KR102525621B1 - 세타-버스트 초음파를 이용한 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법 - Google Patents

세타-버스트 초음파를 이용한 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세타-버스트 초음파 자극을 인가하여, 뇌의 가소성을 향상 또는 억제시키는 뇌의 가소성 조절 장치 및 뇌의 가소성 조절방법에 관한 것으로, 본 발명의 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법은 외과적 수술 없이 비침습적인 방법으로도 안전하게 뇌의 가소성을 조절할 수 있다. 또한, 기존의 경두개 자기 자극 또는 경두개 전기 자극과는 달리 경두개 초음파자극은 공간 해상도가 높아 필요한 뇌의 부위에 국소적인 자극 조절이 가능하며, 세타-버스트 펄스를 사용한 기존의 경두개 자기 자극보다 침투성, 공간 해상도 및 후속효과의 지속력이 현저히 상승되어, 수 분간의 자극으로도 최대 1시간까지 그 효과가 지속된다. 따라서, 본 발명의 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법은 세타-버스트 펄스의 인가 패턴에 따라 뇌의 가소성을 향상 또는 억제시킴으로써 뇌의 장기 강화 및 억제를 통한 학습 능력, 기억력 등의 향상 및 우울증등 각종 신경 관련 질환의 예방 및 치료, 간질 및 발작과 같은 비정상적으로 증가된 뇌의 활동도 조절 등의 뇌기능 관련 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세타-버스트 초음파를 이용한 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법{Neural Plasticity Control Device and Method Using Theta-Burst Ultrasound}
본 발명은 세타-버스트 초음파 자극을 인가하여, 신경의 가소성을 향상 또는 억제시키는 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법에 관한 것이다.
경두개 자기 자극(Transcranial Magnetic Stimulation, TMS) 및 경두개 전기 자극(Transcranial Electric Stimulation, TES)과 같은 비침습 뇌 자극 기술은 신경과학에서, 뇌 구조-기능 관계를 연구하고, 임상의학에서 정신적/신경학적 증상을 치료하는데 널리 사용되어왔다(Brain Stimul 1, 363-369 (2008)). 그럼에도 불구하고, TMS와 TES는 수 제곱 센티미터에서 수십 제곱 센티미터의 공간 해상도를 가지며, 뇌의 표면에만 영향을 미친다(Med Biol Eng Comput 50, 671-681 (2012); Neuroimage 58, 849-859 (2011)).
반면, 경두개 초음파는 반 입방 밀리미터에서, 수 입방 밀리미터까지의 높은 공간 해상도를 가지며, 비침습적으로 뇌 깊숙이 침투함으로써 국소적인 뇌 기능의 변화를 일으킬 수 있다(Med Phys 43, 5730 (2016); Ultrasound Med Biol 42, 1512-1530 (2016); PLoS One 9, e86939 (2014)). 현재 보고된 프로토콜들에 따르면, 진단용 초음파 이미징 시스템(2.32MHz 중심주파수)를 사용하여, 인간의 운동 피질에 2분간 초음파 자극을 가한 결과, 6분 동안의 운동 유발 전위(motor evoked potentials, MEP)의 후속효과가 관찰되었으며, 마취된 돼지의 복측-후측 시상 핵(ventro-posterolateral thalamic nucleus)에 10Hz(1.14MHz 중심주파수)의 경두개 초음파를 40초간 가한 결과 10분간 체성 감각 유발 전위의 억제가 관찰되었다 (Dallapiazza et al., 2018). 그러나, 상기한 것과 같이, 수분간의 자극으로 최대 10분의 후속효과를 나타내는 프로토콜은 임상 질환 치료에 사용되기에 지속력 및 후속효과가 현저히 부족하다.
한편, "세타-버스트" 패러다임은 전기 자극 방법을 통해 보고된 바 있으며, 이를 적절하게 사용하는 경우, 뇌의 가소성의 장기 강화(LTP) 또는 억제(LTD)를 유발할 수 있다고 알려져 있다(J Neurophysiol24, 243-259 (1961)). "세타-버스트 자극"은 학습 또는 기억 과정에서 생체내에서 관찰되는 신경적 활동을 모방한 자극으로, 높은 주파수의 자극을 세타 주파수(약 4Hz 내지 약 8Hz) 특히 최근 보고된 경두개 자기 자극(TMS) 또는 경두개 직류 자극(tDCS) 기반의 세타 중첩 감마 패턴 전달은 단일 주파수 자극에 비해 더 오랫동안 지속되는 신경 가소성 조절효과를 나타내는 것으로 보고되었으며(Curr Biol26, 1513-1521 (2016); Neuron45, 201-206 (2005)), FDA는 TMS 기반의 세타-버스트 자극 프로토콜을 승인한 바 있다. 지금까지의 모든 보고 및 상용화된 기기들은 세타-버스트 자극은 경두개 자기 자극 기법(TMS)으로 뇌에 전달하며, TMS 기반의 자극 장치를 사용하는 경우, 50Hz의 3개의 펄스를 5Hz로 반복하는 프로토콜이 가장 최적의 효과를 나타내는 것으로 상용화되어 있다. TMS 기반의 세타-버스트 자극은 신경 가소성을 증가시키는 iTBS(간헐적 세타-버스트 자극)의 경우에 10분 이내(약 3~4분)의 자극을 통해 최대 20분간 지속되는 후속효과가 관찰되었다(Neuron, Volume 45, ISSUE 2, P201-206, January 20, 2005). 상기 세타-버스트 패턴을 이용한 뇌 자극이 임상 질환의 치료를 위한 강력한 도구로 사용되기 위해서는, 현재 보고된 경두개 자기 자극(TMS) 또는 경두개 전기 자극(TES) 기반의 세타-버스트 자극 프로토콜보다 해상도와 침투력의 향상이 필요하며, 특히, 후속효과의 지속력 향상을 나타내는 프로토콜의 개발이 가장 중요하다.
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 짧은 자극기간 (stimulation duration, 40 초 또는 200 초)으로도 장기간 동안 뇌의 가소성을 조절하기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 단순 세타 초음파에 감마 주파수의 버스트 효과를 결합한 세타-버스트 초음파를 뇌에 인가하여 자극하는 경우, 인가 패턴에 따라, 운동 유발 포텐셜 (motor-evoked potentials; MEPs)이 증폭되거나 감소하는 것을 확인하고, 상기 세타-버스트 초음파의 신경 가소성 조절 메커니즘이 NMDA(N-methyl-d-aspartate) 수용체의 활성화, BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 및 신규 단백질 (de novo protein synthesis)의 합성과 관련되어 있음을 확인하였다. 나아가 세타-버스트 초음파의 위상 진폭 결합 (theta-to-gamma phase-amplitude coupling, PAC)이 뇌파 조절 및 뇌의 가소성 조절과 밀접한 관련이 있음을 확인하고, 세타-버스트를 구성하는 펄스의 개수, 주파수 등을 최적화 함으로써, 단 5분 이내의 자극으로도 최대 1시간(종래의 약 3배 이상) 지속되는 후속효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 이러한 효과의 재현성이 매우 높음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 세타-버스트 초음파 자극을 사용하여, 신경 가소성의 향상 또는 억제가 가능한 신경 가소성 조절 장치 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세타-버스트 초음파 자극을 통한 신경 가소성의 조절방법 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경 가소성 향상 모드 또는 신경 가소성 억제 모드의 변환이 가능한, 제어부 및 적어도 하나의 세타-버스트 초음파 자극 생성부를 포함하는 신경 가소성 조절 장치에 있어서,
상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는
세타-버스트 펄스를 생성하는 펄스 발생기(Pulse generator);
상기 세타-버스트 펄스를 정현파 형태로 변환하는 함수 발생기; 및
상기 정현파 형태로 변환된 세타-버스트 펄스를 초음파로 변환하는 트랜스듀서(Transducer)를 포함하며,
상기 제어부는 상기 신경 가소성 향상 모드 또는 상기 신경 가소성 억제 모드에 따라 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 제어 신호를 송신하고,
상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 수신된 제어 신호에 따라 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS) 또는 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)을 생성하는 신경 가소성 조절 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 대상의 뇌에 간헐적 또는 연속적 세타-버스트 초음파 자극을 인가하여 자극하는 단계를 포함하는 뇌의 가소성 조절방법을 제공한다.
본 발명의 신경 가소성 조절 장치는 대상의 뇌에 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS) 또는 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)을 인가하여, 기억 및 학습의 세포 기전으로 알려져 있는 장기 강화 (long-term potentiation, LTP) 또는 장기 억제 (long-term depression, LTD)와 유사한 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법은 외과적 수술없이 비침습적인 방법으로도 안전하게 뇌의 가소성을 조절할 수 있다. 또한, 기존의 경두개 자기 자극 또는 경두개 전기 자극과는 달리 경두개 초음파자극은 높른 공간 해상도와 뇌 침투력이 높아 필요한 부위에 국소적인 조절이 가능하며, 특히, 세타-버스트 펄스를 사용한 기존의 경두개 자기 자극보다 조절 지속력이 현저히 상승되어, 수 분간의 자극으로도 최대 1시간까지 그 효과가 지속된다.
따라서, 본 발명의 신경 가소성 조절 장치 및 조절방법은 세타-버스트 초음파 자극의 인가 패턴에 따라 뇌의 가소성을 향상 또는 억제시킴으로써 뇌의 장기 강화를 통한 학습 능력, 기억력 등의 향상 및 다양한 신경 정신과적 질환의 예방 및 치료 등의 뇌기능 관련 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 비정상적으로 동기화되어 있거나 활성화 되어 있는 뇌의 기능을 약화시킴으로써 간질, 발작 등과 같은 뇌기능 조절에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 세타-버스트 초음파 자극(TBUS) 프로토콜 및 운동 유발 전위(MEP)에 미치는 영향을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1a는 실시 예에서 수행된 초음파 자극 및 운동 유발 전위 데이터 수집을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 실시 예에서 사용된 세타-버스트 초음파 자극 조건을 나타낸 것이다. 단일 펄스는 17ms 길이의 500kHz 초음파로 구성되며, 상기 단일 펄스 4개가 30Hz로 반복되어 감마 펄스 버스트를 구성하고, 단일 펄스 4개로 구성된 펄스 버스트는 5Hz로 반복된다. 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)에서는 2초의 세타 버스트-초음파 자극 및 8초의 인터미턴스의 주기로 자극을 인가 하였으며, 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)의 경우 인터미턴스 없이 세타-버스트 초음파 자극이 인가되었다.
