KR102520382B1 - 노화 세포에 의해 유발되거나 매개되는 병태의 임상 관리에서의 사용 및 암 치료를 위한 bcl 패밀리 길항제인 아실 설폰아마이드 - Google Patents

노화 세포에 의해 유발되거나 매개되는 병태의 임상 관리에서의 사용 및 암 치료를 위한 bcl 패밀리 길항제인 아실 설폰아마이드 Download PDF

Info

Publication number
KR102520382B1
KR102520382B1 KR1020207036888A KR20207036888A KR102520382B1 KR 102520382 B1 KR102520382 B1 KR 102520382B1 KR 1020207036888 A KR1020207036888 A KR 1020207036888A KR 20207036888 A KR20207036888 A KR 20207036888A KR 102520382 B1 KR102520382 B1 KR 102520382B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
bcl
treatment
mice
senescent cells
Prior art date
Application number
KR1020207036888A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210020930A (ko
Inventor
앤-마리 보솔레이
라이언 허드슨
Original Assignee
유니티 바이오테크놀로지, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니티 바이오테크놀로지, 인크. filed Critical 유니티 바이오테크놀로지, 인크.
Publication of KR20210020930A publication Critical patent/KR20210020930A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102520382B1 publication Critical patent/KR102520382B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/661—Phosphorus acids or esters thereof not having P—C bonds, e.g. fosfosal, dichlorvos, malathion or mevinphos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/32—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/33—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/337—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/650952—Six-membered rings having the nitrogen atoms in the positions 1 and 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Abstract

본 발명의 아릴 설폰아마이드 화합물은 강력하고 세포-유형 특이적인 Bcl 저해 활성을 가진다. 이러한 부류의 선택된 화합물은 노화 세포의 아포토시스를 촉진시키고, 노화-관련 병태를 치료하기 위해 개발되고 있다. 이러한 부류의 선택된 화합물은 암 세포의 아포토시스를 촉진시키고, 화학요법제로서 개발될 수 있다.

Description

노화 세포에 의해 유발되거나 매개되는 병태의 임상 관리에서의 사용 및 암 치료를 위한 BCL 패밀리 길항제인 아실 설폰아마이드
우선권 적용
본 출원은 2018년 6월 13일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/684,681호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 우선권 출원은 이로써 본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참조에 의해 원용된다.
본 발명의 분야
하기에 개시되고 청구된 기술은 대체적으로 연령-관련 병태에서 노화 세포 및 이의 역할의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 Bcl 단백질 활성을 저해하는 새로운 소분자 화합물을 제공한다.
노화 세포는 더 이상 복제 능력을 가지지 않지만, 기원 조직에 남아 노화-연관 분비형 표현형(senescence-associated secretory phenotype: SASP)을 유발하는 세포로서 특징지어진다. 많은 연령-관련 병태가 노화 세포에 의해 매개되고, 병태 또는 그 주위의 조직으로부터 세포의 선택적인 제거가 이와 같은 병태의 치료를 위해 임상적으로 사용될 수 있다는 것이 본 개시내용의 전제이다.
미국 특허 제10,130,628호(Laberge 등)는 MDM2 저해제, Bcl 저해제, 및 Akt 저해제를 사용하여 노화 세포에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 생각되는 특정 연령-관련 병태의 치료를 기재한다. US　20170266211　A1(David 등)은 연령-관련 병태의 치료를 위한 특정 Bcl 저해제의 용도를 기재한다. 미국 특허 제8,691,184호, 제9,096,625호 및 제9,403,856호(Wang 등)는 소분자 라이브러리의 Bcl 저해제를 기재한다.
인간 질환에서 노화 세포의 역할과 관련된 다른 개시내용은 출원공개 US 2017/0056421　A1(Zhou 등), WO 2016/185481(Yeda Inst.), US　2017/0216286　A1(Kirkland 등), 및 US　2017/0281649　A1(David); 및 Furhmann-Stroissnigg 등(Nat Commun. 2017 Sep 4;8(1):422), Blagosklonny(Cancer Biol Ther. 2013 Dec;14(12):1092-7), 및 Zhu 등(Aging Cell. 2015 Aug;14(4):644-58)에 의한 논문을 포함한다.
하기 개시내용은 노화 세포를 선택적으로 제거하기 위한 전력을 개괄하고, 효과적인 화합물, 약제학적 조성물, 개발 전력, 및 치료 프로토콜을 제공하며, 다수의 후속 이점을 기재한다.
