strain is the highest at pH 5.5 to 7.0, and the herbicidal activity decreases thereafter.
실시예Example
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to explain the present invention in detail. However, the embodiments according to the present invention can be modified in many different forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the embodiments described below. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
재료 및 방법Materials and Methods
1. 토양 시료1. Soil samples
토양 시료는 2018년 4월 중 경기도, 강원도, 충청북도, 충청남도, 경상북도, 경상남도 및 전라북도의 13개 장소의 다양한 산림, 비농경지에서 10-20 cm 깊이의 식물 근권에서 채취하였고, 4℃로 실험실에서 보관하였다. 각 시료를 실온에서 건조시킨 후 분쇄하고 2 mm 메쉬 체를 통과시켜 준비하였다.Soil samples were collected from plant rhizospheres at a depth of 10-20 cm in various forests and non-agricultural lands in 13 locations in Gyeonggi-do, Gangwon-do, Chungcheongbuk-do, Chungcheongnam-do, Gyeongsangbuk-do, Gyeongsangnam-do, and Jeollabuk-do during April 2018, and stored in the laboratory at 4℃. did Each sample was dried at room temperature, ground, and prepared by passing through a 2 mm mesh sieve.
2. 스트렙토마이세스의 분리 및 배양 준비2. Isolation of Streptomyces and Preparation for Culture
각 시료 1 g을 멸균 시험관에 있는 9 mL의 증류수에 현탁하고 볼텍스 하였다. 그 다음 토양 용액을 10-3까지 연속 희석한 후, 희석액의 100 μL 분취량을 부식산-비타민(humic acid-vitamin, HV) 한천[20 g 미생물 배지용 한천(bacteriological agar), 0.5 g MgSO4, 5 g Na2HPO4, 0.2 g CaCO3, 10 g 부식산, 20 g KCL, 5 g 사이클로헥시미드, 및 1 L 증류수)에 스프레드 하였다. 배양 플레이트를 박테리아 콜로니의 포자가 형성될 때까지 14일 동안 암실에서 25℃에서 인큐베이션하였다. 스트렙토마이세스의 대표적인 콜로니를 신선한 베넷 한천 플레이트[Bennet's agar plate: 포도당 10 g, 효모 추출물 1 g, 펩톤 2 g, 쇠고기 추출물 1 g, 미생물 배지용 한천 20 g, 증류수 1 L]에 선별하여 도말한 후 25℃에서 7시간 동안 배양하였다. 베넷 한천 배지로부터 분리된 스트렙토마이세스 균주의 순수한 콜로니를 신선한 M3 액체 배지(20 g 소이톤, 20 g 포도당, 40 g 가용성 전분, 6 g CaCO3 및 1 L 증류수)에서 배양하고 7일 동안 27℃에서 회전식 진탕기(160 rpm)에서 배양하였다. 발효액을 10분(8,000 rpm) 동안 원심분리하여 박테리아의 바이오매스를 수확하였다.1 g of each sample was suspended in 9 mL of distilled water in a sterile test tube and vortexed. The soil solution was then serially diluted to 10 -3 , then 100 μL aliquots of the dilutions were added to humic acid-vitamin (HV) agar [20 g bacteriological agar, 0.5 g MgSO 4 ]. , 5 g Na 2 HPO 4 , 0.2 g CaCO 3 , 10 g humic acid, 20 g KCL, 5 g cycloheximide, and 1 L distilled water). Culture plates were incubated at 25° C. in the dark for 14 days until bacterial colonies sporulated. A representative colony of Streptomyces was selected and smeared on a fresh Bennett's agar plate [Bennet's agar plate: glucose 10 g, yeast extract 1 g, peptone 2 g, beef extract 1 g, microbial agar 20 g, distilled water 1 L] After incubation at 25 ℃ for 7 hours. Pure colonies of Streptomyces strains isolated from Bennett's agar medium were cultured in fresh M3 broth (20 g soytone, 20 g glucose, 40 g soluble starch, 6 g CaCO 3 and 1 L distilled water) at 27°C for 7 days. were cultured on a rotary shaker (160 rpm). Bacterial biomass was harvested by centrifuging the fermentation broth for 10 minutes (8,000 rpm).