도 1c는 도 1a의 EMG 기록결과이며, 앞다리 삼두근의 MEP 진폭 및 통합 프로파일을 사용하는 MEP 시작 지연(MEP onset latency)를 나타낸 것이다.
도 1d는 MEP의 진폭 및 시작 지연에 대한 그룹별 데이터를 나타낸 것이다(별도의 언급이 없는 경우, 각 그룹의 N=6). 반복 분산 측정 분석(RM-ANOVA)을 이용하여 TBUS_패턴-시간 상호관계를 나타냈다(F 12,90=2.54, p<.01).
도 1e는 iTBUS 및 경두개 초음파에 일반적으로 사용되는 10Hz 초음파 자극의 효과를 비교한 것이다. 물리적인 자극의 기간이나 강도는 두 자극 법에서 동일하나, 자극패턴만 상이하다.
도 1f는 감마 버스트 유무에 따른 5Hz의 자극을 간헐적으로 인가한 경우의 효과를 나타낸 것이다. RM-ANOVA를 통해 감마 버스트를 포함하는 iTBUS가 감마 버스트를 포함하지 않는 i-Theta 자극보다 우수한 MEP 향상 후속효과를 나타내는 것을 확인하였다(그룹 주요 효과, F1,10=5.93, p<.05).
도 1g는 총 자극 펄스의 수에 따른 지속시간의 변화를 확인한 결과이다(총 800 펄스). RM-ANOVA는 TBUS 패턴-시간 상호관계(F10,100 = 3.37, p <.001) 및 TBUS 패턴 주요 효과(F1,10 = 21.19, p <.001)를 나타낸다.
도 2는 3개 또는 4개의 단일 펄스로 구성된 감마 버스트를 포함하는 세타-버스트 자극을 사용하는 경우에 iTBUS에 대한 MEP의 AUC(Area under curve)를 비교한 결과이다(iTBUS400(4 Pulse), N = 18; iTBUS300(3 Pulse), N=6).
도 3은 TBUS를 이용한 비침습적 운동피질 자극 방법이 새로운 운동 기술의 학습에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 각 그룹에서 N=9이다.
도 3a는 단일 팰렛 도달 실험(Single pellet reaching task)을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3b는 10일의 훈련 기간동안의 성공률을 나타낸 것이다. RM-ANOVA는 TBUS 패턴-자극위치 상호관계를 나타낸다(F1,24 = 7.50, p < .05).
도 3c는 대측(contralateral) 또는 동측(ipsilateral) M1에 iTBUS를 인가한 경우, 학습효과와의 상호관계 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3d는 1분당 도달을 위한 시도 횟수를 나타낸 것이다.
도 4는 다른 파라미터(중심 주파수, 버스트 주파수 등)를 갖는 세타-버스트 초음파 자극의 효과를 나타낸 것이다.
도 4a는 인가된 다른 파라미터의 세타-버스트 초음파 자극 특성을 나타낸 것이다.
도 4b는 iTBUS, cTBUS 및 위약(sham) 자극을 인가한 경우, MEP 진폭에 대한 효과를 나타낸 것이다. RM-ANOVA는 TBUS 패턴-시간 상호관계를 나타낸다(F14,210 = 1.85, p < .05).
도 4c는 MEP 시작 지연을 나타낸 것이다. 그룹 간 또는 그룹 내에서 유의한 차이가 없었다.
도 5는 TBUS의 가소성 조절효과에 대한 약리 및 분자 메커니즘에 관한 것이다.
도 5a는 저용량 D-사이클로세린(D-cycloserine, DCS), 메만틴(memantine) 또는 식염수를 처리한 경우에 iTBUS (총 800 펄스)의 효과를 확인한 결과이다. RM-ANOVA는 그룹-시간 상호관계를 나타낸다(F20,150 = 2.0, p < .01).
도 5b는 저용량 D-사이클로세린(D-cycloserine, DCS), 메만틴(memantine) 또는 식염수를 처리한 경우에 cTBUS의 효과를 확인한 결과이다. RM-ANOVA는 그룹-시간 상호관계를 나타낸다(F20,150 = 2.69, p <.001).
도 5c는 단백질 생성 억제제인 CXM(cycloheximide) 또는 식염수를 처리한 경우에, iTBUS의 효과를 나타낸 것이다. RM-ANOVA는 그룹-시간 상호관계를 나타낸다 (F10,100 = 1.98, p < .05).
도 5d는 CXM 또는 식염수 처리 그룹에 대한 cTBUS의 효과를 나타낸 것이다. RM-ANOVA는 그룹-시간 상호관계를 나타낸다 (F10,100 = 2.18, p < .05).
도 5e는 ANA-12 또는 대조군인 DMSO 처리그룹 및 BDNF 프로모터 IV 녹아웃(BDNF-IV-KO) 쥐에서의 iTBUS의 효과를 나타낸 것이다. RM-ANOVA는 그룹 주요 효과를 나타낸다 (F2,15 = 6.97, p < .01).
도 5f는 ANA-12 또는 DMSO 처리그룹 및 BDNF 프로모터 IV 녹아웃(BDNF-IV-KO) 쥐에서의 cTBUS의 효과를 나타낸 것이다. RM-ANOVA는 그룹 주요 효과를 나타낸다(F2,15 = 6.72, p <.01).
도 5g는 iTBUS 이후 자극 및 비자극 영역에 대한 c-Fos 면역 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 5h는 TBUS 후, M1에서 c-Fos 발현을 나타낸 것이다(각 그룹당 N=7). RM-ANOVA는 그룹-자극위치 상호관계를 나타낸다 (F2,18 = 9.13, p < .01).
도 6은 H&E 염색(위) 및 에반스 블루(아래)를 사용한 TBUS의 안전성 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 2초간의 세타-버스트 초음파 자극에 사건-관련 뇌 반응을 나타낸 것이다(N=6). 파란 선은 각 개별적 EEG 추적 검은색 선은 이들의 평균을 나타낸 것이다.
도 8은 4가지 방법으로 확인된 MEP 시작 지연을 나타낸 것이다: 통합 프로파일(IP), Teager-Kaiser Energy Operator (TKEO), Sample Entropy (SampEn), 및 선형 포락선(Linear envelope).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
현재까지, 경두개 자기 자극(TMS) 또는 경두개 전기 자극(TES)이 인간과 동물의 뇌의 기억력 향상과 같은 가소성 변화를 위해 주로 사용되어 왔다. 그러나, 상기 TMS 또는 TES는 낮은 공간 해상도를 가지기 때문에, 뇌의 표면 자극만이 가능하다는 단점이 있었다. 경두개 초음파 자극(TUS)은 TMS 및 TES에 비해 높은 공간해상도를 가져, 뇌의 심부와 같은 원하는 부위의 자극에 유리하다는 장점이 있으나, 기존의 10Hz(1.14MHz 중심주파수)의 경두개 초음파 자극 방법은 최대 10분의 후속효과를 나타내어, 임상적으로 상용화 되기에 어려움이 있었다(Dallapiazza et al., 2018).
본 발명의 일 실시예에서는 경두개 자기 자극(TMS) 기반 기술에서 사용되는 세타-버스트 주파수를 경두개 초음파 자극(TUS)에 인가하는 경우에, 상기한 공간 해상도 외에도, 가소성 조절의 강도 및 효과의 지속력이 현저히 향상되는 것을 확인하였으며, 기존의 TMS에서 최적화되어 사용되는 3 pulse burst(50Hz)보다, TUS(경두개 초음파 자극)에 적합한 세타-버스트 주파수 조건을 확인하였다.
나아가, 기존의 TMS기반의 세타-버스트 자극에서는 간헐적 theta-burst 의 경우, 총 인가 펄스의 증가가 지속력에 유의미한 영향을 미치지 못하며, 최대 20분의 지속력을 나타낸다고 보고되었으나(Neuron 45, 201-206 (2005); Clin Neurophysiol 118, 1028-1032 (2007)), 본 발명의 다른 실시예에서, 세타-버스트 초음파 자극(TBUS, Theta-Burst Ultrasound Stimulation)을 이용한 총 인가 펄스가 400개의 단일 펄스에서 800개의 단일펄스로 증가하는 경우, 효과 지속력이 2배 이상 증가하여 최대 1시간의 지속력을 나타내는 것을 확인하였으며, 세타-버스트 초음파 자극(TBUS)의 신경 가소성 조절 메커니즘이 NMDAR, BDNF/TrKB 신호 및 신규 단백질 합성과 밀접한 연관이 있음을 입증하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 운동 유발 전위(MEP)의 진폭을 기준으로 뇌의 운동 피질의 M1에 자극을 가하여, 효과를 확인하였으나, 이러한 연구방법은 신경 가소성의 조절 여부를 확인하기 위해 사용되는 전통적인 방법이며, 따라서, 운동 유발 전위의 조절 뿐 아니라 신경 가소성의 조절, 특히 뇌 신경의 가소성 향상을 통한 학습 능력, 기억력 등의 향상 및 우울증의 예방 및 치료, 뇌 신경의 가소성 억제를 통한 간질, 발작 등의 예방 및 치료와 같은 다양한 뇌기능 관련 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 신경 가소성 향상 모드 또는 신경 가소성 억제 모드의 변환이 가능한, 제어부 및 적어도 하나의 세타-버스트 초음파 자극 생성부를 포함하는 신경 가소성 조절 장치에 있어서,
상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는
세타-버스트 펄스를 생성하는 펄스 발생기(Pulse generator);
상기 세타-버스트 펄스를 정현파 형태로 변환하는 함수 발생기; 및
상기 정현파 형태로 변환된 세타-버스트 펄스를 초음파로 변환하는 트랜스듀서(Transducer)를 포함하며,
상기 제어부는 상기 신경 가소성 향상 모드 또는 상기 신경 가소성 억제 모드에 따라 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 제어 신호를 송신하고,
상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 수신된 제어 신호에 따라 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS) 또는 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)을 생성하는 신경 가소성 조절 장치에 관한 것이다.