Bcl 저해제의 새로운 패밀리가 개발되었다. 이 패밀리의 Bcl 저해제 중 일부는 특히 효과적인 세놀리틱 작용제(senolytic agent)이다. 시험관내 또는 생체내에서 노화 세포를 본 개시내용의 화합물 및 조성물과 접촉시키는 것은 이와 같은 세포를 선택적으로 조절하거나 제거한다. 상기 저해제는 연령-관련 병태가 있는 대상체에서 표적 조직에 투여하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 의해 상기 조직 내 또는 그 주위의 노화 세포를 선택적으로 제거하고 상기 병태의 하나 이상의 증상 또는 징후를 경감시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 패밀리로부터 선택된 화합물은 화학요법제로서 제형화되고 시판될 수 있다.
본 발명은 하기 설명, 도면, 및 첨부된 청구범위에서 제시된다.
도 1은 본 발명에 따른 예시적인 화합물을 화학적으로 합성하기 위한 일반적인 합성 도식을 도시한다.
도 2A, 도 2B 및 도 2C는 골관절염 동물 모델에서 각각 노화 세포 마커인 p16, IL-6, 및 MMP13의 발현을 도시한다. 노화 표현형은 MDM2를 저해하는 세놀리틱 작용제인 뉴트린-3A(Nutlin-3A)에 의해 개선될 수 있다. 본 발명에 따른 Bcl 저해제는 동일한 목적을 위한 세놀리틱 작용제로서 선택될 수 있다.
도 3A는 효과적인 세놀리틱 작용제가 골관절염 모델에서 처리된 마우스에게 대칭적인 체중 부하를 회복시키는 것을 도시한다. 도 3B, 도 3C 및 도 3D는 이들 마우스에서 관절의 조직병리를 나타내는 이미지. 작용제를 이용한 처리는 프로테오글리칸 층의 파괴를 방지하거나 역전시키는 데 도움이 된다.
도 4A 및 도 4B는 세놀리틱 작용제와 함께 유리체내 투여될 때 마우스 산소-유도성 망막증(OIR) 모델에서 신생혈관형성 및 맥관소멸 둘 다의 반전을 도시한다. 도 4C 및 도 4D는 당뇨망막병증에 대한 스트렙토조토신(STZ) 모델로부터 취한 것. STZ-유도성 혈관 누출은 세놀리틱 작용제의 유리체내 투여로 약화된다.
도 5는 노화 세포를 제거하는 것이 궐련(cigarette) 연기(CS) 유도성 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)에 대한 마우스 모델에서 산소 포화도(SPO2)를 회복시키는 데 도움이 됨을 도시한다.
도 6은 죽상동맥경화증에 대한 마우스 모델로부터 취한 데이터로서, 여기서 LDL 수용체가 결여된 근친교배시킨 마우스에게 고지방 식이를 공급하였다. 우측 패널은 대동맥에서 플라크에 대한 염색을 나타낸다. 중간 패널은 플라크로 덮인 대동맥의 표면적이 세놀리틱 작용제를 이용한 처리에 의해 감소되었음을 정략적으로 나타낸다.
노화 세포는 더 이상 복제 능력을 가지지 않지만, 기원 조직에 남아 노화-연관 분비형 표현형(SASP)을 유발하는 세포로서 특징지어진다. 많은 연령-관련 병태가 노화 세포에 의해 매개되고, 병태 또는 그 주위의 조직으로부터 세포의 선택적인 제거가 이와 같은 병태의 치료를 위해 임상적으로 사용될 수 있다는 것이 본 개시내용의 전제이다.
하기에 기재되고 청구된 기술은 연령-관련 병태의 치료를 위해서 표적 조직으로부터 노화 세포를 선택적으로 제거하는 데 사용될 수 있는 새로운 부류의 Bcl 저해제의 첫번째 설명을 나타낸다.
Bcl 단백질 활성의 저해
Bcl 단백질 패밀리(TC# 1.A.21)는 Bcl-2 상동성(BH) 도메인을 공유하는 진화적으로 보존된 단백질을 포함한다. Bcl 단백질은 미토콘드리아에서 프로그래밍된 세포 사멸의 한 형태인 아포토시스를 상향조절 또는 하향조절하는 능력으로 가장 유명하다. 하기 설명은 사용자가 본 개시내용의 화합물의 과학적 토대 중 일부를 이해하는 데 도움을 주기 위해 제공된다. 이러한 개념은 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않으며, 명시적으로 언급되거나 요구되는 것 이상으로 본 명세서에 기재된 화합물 및 방법의 사용을 어떠한 방식으로 제한하지 않는다.
본 개시내용의 맥락에서, 특히 관심이 있는 Bcl 단백질은 아포토시스를 하향조절하는 단백질이다. 항-아포토시스 Bcl 단백질은 BH1 및 BH2 도메인을 함유하며, 이들 중 일부는 추가적인 N-말단 BH4 도메인(Bcl-2, Bcl-x(L) 및 Bcl-w(Bcl-2L2))을 함유한다. 이들 단백질을 저해하는 것은 아포토시스에 대한 세포의 감수성 또는 속도를 증가시킨다. 따라서, 이와 같은 단백질의 저해제는 단백질이 발현되는 세포를 제거하는 것을 돕는 데 사용될 수 있다.