3. 스트렙토마이세스 배양액의 경엽처리효과3. Foliage treatment effect of Streptomyces culture medium
스트렙토마이세스 균주 배양액을 바랭이(Digitaria ciliaris)에 처리하여 온실 조건(30/25 ± 5℃, 명암 = 14/10 h)에서 제초 활성을 확인하였다. 바랭이는 밭작물에서 중요한 잡초로, 이를 방제하지 않으면 높은 수확량 손실이 발생할 수 있다. 바랭이 종자 20-25개를 원예용 상토를 포함하는 포트에 파종하였으며 온실 조건에서 7-10일 동안 생장하였다. 스트렙토마이세스 배양여액 5 mL을 바랭이 잎에 살포하였다. 모든 처리에 0.1% tween-20을 추가하였다. 제초 활성은 7 DAT (days after treatment)에서 처리되지 않은 대조군 식물과 비교하여 달관조사하였다. 고사(mortality)의 생리학적 및 형태학적 증상의 평가는 브라질 잡초과학원(SBCPD)의 고사율을 기준으로 평가하였다(0%=손상 없음, 20-40%=경미한 손상 또는 빠른 회복과 함께 성장의 영향 또는 감소, 40- 60%=중등도 손상 또는 느린 회복 또는 최종적인 성장 감소, 60-80%=심각한 손상 또는 회복 불가능한 성장 감소 및/또는 스탠드 감소, 80-100%=완전한 파괴 또는 극소수의 생존).The herbicidal activity was confirmed by treating the Streptomyces strain culture medium to Indica ( Digitaria ciliaris ) under greenhouse conditions (30/25 ± 5 ° C., light/dark = 14/10 h). Indica is an important weed in field crops and can cause high yield losses if not controlled. 20-25 Indica seeds were sown in pots containing horticultural medium and grown for 7-10 days in greenhouse conditions. 5 mL of the Streptomyces culture filtrate was sprayed on the leaves of Indica. 0.1% tween-20 was added to all treatments. Herbicidal activity was evaluated at 7 DAT (days after treatment) compared to untreated control plants. Evaluation of physiological and morphological symptoms of mortality was evaluated based on mortality rates of the Brazilian Academy of Weed Sciences (SBCPD) (0% = no damage, 20-40% = slight damage or effect of growth with rapid recovery) or reduction, 40-60% = moderate damage or slow recovery or eventual reduced growth, 60-80% = severe damage or irreversible growth reduction and/or reduced stand, 80-100% = complete destruction or very few survivors).
4. 스트렙토마이세스 배양액의 토양처리효과4. Soil treatment effect of Streptomyces culture medium
바랭이(Digitaria ciliaris) 종자 20개를 상업용 원예용 상토를 담은 포트에 1-2 cm 깊이로 심었다. 스트렙토마이세스 균주 DS001의 배양여액의 농도는 토양처리를 위해 25%, 50%, 75% 및 100%로 희석되었다. 포트당 5 mL 부피의 각 배양여액을 분무하였다. 대조군으로는 증류수를 사용하였다. 실험은 3회 반복으로 완전임의배치법으로 수행되었다. 제초활성은 처리 후 14일에 평가되었다. 종자 발아율은 다음 식에 의해 계산되었다.Twenty seeds of Indica ( Digitaria ciliaris ) were planted to a depth of 1-2 cm in pots containing commercial horticultural medium. The concentrations of the culture filtrate of Streptomyces strain DS001 were diluted to 25%, 50%, 75% and 100% for soil treatment. Each culture filtrate in a volume of 5 mL per pot was sprayed. Distilled water was used as a control. The experiment was performed in a completely randomized method with three repetitions. Herbicidal activity was evaluated 14 days after treatment. Seed germination rate was calculated by the following equation.