본 발명의 신경 가소성 조절 장치는 종래 공지된 경두개 초음파 자극 방법 방법 또는 세타-버스트 주파수를 기반으로 하는 경두개 자기 또는 전기 자극을 대체 및 개선시킴으로써 기존의 방법이 갖는 것보다 더욱 강력한 신경 가소성 조절 효과를 가져오며, 기존의 방법이 가지는 짧은 효과 지속력을 극복하여, 최대 3분의 자극으로도 1시간까지 효과가 지속되는 것을 특징으로 함을 확인하였다. 따라서, 특히 재현성 및 효과 지속성 면에서 기존의 방법보다 현저히 뛰어난 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 신경 가소성 조절 장치는 모드의 변환에 따라 세타-버스트 초음파 자극의 발생 패턴을 달리하여, 신경 가소성을 향상 또는 억제 시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 뇌의 가소성 향상을 통한 학습 능력, 기억력 등의 향상 및 우울증의 예방 및 치료, 또는 신경 가소성 억제를 통한 통증 감소 등의 용도에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "세타-버스트"는 뇌의 뉴런에서의 활동 리듬을 모방한 패턴을 의미한다. 구체적으로 세타-버스트는 세타 주파수로 반복되는 각각의 펄스가 버스트(burst)되는 것을 의미한다.
상기 버스트는 고주파의 주파수가 짧은 주기로 빠르게 반복된 하나의 펄스 그룹을 의미하며, 본 발명에서 "펄스 버스트"와 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용된다. 상기 세타-버스트 패턴을 갖는 자극을 세타-버스트 자극(TBS)이라 한다. 종래의 많은 보고에서, TMS 기반의 간헐적 세타-버스트 자극(iTBS)이 신경 가소성을 향상시키고, 연속적 세타-버스트 자극(cTBS)이 신경 가소성을 억제시킬 수 있음이 보고된 바 있으나, 특히 신경 가소성의 향상 효과를 갖는 iTBUS의 지속 효과는 최대 20분에 불과하며, 초음파와 접목하여 세타-버스트 자극을 인가하고 최적화한 예는 전무하다.
본 발명의 용어 "간헐적 세타-버스트 자극(iTBS)"은 세타-버스트 자극이 일정의 간격을 가지고 On/Off 되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 간헐적 세타-버스트 자극이 초음파를 통해 인가되는 경우, iTBUS(intermittent Thet-Burst Ultrasound Stimulation)와 같이 기재된다.
본 발명의 용어 "연속적 세타-버스트 자극(cTBS)"는 세타-버스트 자극이 off없이 연속적으로 인가되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 간헐적 세타-버스트 자극이 초음파를 통해 인가되는 경우, cTBUS(continuous Theta-Burst Ultrasound Stimulation)와 같이 기재된다.
본 발명은 세타-버스트 패턴(또는 주파수)의 초음파 자극을 생성하고 인가하는 것을 특징으로 하며, "세타-버스트 초음파 자극(Theta Burst Ultrasound Stimulation, TBUS)"의 용어로 사용된다.
본 발명의 용어 "펄스 발생기(Pulse generator)"는 펄스의 전달 형태를 결정하여, 원하는 패턴의 전압 또는 전류 펄스를 발생시키는 회로를 의미하며, "펄서"와 실질적으로 동일한 의미에서 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 사용된 펄스 발생기는, Transistor Transistor Logic(TTL) 회로를 통해 세타-버스트 펄스를 발생시키나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "세타-버스트 펄스"는 상기 세타-버스트 주파수 패턴을 갖는 전기적 펄스를 의미한다. 상기 세타-버스트 펄스는 펄스 발생기(Pulse generator)를 사용하여 생성할 수 있으며, 구체적인 파라미터 값(버스트를 구성하는 단일 펄스의 수, 버스트 주파수, 버스트 반복 주파수 등)의 설정을 통해 펄스 발생기로부터 세타-버스트 펄스가 생성된다.
본 발명의 용어, "단일 펄스"는 세타-버스트 펄스에서 버스트를 구성하는 각각의 펄스를 의미한다. 본 발명에 있어서, 각 단일 펄스를 초음파로 변환하기 위해, 각각의 펄스가 정현파와 같은 함수로 변환될 수 있으며, 초음파의 생성을 위해 트랜스듀서와 같은 장치가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 세타-버스트 펄스의 버스트는 3개 내지 5개의 단일 펄스로 구성된 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 4개의 단일 펄스로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세타-버스트 펄스는 30 내지 200Hz의 주파수(감마 주파수)를 갖는 펄스 버스트가 4 내지 8 Hz의 주파수(세타 주파수)로 반복되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 100Hz의 주파수를 갖는 펄스 버스트가 4 내지 8의 Hz의 주파수로 반복될 수 있고, 30Hz의 주파수를 갖는 펄스 버스트가 5Hz의 주파수로 반복되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 펄스 버스트는 25% 내지 75%의 충격 계수(duty cycle)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 일 실시예에서와 같이 50%의 충격 계수(Half-On, Half-Off)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, "충격 계수(duty cycle)"는 온-오프가 주기적으로 반복되는 장치에서, 주기에 대한 온(On) 시간의 비를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 충격 계수는 펄스 반복 주기(Pulse repetition Frequency)와 펄스 폭의 비를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 펄스 발생기는 세타-버스트 펄스를 발생시키며, 세타-버스트 펄스는 함수 발생기(Function generator)에 인가되어 트랜스듀서에 적합한 파형으로 변환된다.
본 발명의 용어 "함수 발생기(Function generator)"는 임의 파형의 전압을 생성하는데 사용되는 연산기로, 시간, 입력 전압에 대해 주어진 함수를 충족하는 전압을 발생시킬 수 있다. 초음파의 생성에 있어서, 함수 발생기는 초음파의 형태와 길이, 중심 주파수 등을 결정한다. 일반적으로 함수 발생기는 함수의 모양, 모드, 주파수, 진폭, 오프셋, 위상차 등의 파라미터를 조절할 수 있다. 본 발명에서, 상기 함수 발생기는 펄스 발생기에서 생성된 펄스를 트랜스듀서에 적합한 형태의 파형(예, 정현파)을 갖도록 변환하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용된 용어 "펄스 발생기" 및 "함수 발생기"는 본 발명의 신경 가소성 조절 장치가 세타-버스트 초음파 자극을 생성하는 메커니즘에서 각각의 역할을 설명하기 위해 사용되며, 별도의 독립된 장치여야만 하는 것은 아니다. 펄스 발생기 및 함수 발생기는 일체형으로 마련되거나 분리된 구성으로 마련될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 함수 발생기는 단일 펄스를 상기 트렌스듀서가 갖는 중심주파수와 일치하는 정현파로 변환하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 정현파는 바람직하게는 200 KHz 내지 600 KHz 의 중심주파수, 바람직하게는 500kHz의 중심 주파수를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정현파는 100%의 충격 계수를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정현파는 5 내지 20ms, 바람직하게는 17ms의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세타-버스트 초음파 자극의 강도는 역치(threshold) 강도의 70% 내지 100%, 바람직하게는 역치 강도의 80 내지 90%, 가장 바람직하게는 약 80%인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "역치 강도"는 하나의 펄스를 신경에 가하는 경우, 50% 빈도로 신경의 흥분(neural firing)이 나타나는 초음파의 강도를 의미한다.
본 발명의 신경 가소성 조절 장치는 단일 초음파 자극을 가하여, 신경의 흥분에 필요한 역치 강도를 측정하는 장치를 별도로 포함할 수 있으며, 자극 부위의 역치 강도를 측정하여, 이를 기준으로 세타-버스트 초음파 자극의 강도를 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펄스 발생기 및 함수 발생기를 통해 생성된 세타-버스트 주파수를 갖는 정현파 형태의 펄스 신호는 상기 트랜스듀서에 의해 초음파로 변환된다.