2000년대 중반에, Abbott Laboratories는 ABT-737(나비토클락스(Navitoclax))로 알려진 Bcl-2, Bcl-xL 및 Bcl-w의 신규 저해제를 개발하였다. 이 화합물은 이들 Bcl-2 패밀리 단백질을 표적으로 하지만 A1 또는 Mcl-1은 표적으로 하지 않는 BH3 모방 소분자 저해제(SMI)의 그룹의 일부이다. ABT-737은 Bcl-2, Bcl-xL 및 Bcl-w에 대한 더 높은 친화성을 고려해 볼 때 이전 BCL-2 저해제보다 우수하다. 시험관내 연구는 B-세포 악성종양이 있는 환자 유래의 1차 세포가 ABT-737에 대하여 민감성임을 나타내었다. 인간 환자에서, ABT-737은 일부 유형의 암 세포에 대하여 효과적이지만, 용량-제한적 혈소판감소증의 대상이 된다.
본 발명서에 기재된 화합물이 Bcl 단백질의 활성 부위에 적합하여 강력한 Bcl 저해를 제공하고/하거나 표적 세포의 아포토시스를 촉진시킨다는 것을 이제 발견하였다. 하기 섹션에서 기재되는 바와 같이, 이들 화합물은 노화 세포와 암 세포를 표적으로 하는 매우 강력하고 특이적인 약물로서 개발될 수 있다.
모델 화합물
본 발명의 다수의 화합물은 하기에 나타낸 화학식의 범주에 속하는 구조를 가진다.
Figure 112020139363786-pct00001
식 중,
X1은 할라이드, 바람직하게는 -Cl이고;
X2는 -COOH이며;
X3은 -SO2CF3; -SO2CH3; 또는 -NO2이고;
X5는 -F 또는 -H이며;
R1은 -CH(CH3)2이고;
R2는 -H 또는 -CH3, 바람직하게는 -CH3이며;
R3 및 R4는 독립적으로 -H 또는 -CH3, 바람직하게는 둘 다 -H이고;
n1은 1 내지 3, 바람직하게는 2이며;
R6은 OH,
Figure 112020139363786-pct00002
및
Figure 112020139363786-pct00003
로부터 선택되고;
여기서 R6의 하이드록실기는 선택적으로 인산화된다.
화학식에서 가능한 임의의 성분은, X3이 -SO2CF3이면 R6의 하이드록실기가 인산화되어야 한다는 조건으로 제공된다. 상기 열거한 임의의 옵션과 조합하여, X2의 -COOH기는 사용자의 선택에 따라 하이드록실기와 함께 또는 그 대신에 인산화될 수 있다.
화합물의 "인산화" 형태는, 포스페이트기가 생체 내에서 (예를 들어, 효소 분해에 의해) 제거될 수 있도록, 하나 이상의 -OH 또는 -COOH기가 -OPO3H2 또는 -CnPO3H2(여기서, n은 1 내지 4임)인 포스페이트기로 치환된 화합물이다. 비-인산화 또는 탈인산화 형태는 이러한 기를 가지지 않는다.
명시적으로 언급되거나 달리 요구되지 않는 한, 입체화학 없이 도시된 화합물은 모든 입체이성질체의 라세미 혼합물, 및 대안적으로 어느 하나의 거울상이성질체를 가지는 거울상이성질체적으로 순수한 제제를 포함한다. 그러나 화학식 I의 임의의 화합물은 전형적으로 하기 화학식 I에 도시된 입체화학을 반드시 가질 필요는 없으며:
Figure 112020139363786-pct00004
이는 또한 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure 112020139363786-pct00005
여기서, 각각의 R3은 독립적으로 H 또는 -CH3이다.
본 발명의 다수의 화합물은 하기에 나타낸 화학식 II의 범주에 속하는 구조를 가지며:
Figure 112020139363786-pct00006
이는 또한 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure 112020139363786-pct00007
여기서:
X1은 -Cl이고;
X2는 -COOH이며;
X3은 -SO2CF3; -SO2CH3; 또는 -NO2이고;
X5는 -F 또는 -H이며;
R1은 -CH(CH3)2이고;
R2는 -CH3이며;
R3 및 R4는 둘 다 -H이고;
n1은 2이며;
R6은 -OR7,
Figure 112020139363786-pct00008
또는
Figure 112020139363786-pct00009
로부터 선택되고;
R7은 -H, -P(O)(OH)2 또는 -(CnH2n)P(O)(OH)2(여기서, n은 1 내지 4 또는 1 내지 8임)이되;
단, X3이 -SO2CF3이면 R7은 -P(O)(OH)2 또는 -(CnH2n)P(O)(OH)2이다.
