KR102528973B1 - 면역항암요법에 대한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 DRG2는 PD-L1 양성 암에서 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응 또는 예후에 대한 예측인자로서, PD-L1 양성 암에서 면역항암제 투여 결정을 위한 동반진단에 사용될 수 있는 바이오마커이다. 본 발명을 통하여 면역항암제 투여 여부를 결정함으로써 치료 반응을 보일 환자에게 선별적으로 면역항암제를 투여할 수 있어, 보다 효과적으로 PD-L1 양성 암을 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

면역항암요법에 대한 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for cancer immunotherapy and use thereof}
본 발명은 면역항암요법에 대한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
종양 세포는 종양 미세환경에서 면역 방어를 피하기 위해 몇 가지 방식으로 숙주 면역력에 작용한다. 이러한 현상은 일반적으로, "암 면역 회피(cancer immune escape)"로 지칭된다. 이러한 시스템에서 가장 중요한 구성성분들 중 하나는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 수용체 및 이의 리간드인 PD-L1(Programmed death-ligand)에 의해 매개되는 면역억제 공동-신호(면역 체크포인트)이다.
PD-1 수용체 및 PD-L1 리간드는 면역 조절에서 필수적인 역할을 수행한다. 활성화된 T 세포 상에서 발현되는 PD-1은 간질 세포, 종양 세포, 또는 둘 다에 의해 발현되는 PD-L1 및 PD-L2에 의해 활성화되고, 이를 통하여, T-세포의 사멸 및 국소화된 면역 억제를 개시하여, 종양 발달 및 성장을 위한 면역-관용되는 환경을 잠재적으로 제공한다. 반대로, 이러한 상호작용의 억제는 국소적 T 세포 반응을 향상시키고, 항종양 활성을 매개할 수 있다.
따라서, 최근에는 인체의 면역체계를 활성화시켜 암 세포를 죽이는 치료법으로서 면역항암요법(cancer immunotherapy), 특별히 면역체크포인트억제제(immune checkpoint inhibitor)가 개발되어 암 치료에 사용되고 있다. 가장 널리 사용되고 있는 면역체크포인트억제제로서 PD-1 또는 PD-L1에 대한 단클론항체를 사용한 억제제가 있다. 이 억제제들은 T 세포 표면에 있는 PD-1과 암세포 표면에 있는 PD-L1의 결합을 억제하여 T 세포 등 면역세포를 활성화시킴으로써 암 세포를 제거하는데, 암환자의 생존율을 획기적으로 증가시키며 일부 환자의 경우 수년간 암의 재발이 없음이 보고된 바 있다.
PD-1 및 PD-L1에 대한 단클론항체를 사용한 억제제는 PD-L1을 발현하는 암세포에만 효과를 보인다. 따라서 PD-1 및 PD-L1 억제제를 사용하기 전에 암조직에서 PD-L1의 발현을 분석하여 PD-L1을 발현하는 암에 대하여만 적용하고 있다. 그러나 PD-L1을 발현하는 암의 경우에도 50% 이상의 암환자들이 PD-1 및 PD-L1 억제제에 반응하지 않음이 보고되는데 아직까지 그 이유를 알지 못한다. 따라서, PD-1 및 PD-L1을 대상으로 하는 면역항암제를 이용하여 암을 효과적으로 치료하기 위해서는 PD-L1을 발현하는 암세포들이 PD-1 및 PD-L1 억제제에 반응하지 않는 이유를 밝혀내고 이를 바탕으로 PD-1 및 PD-L1 억제제에 높은 치료 효과를 보이는 환자를 선별하는 것에 대한 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
Iwai Y, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:12293-97
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 또는 이를 이용한 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측에 관한 정보제공방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
보다 자세하게는, 본 발명자들은 DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현수준이 감소된 경우 암세포에서 PD-L1이 발현되어 있음에도 암세포를 사멸시킬 수 있는 T 세포가 활성화되어 있음을 확인하여, DRG2의 발현수준이 암세포에서의 PD-L1의 발현 및 세포사멸 T 세포의 활성화 모두와 관련되어 있음을 확인하고, DRG2의 발현수준 측정을 통하여 PD-L1 양성 암의 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 동반진단(companion diagnosis)용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 동반진단(companion diagnosis)용 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 동반진단용 조성물을 포함하는 PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 동반진단(companion diagnosis)용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 DRG2 유전자의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 DRG2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, DRG2 유전자 서열의 전체 또는 일부를 증폭하여, DRG2 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 DRG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있으며, 상기 항체는 항체의 전체 또는 일부분일 수 있으나, DRG2 단백질에 결합하여 단백질의 양을 측정할 수 있는 제제라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PD-1에 특이적으로 결합하는 약물은 항-PD-1 항체일 수 있으며, 바람직하게는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 등 일 수 있으나, PD-1에 특이적으로 결합하여 면역항암제의 역할을 하는 것으로 알려져 있는 약물이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 약물은 항-PD-L1 항체일 수 있으며, 바람직하게는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 더발루맙(Durvalumab) 등 일 수 있으나, PD-L1에 특이적으로 결합하여 면역항암제의 역할을 하는 것으로 알려져 있는 약물이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 PD-L1 양성 암의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 PD-L1 양성 암은 일례로 면역조직화학(Immunohistochemistry) 검사를 통하여 PD-L1 발현에 대하여 양성 판정을 받은 암일 수 있으나, 일반적으로 사용되고 있는 PD-L1 양성 암을 판정하는 방법에 의하여 판정된 PD-L1 양성 암이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 대조군과 비교하여 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현수준이 감소된 암을 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮을 암 또는 예후가 나쁠 암으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 대조군은 정상인, 즉, 암을 가지고 있지 않은 사람으로부터 분리된 생물학적 시료에서의 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현 수준이거나, 암 조직이 아닌 암 조직 주변의 정상 조직에서 측정된 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현 수준일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 대조군과 비교하여 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현수준이 감소된 PD-L1 양성 암을 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮을 암 또는 예후가 나쁠 암으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현 감소는 간접적으로 암세포 표면에서 발현된 PD-L1 수준의 감소를 나타낼 수 있으며, 이는 암세포 PD-L1과 T세포 PD-1과의 결합량의 감소를 나타낼 수 있으며, 또는 암세포에서의 PD-L1의 수준 증가, 및 CD8 T 세포의 수 또는 이의 활성 증가를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준은 바람직하게는 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정될 수 있으며, 상기 생물학적 시료는 암세포, 암조직, 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 타액, 소변, 대변 등이며, 바람직하게는 암세포 또는 암조직이나, DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질을 포함하고 있는 시료라면 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 PD-L1 양성 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 동반진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 측정 수준이 대조군과 비교하여 감소된 경우, 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮거나, 또는 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 a) 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 측정 수준이 대조군과 비교하여 감소된 환자를 선별하는 단계; 및 c) 상기 선별된 환자에게 면역항암제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명은 DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 면역항암제 투여를 위한 환자를 선별하는 용도를 제공한다.