본 발명의 용어 "트랜스듀서"는 정현파 형태로 변환된 세타-버스트 펄스를 초음파로 변환하는 장치를 의미한다. 본 발명에 있어서, 초음파를 원하는 부위(집속점)에 조사할 수 있도록 하기 위해, 하나 이상의 트랜스듀서를 1차원 또는 2차원, 선형 또는 곡면으로 배열하여 트랜스듀서 어레이 또는 트랜스듀서 모듈로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 트랜스듀서는 예를 들어, 자성체의 자왜효과를 이용한 자왜 초음파 트랜스듀서(Magnetostrictive Ultrasonic Transducer), 압전 물질의 압전 효과를 이용한 압전 초음파 트랜스듀서(Piezoelectric Ultrasonic Transducer) 또는 압전형 미세가공된 초음파 트랜스듀서(piezoelectric micromachined ultrasonic transducer, pMUT), 미세 가공된 박막의 진동을 이용한 정전용량형 미세가공 초음파 트랜스듀서(Capacitive Micromachined Ultrasonic Transducer) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 하나 이상의 트랜스듀서가 사용되는 경우, 각각의 트랜스듀서마다 별도의 변환된 세타-버스트 펄스가 인가될 수 있으며, 자극 인가 부위의 위치에 따라 지연된 세타-버스트 펄스가 인가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 주파수 전력 증폭기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 주파수 전력 증폭기는 함수 발생기에 의해 변환된 세타-버스트 펄스를 증폭하여 트랜스듀서에 제공함으로써, 초음파 자극 강도의 조절이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 트랜스듀서에 음향 콜리메이터(acoustic collimator)가 추가로 장착되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 음향 콜리메이터는 트랜스듀서에서 생성된 분산된 초음파 자극을 특정 지향성을 지니게 하는 연제의 통을 의미한다. 콜리메이터를 통해 초음파 자극의 집속점을 조절할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 콜리메이터의 형태는 콘형, 편평형, 벌집형, 평행다공형 등이 사용될 수 있으며, 콜리메이터의 내부는 초음파용 젤로 채워진 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종래 보고된 바와 같이, 세타-버스트 자극은 그 인가 패턴에 따라 간헐적 세타-버스트 자극(iTBS) 및 연속적 세타-버스트 자극(cTBS)로 나뉘며, 본 발명의 일 실시예에서는 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)의 경우 신경 가소성의 현저한 향상 효과를, 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)의 경우 신경 가소성의 현저한 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 신경 가소성 조절 장치는 신경 가소성 향상 모드와 신경 가소성 억제 모드의 변환이 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 신경 가소성 향상 모드와 신경 가소성 억제 모드에 따라 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS) 또는 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)을 생성 또는 인가하도록 제어 신호를 송신하는 것을 특징으로 할 수 있다.
도 7에서 확인한 바와 같이, 2초의 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)을 인가하는 경우에, 개체에 따라, 약 3 내지 14초의 후속효과 지속시간을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)의 버스트에 따른 효과 증진을 극대화 하기 위해서는 상기 후속효과 지속시간에 맞게 세타-버스트 초음파 자극을 간헐적으로 인가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)은 세타 버스트 초음파 자극이 일정 간격을 두고 생성 또는 인가되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 간헐적 세타-버스트 초음파 자극은 2초의 자극 및 3 내지 14초(바람직하게는, 8초)의 자극 간격을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제어부는 신경 가소성 향상 모드 또는 신경 가소성 억제 모드에 따라 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 제어 신호를 송신한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제어부의 제어 신호에 따라 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 세타-버스트 초음파 자극 시간 및 자극 간격을 제어하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 상기 제어 신호를 수신하여, 세타-버스트 초음파 자극 생성부의 펄스 발생기를 제어하여 세타-버스트 펄스의 생성 시간 및 생성 간격을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 상기 제어 신호를 수신하여, 세타-버스트 초음파 자극 생성부의 트랜스듀서를 제어하여 세타-버스트 초음파 자극의 인가 시간 및 인가 간격을 조절할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 펄스 발생기의 제어 및 트랜스듀서의 제어가 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 신경 가소성 조절 장치가 신경 가소성 향상 모드인 경우, 상기 제어부는 2초의 자극 시간 및 3 내지 14초(바람직하게는 8초)의 자극 간격을 갖는 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)을 생성하도록 제어 신호를 송신하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 신경 가소성 조절 장치가 신경 가소성 향상 모드인 경우, 상기 초음파 생성부는 상기 제어부의 제어 신호를 수신하여, 2초의 인가 시간 및 3 내지 14초(바람직하게는 8초)의 인가 간격으로 세타-버스트 초음파 자극이 인가되도록 하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 초음파 자극 대상에, 2초의 세타-버스트 초음파 자극을 인가한 경우, 신경 가소성 조절효과의 지속시간을 검출하고, 이에 따라 간헐적 세타-버스트 초음파 자극의 생성 간격 또는 자극 인가 간격이 제어되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 신경 가소성 조절 장치는 EEG 검출 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 다른 신경 가소성 측정기기 또는 본 발명의 신경 가소성 조절 장치에 의해 측정된 효과 지속시간 정보에 따라 자극 간격을 제어하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 신경 가소성 조절 장치가 신경 가소성 억제 모드인 경우, 상기 초음파 생성부는 상기 제어부의 제어 신호를 수신하여, 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)을 생성 및 인가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 상기 초음파의 파라미터를 조절하는 제어 신호를 추가로 송신하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 모드 변환입력이 가능한 입력부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 입력부에 입력된 사용자의 조작에 따라 상기 신경 가소성 향상 모드 및 상기 신경 가소성 억제 모드가 변환 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입력부는 모드 입력 신호 이외에도, 세타-버스트 파라미터의 설정 입력이 가능한 것을 특징으로 할 수 있으며, 입력된 세타-버스트 파라미터에 따라 파라미터 입력 신호를 제어부에 송신하고, 상기 제어부는 다시 주파수 자극 생성부에 제어 신호를 송신하여 입력된 파라미터 값을 갖는 주파수 자극을 생성하도록 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입력부는 자극의 시작 및 종료의 입력이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 입력부는 자극의 시작 신호 또는 종료 신호를 제어부에 송신하며, 상기 제어부는 시작 신호 또는 종료 신호의 수신에 따라 세타-버스트 초음파 자극 생성부가 자극 생성 및 종료하도록 제어 신호를 송신하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입력부는 예를 들어, 버튼, 스크린 및 조작버튼, 터치스크린등의 구성을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 입력부는 별도의 입력 장치로서 전기 신호, 적외선 신호, 초음파 신호 등 다양한 신호 전달 방법을 사용하여, 제어부에 원격으로 모드 입력 신호를 전송할 수 있다.
본 발명에 있어서, 입력부로부터 수신된 모드 입력 신호에 따라 제어부는 iTBUS 또는 cTBUS를 생성하도록 제어 신호를 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 송신할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입력부는 스마트폰, 리모콘, 스마트 워치 등의 다양한 전자기기인 것을 특징으로 할 수 있다.
TMS 기반의 세타-버스트 자극에서는 2배의 총 단일 펄스를 갖는 간헐적 세타 버스트 자극을 인가하는 경우, 오히려 신경 가소성 향상 효과가 억제되는 것으로 보고 되는 것과 대조적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 초음파 기반의 세타-버스트 자극에서, 총 2배의 총 단일 펄스(800)를 갖는 간헐적 세타 버스트 자극이 2배의 지속력(최대 1시간)을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 400 내지 1600개의 총 단일 펄스, 바람직하게는 400 내지 800개의 총 단일 펄스, 가장 바람직하게는 800개의 총 단일 펄스를 포함하는 세타 버스트 초음파 자극을 생성하도록 제어 신호를 송신하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "신경 가소성"은 경험, 학습 등에 의해 신경계에 발생하는 기능적 구조적 변형을 의미한다. 상기 신경 가소성은 기억, 신경 발달과 같은 기능뿐만 아니라, 변화하는 환경, 노화, 또는 병리학적 원인에 의한 반응으로 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 세타-버스트 초음파 자극은 뇌 신경의 가소성을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세타-버스트 초음파 자극이 인가되는 뇌의 부위, 깊이, 자극 위치, 강도 등은 뇌의 구조 및 기능에 대한 많은 종래의 문헌을 참고하여 목적에 따라 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 뇌 전두엽에서 가소성 전하가 특징인 우울증의 경우 iTBUS를 인가하여 가소성 향상과 우울 증상의 감소를 유도할 수 있으며, 기억력에 중심적인 역할을 하는 뇌 해마에 iTBUS 실시하여 기억력 향상을 도모할 수 있다. 반면 가소성 억제를 목표로 간질이나 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 등에 cTBUS를 인가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 뇌의 운동피질 M1 부위의 운동 유발 포텐셜을 측정함으로써 뇌의 가소성 조절효과를 확인하였으나, 이는 신경 가소성 조절 효과를 확인하는 전통적인 실험방법에 불과하며, 본 발명의 신경 가소성 조절 장치의 작용 메커니즘이 뇌의 전반적인 활성 또는 비활성 신호전달에 관여하는 글로탐산 수용체인 NMDA 수용체, BDNF/TrkB 신호 전달 및 신규 단백질 합성(de novo protein synthesis)과 연관되어 있음을 증명한 이상. 본 발명의 뇌 가소성 조절 장치는 M1 부위 및 운동 학습능력의 향상 이외에도 뇌의 가소성 조절이 필요한 뇌의 모든 부위 (공포기억 관장 편도체, 기억 및 학습 관련 해마, 전두엽, 운동 능력 및 감정 조절 소뇌 등)에 통상의 기술자에 의해 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 대상의 뇌에 간헐적 또는 연속적 세타-버스트 초음파 자극을 인가하는 단계((a) 단계)를 포함하는 신경의 가소성 조절방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 세타-버스트 펄스의 버스트(펄스 버스트)는 3개 내지 5개의 단일 펄스로 구성된 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 4개의 단일 펄스로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세타-버스트 초음파 자극은 30 내지 200Hz의 주파수(감마 주파수)를 갖는 펄스 버스트가 4 내지 8 Hz의 주파수(세타 주파수)로 반복되는 것을 특징으로 하는 신경의 가소성 조절방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 펄스 버스트는 25% 내지 75%의 충격 계수(duty cycle)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 일 실시예에서와 같이 50%의 충격 계수(Half-On, Half-Off)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단일 펄스는 약 200kHz 내지 600kHz, 바람직하게는 약 500kHz의 중심 주파수를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단일 펄스는 100%의 충격 계수(duty cycle)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 간헐적 세타-버스트 초음파 자극을 인가하는 경우, 약 2초 길이의 세타-버스트 초음파를 약 0.1Hz의 주파수로 반복하여 인가(2초 인가, 8초 간격)하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 총 약 400개 내지 약 1600개, 바람직하게는 약 400회 내지 800개, 가장 바람직하게는 800개의 총 단일 펄스가 대상의 뇌의 인가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
초음파 자극은 본 발명의 신경 가소성 조절 장치를 통해 생성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 기존의 경두개 초음파 발생 장치를 통해서도 생성될 수 있다.