[계산식][formula]
종자 발아율=(발아된 종자수/총 종자수)x100Seed germination rate = (number of germinated seeds/total number of seeds) x 100
5. 16S rRNA 유전자 서열 분석5. 16S rRNA gene sequence analysis
제초 활성이 가장 높은 스트렙토마이세스 균주를 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 통해 특성화하였다. 16S rRNA는 범용 프라이머 27F (5'-AGAGRRTGARCCTGGCTCAG-3') 및 1492R (5'-GGRTACCTTGRRACGACTT-3')을 사용하여 증폭되었다. 100℃에서 10분간 가열하여 파괴된 단일 콜로니의 박테리아 세포로부터 게놈 DNA를 얻었다. 포자 형성 균주의 경우, 박테리아 세포를 완충액에서 650 W의 마이크로파에서 30초 동안 파괴했다. 현탁액을 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 2 μL의 상징액을 PCR에 사용하였다. PCR 산물은 SolGent Inc.(대전, 한국)에서 정제 및 시퀀싱되었다. 결과 시퀀스는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLASTn 프로그램으로 분석되었다. 계통수는 MEGA 6.0 프로그램을 사용하여 Neighbor-joining 방법으로 생성되었다.Streptomyces strains with the highest herbicidal activity were characterized through 16S rRNA gene sequencing. 16S rRNA was amplified using universal primers 27F (5′-AGAGRRTGARCCTGGCTCAG-3′) and 1492R (5′-GGRTACCTTGRRACGACTT-3′). Genomic DNA was obtained from single colonies of bacterial cells disrupted by heating at 100°C for 10 minutes. For sporulation strains, bacterial cells were disrupted in a microwave at 650 W for 30 seconds in buffer. The suspension was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. After centrifugation, 2 μL of supernatant was used for PCR. PCR products were purified and sequenced at SolGent Inc. (Daejeon, Korea). The resulting sequences were analyzed with the BLASTn program at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). The phylogenetic tree was generated by the neighbor-joining method using the MEGA 6.0 program.
6. 배양 조건 설정6. Setting up culture conditions
스트렙토마이세스 균주 DS001의 제초 활성을 측정하기 위해, 박테리아 분리물을 200 mL M3 액체 배지를 포함하는 500 mL 삼각 플라스크에 접종하였다. 접종 후, 박테리아 균주가 포함된 플라스크를 160 rpm에서 20, 25, 30 및 35℃ 범위의 온도, 50, 100, 150 및 200 rpm 범위의 교반 속도, 초기 pH를 3, 5.5, 7, 8.5, 10으로 하고 진탕기에서 7일 동안 27℃에서 진탕 배양한 후 배양여액을 바랭이에 처리하여 시험하였다. 달관평가는 처리 후 7일에 실시하였다.To measure the herbicidal activity of Streptomyces strain DS001, bacterial isolates were inoculated into 500 mL Erlenmeyer flasks containing 200 mL M3 broth. After inoculation, flasks with bacterial strains were incubated at temperatures ranging from 160 rpm to 20, 25, 30 and 35 °C, agitation rates ranging from 50, 100, 150 and 200 rpm, and initial pHs of 3, 5.5, 7, 8.5, 10 After culturing with shaking at 27 ℃ for 7 days in a shaker, the culture filtrate was treated and tested. Dalgwan evaluation was conducted 7 days after treatment.
7. 광합성 억제7. Inhibition of photosynthesis
바랭이 종자를 온실 조건(30/25 ± 5℃, 명암 = 14/10 h)에서 2주 동안 포트(6 cm Х 9 cm)에서 재배하였다. 100% 농도의 스트렙토마이세스 균주 DS001의 배양여액과 파라콰트[paraquat](1,155 g a.i./ha) 및 글루포시네이트 암모늄[glufosinate ammonium](900 g a.i./ha)을 2-3 엽기의 식물에 처리하였다. 처리 후 식물을 성장상(30/25±5℃, 명암 = 12/12시간)에서 배양하였다. 바랭이 잎의 광합성 억제율은 처리 24시간 후 엽록소 형광 측정기(Handy PEA, Hansatech Instruments, UK)로 측정하였다. 모든 처리는 각 시험에서 3회 반복되었다.Indica seeds were grown in pots (6 cm Х 9 cm) for 2 weeks under greenhouse conditions (30/25 ± 5 °C, light = 14/10 h). The culture filtrate of Streptomyces strain DS001 at 100% concentration, paraquat (1,155 g a.i./ha) and glufosinate ammonium (900 g a.i./ha) were treated with plants in the 2-3 leaf stage. . After treatment, the plants were cultured in the growth phase (30/25±5° C., light/dark = 12/12 hours). Photosynthesis inhibition rate of the leaves of indica was measured 24 hours after treatment with a chlorophyll fluorescence meter (Handy PEA, Hansatech Instruments, UK). All treatments were repeated 3 times in each test.