본 발명의 DRG2는 PD-L1 양성 암에서 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응 또는 예후에 대한 예측인자로서, PD-L1 양성 암에서 면역항암제 투여 결정을 위한 동반진단에 사용될 수 있는 바이오마커이다. 구체적으로, PD-L1 양성 암에서 조직 세포의 내부 및/또는 표면에 존재하는 DRG2의 양을 측정한 후, 측정된 DRG2의 양을 분석하여 면역항암제의 투여 여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 선별방법을 통하여 면역항암제 투여 여부를 결정함으로써 높은 치료 효과를 나타낼 환자들에게 선별적으로 면역항암제를 투여할 수 있어, 보다 효과적으로 PD-L1 양성 암을 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 임상 데이터베이스에서의 PD-L1 고발현과 DRG2 저발현 사이의 관련성을 보여준다.
구체적으로, 도 1a는 TCGA 종양에서의 높은 PD-L1(CD274) 유전자 발현 및 GEPIA(survival curve)을 사용한 GTEx 데이터에 기초한 전체 생존율을 보여준다.
도 1b는 TCGA 종양에서의 낮은 PD-L1(CD274) 유전자 발현 및 GEPIA(survival curve)을 사용한 GTEx 데이터에 기초한 전체 생존율을 보여준다.
도 2a 내지 2e는 흑색종 종양 모델에서 DRG2 결핍이 CD8 T 세포의 활성을 증진시킴을 보여준다.
구체적으로, 도 2a는 qRT-PCR(A) 및 웨스턴 블랏(B)으로 확인한 DRG2 넉-다운 결과이다.
도 2b는 대조군 및 DRG2 KD 흑색종(5 x 105 세포)를 C57BL/6 마우스에 피하 주사한 후 흑색종의 성장을 18일간 관찰한 결과이다.
도 2c는 TILs(tumor infiltrating lymphocytes) 내 CD8+IFN-γ+ T 세포, CD3-NK1.1+ NK 세포, CD11C+F4/80+ M1 MΦ및 CD206+F4/80+ M2 MΦ의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 2d는 억제 리간드인 PD-L1, PD-L2, Gal-9 및 활성화 리간드인 4-1BBL, OX40L, CD70, 및 억제 및 활성화 리간드인 CD80, CD86와 같은 T 세포 면역 체크포인트의 수준을 원발성 대조군과 DRG2 KD 원발성 흑색종에서 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
도 2e는 항체 처리된 원발성 흑색종 용해물의 웨스턴 블랏 결과(좌측) 및 PD-L1 수준에 대한 유세포 분석 결과(우측)이다.
도 3a 내지 3f는 흑색종에서 DRG2 결핍이 IFN-γ에 의해 유도된(IFN-γPD-L1의 발현을 IFN-γpathway의 증진을 통하여 증가시킴을 보여준다.
구체적으로, 도 3a 및 3b는 대조군 및 DRG2 KD B16F10 세포에서 24시간 동안 IFN-γ처리(5 ng/ml)에 따른 PD-L1 발현 변화를 보여주는 qRT-PCR 결과이다. PD-L1 수준에 대한 유세포 분석 결과를 히스토그램으로 나타내었다.
도 3c는 용량 의존적으로 24시간 동안 IFN-γ처리된 대조군 및 DRG2 KD B16F10 세포에서의 IFN-γ신호전달(signaling)에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3d는 PD-L1의 IRF1 전사인자에 대한 qRT-PCR 분석 결과이다.
도 3e는 plat-bottom 96 웰 플레이트(좌측) 및 24 transwell 플레이트(우측)에서 48시간 동안 IFN-γ전-처리되거나 처리되지 않은 대조군 및 DRG2 KD B16F10 세포와 공동 배양한 활성화된 primary CD4 T 세포의 soluble IL-2 수준을 보여준다.
도 3f는 대조군 및 DRG2 KD B16F10 세포의 상청액으로 배양한 활성화된 primary CD4 T 세포의 IL-2 mRNA(좌측) 및 soluble IL-2(우측)의 수준을 보여준다.
도 4a 내지 4c는 DRG2 결핍 흑색종에서 PD-L1이 재조합 PD-1과의 결합 친화성(binding affinity)을 감소시켰음을 보여준다.
구체적으로, 도 4a는 흑색종에서의 재조합 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다. 대조군 및 DRG2 KD 흑색종 세포를 IFN-γ(0.5 ng/ml)로 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않은 후, 유세포 분석 30분 전에 재조합 PD-1(1 μg/ml)을 10분간 처리하였다.
도 4b는 IFN-γ(0.5 ng/ml)를 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않은 대조군 및 DRG2 KD 흑색종 세포의 PD-L1에 대한 유세포 분석 히스토그램을 보여준다. PD-1과 PD-L1의 상호작용 친화성(interaction affinity)은 PD-L1+ 세포에 대한 PD-1+의 %로 계산하였다.
도 4c는 대조군 및 DRG2 KD 세포에서의 PD-L1+ 세포 당 PD-1과 상호작용하는 세포의 비율을 보여준다.
도 5a 내지 5c는 DRG2 결핍이 세포 내 PD-L1을 증가시킴을 보여준다.