비제한적인 예를 들어, 뇌의 일부 영역에 자극을 가하기 위하여 집속 초음파(focused ultrasound) 장치가 사용될 수 있다. 집속 초음파 장치는 자극을 가하려는 일부 영역에 초음파가 집속되도록 한다. 본 발명에서, 집속 초음파 장치는 수술 대용으로 사용되는 HIFU (highintensity focused ultrasound)에 비하여 상대적으로 낮은 에너지를 전달한다. 집속 초음파 장치의 예들이 미국 공개번호 제2016-0242648호(발명의 명칭: SYSTEMS AND METHODS FOR NON-INVASIVE BRAIN STIMULATION WITH ULTRASOUND), 미국공개번호 제2015-0148710호(발명의 명칭: Ultrasound Modulation of the Brain for Treatment of Stroke, Brain Injury, and Other Neurological Disorders), 미국등록번호 제8617073호(발명의 명칭: Focusing ultrasound into the brain through the skull by utilizing both longitudinal and shear waves) 및 미국공개번호 제2011-0112394호(발명의 명칭: NEUROMODULATION OF DEEP-BRAIN TARGETS USING FOCUSED ULTRASOUND) 등에 개시되어 있다.
본 발명의 용어 자극의 "인가"는 원하는 자극부위(집속점)에 자극을 가하는 것을 의미한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세타-버스트 초음파 자극(TBUS)의 프로토콜 및 운동 유발 전위(MEPs)에 미치는 영향확인
도 1a에 도시된 것과 같이, 대측 삼두근에서, 실질적인 운동 유발 전위(MEP)를 유도하기 위해(Neuron 66, 681-694 (2010), 세타-버스트 초음파 자극(TBUS) 전후에 운동 유발 전위 유도를 위한 초음파 자극(500kHz 중심주파수, 8500 사이클, 2.79W/cm2)을 좌측 운동 피질에 전달하였다. MEP의 진폭은 피질 운동 뉴런의 상태 변화 수준을 정량화 한 것이다(Curr Opin Neurol 6, 715-723 (1993); Exp Brain Res 233, 679-689 (2015)). TBUS는 MEP를 위한 단일 초음파 자극(역치 자극) 강도의 80%의 강도로 제공되었다. TBUS의 구성은 33.33 ms의 초음파 자극 발생 간격을 갖는 4회의 자극이 200ms마다 반복되는 “세타-버스트” 패턴을 갖는 것으로, 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)은 2초의 자극 전달 및 8초의 인터미턴스를 갖는 10초의 자극 전달 사이클로 인가되며, 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)는 인터미턴스 없이 지속적인 세타-버스트 초음파 자극으로 인가된다(도 1b). 도 1c는 운동 유발 전위의 유도를 위한 단일 초음파 자극인가후, MEP의 발생을 확인한 것이다.
도 1d에 도시된 바와 같이, 위약 (placebo) 자극을 인가한 그룹에 비해, iTBUS를 인가한 경우에는 최소 15분 동안 약 25% 내지 100% 향상된 높은 MEP 진폭이 유지되며, cTBUS를 인가한 경우 인가하기 전보다 약 10% 내지 30% 더 낮은 MEP 진폭을 나타냈다. 각 그룹간의 효과 차이는 유의한 값을 나타냈다(F2,15=16.84, p<0.001). 그러나, 인가한 자극 패턴에 따라 진폭의 후속효과는 관찰된 것에 반하여, MEP 시작 지연(onset latency)에 대한 유의한 차이는 발견되지 않았다(아래). 평균 MEP 성공률(스코어링된 MEP의 수/주어진 초음파 자극 수)은 iTBUS 그룹에서, 0.84(SD=6.61), cTBUS 그룹에서 0.63(SD=0.21), 위약 자극 그룹에서 0.57(SD=0.19)이다.
도 1e에 도시된 것과 같이, 기존의 경두개 초음파 자극 주파수인 10Hz 단일 초음파(Curr Biol 26, 1513-1521 (2016))와의 효과를 비교하였다. 총 펄스 수를 동일하게 설정한 10Hz 단일 초음파 자극은 유의미한 효과를 나타내지 못한 반면, iTBUS는 자극인가 전 기준선과 비교하여 약 2배의 MEP 향상 효과가 약 15분까지 지속되었다.
다음으로, 본 발명의 iTBUS에서, 4개의 단일 펄스 사이의 간격을 제거한 초음파 자극을 사용하여(i-Theta 자극), 30Hz 버스트가 MEP에 미치는 효과를 확인하였다. 도 1f에 도시된 것과 같이, 기준선과 비교하여, i-Theta 이후 첫 5분간 MEP는 유의하게 상향되는 경향만을 나타내고 다시 복구되었으나, iTBUS를 인가한 경우에는 최대 15분간 기준선 대비 MEP 향상 효과가 지속되었다. 이는 “30Hz 버스트”의 효과가 동일한 수의 단일 스파이크보다 더욱 강력한 효과를 가져오는 것을 의미하며, 후속 입력에 대한 준비성이 증가되었기 때문으로 판단된다(Trends Neurosci 24, 122-126 (2001)).
실시예 2: TBUS에 포함된 총 펄스 수(인가 시간)에 따른 TBUS 효과의 지속성 확인
TBUS에 포함된 총 펄스 수는 지속력과 비례관계에 있지 않다. 세타-버스트 자극에 대한 총 펄스 수에 따른 MEP 효과에 대한 기존의 보고는 TMS 기반의 세타 버스트 자극에서 총600펄스(버스트 당 3개의 단일 펄스로 구성)에서 총 펄스 수를 2배로 늘리는 경우(1200 펄스) 신경 가소성의 향상 효과가 발생하지 않으며, 오히려 억제되는 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다. (Exp Brain Res, 2010 Jul;204(2):181-7.　doi: 10.1007/s00221-010-2293-4.　Epub 2010 Jun 22.)
그럼에도 불구하고, 본 발명의 초음파 기반의 세타-버스트 주파수 자극 시스템에서, 총 펄스 수의 최적화를 위해, TBUS에 포함된 총 펄스 수에 따른 TBUS 효과 지속력을 확인하였다. 도 1g에 도시된 것과 같이, 총 800 펄스의 iTBUS를 인가한 경우, MEP 향상이 최대 50분까지 지속되었으며, cTBUS의 경우에도 최대 40분까지 MEP의 감소효과가 지속되며, 50분까지 감소 경향 수준에서 지속되는 것을 확인하였다. 따라서, 약 400개 내지 1600개의 총 펄스 수를 인가하는 경우에, 효과적인 MEP 향상 효과를 예상할 수 있으며, 800개의 총 펄스 수를 인가하는 것이 세타-버스트 초음파 자극에 가장 최적화된 것임을 알 수 있다.
실시예 3: iTBUS를 인가하는 경우, 펄스 버스트에 포함된 단일 펄스의 개수에 따른 MEP 유도 효과 확인
다음으로, 초음파 기반의 세타-버스트 주파수 자극에 있어서, 4 펄스 버스트와 3 펄스 버스트의 효과 차이를 확인하였다. 3 펄스 버스트는 경두개 자기 자극(TMS) 기반의 최적화된 세타-버스트 자극이다.
도 2에 도시된 것과 같이, 동일한 시간(92 초) 동안 30Hz의 3펄스 버스트 및 4펄스 버스트가 5Hz로 전달된 iTBUS(2초 자극, 8초 휴식)에서 MEP 향상 효과를 확인하였다. 4펄스의 버스트를 갖는 iTBUS400의 경우, 3펄스의 버스트를 갖는 iTBUS300보다 현저히 높은 MEP 향상을 나타냈으며, 이는, 4 펄스 버스트가 초음파 기반의 세타-버스트 주파수 자극에 더욱 최적화된 패턴임을 의미한다.
실시예 4: 새로운 운동 기술 학습에 대한 TBUS의 효과 확인
LTP(Long-Term Potentiation)는 새로운 운동 기술을 학습할 때, M1에서 발생한다(Science 290, 533-536 (2000)). TBUS가 학습 유도된 LTP를 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 마우스는 반복적인 경험에 의한 운동 기술의 학습을 기반으로 하는 실험인 단일 펠렛 도달 시험(SPRT)방법을 사용했다(J Vis Exp, (2014), 도 3a).
10일간 매일 훈련 직전에 각 그룹(2*2 요인 설계된 4개 그룹)의 마우스에게 iTBUS 또는 cTBUS를 대측 또는 동측 M1에 인가하였다. 동측 M1에 대한 iTBUS 또는 cTBUS의 인가는 흥분 및/또는 청각에 의한 스타틀 반응(arousal and/or auditory startle response)과 같은 비특이적 효과에 대한 활성 대조군으로 사용되었다(Neuron 98, 1031-1041 e1035 (2018); Neuron 99, 866 (2018)).
도 3b 및 3c는 10일간의 훈련에 따른 성공률(정확한 도달)을 도시한 것이다. 대측에 대한 iTBUS의 인가는 다른 실험군 또는 대조군에 대한 것보다 현저히 높은 성공률을 나타냈으며, 대측 M1에 대한 cTBUS의 인가는 비교적 낮은 성공률을 나타내었다. 동측 M1에 대한 TBUS의 인가는 iTBUS 및 cTBUS가 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 대측 M1에 인가된 iTBUS는 동측(ipsilateral) M1에 인가된 iTBUS보다도 더 높은 성공률을 나타냈다. 따라서, 앞다리 운동 능력 학습 에 대해, 대측에 대한 iTBUS 또는 cTBUS의 인가는 학습 능력 향상에 현저한 영향을 미친다는 것을 검증하였다.