8. 전해질 누출 분석8. Electrolyte leakage analysis
1주 된 오이(Cucumis sativus) 자엽을 전해질 누출 분석을 위해 사용하였다. 총 30개의 잎 디스크(약 5 mm 직경)를 1 mM의 MES 완충액이 포함된 페트리디쉬에 넣은 다음, 스트렙토마이세스 배양여액 5 mL, 파라콰트(1,155 g a.i./ha) 및 글루포시네이트 암모늄(900 g a.i./ha) 각각을 페트리디시에 첨가했다. 미처리 대조군은 5 mL의 물을 첨가한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방식으로 제조되었다. 처리 후, 배양을 위해 페트리디쉬를 25℃에서 생장상에 두었다. 전해질 누출은 전자 전도도 측정기(TOA-DKKCM-21P, DKK TOA, Japan)를 사용하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 및 24 HAT에서 측정되었다.One-week-old cucumber ( Cucumis sativus ) cotyledons were used for electrolyte leakage assay. A total of 30 leaf discs (approximately 5 mm in diameter) were placed in a Petri dish containing 1 mM of MES buffer, followed by 5 mL of Streptomyces culture filtrate, paraquat (1,155 g ai/ha) and ammonium glufosinate (900 g). ai/ha) were each added to the petri dish. An untreated control was prepared in the same manner as above except that 5 mL of water was added. After treatment, the petri dish was placed on a growth bed at 25°C for culture. Electrolyte leakage was measured at 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 24 HAT using an electronic conductivity meter (TOA-DKKCM-21P, DKK TOA, Japan).
결과result
1. 제초활성을 가진 스트렙토마이세스 균주의 경엽처리효과1. Foliage treatment effect of Streptomyces strains with herbicidal activity
스크리닝 결과, 332 균주 중 16개 균주(4.8%)가 바랭이 생장에 상당한 억제 활성을 나타내었다. 16개 균주의 출처는 강원도 4개 균주, 경상북도와 충청남도 10개 균주, 경상남도 2개 균주로 확인되었다.As a result of the screening, 16 strains (4.8%) out of 332 strains showed significant inhibitory activity against indica growth. The sources of the 16 strains were identified as 4 strains from Gangwon-do, 10 strains from Gyeongsangbuk-do and Chungcheongnam-do, and 2 strains from Gyeongsangnam-do.
도 1에는 바랭이의 생장에 대해 선별된 16개 균주의 제초 활성을 나타내었다. 도 1을 참조하면, 선별된 16개 균주 중 DS012, DS077, DS001의 3개 균주는 바랭이의 증식 억제에 대해 상당한 활성을 보였다. 처리 후 7일에 균주 DS012 및 DS077 처리에서 바랭이에 대한 효과는 각각 88.3% 및 89.67%인 반면, 균주 DS001 처리 후 바랭이의 생장은 95.5% 감소하였다.1 shows the herbicidal activity of 16 strains selected for the growth of indica. Referring to FIG. 1, among the 16 selected strains, three strains, DS012, DS077, and DS001, showed significant activity against the growth inhibition of Indica. At 7 days after treatment, the effects on indica in the treatment of strains DS012 and DS077 were 88.3% and 89.67%, respectively, while the growth of indica after treatment with strain DS001 was reduced by 95.5%.