구체적으로, 도 5a는 IFN-γ가 처리되거나 처리되지 않은 대조군 및 DRG2 KD B16F10 세포 용해물에서 Endo H 처리에 따른 PD-L1 탈당화(deglycosylation)에 대한 웨스턴 블랏 결과(좌측) 및 이에 대한 그래프(우측)이다.
도 5b는 대조군 및 DRG2 KD 흑색종 세포에서 IFN-γ처리 또는 비-처리 후의 PD-L1의 단백질 발현을 보여주는 공초점 현미경 이미지(좌측) 및 이에 대한 그래프(우측)이다. 적색 형광은 PD-L1을 나타내며, 청색 형광은 핵을 나타낸다.
도 5c는 대조군 및 DRG2 KD 사람의 난소암 세포(SKOV3)에서 IFN-γ처리 후의 PD-L1의 단백질 발현을 보여주는 공초점 현미경 이미지(좌측) 및 이에 대한 세포표면에 발현된 PD-L1 비율 그래프(우측 상단) 및 DRG2 KD, IFN-γ의 효과를 확인하는 웨스턴블랏 결과(우측 하단)이다. 적색은 PD-L1을 나타내며, 청색은 핵을 나타낸다.
도 6은 DRG2의 발현 수준 변화에 따른 암세포 표면에서의 PD-L1의 발현 수준 변화 및 이에 따른 암세포 표면의 PD-L1과 T 세포의 PD-1 사이의 상호작용의 변화를 간략히 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 PD-L1 양성 암 환자에게 면역항암제를 투여할 경우, 20 내지 30%의 암 환자에게만 면역항암제가 치료 효과를 나타내는 점에 착안하여, 면역항암제의 투여를 위한 환자를 선별하는 방법에 대하여 예의 연구한 결과, DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현이 감소된 환자의 경우에는 PD-L1이 세포 표면에 정상적으로 위치하지 못하여, 면역항암제에 대한 치료 효과가 낮은 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 보다 자세하게는, 일반적으로 PD-L1의 발현이 증가될 경우, T 세포 등 면역세포의 활성화가 감소되어 생존률이 감소되나, DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현이 감소된 경우 PD-L1의 발현이 증가되나, 암의 성장은 억제되는 것을 확인하였다. 이에 대하여 자세히 연구한 결과, DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현이 감소된 경우 발현이 증가된 PD-L1이 세포 표면에 정상적으로 위치하지 못하여, PD-1과의 결합 정도가 감소되는 것을 확인하였다. 즉, PD-1에 대한 면역항암제 또는 PD-L1에 대한 면역항암제는 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제함으로써 면역항암제의 효능을 나타내다, DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현량이 감소된 암에서는 면역항암제가 작용할 수 없다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 기존의 PD-L1의 발현량 만을 측정하여 면역항암제를 투여하는 방법으로는 면역항암제에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있는 환자를 정확히 선별할 수 없다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현이 증가된 암 환자, 또는 PD-L1 양성 암 환자이며 동시에 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현이 증가된 암 환자를 면역항암제를 투여하는 환자로 선별하는 방법을 제공함으로써, 면역항암제에 대한 치료 효율을 현저히 높여, 암 환자의 고통 및 치료 비용을 효과적으로 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에 있어서, DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2)란세포 내의 여러 가지 조절에 관여하는 단백질로서, large superfamily를 이루고 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 superfamily에는 trimeric G protein(예를 들어, transducin), monomeric G protein(예를 들어, ras) 및 단백질 합성에 관여하는 GTPase(예를 들어, elongation factor Tu) 등과 같은 중요한 3개의 subfamily가 존재하는데, 최근 이들과 염기서열 및 기능이 서로 다른 새로운 그룹의 G protein들이 발견되었으며, 이 중 하나인 DRG(developmentally regulated GTP-binding protein)는 GTP와 결합에 필요한 G1부터 G5까지의 5개 region을 모두 지니고 있고, 크기는 trimeric G protein과 유사하다. 그러나, 아미노산 서열이 trimeric G protein 뿐만 아니라, 기존의 G protein subfamily들과 전혀 다른 특성을 지니고 있어 새로운 subfamily로 구분되고 있다.
또한, DRG에는 DRG1과 DRG2가 있으며, 세균으로부터 사람에 이르기까지 거의 모든 종류의 세포에 존재한다. 예를 들면, Halobacterium cutirubrum, Thermoplasma acidophilum, Methanococcus jannaschii, Caenorhabditis elegans, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae 등에서 존재함이 확인되었다. 그러나 아직까지 DRG2가 암세포에서의 PD-L1의 발현 및 세포사멸 T 세포의 활성화와 관련되어 있음에 대해서는 알려진 바는 없다.
본 명세서에 있어서, “DRG2의 유전자 또는 단백질의 수준(또는 발현수준)”은 DRG2 유전자의 mRNA 발현수준과 이로부터 발현되는 DRG2 단백질의 발현수준을 모두 포함하는 의미로서 사용된다. 본 명세서에 있어서, 상기 “유전자의 수준(발현수준)”은 면역항암제에 대한 치료 효과를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 DRG2 유전자의 mRNA 존재 여부 및/또는 발현정도를 확인하는 과정으로써, mRNA의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), RNA-염기순서결정법(RNA-seq; RNA-sequencing), 나노스트링, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, mRNA의 발현량을 측정할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 명세서에 있어서, 상기 “단백질의 수준(발현수준)”은 면역항암제에 대한 치료 효과를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 DRG2 유전자로부터 코딩된 단백질의 존재 여부와 발현수준을 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 등을 이용해 단백질의 양을 확인하거나, 단백질의 활성을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(immunoprecipitation assay), 보체고정분석(complete fixation assay), 유세포분석(FACS), 단백질 칩(protein chip), 리간드 바인딩 에세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry) 등이 있으나, 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "동반진단(Companion diagnostics)"이란, 특정 치료 약물을 특정 환자에 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위한 진단 테스트 중 하나를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 PD-L1 양성 암을 갖는 개체에 면역항암제(예컨대, 항-PD-1 항체)를 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위하여, 암 환자에서 DRG2의 발현수준을 동반진단 마커로서 함께 측정할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법"이란 면역항암제에 대한 치료 효과를 예측하고, 이를 통한 예후를 예측하는 방법에 관한 것으로, DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현이 감소된 환자의 경우에는 면역항암제에 대한 치료 효과가 낮을 수 있는 가능성에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 상기 DRG2 유전자의 수준을 측정하는 제제는 DRG2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 바이오마커(DRG2) 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적(complementary)인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어, "상보적"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "상보적"은 용어 "완전 상보적(perfectly complementary)"과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형(template) 서열과 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DRG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체(antibody)는 DRG2 단백질의 일부 또는 전부를 항원성 부위로 인지하여, 상기 항원성 부위에 특이적이고 직접적으로 결합하는 것을 의미하며, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 모노클로날(monoclonal) 항체, 또는 이의 단편들을 모두 포함한다. 이러한 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작될 수 있다. 즉, 상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method), 재조합 DNA 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.