1분당 도달 시도 횟수를 확인한 결과, 대측 M1에 cTBUS를 인가한 경우에 더 많은 시도를 수행한 것을 확인할 수 있으며, 이는 대측 cTBUS를 인가한 경우는 대측 iTBUS를 인가한 경우보다 학습향상은 떨어지지만 이러한 결과는 cTBUS에 의해 실험동물에서는 먹이를 먹고자 하는 의욕 감소가 생긴 것 이 아닌 학습능력의 감소에 의한 행동양상임을 나타낸다(도 3d).
실시예 5: 다른 파라미터를 갖는 세타-버스트 초음파 자극을 통한 MEP 향상 또는 억제 효과확인
직경 14mm 및, 530kHz, -6dB에서 480~650kHz 대역폭을 갖는 530kHZ 트랜스듀서(http://ultrasonics.co.kr)를 사용하였다. 콘 모양의 초음파 젤로 채워진 음향 콜리메이터(d=2.0mm)이 트랜스듀서에 장착되었다. 4ms 길이의 단일펄스를 PRF 1kHz 각 PRF 당 264 사이클의 정현파, 50% 충격 계수를 갖는 초음파로 변환하여 사용하였으며, 상기 4ms 길이의 단일 펄스 4개가 50Hz로 버스트된 펄스 버스트가 5Hz로 반복되는 세타-버스트 초음파 자극을 생성하였다(도 4a).
공간 피크-펄스 평균강도 (Isppa)는 402mW/cm2 이다(피크 레어펙션 압력: 0.112 MPa, 매질 밀도: 1028 kg/m3, 매질에서의 음속: 1515 m/sec). 공간 피크-시간 평균강도 (I-spta)는 1ms의 초음파에서 50% 충격 계수를 갖기 때문에, 201mW/cm2이며, iTBUS의 경우 Ispta는 0.25mW/cm2, cTBUS의 경우 Ispta는 16mW/cm2이다. MI는 0.154이다.
상기 세타-버스트 초음파 자극을 2초의 자극(40 펄스) 및 8초의 인터미턴스를 갖는 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)으로 10회 인가되었다(총 400 펄스). 또한, 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)으로 총 400 펄스 인가하여 MEP에 대한 효과를 확인하였다. MEP 측정은 동일한 초음파 변수(중심 주파수 430kHz, PRF=1kHz, 50% 충격 계수)로 50ms의 초음파 시간으로 좌측 운동피질을 자극하여 MEP를 발생시켰다.
도 4b에 도시된 바와 같이, iTBUS의 인가는 가짜 자극에 비해 5분 에서 25분까지 MEP를 다소 유의한 수준에서 향상시킴을 나타내며, cTBUS의 효과는 가짜 효과에 비해 다소 감소되었으나, 통계적으로 유의한 변화는 아니었다. 평균 MEP 성공률(스코어링된 운동 반응 수/ 인가된 초음파 자극수)는 iTBUS에서 0.66 (SD = 0.20), cTBUS에서 0.69 (SD = 0.20), 가짜 자극에서 0.63 (SD = 0.14)이다. 그룹간의 성공률차이는 유의한 수준에 미치지 못했다. MEP 시작 지연에는 iTBUS, cTBUS 및 가짜 자극이 유의한 영향을 나타내지 못했다(도 4c).
실시예 6: 세타-버스트 초음파 자극에 따른 뇌 가소성 조절효과의 약리학적 분자적 메커니즘
TBUS 유도된 가소성 조절의 기초가 되는 분자 및 세포 단위의 메커니즘을 탐구하기 위해, TBUS 유도 가소성 효과가 많은 형태의 신경 가소성 조절 메커니즘(Nat Rev Neurosci 8, 413-426 (2007))과 마찬가지로 NMDAR(N-methyl-d-aspartate receptor)에 의존하는지 여부를 테스트했다.
도 5a는 D-cycloserine (DCS, a 부분적 NMDAR 작용제), memantine (a 부분적 NMDAR 길항제), 및 식염수 비히클 대조군 그룹에 대한 iTBUS를 확인 한 결과이다. 식염수를 처리한 대조군은 iTBUS 처리후 35분까지 촉진효과를 나타냈으나, 메만틴 처리군은 유의한 효과를 나타내지 않았다. 저용량 DCS 처리 그룹은 초기(5분)에 유의한 수준의 향상 이후, iTBUS후 40분 이후부터 지연된 촉진을 보였는데, 이는 TMS기반의 세타-버스트 자극으로 인한 데이터와 유사하다(Brain Stimul 12, 1063-1065 (2019)). DCS처리 그룹은 메만틴 처리그룹에 비해 실험 종료시까지 더 높은 MEP 향상 효과를 나타내었다. 본 결과는 TBUS 가소성 조절 효과가 글로탐산 수용체인 NMDA 수용체를 매개로 나타난다는 것을 의미한다.
도 5b에 도시된 바와 같이, iTBUS에서의 결과와 마찬가지로, cTBUS를 처리한 경우에, 식염수 처리그룹은 MEP의 억제를 나타냈으나, 메만틴을 처리한 그룹은 MEP의 억제가 나타지 않았으며, DCS그룹은 초기 MEP의 약간의 향상 후, 35분부터 지연된 억제효과를 나타냈는데, 이는 DCS 매개된 NMDAR 신호전달 증가에 의한 LTP 유사과정에 의한 것으로 판단된다(Proc Natl Acad Sci U S A 112, 15331-15336 (2015)). 본 결과는 iTBUS 뿐만 아니라 cTBUS 효과도 NMDA 수용체를 매개로 나타난다고 할 수 있다.
장기 시냅스 가소성은 시냅스 강도의 변화를 촉진하기 때문에 새로운 단백질의 합성을 필요로 한다(Proc Natl Acad Sci U S A 99, 467-472 (2002)). 따라서, 단백질 합성 억제제인 CXM(cycloheximide)의 처리가 TBUS에 의한 신경 가소성 조절 효과를 차단하는지 여부를 확인했다.
iTBUS 조건에서, 식염수를 처리한 경우 약 40분까지 MEP의 향상이 지속적으로 관찰되었다. 대조적으로 CXM 처리그룹의 경우, 유의미한 MEP의 변화를 나타내지는 않았다(도 5c).
cTBUS 조건에서, 식염수 처리군은 기준선에 비해, 5에서 50분까지 MEP가 감소한 반면, CXM처리군은 유의한 변화를 나타내지 않는다. 식염수 처리군은 CXM 처리군에 비해 낮은 MEP를 나타냈다(도 5d).
상기 결과는 iTBUS와 cTBUS의 뇌 가소성 조절 효과에 있어서, 새로운 단백질의 합성을 필요로 함을 시사한다.
뇌 유래 신경영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)는 신경 가소성의 유지에 중요하며, 단백질 합성을 조절한다(Trends Neurosci 28, 464-471 (2005)). 세타-버스트 자극에 의해 생성되는 LTP에는 BDNF가 필요하다는 점은 이미 보고된 바 있다(Neuron 32, 123-140 (2001)). 따라서, TBUS를 인가한 경우에도, BDNF가 관여하는지 여부를 확인했다. BDNF 수용체 (tropomyosin receptor kinase B, TrkB) 길항제인 ANA-12 또는 대조군으로 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하고, 프로모터 IV를 통한 활성 유도 BDNF 발현이 결핍된 마우스 그룹(BDNF-IV-KO)을 사용했다(Proc Natl Acad Sci U S A 110, 15103-15108 (2013)).
iTBUS 조건에서, DMSO 그룹의 MEP는 ANA-12 처리그룹 또는 BDNF-IV-KO 그룹보다 높게 나타났으며, ANA-12 처리 그룹 및 BDNF-IV-KO 그룹 간에는 유의미한 차이가 없었다(도 5e).
cTBUS 조건에서, DMSO를 처리한 그룹의 MEP가 현저히 감소된 반면, ANA-12 처리 그룹 및 BDNF-IV-KO 그룹 간에는 유의미한 차이가 없음을 확인하였다(도 5f).
초기 유전자 c-Fos의 활성화는 장기 시냅스 가소성에 중요하기 때문에, 이것이 TBUS 유도 가소성의 조절에도 관여하는지 확인했다. iTBUS, cTBUS 또는 가짜 자극 총 800개 펄스를 좌측 M1에 인가했다. 30분 후, 마우스를 희생시키고 면역 조직 화학을 위해 그들의 뇌를 수확 하였다. c-Fos-양성 세포의 정량화 결과, 좌측 M1에서, iTBUS 유도된 c-Fos수준이 cTBUS보다 현저히 높게 나타났으나, 우측 M1에서는 그룹간의 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. iTBUS를 인가한 그룹에서만, 자극 위치에 따른 c-Fos 발현 수준의 증가 차이를 나타낸다(도 5g 및 도 5h).
실시예 6: TBUS의 안전성 검사
마지막으로, TBUS의 안전성을 검사하기 위해, H&E 염색(hematoxylin and eosin staining)을 사용하여, 출혈(hemorrhaging) 또는 조직 손상 가능성을 확인하였다. 10일간 매일 총 800개 단일 펄스의 iTBUS, cTBUS 및 위약 자극(sham)을 인가하고, H&E 염색을 이용하여 출혈 또는 조직 손상을 확인하였다(그룹당 N=2).
그 결과 도 6에 도시된 바와 같이, 어떠한 동물에서도 조직 손상이 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 본 발명의 실시 예에서 사용된 초음파 강도(MEP 역치 자극의 80~90%, 0.29MPa) 수준이 생체에 무해함을 의미한다.
또한, 약물을 전달하는 경우를 제외하면, 혈관뇌 장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)의 의도치 않은 개방은 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 따라서, 에반스 블루를 꼬리 정맥에 주사하여 뇌에서 염료의 분포를 통해 BBB 파괴 여부를 확인했으나, 유의미한 변화를 확인하지 못했으며, 이는 에반스 블루 염료가 BBB를 통과하지 못하였으며(도 6), EK라서, BBB가 파괴되지 않았음을 의미한다.
실시예에서 사용된 재료 및 방법
동물(마우스)
생후 8-14 주령의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 모든 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜로 IBS에서 수행되었다.