이는, R7이 -P(O)(ONa)2 또는 -(CnH2n)P(O)(ONa)2인 경우와 같이, 나타낸 바와 같은 R7의 산 형태, 및 이의 염 형태를 둘 다 별도로 및 함께 포함한다.
물질의 조성물로서 또는 특정 맥락에서 사용하기 위한, 본 개시내용 및/또는 각각의 구조식에 열거된 각각의 화학 종은, 미국 특허 제8,691,184호, 제9,096,625호 및 제9,403,856호(Wang 등) 중 임의의 것에 명시적이고 정확하게 묘사되거나 기재되지 않은 한, 선택적으로 사용되거나 청구될 수 있다. 본 개시내용 및/또는 각각의 구조식에 열거된 각각의 화학 종은, US　20170266211　A1(David 등)에 명시적이고 정확하게 도시되거나 기재되지 않은 한, 선택적으로 사용되거나 청구될 수 있다.
본 개시내용에 따라서 제조 및/또는 사용에 적합할 수 있는 예시적인 화합물은 표 1A에 표시되어 있다.
Figure 112020139363786-pct00010
Figure 112020139363786-pct00011
Figure 112020139363786-pct00012
Figure 112020139363786-pct00013
Figure 112020139363786-pct00014
Figure 112020139363786-pct00015
Figure 112020139363786-pct00016
Figure 112020139363786-pct00017
Figure 112020139363786-pct00018
Figure 112020139363786-pct00019
Figure 112020139363786-pct00020
Figure 112020139363786-pct00021
본 개시내용에 따라서 세놀리틱 작용제로서 또는 노화 연관 질환의 치료를 위해 테스트되고 개발될 수 있는 다른 화합물은 표 1B에 나타낸 화합물을 포함한다:
Figure 112020139363786-pct00022
세놀리틱 및 화학요법 활성에 대한 화합물의 평가
본 개시내용에 제시된 이들 및 다른 화합물은 약제의 제조 및 인간 치료법에서의 사용을 위한 활성제로서 사용하기 위한 후보 작용제임을 나타내는 방식으로 수행하는 능력에 대해 분자 수준에서 평가될 수 있다.
예를 들어, 치료법이 Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, 또는 다른 Bcl 패밀리 단백질을 거쳐 노화 세포의 아포토시스를 촉발시키는 것을 포함하는 경우, 화합물은 하나 이상의 Bcl 단백질과 이들 각각의 동족 리간드 사이의 결합을 저해하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 실시예 1은 Bcl 동형단백질에 대한 결합을 결정하기 위한 동종 분석(분리 단계를 필요로 하지 않는 분석)의 예시를 제공한다. 화합물은 표적 동형단백질과 상호작용하여 세놀리시스(senolysis)를 유발하는 능력에 대해 분자 수준에서 스크리닝될 수 있다. 실시예 2 및 3은 이러한 목적으로 설계된 분석의 예시를 제공한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 화합물은 노화 세포를 특이적으로 살해하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 배양된 세포를 화합물과 접촉시키고, 세포의 세포 독성 또는 저해 정도를 결정한다. 노화 세포를 살해하거나 저해하는 화합물의 능력은 저밀도에서 자유롭게 분열하는 정상 세포, 및 고밀도에서 정지 상태에 있는 정상 세포에 대한 화합물의 효과와 비교될 수 있다. 실시예 2 및 3은 인간 표적 조직 섬유아세포 IMR90 세포주 및 HUVEC 세포를 사용한 노화 세포 살해의 예시를 제공한다. 유사한 프로토콜이 알려져 있으며, 다른 노화 세포 및 다른 세포 유형, 예컨대 암 세포를 살해하거나 저해하는 세포의 능력을 테스트하기 위해 개발되거나 최적화될 수 있다.
시험관내에서 노화 세포를 선택적으로 살해하는 데 효과적인 후보 Bcl 저해제가 특정 질환에 대한 동물 모델에서 추가로 스크리닝될 수 있다. 하기 실험 섹션의 실시예 4, 5, 6, 및 7은 각각 골관절염, 안질환, 폐질환, 및 죽상동맥경화증에 대한 예시를 제공한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 화합물은 암 또는 종양 세포를 특이적으로 살해하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 배양된 세포를 화합물과 접촉시키고, 세포에 대한 세포 독성 정도, 및/또는 세포 증식을 저해하는 능력을 결정한다. 암 세포에 대한 효과는 배양물에서 동일한 원래 조직 유형의 정상 세포에 대한 화합물의 효과와 비교될 수 있다. 화합물은 또한 확립된 동물 모델에서 종양을 제거, 암 세포 성장을 저해, 및 암의 증상 및 징후를 치료하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 실시예 8은 화학요법제로서 본 개시내용의 화합물의 잠재력을 평가하는 시험관내 및 생체내 분석의 예시를 제공한다.