본 명세서에서 있어서, "면역항암제"는 면역 체크포인트 억제제로도 불리우는, 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 억제, 방해 또는 조절하는 물질을 의미한다. 면역 체크포인트 단백질은 T 세포의 활성화 또는 기능을 조절한다. 다수의 면역 체크포인트 단백질, 예를 들면, PD-1, PD-L1, CTLA-4 등이 공지되어 있다. 이들 단백질은 T 세포 반응의 공-자극성 또는 억제성 상호작용에 관여한다. 면역항암제는 항체를 포함할 수도 있고, 항체로부터 기원할 수도 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1)에 특이적으로 결합하는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 특정예에서, 상기 PD-1에 특이적으로 결합하는 약물은 항-PD-1 항체일 수 있으며, 상기 항-PD-1 항체의 예로는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 면역항암제는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 특정예에서, 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 약물은 항-PD-L1 항체일 수 있으며, 상기 항-PD-L1 항체의 예로는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 더발루맙(Durvalumab) 등을 들 수 있다.
상기 "항체(antibody)"는 PD-1, PD-L1, CTLA4 등의 면역 체크포인트 단백질에 대해 특이적으로 결합하여 면역 체크포인트 억제 활성을 나타내는 물질이다. 상기 항체의 범위에는 완전한 형태의 항체뿐만 아니라, 항체 분자의 항원 결합 부위도 포함된다.
본 명세서에 있어서, “암(cancer)”은 침윤에 의해 국부적으로 그리고 전이를 통해 체계적으로 확장할 수 있는 저산소 골수에 있는 줄기 세포로부터 발생한 각종 혈액암과 함께 무한 성장이 예고되는 악성의 고형 종양을 말한다. 특별히 이에 제한적이지 않지만, 암의 구체적인 예로는 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지암, 결장암 및/또는 직장암, 담낭암, 위장관암, 두부 및 목의 암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 신경조직암, 췌장암, 전립선암, 부갑상선암, 피부암, 위암, 및 갑상선암이 포함된다. 암의 다른 예로는, 선암, 선종, 기저 세포암, 자궁경부 이형성증 및 상피 내암, Ewing 육종, 편평세포암종, 액선 세포암, 악성 뇌종양, 모세포암, 장의 신경절신경종, 과다형성 각막신경암, 섬세포암, Kaposi 암, 평활근종, 백혈병, 림프종, 악성 암양종, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, Marpanoidhabitus 암, 수양암, 전이성 피부암, 점막 신경종, 골수이형성 증훈군, 골수종, 사상식육종, 신경아세포종, 골육종, 골원성 및 기타 육종, 난소암, 크롬 친화성 세포종, 진성 적혈구 증가증, 원발성 뇌종양, 소세포성 폐암, 궤양성 및 유두상 편평상피암, 정낭피종, 연조직 육종, 망막아종, 횡문근아세포종, 신세포 종양 또는 신세포암, 망상세포성 육종, 및 빌름스 종양이 포함된다. 암의 구체적인 예로는 또한 성상 세포종, 위장 기저 종양(gastrointestinal stromal tumor, GIST), 신경교종 또는 신경교아종, 신세포암(renal cell carcinoma, RCC), 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC), 및 췌장 신경내분비암이 포함된다. 바람직하게는, 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종, 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물은 PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 PD-L1 양성 암은 면역조직화학(Immunohistochemistry) 검사를 통하여 PD-L1 발현에 대하여 양성 판정을 받은 암일 수 있으며, 면역조직화학 검사를 통하여 PD-L1 양성 암인지 음성 암인지 여부를 결정하는 방법 및 이를 위한 키트(예컨대, KEYTRUDATM의 동반진단 키트인 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx) 등이 공지되어 있다.
PD-L1 동반진단 키트(예컨대, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)는 염색 시 세포막과 세포질 내부의 PD-L1을 모두 염색시켜 PD-L1의 발현 정도가 어느 정도인지를 확인하고, 이를 바탕으로 PD-L1 양성 암(Tumor Proportion Score≥50%)인 경우, 치료제로 면역항암제(예를 들어, 키트루다(Keytruda))를 사용하는 방식으로 사용되고 있다. 즉, 면역항암제의 투여 여부 결정을 암 조직 내에서 PD-L1을 발현하는 암세포의 비율을 토대로 판단하고 있다. 암의 PD-L1은 CD8 T 세포를 억제하는 기작을 가지고 있으며, 이로 인해 암의 성장이 더욱 촉진시킨다. 반대로, 면역항암제는 PD-L1을 억제시켜 T 세포의 활성을 증가시킴으로써 암 환자를 치료하는 방식이다. 이러한 치료를 하기 위해서는 암 조직에서 PD-L1이 잘 발현되어 있어야 한다. PD-L1의 발현이 잘되지 않은 암 환자에게 면역항암제를 투여할 경우에는 치료 효과를 거의 나타내지 않는다.