세타-버스트 초음파의 생성 및 자극
본 발명에서, 다양한 특성(주파수, PRF, 버스트에 포함된 단일 펄스의 수, 총 자극 펄스의 수)을 갖는 세타-버스트를 테스트하여, 초음파 자극에 최적화된 특성을 갖는 세타-버스트 초음파 자극을 확인하였다.
30Hz의 느린 감마 주파수를 5Hz의 세타 주파수와 크로스 커플링 하여, 세타-버스트 초음파 자극(Theta burst ultrasound stimulation, TBUS)을 생성하였다. 구체적으로, 세타-버스트 초음파의 파형은 펄스 발생기(Pulse generator) (Master 9, AMPI, Jerusalem, Israel)와 2개의 함수 발생기(function generator) (https://www.keysight.com/, 33600A)를 사용하여 전기적 신호로 생성하였다. 사용된 펄스 발생기는 감마 중첩 세타 TTL (Transistor-Transistor Logic) 펄스를 생성하여, 제1 함수 발생기로 전달하였다. 상기 감마 중첩 세타 TTL (Transistor-Transistor Logic) 펄스는 4개의 TTL 펄스가 30Hz(33.33ms inter-stimulus onset interval)로 전달되었으며, 이러한 4개 TTL 펄스(펄스 버스트)의 전달은 5Hz(200ms)의 주파수로 반복되었다.
도 7에서 확인한 바와 같이, 2초의 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)을 인가하는 경우에, 개체에 따라, 약 3 내지 14초의 후속효과 지속시간을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 간헐적 세타-버스트 초음파 자극(intermittent TBUS, iTBUS)의 경우, 상기 감마 중첩 세타 TTL 펄스는 8초 간격으로, 2초 동안 전달되었으며, 연속적 세타-버스트 초음파 자극(continuous TBUS)의 경우, 8초의 간격 없이 지속적으로 감마 중첩 세타 TTL 펄스를 전달하였다.
제1 함수 발생기는 전달된 각 TTL 펄스마다 1kHz의 펄스 반복 주파수(Pulse Repetition Frequency, PRF)에서 17개의 펄스를 출력으로 생성하였다(17ms 길이의 펄스). 제1 함수 발생기의 출력은 제2 함수 발생기의 외부 트리거로 제공되어, 500kHz의 음향 주파수(중심 주파수)에서 각각의 상기 펄스 반복 주파수 당 500 사이클의 사인파가 반복되는 100%의 충격 계수(duty cycle)를 갖는 정현파로 변환되었으며, 따라서, 최종적으로 각각의 TTL 펄스는 8500개의 사이클을 갖는 사인파로 변환 되었다(도 1B).
생성된 정현파는 75W 무선 주파수 전력 증폭기(A075, E&I, Rochester, NY, USA)를 사용하여 증폭되었으며, 트랜스듀서(Olympus Panametrics V301)에 공급되어, 초음파로 변환되었다. 상기 트랜스 듀서의 직경은 2.54mm이며, 중심주파수는 500kHz이다. 원뿔 모양의 초음파 젤 (http://www.da-yo.com/, Progel-II)로 채워진 음향 콜리메이터(acoustic collimator, 64ms 길이, d = 2.5 mm의 출력 구경)가 변환기에 장착되었다.
운동 유발 전위의 유도
운동 유발 전위(MEP) 측정의 경우, 실제 사지의 움직임을 생성하기 위해, 동일한 초음파 파라미터 (중심주파수= 500kHz, PRF= 1kHz (17 사이클), 및 100% 충격 계수(duty cycle))를 갖는 초음파로 좌측 운동 피질(left motor cortex)을 자극하였다. 세타-버스트 초음파 자극 전 10분 및 자극 후 30 내지 50분 간 5분의 블록마다, 10 - 15초 간격(지터 간격)으로 25회의 초음파 자극을 인가하였다.
초음파 강도 측정
음향 콜리메이터 끝의 초음파 강도는 바늘 하이드로폰 시스템(needle hydrophone system (Precision Acoustics, UK))을 사용하여 측정했다. MEP를 유도하기 위한 17ms 초음파 자극의 경우, 공간 피크-펄스 평균 강도(spatial peak-pulse average intensity, Isppa는 다음의 식(Nat Protoc 6, 1453-1470 (2011))을 사용하여 계산되었으며, 2.787W/cm2이었다.
Isppa= A2/2ρc
A: 피크 레어펙션 압력(the peak rarefactional pressure (0.299 MPa)),
ρ: 매질(medium) 밀도 (1028 kg/m3),
c: 매질에서의 음속(1515 m/sec).
초음파 빔의 생체 효과를 나타내는 MI(mechanical index,) 값은 다음의 식으로 계산되었으며, 0.422였다.
MI = A/√f
세타-버스트 초음파 자극에서도 동일한 자극을 사용했으나, 강도를 80%로 감소시켜 사용하였다. iTBUS의 공간-피크 시간-평균 강도(spatial-peak temporal-average intensity, ISPTA)는 54.4mW/cm2 였으며, cTBUS의 ISPTA는 272mW/cm2 였다. 상기 값들은 FDA 임상 초음파 이미징의 임계값 (MI = 1.9 및 Ispta = 720 mW/cm2) 보다 매우 낮다. 위의 모든 계산에는 압력의 실효값(root mean square)이 사용되었다.
운동 유발 전위(Motor-evoked potential (MEP))실험 및 데이터 분석
동물은 이소플루레인 마취 시스템 (Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA)을 사용하여, 산소와 함께 분당 1.5L속도로 2% 이소플루레인을 전달하여 인덕션 챔버에서 마취되었다. 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 안연고로 덮었다. 트랜스듀서가 배치될 머리의 배측면(dorsal surface)의 털을 클리퍼를 사용하여 다듬은 뒤, 제모 크림 (Nair, Church & Dwight, Frenchs Forest, Australia)을 도포하였다. 제모 후, 동물을 정위 고정기로 고정시키고, 앞다리를 매달았다. 실험 시작 시, 개별 맞춤형 가벼운 마취 상태로 만들기 위한 앵커포인트로서, 노즈콘을 통해 유입되는 이소플루레인 레벨을 0.25%로 조정하였다. 깊은 마취 상태에서는 운동 반응을 인위적으로 생성하는 것이 어렵기 때문에, 가벼운 마취 상태로 만드는 것은 중요하다. 운동 유발 전위는 핀치 반응(Pinch response)를 관찰하여 확인하였다.
유도된 다리의 움직임은 가는 와이어 전극(A.M. Systems, Cat: 790900, Sequim, WA) 및 PowerLab 26T (AD Instruments)을 사용하여 기록하였다. 구체적으로 근육 조직의 생체 전위차를 기록하기 위해, 두 쌍의 가는 와이어 전극을 오른쪽 앞다리의 상완 삼두근(right triceps brachii)을 따라 약 3~5mm 간격으로 삽입했다(Nat Protoc 6, 1453-1470 (2011)). 공통 접지 전극(Grass Technologies, F-E2)은 등쪽에 피하로 삽입하였다.
EMG 신호는 2kHZ로 샘플링 되었다. Raw EMG 신호는 대역 통과 필터링 되었으며(10-500Hz), 차단 주파수가 20Hz인 제로 위상 지연 2차 버터워스 필터(zero-phase lag 2nd-order Butterworth filter)를 사용하여 정류(rectified) 및 평활화(smoothed)하였다. 결과 선형 포락선(linear envelope)의 피크 진폭은 운동 피질의 흥분 정도를 나타낸다. 초음파 자극이 시작되기 직전에, 50 msec window(100개의 샘플)이 기준선으로 사용되었다(Ultrasound Med Biol 39, 312-331 (2013)). MEP 시작 시간의 경우, 널리 사용되는 3σ 임계값 접근 방식(3σ threshold approach)이 신호 대 잡음 비율이 낮을 때 MEP 시작 시간을 정확하게 포착할 수 없기 때문에, 통합 프로파일을 사용하였다(Biomed Signal Proces 24, 19-24 (2016)). 개념적으로 통합 프로파일을 사용한 방법은 시간이 지남에 따라, 정류된 신호의 누적 영역을 사용하여, 불균형적인 기울기 증가의 시작점을 감지한다.
MEP 시작 검출방법 성능 평가
도 8은 4가지 MEP 시작 검출 방법에 따라 측정된 운동 유발 전위의 시작 지연(MEP onset latency)을 나타낸 것이다.
4가지 MEP 시작 검출 방법의 성능 평가를 위해, 6마리의 동물에서 각 200개씩 다양한 수준의 노이즈를 가진 1200개의 MEP 신호를 대상으로 시각적으로 확인하여 정확한 시작 시간을 직접 표시하였다(visual detection, 검은색 점). 통합 프로파일 방법(IP, 빨간색 점)은 다음 3개의 식을 사용하여 계산하였다(Biomed Signal Proces 24, 19-24 (2016)).
IP(t)는 모든 정류된 원시 샘플(rectified raw samples) X(i)의 연속적으로 합한 것이다.
L(t)는 신호 전체 길이(M)에 걸쳐 균등하게 분포된 신호의 적분 값이다.
MEP 시작 지연은 D(t)가 최대 값에 도달한 지점으로 정의하였다.
따라서, 상기 통합 프로파일은 IP(t)에 대한 불균형한 기울기 증가의 시작점을 감지하는 방법이다 (도 1C) 참조).
Teager-Kaiser Energy Operator (TKEO, 파란색 점) 방법(Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc 2005, 7549-7552 (2005))은 MEP 시작 지연을 결정할 때, MEP 신호의 진폭 및 주파수 정보를 모두 고려하는 방법이다.
TKEO는 아래의 식을 통해 계산하였다.
Figure 112020099321460-pat00001
상기 x는 MEP 신호를 의미하며, n은 10-500Hz 대역 통과 필터링 및 정류된 MEP 신호에 사용된 샘플의 수를 의미한다.