약제의 제형
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 약제학적 작용제의 제조 및 제형은, 예를 들어 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy]의 현재 판에 기재된 바와 같은, 표준 기술을 포함할 수 있다. 제형은 전형적으로, 치료 중인 병태와 관련이 없는 조직에의 노출 또는 부작용을 최소화하면서, 표적 세놀리틱 세포에 대한 작용제의 접근을 향상시키고 최적의 효과 기간을 제공하는 방식으로, 예를 들어, 국소 투여에 의해, 표적 조직에의 투여를 위해 최적화될 수 있다.
노화 관련 병태 및 다른 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 약학 제제는 Bcl 저해제를 약제학적으로 허용가능한 염기 또는 담체 및 필요에 따라 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 표적 조직에 따라, 지속 또는 시한 방출을 위한 약제학적 조성물을 제형화하는 것이 적절할 수 있다. 경구 시한 방출 제형은 동질이성(isomeric) 변형체, 결합제, 또는 코팅제의 혼합물을 포함할 수 있다. 주사용 시한 방출 제형은 결합제, 캡슐화제, 또는 마이크로입자와 함께 활성제를 포함할 수 있다. 관절 질환, 예컨대 골관절염의 치료를 위해, 약제학적 조성물은 전형적으로 관절내 투여용으로 제형화된다. 안질환, 예컨대 녹내장, 당뇨망막병증 또는 연령-관련 황반변성(AMD)의 치료를 위해, 조성물은 유리체내 또는 전방내 투여용으로 제형화될 수 있다. 폐질환의 치료를 위해, 조성물은 에어로졸로서, 또는 기관내 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 하나 이상의 작용제 또는 조성물의 단위 용량을 포함하는 키트인 상업용 제품을 제공한다. 이와 같은 키트는 전형적으로 하나 이상의 용기에 약학 제제를 포함한다. 제제는 하나 이상의 단위 용량(결합 또는 분리)으로 제공될 수 있다. 키트는 이를 필요로 하는 대상체의 표적 조직에서 또는 그 주위에서 작용제 또는 조성물의 투여를 위한 시린지와 같은 장치를 함유할 수 있다. 제품은 또한 노화 세포 연관 병태를 치료함에 있어서 약물의 사용 및 수반되는 이점을 기재하는 정보 패키지 삽입물, 및 선택적으로 조성물의 치료 전달을 위한 기기 또는 장치를 함유하거나 동반할 수 있다.
치료 설계
노화 세포는 나이가 들면서 축적되며, 이는 노화 세포에 의해 매개되는 병태가 노인에서 더 빈번하게 발생하는 이유이다. 추가적으로, 폐 조직에 대한 다양한 유형의 스트레스는 노화 세포의 출현과 노화 세포가 발현하는 표현형을 촉진시킬 수 있다. 세포 스트레스 요인은 산화 스트레스, 대사 스트레스, DNA 손상(예를 들어, 환경적 자외선 노출 또는 유전적 장애의 결과), 종양유전자 활성화, 및 텔로미어 단축(예를 들어, 과다증식으로 인함)을 포함한다. 이와 같은 스트레스 요인을 받은 조직은 노화 세포의 출현율이 더 높을 수 있으며, 이는 결국 더 이른 나이에, 또는 더 심각한 형태로 특정 병태를 나타낼 수 있게 된다. 특정 병태에 대한 유전적 민감성은 질환-매개 노화 세포의 축적이 유전적 구성요소에 의해 직접 또는 간접적으로 영향을 받을 수 있으며, 이는 조기 발현으로 이어질 수 있음을 시사한다.
노화 세포 패러다임의 이점 중 하나는 노화 세포의 성공적인 제거가 대상체에게 장기적인 치료 효과를 제공할 수 있다는 것이다. 노화 세포는 본질적으로 비-증식성이며, 이는 더 많은 노화 세포가 있는 조직의 후속 재증식은 조직의 비-노화 세포의 노화 세포로의 전환에 의해서만 일어날 수 있음을 의미하는데, 이 과정은 단순한 증식보다 상당히 더 오래 걸린다. 보편적인 원칙으로서, 표적 조직에서 노화 세포를 제거하는 데 충분한 세놀리틱 작용제를 이용한 치료 기간(단일 용량, 또는 예를 들어 매일, 주 2회, 또는 매주 제공되는 복수 용량, 수일, 1주, 또는 수개월의 기간에 걸쳐 제공됨)은 대상체에게 세놀리틱 작용제가 투여되지 않는 동안 효능 기간(예를 들어, 2주, 1개월, 2개월, 또는 그 이상)을 제공할 수 있으며, 대상체는 치료되는 병태의 하나 이상의 유해 징후 또는 증상의 완화, 감소, 또는 반전을 경험한다.