본 명세서에 있어서, "PD-L1 양성"은 적어도 약 1%의 PD-L1 발현을 의미할 수 있다. PD-L1의 발현은 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, PD-L1의 발현은 면역조직화학(IHC)에 의해 측정될 수 있다. PD-L1 양성 암(종양)은 IHC에 의해 측정한 결과, 종양 세포의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10% 또는 적어도 약 20%가 PD-L1을 발현하는 암일 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 “키트(kit)”는 시료 내의 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하여, 면역항암제에 대한 치료 효과를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 양을 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 상기 키트는 유전자 증폭 키트, 마이크로어레이 칩 등의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어 "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR)은 미국 특허 제4683195호, 제4683202호, 제4800159호에 개시되어 있다. 상기 마이크로어레이에 있어서, 프로브를 포함할 수 있으며, 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료는 표지(labeling) 될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에는 대조군으로 house-keeping gene, beta-actin 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "기준값(reference value) 또는 대조군"은 유전자(mRNA) 또는 단백질의 과발현/저발현을 나누는 기준이 되는 값을 의미한다. 상기 기준값은 예를 들어, 정상인의 평균 mRNA/단백질 발현수준이거나, 또는 암 조직 주변의 정상 조직의 평균 mRNA/단백질 발현수준일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기준값 또는 대조군은 특정 환자군의 평균 mRNA/단백질 발현수준의 분포에 따라 정해질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험재료 및 실험방법
세포 배양
마우스 흑색종 B16F1, B16F10 세포주 및 인간 난소암 SKOV3 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB-서울, 한국)에서 구입하였다. 세포를 5% CO2의 가습 대기 하에서 37℃의 온도로 10% 소 태아 혈청(WELGENE, 한국)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. B16F10 세포주에서 유전자 발현에 대한 저산소증의 효과는 93% N2, 5% CO2 및 2% O2로 구성된 가스 혼합물을 유지한 다중 가스 인큐베이터(Galaxy R, New Brunswick Scientific)에서 세포를 인큐베이션 함으로써 시험하였다.
실험동물
6주령 암컷 C57BL/6 마우스를 오리엔트 바이오(부산, 한국)에서 구입하였다. 마우스를 특정 병원체가 없는 조건 하에서 울산대학교의 실험실 동물시설에서 사육하였고, 울산대학교의 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 사용하였다.
TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터 분석
TCGA 정상(normal)과 비교한 TCGA 종양의 PD-L1(CD274) 유전자 발현 및 GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)를 이용한 GTEx 데이터에 기반하여 전체 생존율(Overall survival, OS) 분석을 수행하였다. 가설 검정과 관련하여, GEPIA는 로그 순위 검정을 고려하였다. 50%(중앙값)의 CD274 발현 임계 값으로 CD274 고발현과 저발현 코호트(cohort)를 분류하였다. 따라서, CD274 발현 수준이 50% 보다 높거나 낮은 샘플을 각각 고발현 코호트(cutoff-high) 및 저발현 코호트(cutoff-low)로 분류하였다. DRG2 발현 프로파일 및 몇몇 환자들의 임상 정보를 포함하는 데이터는 GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)를 사용하여 수득하였다. 샘플의 수준(Fragments Per Kilobase of transcript per Million (FPKM) 표준화)을 얻었다.
플라스미드, siRNA, 트랜스펙션 및 리포터 에세이
마우스 DRG2에 대한 shRNA(DRG2-shRNA, TRC0000047195, 5'-CCGGGCTCATCCTACATGAATACAACTCGAGTTGTATTCATGTAGGATGAGCTTTTTG-3'(서열번호 25))를 포함하는 플라스미드 컨스트럭트 pLKO-DRG2-shRNA 및 비-타겟 shRNA 대조군 벡터(MISSION pLKO.1-puro non-mammalian shRNA control plasmid DNA, SHC002)를 Sigma에서 구입하였다. 마우스/인간에 대한 siRNA(siDRG2, 5'-CAUUGAAUACAAAGGUGCCAACA-3'(서열번호 26)) 및 대조군 siRNA(scRNA)는 GenePharma에서 구입하였다.
DRG2-결핍 세포를 제조하기 위하여, B16F10 세포를 pLKO-DRG2-shRNA로 트랜스펙션 시키고, 퓨로마이신(Sigma P9620)을 이용하여 B16F10/shDRG2를 선별하였다. pLKO.1-puro 내 비-타겟 shRNA를 사용하여 대조군 세포 B16F10/pLKO를 제조하였다. 세포는 TurboFect(Thermo Scientific)를 사용하여 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션의 효율을 모니터링 하기 위하여, GFP 발현 벡터 pEGFP-N1/C1(Clontech)을 플라스미드 컨스트럭트와 함께 공동 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 효율(> 80%)을 확인한 후 세포를 추가 연구에 사용하였다.
실시간 및 반정량(semiquantitative) RT-PCR
TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. NanoDropTM 2000 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 RNA 농도를 측정한 후, 총 RNA 2 μg 및 M-MLV 역전사 효소(Promega)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 표 1에 기재된 유전자 특이적 프라이머를 사용한 실시간 및 반정량 PCR에서 주형으로 사용하였다. SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)를 사용하여 ABI 7500 Fast Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)으로 실시간 qRT-PCR을 실시하였다. Taq polymerase(Solgent, 대전, 한국)를 사용하여 반정량 RT-PCR을 실시하였다.
[표 1]
Figure 112021035607334-pat00001
웨스턴 블랏(Western botting)
탈당화 분석(deglycosylation assay)을 위하여, 세포 추출물 내 단백질 또는 농축된 상청액을 SDS-PAGE로 분리하고, anti-DRG2(Proteintech), mouse anti-PD-L1(Abcam), anti-phospho STAT1(cell signaling), anti-β희석액을 각각 처리하였다. 면역반응성(Immunoreactivity) 밴드는 Pierce ECL Western blotting substrate(Thermo Scientific)를 사용하여 검출하였다.
PD-1과 PD-L1 상호작용 분석(interaction assay)
PD-1과 PD-L1 단백질 상호작용을 측정하기 위하여, 현탁 세포를 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 15분간 고정하고, 재조합 인간 PD-1 Fc 단백질(R&D Systems)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체로 anti-human Alexa Fluor 488 dye conjugate(Life Technologies)를 사용하였다. 핵을 DAPI(blue; Life Technologies)로 염색하였다. 그리고 나서 FACS 유세포 분석기(Becton Dickinson, Inc.)를 사용하여 Alexa Fluor 488 dye의 형광 강도를 측정하였다.