균주 DS012 및 DS077의 경우, 제초 활성을 나타내었지만 바랭이의 생장을 완전히 억제하지는 않았다. 도 2를 참조하면, 균주 DS001은 바랭이의 잎을 노랗게 만들며 식물의 생장을 정지시키며 결국 고사에 이르게 한다. 상기 균주 DS001은 스트렙토마이세스 속 DS001(Streptomyces sp. DS001) 균주로 명명하여 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2022년 10월 17일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC15136BP를 부여받았다.Strains DS012 and DS077 showed herbicidal activity but did not completely inhibit the growth of indica. Referring to FIG. 2, strain DS001 turns the leaves of indica yellow, stops the growth of the plant, and eventually leads to death. The strain DS001 was named as Streptomyces sp. DS001 strain and deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) on October 17, 2022, and was given accession number KCTC15136BP.
2. 제초활성을 가진 스트렙토마이세스 균주의 토양처리효과2. Soil treatment effect of Streptomyces strains with herbicidal activity
스트렙토마이세스 균주 DS001의 토양에 처리실험에서 바랭이 종자의 발아율은 미처리 대조군(95±1.25)과 비교하여 모든 농도에서 민감하게 나타났다(25%: 30±2.13, 50%: 10±1.53, 75%: 0, 100%: 0). In the soil treatment experiment of Streptomyces strain DS001, the germination rate of indian seeds was sensitive at all concentrations compared to the untreated control (95±1.25) (25%: 30±2.13, 50%: 10±1.53, 75%: 0, 100%: 0).
표 1을 참조하면, 온실 실험에서 스트렙토마이세스 균주 DS001 배양 여액은 처리 후 7일에 미처리 대조군과 비교하여 모든 농도(25%: 36.67±5.77, 50%: 45±15.00, 75%: 75±5.00, 100%: 90±5.00)에서 바랭이의 종자발아 억제에 효과적인 활성을 보여주었다.Referring to Table 1, in the greenhouse experiment, the Streptomyces strain DS001 culture filtrate was treated at all concentrations (25%: 36.67±5.77, 50%: 45±15.00, 75%: 75±5.00) compared to the untreated control on day 7. , 100%: 90±5.00) showed an effective activity in inhibiting seed germination of Indica.
3. 스트렙토마이세스 균주 DS001의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석3. 16S rRNA gene sequence analysis of Streptomyces strain DS001
분리된 스트렙토마이세스 균주 DS001은 범용 프라이머를 이용한 PCR 기법으로 16S rRNA 유전자 염기서열 분석하여 동정하였다. 스트렙토마이세스 균주 DS001의 계통발생학적 분석은 16S rRNA 서열과 스트렙토마이세스 속 15종의 16S rRNA 서열을 사용하여 Neighbor-joining 방법 기반으로 구축되었다. 염기서열 데이터는 GenBank에 수탁번호 NR146048.1로 등록되어 있다. BLAST 결과에 기초하여, 분리된 스트렙토마이세스 균주 DS001은 도 3에 도시된 바와 같이 스트렙토마이세스 포미카에(1H-GS9)와 99% 유사하였다. The isolated Streptomyces strain DS001 was identified by sequencing the 16S rRNA gene by PCR using universal primers. Phylogenetic analysis of Streptomyces strain DS001 was constructed based on the neighbor-joining method using 16S rRNA sequences and 16S rRNA sequences of 15 species of the genus Streptomyces. The nucleotide sequence data is registered in GenBank under the accession number NR146048.1. Based on the BLAST results, the isolated Streptomyces strain DS001 was 99% similar to Streptomyces formicae (1H-GS9) as shown in FIG. 3 .
4. 스트렙토마이세스의 생장에 대한 온도, 교반 및 pH의 영향4. Influence of temperature, agitation and pH on the growth of Streptomyces
스트렙토마이세스 균주 DS001을 전술한 온도(20, 25, 30 및 35℃), 교반 속도(50, 100, 150 및 200 rpm) 및 pH(3.0, 5.5, 7.0, 8.5 및 10.0)에서 배양하였고, 그 결과를 도 4a, 도 4b 및 도 4c에 나타내었다. Streptomyces strain DS001 was cultured at the aforementioned temperatures (20, 25, 30 and 35° C.), agitation rates (50, 100, 150 and 200 rpm) and pH (3.0, 5.5, 7.0, 8.5 and 10.0). The results are shown in Figures 4a, 4b and 4c.