본 개시내용에 따른 세놀리틱 작용제를 이용하여 특정 노화-관련 병태를 치료하기 위해, 치료 요법은 노화 세포의 위치, 및 질환의 병태생리에 의존할 것이다.
치료에 적합한 노화-관련 병태
본 개시내용의 Bcl 저해제는 다양한 노화-관련 병태의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이와 같은 병태는 (반드시 그런 것은 아니지만) 전형적으로, 비이환 조직에서 노화 세포(예컨대, p16 및 다른 노화 마커를 발현하는 세포)의 빈도 또는 p16 및 다른 노화 마커의 발현의 수준과 비교하여, 병태 부위 또는 그 주변에서 이러한 노화 세포의 과잉, 또는 그러한 발현의 과잉을 특징으로 할 것이다. 현재 관심이 있는 비-제한적인 예는 하기 섹션에서 예시되는 바와 같이, 골관절염, 안질환, 및 폐질환의 치료를 포함한다.
골관절염의 치료
본 개시내용에 열거된 임의의 Bcl 저해제는 본 개시내용에 따라서 골관절염을 치료하기 위해 개발될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용에 열거된 Bcl 저해제는 골관절염이 발생한 관절을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 이를 필요로 하는 대상체의 관절 또는 그 주위에서 노화 세포를 선택적으로 제거하기 위해 개발될 수 있다.
골관절염 퇴행성 관절 질환은 기계적 스트레스가 높은 부위에서 연골의 세섬유화(fibrillation), 골경화, 및 활막 및 관절낭의 비후를 특징으로 한다. 세섬유화는 연골의 표면층의 분열을 수반하는 국소 표면 해체이다. 초기 분열은 우세한 콜라겐 다발의 축을 따라 연골 표면과 접선 방향이다. 연골 내의 콜라겐은 해체되고, 프로테오글리칸이 연골 표면으로부터 손실된다. 관절에서 프로테오글리칸의 보호 및 윤활 효과가 없으면, 콜라겐 섬유는 분해되기 쉽고, 기계적 파괴가 잇따라 일어난다. 골관절염 발병에 대한 소인적 위험 요인은 연령 증가, 비만, 이전 관절 손상, 관절의 과다 사용, 대퇴부 근육 약화, 및 유전적 특징을 포함한다. 골관절염의 증상은 활동하지 않거나 과다사용 후 관절, 특히 둔부, 무릎, 및 허리의 아픔 및 뻐근함; 움직이면 사라지는 휴식 후 뻣뻣함; 및 활동 후 또는 하루가 끝날 무렵 더 악화되는 통증을 포함한다.
본 개시내용에 따른 화합물은 관절에서 프로테오글리칸 층의 손실 또는 침식을 감소 또는 저해하고, 이환된 관절에서 염증을 감소시키며, 콜라겐, 예를 들어 2형 콜라겐의 생성을 촉진, 자극, 향상, 또는 유도하는 데 사용될 수 있다. 화합물은 관절에서 생성되는 염증성 사이토카인, 예컨대 IL-6의 양 또는 수준의 감소를 유발할 수 있으며, 염증이 감소된다. 화합물은 골관절염을 치료하고/하거나 대상체의 관절에서 생성되는 콜라겐, 예를 들어 2형 콜라겐을 유도하는 데 사용될 수 있다. 화합물은 또한 관절에서 콜라겐을 분해하는 메탈로프로테이나제 13(MMP-13)의 생성을 감소, 저해, 또는 저감시키고, 프로테오글리칸 층을 회복시키거나 프로테오글리칸 층의 손실 및/또는 분해를 저해하는 데 사용될 수 있다. 이에 의해 화합물을 이용한 치료는 또한 뼈의 침식 가능성을 감소시키거나, 침식을 저해 또는 감소시키거나, 뼈의 침식을 늦출 수 있다. 화합물은 골관절염 관절에 직접, 예를 들어 관절내, 국부적으로, 경피, 피내, 또는 피하로 투여될 수 있다. 화합물은 또한 관절 강도의 저하를 회복, 개선, 또는 저해하고, 관절 통증을 감소시킬 수 있다.
안과 병태의 치료
본 개시내용에 열거된 임의의 Bcl 저해제는 대상체의 눈 또는 그 주위에서 노화 세포를 제거함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 안과 병태를 예방하거나 치료하는 데 사용될 수 있으며, 이에 의해 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 중증도가 감소된다. 이와 같은 병태는 눈 뒤쪽 질환(back-of-the-eye disease), 및 눈 앞쪽 질환(front-of-the-eye disease)을 둘 다 포함한다. 유사하게, 본 개시내용에 열거된 Bcl 저해제는 이를 필요로 하는 대상체에서 안구 조직 또는 그 주위에서 노화 세포를 선택적으로 제거하기 위해 개발될 수 있다.