면역세포화학(Immunocytochemistry)
면역세포화학 분석을 위하여, 세포를 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 15분간 고정하고, 5% Triton X-100로 5분간 투과시킨(permeabilized) 다음 1차 항체를 사용하여 염색하였다. 2차 항체로 anti-mouse Alexa Fluor 488 또는 594 dye conjugate 및/또는 anti-rabbit Alexa Fluor 488 또는 594 dye conjugate(Life Technologies)를 사용하였다. 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI; blue; Life Technologies)로 염색하였다. 마운팅(mounting) 후, Olympus 1000/1200 laser-scanning confocal system을 사용하여 세포를 관찰하였다.
공동 배양(Co-culture) 및 IL-2 측정
T 세포 불활성화에 대한 종양세포의 영향을 분석하기 위하여, 종양 세포를 마우스 T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)로 활성화된 마우스 비장 CD4 T 세포와 공동 배양하였다. 5:1(Jurkat: tumour cell)의 비로 48시간 동안 인큐베이션 하였다. 배지 내로 분비된 IL-2 수준을 마우스 IL-2 ELISA 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다.
통계적 유의성
모든 실험은 최소 세 번 이상 반복하였으며, 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student's t-test로 확인하였고, P < 0.05이면, 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. Ns는 non-significant, *는 P < 0.05, **는 P < 0.01, ***는 P < 0.001, ****는 P < 0.0001을 나타낸다.
실험결과
실시예 1. PD-L1과 생존률의 연관관계의 확인
알려진 바와 같이, PD-L1의 수준이 높을 때 낮은 생존률을 나타내는지 임상데이터를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 1a 및 1b에 나타내었다.
도 1a에 나타난 바와 같이, 높은 PD-L1 수준을 가지는 암 환자는 낮은 생존률을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 환자에서 DRG2의 발현량을 확인한 결과, 정상적인 주변 조직에 비하여 암세포에서 DRG2의 발현이 증가된 것을 확인하였다.
반면, 도 1b에 나타난 바와 같이, PD-L1의 수준이 높으나 생존률이 높은 환자에서 DRG2의 발현량을 확인한 결과, 정상적인 주변 조직에 비하여 암세포에서 DRG2의 발현이 감소된 것을 확인하였다.
이를 통하여, 기존에 알려져 있는 바와 같이 PD-L1의 수준이 높다고 하여 낮은 생존률을 나타내는 것이 아니며, 이는 DRG2의 발현 정도에 따라 달라지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. DRG2 발현수준에 따른 암 성장 및 면역세포 분포 확인
DRG2 발현 수준이 암에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스에 암을 주입하고, 암의 성장과 면역세포의 분포를 확인하였다. 그 결과는 도 2a 내지 2e에 나타내었다.
도 2a는 DRG2 넉-다운 흑색종에서 DRG2의 수준이 감소하였음을 보여주는 RT-PCR(좌측) 및 웨스턴 블랏(우측) 실험결과이다. 도 2a에 나타난 바와 같이, shDRG2로 트랜스팩션된 세포는 DRG2의 발현이 감소된 것을 확인하였다.
도 2b는 마우스의 옆구리 부분에 세포(pLKO/B16F10 또는 shDRG2/B16F10)를 피하 주사한 후 시간이 지남에 따른 암 성장을 측정한 결과이다. 도 2b에 나타난 바와 같이, DRG2의 수준이 감소된 암 세포(shDRG2/B16F10)를 주사한 경우에는 대조군(pLKO/B16F10)과 비교하여 암의 성장이 억제된 것을 확인하였다.
상기와 같은 암 성장의 차이가 암 주변에 있는 면역세포의 분포차이에 의한 것인지 확인하기 위하여 유세포 분석을 실시하였다(도 2c). 암 주변에는 다양한 면역세포가 존재하며, 이중에서 암을 직접적으로 사멸시키는 역할을 하는 주된 세포는 세포 사멸 T 세포(CD8 T cell)이다. 따라서, DRG2의 수준이 감소된 암 조직 내의 CD8 T 세포의 활성화된 형태인 CD8+IFN-gamma+ T 세포의 분포를 확인하였다. 그 결과, 도 2c에 나타내었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, CD8+IFN-gamma+ T 세포는 shDRG2/B16F10 암조직에 현저히 증가되었으나, 다른 면역세포(간접적으로 CD8 T 세포에 영향을 주는 세포)의 경우에는 대조군과 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통하여, 암세포에서 DRG2의 수준이 감소되면, 암세포가 CD8 T 세포의 활성을 조절하지 못하며, 이러한 활성 조절이 다른 면역세포에 의한 기작이 아니라 직접적으로 CD8 T 세포와의 교류를 통하여 이루어지는 것을 확인하였다.
T 세포를 조절하는데 중요한 역할을 하는 암조직의 표면 단백질들의 양을 mRNA 수준에서 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과는 도 2d에 나타내었다. 도 2d에 나타난 바와 같이, DRG2의 수준이 감소된 암 조직 내의 T 세포를 활성화시키는 표면 단백질과 억제시키는 표면 단백질을 모두 확인한 결과, T 세포의 활성을 억제하는 PD-L1 유전자의 발현량이 증가된 것을 확인하였다.
단백질 수준에서도 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏 및 유세포 분석을 실시하였다. 그 결과는 도 2e에 나타내었다. 도 2e에 나타난 바와 같이, mRNA 결과와 마찬가지로 DRG2의 수준이 감소된 암 조직 내에서 PD-L1 단백질 수준이 증가되어 있음을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 일반적으로 암조직 내의 PD-L1의 발현 증가는 T 세포의 활성화를 억제하여 암의 성장 및 전이를 촉진시키는 것으로 알려져 있는데, DRG2 수준이 감소된 암조직 내에서는 PD-L1의 수준이 증가되나 T 세포는 활성화되어 암의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. DRG2 발현 수준이 PD-L1의 발현에 미치는 영향 확인
DRG2의 수준 감소가 직접적으로 PD-L1에 미치는 영향을 확인하기 위하여 in vitro 상에서 실험을 실시하였다. 그 결과는 도 3a 내지 3f에 나타내었다. T 세포와 암조직간의 교류를 모방하기 위하여 배지에 PD-L1의 발현을 증가시키는 사이토카인인 IFN-gamma를 함께 처리하고 실험을 진행하였다.