따라서, TKEO 출력은 진폭과 주파수의 곱에 비례한다. 3SD의 전통적인 임계값 방법을 사용하여, 시작 지연을 결정하였다.
샘플 엔트로피(SamEn, 녹색 점)(J Electromyogr Kinesiol 22, 901-907 (2012))는 16ms 마다 이동하는 32ms의 시간 창(time window)을 사용하여 계산되었다. 각각의 시간 창에서, 샘플 엔트로피를 계산하였다. 0.5의 임계값을 사용하여 시작 지연을 결정했다.
마지막으로 선형 포락선 방법(Linear envelope, 보라색 점)은 차단 주파수가 20Hz인 0 위상 지연 2차 버터워스 필터를 사용하여, 10-500Hz 대역 통과 필터링, 정류 및 평활화에 이어 3SD의 임계값을 사용했다.
시작 지연에서, SamEn 데이터는 시각적 관측 데이터에 비해 훨씬 빠른 시작 지연을 나타냈으며, TKEO 및 선형 포락선 데이터는 시각적 관측 데이터에 비해 더 높은 변동성을 나타냈다. 따라서, IP 방법은 본 발명의 전문 매뉴얼 스코어링을 가장 근접하게 나타낸다.
단일 팰릿 도달 실험
세타-버스트 초음파 자극(TBUS) 효과의 해석을 위해, TBUS가 새로운 운동 기술의 후속적인 습득에 영향을 미치는지 조사하였다. iTBUS 및 cTBUS의 운동 기술 학습능력에 대한 효과는 종래 공지된 것과 동일한 방법으로(J Vis Exp, (2014)) 수행된 단일 팰릿 도달 실험(single pellet reaching task (SPRT))을 통해 확인하였다. 전면에 0.5cm의 폭을 갖는 세개의 수직 슬릿(상부에 이중 슬릿 (2.5cm 간격) 및 하부에 단일 슬릿)을 갖는 높이 20cm, 깊이 15cm, 및 폭 8.5cm 의 아크릴 챔버를 사용하였다.
행동조성(shaping) 시작 이틀 전부터 실험이 끝날 때까지 음식은 하루에 체중의 10%로 제한되었다. 행동조성 과정에서, 동물을 챔버에 적응 시켰다. 펠릿(29mg 곡물 펠릿, Product# F0163, Bio-Serv, New Jersey)을 중앙 슬릿 앞의 트레이에 놓고 동물이 두 앞다리로 펠릿을 회수할 수 있도록 하였다. 동물이 20분 내에 20번의 도달시도를 할 때까지 행동조성이 완료되었으며, 주사용 앞다리를 결정하기 위해 총 시도의 70% 이상 사용된 앞다리 하나를 사용하는 것으로 결정하였다. 행동조성 시작 후 4일 이내 기준에 도달하지 못한 동물은 제외되었다.
행동조성 후, 10일간의 연속적인 단일 펠릿 도달 훈련 과정을 수행하였다. 훈련 과정은 30번의 도달 또는 20분간의 훈련 중 먼저 달성된 때에 완료되었다. 매일 계속되는 훈련 직전에 주사용 앞다리의 대측 또는 동측 운동 피질에 iTBUS 또는 cTBUS를 총 800 펄스를 인가하였다. 개체간의 2*2 요인 설계(TBUS 종류(iTBUS, cTBUS)*자극 운동피질(대측, 동측))의 각 그룹에 9마리의 동물이 포함되었다. 동물은 쉐이핑에 소요된 일수 및 주사용 앞다리에 따라 계층화 한 후(빠른 학습자 1일, 중급 학습자 2~3일, 느린 학습자 4일 표 1), 4개의 실험 그룹 중 하나에 할당되었다.
표 1
주사용 앞다리 및 쉐이핑 소요 일 수 에 따른 그룹 할당
Figure 112020099321460-pat00002
각 세션의 동물은 온라인 스코어링을 참조하기 위해 비디오로 녹화되었다. 도달 행동은 성공(주사용 앞다리가 펠릿을 잡고 회수하여 입에 넣음), 실패(주사용 앞다리가 펠릿에 닿지만 잡지 않거나 떨어뜨림), 미스(주사용 앞다리를 사용하여 시도했지만 펠릿에 도달하지 못함)로 분류되었으며, 미스는 실패로 분류하였다.
약리학 실험
TBUS에 의한 가소성 효과가 NMDAR에 의존하는지 여부를 확인하기 위해, 동물을 iTBUS 에 대해 3개의 실험 그룹(각 그룹에서 6마리) 및 cTBUS에 대해 다른 3개의 그룹에 무작위로 할당하여, 메만틴(memantine (Tocris, Bristol, UK) 5mg/kg (6.25 ml/kg, i.p.), D-cycloserine (Sigma-Aldrich, St. Louis) 3mg/kg (10ml/kg, i.p.) 또는 식염수(0.9% NaCl, i.p.)를 급속 주사 하였다(Eur J Pharmacol 257, 7-12 (1994)).
TBUS가 새로운 단백질 합성을 유도하는지 여부를 테스트하기 위해, 사이클로헥시미드(cycloheximide, CXM, Sigma-Aldrich, St. Louis) 30 mg/kg (10ml/kg, i.p.) 또는 식염수를 주사하였다 (Behav Brain Res 233, 293-297 (2012)).
BDNF가 TBUS로 인한 후속효과 발생에 관여하는지 확인하기 위해, ANA-12 0.5mg/kg (dissolved in 1% DMSO in saline, 10ml/kg, i.p.) 또는 1% DMSO 식염수를 투여하였다.
면역조직화학법
iTUBS, cTUBS 또는 위약(sham) 자극(각, 총 800 펄스)을 왼쪽 M1에 인가하였다. 자극 30분 후, 케타민 및 자일라진 주사(ketamine 및 xylazine, 0.13 g/kg i.p.)를 사용하여 깊이 마취하였다. 이어서 마우스를 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 이은 PBS 중 4% 파라포름알데히드(PFA in PBS)로 경심관류(transcardially perfused)를 통해 관류시켰다. 그 후, 뇌를 추출하고 밤새 4℃에서 4% PFA에 후고정(postfix)시켰다. 이를 가라 앉을 때까지, 4℃의 PBS 중 30% 수크로오스 용액에 담가두었다. 뇌는 운동 피질 주변 20μm에서 관상평면(coronal plane)에서 절편화되었다. 절편은 c-fos 항체(1:3000, sysy 226 003, Synaptic Systems, Goettingen, Germany) 및 NeuN 항체(1:500, Millipore, Cat. #MAB377)를 사용하여 밤새 4℃에서 면역 표지되었다.
그 후, 슬라이스를 1X PBST(1X PBS 중 0.3% Triton X-100)로 세척하고, 2차 항체(1:800, Goat Anti-Rabbit IgG (H&L), Alexa Fluor 568, Abcam, ab175471 and 1:800, CyTM5-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch, 115-175-146)와 상온에서 2시간동안 배양하였다. 그 후, 절편을 1X PBST로 세척하고 슬라이드 글라스에 올려두어, 공초점 현미경 (an inverted research microscope Nikon Eclipse Ti-E with the perfect focus system, Nikon Instrument Inc., Tokyo, Japan)을 사용하여 2채널 공초점 이미지를 얻었다. 결과 이미지는 ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 처리 및 분석되었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 신경 가소성 향상 모드 또는 신경 가소성 억제 모드의 변환이 가능한, 제어부 및 적어도 하나의 세타-버스트 초음파 자극 생성부를 포함하는 신경 가소성 조절 장치에 있어서,
    상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는
    세타-버스트 펄스를 생성하는 펄스 발생기(Pulse generator);
    상기 세타-버스트 펄스를 정현파 형태로 변환하는 함수 발생기; 및
    상기 정현파 형태로 변환된 세타-버스트 펄스를 초음파로 변환하는 트랜스듀서(Transducer)를 포함하며,
    상기 제어부는 상기 신경 가소성 향상 모드 또는 상기 신경 가소성 억제 모드에 따라 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 제어 신호를 송신하고,
    상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부는 신경 가소성 향상 모드의 제어 신호가 수신될 때 세타-버스트 초음파 자극(iTBUS)를 생성하고, 신경 가소성 억제 모드의 제어 신호가 수신될 때 연속적 세타-버스트 초음파 자극(cTBUS)를 생성하는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세타-버스트 펄스는 30 내지 200Hz의 주파수를 갖는 3 내지 5개의 단일 펄스로 구성된 펄스 버스트가 4 내지 8 HZ의 주파수로 반복되는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펄스 버스트는 4개의 단일 펄스로 구성된 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치
  4. 제2항에 있어서, 상기 펄스 버스트는 25% 내지 75%의 충격 계수(duty cycle)를 갖는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 정현파는 200 내지 600 KHz의 중심 주파수 및 100%의 충격 계수를 갖는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세타-버스트 초음파 자극의 강도는 역치 (threshold) 강도의 70% 내지 100%인 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 신경 가소성 조절 장치가 신경 가소성 향상 모드인 경우,
    상기 제어부는 간헐적 세타-버스트 초음파 자극을 생성하도록 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 제어 신호를 송신하는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  8. 제7항에 있어서, 상기 간헐적 세타-버스트 초음파 자극은 2초의 초음파 자극 시간 및 3 내지 14초의 자극 간격을 갖는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 신경 가소성 조절 장치가 신경 가소성 억제 모드인 경우,
    상기 제어부는 연속적 세타-버스트 초음파 자극을 생성하도록 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부에 제어 신호를 송신하는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제어부는 총 400 내지 800개의 단일 펄스를 포함하는 세타 버스트 초음파 자극을 생성하도록 상기 세타-버스트 초음파 자극 생성부를 제어하는 것을 특징으로 하는 신경 가소성 조절 장치.
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