본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 안질환은 노안, 황반변성(습성 또는 건성 AMD를 포함함), 당뇨망막병증, 및 녹내장을 포함한다.
황반변성은 눈 뒤쪽 질환으로 특징지어질 수 있는 신경변성 병태이다. 이는 황반이라 불리는 망막의 중심부에 있는 광수용체 세포의 손실을 유발한다. 황반변성은 건성 또는 습성일 수 있다. 건성 형태는 습성보다 더 흔하며, 연령-관련 황반변성(AMD) 환자의 약 90%가 건성 형태로 진단받는다. 건성 AMD는 망막색소상피(RPE) 층의 위축과 연관되며, 이는 광수용체 세포의 손실을 유발한다. 습성 AMD에서는, 새로운 혈관이 망막 아래에서 성장하여 혈관과 체액이 누출될 수 있다. 비정상적으로 누출되는 맥락막 신생혈관형성은 망막 세포가 죽게 하여, 중심 시력에 맹점을 형성할 수 있다. 황반의 부르크막(Bruch's membrane) 하부에 삼출물, 또는 "드루젠"의 형성은 황반변성이 생기고 있다는 물리적 징후일 수 있다. 황반변성의 증상은, 예를 들어 인지된 왜곡 및 색 지각 변화를 포함한다.
또 다른 눈 뒤쪽 질환은 당뇨망막병증(DR)이다. 위키피디아(Wikipedia)에 따르면, DR의 첫번째 단계는 비-증식성이며, 전형적으로 실질적인 증상 또는 징후가 없다. NPDR은 안저 촬영으로 검출가능하며, 여기서 미세동맥류(동맥벽의 미세한 혈액이 채워진 돌출부)를 볼 수 있다. 시력이 저하된 경우, 플루오레세인 혈관조영술을 수행하여 눈 뒤쪽을 볼 수 있다. 좁아지거나 막힌 망막 혈관을 명확하게 볼 수 있으며, 이는 망막 허혈(혈류 부족)이라고 불린다. 혈관이 내용물을 황반 영역으로 누출하는 황반 부종은 NPDR의 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 황반 부종의 증상은 시야가 흐려지고 양쪽 눈에서 동일하지 않은 이미지의 어두워짐 또는 왜곡이다. 광 간섭성 단층촬영은 황반 부종의 망막 비후(유체 축적으로 인함)의 영역을 보여줄 수 있다. DR의 두번째 단계에서는, 증식성 당뇨망막병증(PDR)의 일부로 눈의 뒤쪽에 비정상적인 새로운 혈관(신생혈관)이 형성되며, 이는 파열 및 출혈(유리체 출혈)을 일으키고 시야가 흐려질 수 있다. 안저 검사에서, 임상의는 면모반, 화염 출혈(유사한 병변이 또한 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi)의 알파-독소에 의해 유발됨), 및 점상 출혈을 볼 것이다.
본 개시내용의 세놀리틱 작용제를 이용한 눈 뒤쪽 질환의 치료의 이점은 비정상적인 신생혈관형성, 병원성 혈관형성, 맥관소멸, 안내 출혈, 망막 손상, 및 시력 손실과 같은 병태의 불리한 특성의 저해 또는 지연을 포함할 수 있다. 세놀리틱 작용제는 눈 또는 그 주위에서, 예를 들어 안내, 유리체내, 또는 안구후 주사에 의해 투여될 수 있다. 최적으로, 부분적인 정도의 시력 개선과 함께, 기능적 혈관구조의 회복, 기능적 혈관형성, 망막 재성장 또는 회복과 같은 일부 병태생리에서의 반전이 있을 것이다.
노안은 나이가 들어감에 따라 정상적인 눈의 수용 속도와 폭이 감소함에 따라 눈이 가까운 물체에 초점을 맞추는 능력의 점진적인 감소를 보이는 연령-관련 병태이다. 수정체의 탄력 상실과 섬모체근의 수축성 상실은 노안을 유발할 수 있다. 수정체 전낭 및 수정체 후낭의 기계적 특성의 연령-관련 변화는, 조직 구성의 변화로 인해, 수정체 후낭의 기계적 강도가 연령에 따라 현저하게 감소함을 시사한다. 수정체낭의 주요 구조적 구성요소는 3차원 분자 네트워크로 구조화된 기저막 IV형 콜라겐이다. 안내 수정체에 대한 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 및 라미나(lamina)의 부착은 세포 이동을 저해할 수 있고 PCO의 위험을 감소시킬 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공되는 세놀리틱 작용제는 IV형 콜라겐 네트워크의 해체를 늦추고, 상피 세포 이동을 감소 또는 저해할 수 있으며, 또한 노안의 발생을 지연시키거나 병태의 진행 중증도를 감소시키거나 늦출 수 있다. 상기 세놀리틱 작용제는 또한 후발성 백내장 수술에 유용하여 PCO의 발생 가능성을 감소시킬 수 있다.