도 3a의 상단 그래프는 shDRG2를 이용하여 DRG2의 수준을 감소시킨 것이고, 하단 그래프는 siDRG2를 이용하여 DRG2의 수준을 감소시킨 것이다. DRG2의 수준을 인위적으로 감소시킨 후에, IFN-gamma에 의해 유도되는 PD-L1 유전자의 수준을 qRT-PCR로 확인하였다. 도 3a에 나타난 바와 같이, DRG2의 수준을 감소시킨 경우에 PD-L1 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
또한, PD-L1 단백질의 수준을 유세포 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 3b에 나타내었다. 도 3b에 나타난 바와 같이, DRG2의 수준을 감소시킨 경우에 PD-L1 단백질의 양이 증가되는 것을 확인하였다.
도 3c 및 3d는 DRG2의 수준이 감소되었을 때 PD-L1의 수준이 증가되는 기작을 확인하기 위하여, IFN-gamma의 주요 활성 경로인 STAT1 인산화, IRF1의 발현 정도를 웨스턴 블랏 및 RT-PCR로 각각 확인한 결과이다. 도 3c 및 3d에 나타난 바와 같이, DRG2의 수준의 감소는 IFN-gamma에 의한 STAT1 인산화 및 IRF1의 발현 정도를 현저히 증가시키는 것을 확인하였다. 그리고 이를 통하여, PD-L1의 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
도 3e 및 3f는 실시예 2의 in vivo 실험 결과와 마찬가지로 in vitro 상에서도 T 세포의 활성에 차이를 보이는지를 확인한 결과이다. 암세포는 PD-L1과 같은 표면 단백질을 이용하여 직접적인 접촉을 통하여 T 세포의 활성을 억제하기도 하지만, 사이토카인을 분비하는 것으로도 직접적인 접촉 없이 T 세포를 조절할 수도 있다. 따라서, 암세포와 T 세포를 co-culture하여 직접적인 접촉이 유지되는 경우(도 3e의 좌측 도면), 암세포가 제거된 암세포 배양액(conditioned media)을 이용하여 T 세포를 배양한 경우(도 3e의 우측 도면), 그리고 트랜스웰을 이용하여 T 세포와 암 세포의 직접적인 접촉 없이 co-culture한 경우(도 3f의 좌측(RT-qPCR 측정 결과) 및 우측(ELISA 측정 결과) 도면)의 각각의 IL-2의 양을 측정하였다. 도 3e 및 3f에 나타난 바와 같이, T 세포와 암세포의 직접적인 접촉이 있는 경우(도 3e의 좌측 도면)에만 IL-2의 양이 증가되며, 직접적인 접촉이 없는 경우에는 IL-2의 양이 유의성 있는 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이를 통하여 직접적인 접촉을 통하여 T 세포의 활성이 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, DRG2의 수준이 감소된 암세포는 IFN-gamma에 의한 PD-L1의 발현을 증가시키며, T 세포와 직접적인 접촉이 있는 경우에만 T 세포를 활성화시키는 것을 확인하였다.
실시예 4. DRG2의 발현 수준 감소가 PD-L1 기능에 미치는 영향 확인
DRG2의 수준이 감소된 암에서 PD-L1의 발현량은 증가되나, 정상적으로 기능하지 못하는 이유를 확인하기 위하여, 일차적으로 T 세포의 표면 단백질인 PD-1과 암세포의 표면 단백질은 PD-L1의 결합 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 4a 내지 4c에 나타내었다.
도 4a에 나타난 바와 같이, PD-1 단백질을 암세포에 처리하였을 때, PD-1 단백질과 결합하고 있는 암세포의 양을 유세포 분석기를 이용하여 확인한 결과, pLKO/B16F10+IFN-gamma에 비해 shDRG2/B16F10+IFN-gamma의 샘플에서 PD-1과의 접촉이 더 감소되어 있음을 확인하였다.
도 4b는 도 4a에서 이용된 세포의 PD-L1의 양을 다시 확인한 결과로, DRG2의 수준이 감소된 경우 PD-L1의 양은 증가되어 있는 것을 확인하였다.
도 4c는 도 4b에서 확인한 PD-L1 양 대비 도 4a에서 확인된 PD-1과의 접촉량을 계산한 결과로, DRG2의 수준이 감소되었을 때 PD-L1의 수준 대비 PD-1과의 접촉량이 현저히 감소된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, DRG2의 수준이 감소된 암에서는 PD-L1의 발현이 증가되나, PD-L1과 T 세포의 PD-1과의 결합량은 반대로 감소된 것을 확인할 수 있었다. 즉, DRG2의 수준이 감소된 암세포의 경우에는 T 세포와의 직접적인 접촉이 억제되어 T 세포의 활성을 증가시키며, 발현이 증가된 PD-L1은 그 기능이 정상적으로 유지되지 못하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. DRG2 수준 감소에 따른 암세포 내의 PD-L1 기능 저하 기작 확인
DRG2의 수준 감소는 PD-L1의 발현을 증가시키지만, PD-L1의 기능은 억제시키는 기작을 확인하기 위하여, PD-L1의 당화 정도와 PD-L1이 암세포 내에 존재하는 위치를 확인하였다. 그 결과는 도 5a 내지 5d에 나타내었다.
도 5a는 PD-L1의 당화(Glycosylation) 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과(좌측) 및 이를 정량화한 결과(우측)로서, PD-L1의 당화가 일어나지 않은 경우 PD-1과의 상호작용하는 효율이 감소되는 것으로 알려져 있다. 도 5a에 나타난 바와 같이, PD-L1의 완전환 당화인 경우에는 55 kDa 크기의 PD-L1이 관찰되나, Endo H에 의하여 불완전 당화된 부분이 잘리게 되면 30 내지 35 kDa의 크기에서 밴드가 관찰되는 것을 확인하였다. 그러나 DRG2의 수준이 감소되었어도 여전히 Endo H에 의하여 잘려지지 않은 완전 당화된 PD-L1의 양이 많은 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, DRG2 수준이 감소되었을 때 당화의 불완전성 때문에 PD-L1의 기능 저하를 나타내는 것이 아닌 것을 확인할 수 있었다.