도 4a, 도 4b 및 도 4c를 참조하면, 스트렙토마이세스 균주가 25-30℃의 온도, 150-200 rpm 사이의 교반 속도, pH 5.5-7 사이에서 높은 제초 활성을 보인 반면, 그 이상의 고온이나 더 높은 pH에서는 제초 활성은 감소하는 것으로 나타났다.Referring to Figures 4a, 4b and 4c, while the Streptomyces strain showed high herbicidal activity at a temperature of 25-30 ° C, an agitation speed of 150-200 rpm, and a pH of 5.5-7, at higher temperatures or higher Herbicidal activity was shown to decrease at higher pH.
5. 엽록소 함량에 대한 영향5. Effect on chlorophyll content
광합성을 억제하는 제초제는 엽록체에서 빛 의존 반응과 전자 전달 시스템을 억제하여 활성 산소를 축적하고 세포막을 산화시켜 괴사를 일으킨다. 따라서 엽록소의 감소는 활성 제초 대사산물에 대한 제초 활성의 지표로 사용된다. 스트렙토마이세스 균주 DS001, 파라콰트, 글루포시네이트 암모늄을 처리한 바랭이의 엽록소 함량을 엽록소 형광측정기로 평가하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. Herbicides that inhibit photosynthesis inhibit light-dependent reactions and electron transport systems in chloroplasts, resulting in necrosis by accumulating reactive oxygen species and oxidizing cell membranes. Thus, a decrease in chlorophyll is used as an indicator of herbicidal activity for active herbicidal metabolites. The chlorophyll content of the indica treated with Streptomyces strain DS001, paraquat, and glufosinate ammonium was evaluated using a chlorophyll fluorometer, and the results are shown in FIG. 5 .
도 5를 참조하면, 처리농도가 증가함에 따라 엽록소 함량이 전반적으로 감소하는 것으로 관찰되었다. 파라콰트의 경우 농도가 증가함에 따라 엽록소 함량이 급격히 감소하였다. 그러나 스트렙토마이세스 균주 DS001과 글루포시네이트 암모늄의 경우 파라콰트에 비해 약간의 편차를 보였다. 파라콰트(100%)를 처리한 바랭이는 무처리 대조군에 비해 엽록소 함량이 96% 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 스트렙토마이세스 균주 DS001의 배양여액과 글루포시네이트 암모늄 100% 농도 처리시 무처리 대조군에 비해 엽록소 함량이 65% 및 61% 감소한 것으로 관찰되었다. 따라서 스트렙토마이세스 균주 DS001의 배양여액이 광합성을 억제하는 것으로 확인되었다.Referring to Figure 5, it was observed that the chlorophyll content generally decreased as the treatment concentration increased. In the case of paraquat, the chlorophyll content decreased rapidly as the concentration increased. However, Streptomyces strain DS001 and glufosinate ammonium showed a slight deviation compared to paraquat. Indica treated with paraquat (100%) showed a 96% reduction in chlorophyll content compared to the untreated control. On the other hand, it was observed that the chlorophyll content decreased by 65% and 61% compared to the untreated control when the culture filtrate of Streptomyces strain DS001 and 100% concentration of glufosinate ammonium were treated. Therefore, it was confirmed that the culture filtrate of Streptomyces strain DS001 inhibited photosynthesis.
6. 전해질 누출6. Electrolyte leakage
식물 세포막의 파괴를 알아보기 위해 스트렙토마이세스 균주 DS001, 파라콰트 및 글루포시네이트 암모늄 처리 후 전해질 누출 분석을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. Electrolyte leakage analysis was performed after treatment with Streptomyces strain DS001, paraquat and glufosinate ammonium in order to examine the destruction of plant cell membranes, and the results are shown in FIG. 6 .