도 5b는 PD-L1의 세포 내 위치를 확인한 결과이다. 도 5b에 나타난 바와 같이, DRG2의 수준이 감소된 암세포에서의 PD-L1은 세포 내에 존재하는 비율이 높은 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, PD-L1이 세포내이입(endocytosis)에 의하여 세포 외부로 이동하지 못하고, 세포 내부에 존재하는 것을 의미하며, 이로 인하여 PD-1과의 상호작용 효율이 감소되어 T 세포를 활성화시키지 못한다는 것을 확인할 수 있었다.
도 5c는 인간 난소암 세포주인 SKOV3를 이용한 실험 결과이다. 도 5d에 나타난 바와 같이, siDRG2를 이용하여 DRG2의 수준을 감소시킨 인간 암세포에서도 IFN-gamma에 의하여 PD-L1의 발현이 증가되나(좌측 하단 도면), PD-L1이 세포 표면으로 정상적으로 위치하지 못하는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, DRG2 유전자 및/또는 DRG2 단백질의 수준이 감소된 암에서는 PD-L1의 발현이 증가되나, PD-L1이 정상적으로 세포 표면에 위치하지 못하기 때문에 PD-L1과 T 세포 표면의 PD-1과의 결합률이 감소되며, 이를 통하여, PD-L1이 정상적으로 작동하지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 일반적으로 사용되고 있는 면역항암제, 즉, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체 등이 정상적으로 작동하지 못하며, 이로 인하여 PD-L1 양성 암 환자 중에서 20 내지 30% 정도만이 면역항암제에 대한 치료 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 생물학적 시료로부터 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정함으로써, 면역항암제 치료에 효과를 나타낼 수 있는 환자를 선별할 수 있으며, 특별히, PD-L1 양성 암 환자의 경우에는 일반적으로 면역항암제를 투여하나, PD-L1 양성 암 환자에서 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정함으로써 더욱 효과적으로 면역항암제 투여를 위한 환자를 선별할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물, 또는 이를 이용한 정보제공방법을 이용함으로써 면역항암제에 대한 치료 효율을 현저히 높여, 암 환자의 고통 및 치료 비용을 효과적으로 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RopheLBio Co., Ltd. <120> Biomarkers for Cancer immunotherapy and Use thereof <130> MP20-035P1 <150> KR 1020200038620 <151> 2020-03-30 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse DRG2 <400> 1 tggaaccatc caaatccgcc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse DRG2 <400> 2 caagaaggtg gacttaccca ca 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse PD-L1 <400> 3 agcctggaac aacggacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse PD-L1 <400> 4 ctgctaagcc aggaaccctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse PD-L2 <400> 5 ttattcaccg tgacagcccc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse PD-L2 <400> 6 agtgcattct ctgcggtcaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse Gal9 <400> 7 gtgcagttct ctcagccagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse Gal9 <400> 8 gtgggcagga cgaaagttct 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse CD80 <400> 9 tcaatacgac tcgcaaccac a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse CD80 <400> 10 gagggtcttc tgggggtttt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse 4-1BBL <400> 11 acctgggtac ccgagagaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse 4-1BBL <400> 12 gtagcttggc gaacacagga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse OX40L <400> 13 agaagacgct aaggctggtg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse OX40L <400> 14 gccggagagg aagagagttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse CD70 <400> 15 ccgcacacag ctgagttaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse CD70 <400> 16 ctctggtccg tgtgtgaagg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse CD86 <400> 17 aaagaggagc aagcagacgc 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse CD86 <400> 18 catggtgcat ctggggtcca t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse IRF1 <400> 19 gaaagtccaa gtccagccga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse IRF1 <400> 20 gctgtggtca tcaggtaggg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse IL-2 <400> 21 gaaactcccc aggatgctca 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse IL-2 <400> 22 cgcagaggtc caagttcatc t 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse GAPDH <400> 23 ccactcacgg caaattcaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse GAPDH <400> 24 ctccacgaca tactcagcac 20 <210> 25 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRG2-shRNA <400> 25 ccgggctcat cctacatgaa tacaactcga gttgtattca tgtaggatga gctttttg 58 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siDRG2 <400> 26 cauugaauac aaaggugcca aca 23

Claims (23)

  1. DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물로서,
    상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 DRG2 유전자의 수준을 측정하는 제제는 DRG2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DRG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 PD-1에 특이적으로 결합하는 약물은 항-PD-1 항체인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab) 또는 세미플리맙(Cemiplimab)인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 약물은 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 또는 더발루맙(Durvalumab)인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 PD-L1 양성 암의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 대조군과 비교하여 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현수준이 감소된 암을 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮을 암 또는 예후가 나쁠 암으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 대조군과 비교하여 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현수준이 감소된 PD-L1 양성 암을 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮을 암 또는 예후가 나쁠 암으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현 감소는 암세포 표면에서 발현된 PD-L1 수준의 감소를 나타내는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암세포 표면에서의 PD-L1 발현수준의 감소는 암세포 PD-L1과 T세포 PD-1과의 결합 감소를 나타내는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 발현 감소는 암세포에서의 PD-L1의 수준 증가, 및 CD8 T 세포의 수 또는 이의 활성 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준은 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정되는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 암세포, 암조직, 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 타액, 소변, 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  17. 제1항의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 키트로서,
    상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측용 키트.
  18. DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 동반진단(companion diagnosis)용 조성물로서,
    상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물인 것을 특징으로 하는, 동반진단용 조성물.
  19. 제18항의 PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 동반진단용 조성물을 포함하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 동반진단(companion diagnosis)용 키트.
  20. 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서,
    상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물인 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 감소된 경우, 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮거나, 또는 예후가 나쁠 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  22. PD-L1 양성 암 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DRG2(Developmentally-regulated GTP-binding protein 2) 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서,
    상기 면역항암제는 PD-1(Programmed cell death protein 1) 또는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 약물인 것을 특징으로 하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 DRG2 유전자 또는 DRG2 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 감소된 경우, 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮거나, 또는 예후가 나쁠 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, PD-L1 양성 암에서의 면역항암제에 대한 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
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