도 6을 참조하면, 파라콰트 처리 후 2시간에서 24시간 사이에 전해질 누출이 급격히 증가한 반면, 스트렙토마이세스 균주 DS001 배양여액과 글루포시네이트 암모늄 처리 후에는 4시간에서 10시간 사이에 급격한 증가를 보였다. 스트렙토마이세스 균주 DS001에 의해 유발된 전해질 누출의 양은 파라콰트에 의해 유발되는 것만큼 빠르지 않았으나, 글루포시네이트 암모늄 보다 높았다. 상기 3종의 제초제 처리 24시간 후, 파라콰트, 스트렙토마이세스 균주 DS001 배양여액, 글루포시네이트 암모늄의 순으로 많은 전해질 누출량을 확인하였다. 스트렙토마이세스 균주 DS001 배양여액은 처리 후 24시간까지 시간이 지남에 따라 전해질 누출량이 점진적으로 증가했다. 따라서 스트렙토마이세스 균주 DS001 배양여액을 처리한 후 시간이 지남에 따라 식물 세포막을 파괴했음을 알 수 있다.Referring to Figure 6, while the electrolyte leakage rapidly increased between 2 hours and 24 hours after paraquat treatment, it showed a rapid increase between 4 hours and 10 hours after Streptomyces strain DS001 culture filtrate and glufosinate ammonium treatment. The amount of electrolyte leakage caused by Streptomyces strain DS001 was not as rapid as that caused by paraquat, but was higher than that of glufosinate ammonium. After 24 hours of treatment with the three herbicides, large amounts of electrolyte leakage were confirmed in the order of paraquat, Streptomyces strain DS001 culture filtrate, and ammonium glufosinate. The Streptomyces strain DS001 culture filtrate showed a gradual increase in electrolyte leakage over time up to 24 hours after treatment. Therefore, it can be seen that the plant cell membrane was destroyed over time after the treatment of the Streptomyces strain DS001 culture filtrate.
지금까지 본 발명의 스트렙토마이세스 속 DS001 균주를 이용한 잡초 방제용 조성물의 제조방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.So far, specific examples of the method for preparing a composition for controlling weeds using the Streptomyces genus DS001 strain of the present invention have been described, but it is apparent that various modifications are possible within the limits that do not deviate from the scope of the present invention.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be limited to the described embodiments and should not be defined, and should be defined by not only the claims to be described later, but also those equivalent to these claims.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.That is, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not restrictive, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and All changes or modified forms derived from the equivalent concept should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (6)
상기 조성물은 상기 스트렙토마이세스 포미카에(Streptomyces formicae) DS001 균주(KCTC15136BP)의 배양액을 전제 조성물의 50 내지 100%로 포함하고,
상기 조성물은 토양처리에 의하여 바랭이(Digitaria ciliaris)의 발아율을 억제하고 제초 활성을 가지며,
상기 균주를 M3 액체 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는,
잡초 방제용 조성물의 제조방법.
In the method for producing a composition for controlling weeds for culturing Streptomyces formicae DS001 strain (KCTC15136BP),
The composition comprises the culture solution of the Streptomyces formicae DS001 strain (KCTC15136BP) in 50 to 100% of the total composition,
The composition inhibits the germination rate of indica ( Digitaria ciliaris ) by soil treatment and has herbicidal activity,
Characterized in that the strain is cultured in M3 liquid medium,
Method for producing a composition for controlling weeds.
상기 균주를 온도 25 내지 30℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는,
잡초 방제용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
Characterized in that the strain is cultured at a temperature of 25 to 30 ° C.
Method for producing a composition for controlling weeds.
상기 균주를 교반 속도 150 내지 200 rpm에서 배양하는 것을 특징으로 하는,
잡초 방제용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
Characterized in that the strain is cultured at an agitation speed of 150 to 200 rpm,
Method for producing a composition for controlling weeds.
상기 균주를 pH 5.5 내지 7에서 배양하는 것을 특징으로 하는,
잡초 방제용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
Characterized in that the strain is cultured at pH 5.5 to 7,
Method for producing a composition for controlling weeds.
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