녹내장 및 다른 눈 앞쪽 질환은 또한 본 개시내용에서 제공되는 세놀리틱 작용제를 이용하여 치료할 수 있다. 일반적으로, 투명한 유체가 전방(anterior chamber)으로 알려진 눈의 앞부분으로 흘러 들어가고 나온다. 개방각/광우각 녹내장이 있는 개체에서, 투명한 유체는 너무 천천히 배출되어, 눈 내의 압력이 증가하게 된다. 치료하지 않고 방치하면, 눈 내의 높은 압력은 이후에 시신경을 손상시킬 수 있고 완전한 실명으로 이어질 수 있다. 주변시의 상실은 망막의 신경절 세포의 죽음에 의해 유발된다.
치료법의 가능한 이점은 안압 감소, 섬유주 네트워크를 통한 안구 유체의 배출 개선, 및 초래된 시력 상실의 저해 또는 지연을 포함한다. 세놀리틱 작용제는 눈 또는 그 주위에, 예를 들어 안구내 또는 전방내 주사에 의해 또는 국부 제형으로 투여될 수 있다. 치료법의 효과는 자동시야측정, 전방각경검사, 영상화 기술, 주사 레이저 단층촬영, HRT3, 레이저 편광측정, GDX, 광 간섭성 단층촬영, 검안경 검사, 및 중심 각막 두께를 결정하는 각막두께 측정에 의해 모니터링될 수 있다.
폐 병태의 치료
본 개시내용에 열거된 임의의 Bcl 저해제는 본 개시내용에 따라서 폐질환을 치료하기 위해 개발될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용에 열거된 Bcl 저해제는 이를 필요로 하는 대상체에서 폐 또는 그 주위에서 노화 세포를 선택적으로 제거하기 위해 개발될 수 있다. 치료될 수 있는 폐 병태는 특발성 폐섬유증(IPF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 및 폐기종을 포함한다.
COPD는 폐 조직의 파괴, 폐기종, 및 소기도의 기능장애, 폐쇄성 세기관지염으로 인한 지속적으로 좋지 않은 기류로 정의되는 폐질환이다. COPD의 주요 증상은 숨가쁨, 천명, 흉민, 만성 기침, 및 과도한 가래 생성을 포함한다. 궐련 연기-활성화 호중구 및 대식세포 유래의 엘라스타제는 폐포 구조의 세포외 기질을 분해하여, 공기 공간을 넓히고 호흡 능력의 상실을 초래할 수 있다. COPD는, 예를 들어 담배 연기, 궐련 연기, 시가 연기, 간접 흡연, 파이프 연기, 직업상 노출, 먼지, 연기, 매연, 및 오염물질에의 노출에 의해 유발될 수 있으며, 이는 수십년에 걸쳐 일어나서 노화가 COPD의 발병에 대한 위험 요인임을 보여준다.
폐 손상을 유발하는 과정은, 예를 들어 담배 연기 중 고농도의 자유 라디칼에 의해 생성되는 산화 스트레스, 기도에서 자극물에 대한 염증 반응으로 인한 사이토카인 방출, 및 담배 연기 및 자유 라디칼에 의한 항-프로테아제 효소의 손상(이에 의해 프로테아제가 폐를 손상시킬 수 있음)을 포함한다. 유전적 감수성도 또한 상기 질환의 원인이 될 수 있다. COPD가 있는 사람의 약 1%에서, 질환은 간에서 낮은 수준의 알파-1-항트립신의 생성을 유발하는 유전적장애로 인해 발생한다. 알파-1-항트립신은 보통 폐를 보호하기 위해 혈류로 분비된다.
폐섬유증은 폐의 경직 및 흉터를 특징으로 하는 만성 및 진행성 폐질환으로, 호흡 부전, 폐암, 및 심부전을 야기할 수 있다. 섬유증은 상피의 회복과 연관된다. 섬유아세포가 활성화되고, 세포외 기질 단백질의 생성이 증가되며, 수축성 근섬유아세포로의 전환분화는 상처 수축의 원인이 된다. 임시 기질은 손상된 상피를 막고, 상피-간엽 이행(EMT)을 포함하여 상피 세포 이동을 위한 스캐폴드를 제공한다. 상피 손상과 연관된 혈액 손실은 혈소판 활성화, 성장 인자의 생성, 및 급성 염증 반응을 유도한다. 보통, 상피 장벽이 치유되고 염증 반응이 해결된다. 그러나, 섬유성 질환에서, 섬유아세포 반응이 계속되어, 해결되지 않은 상처 치유를 초래한다. 섬유아세포 병소의 형성은 진행중인 섬유화의 위치를 반영하는 질환의 특성이다.
폐섬유증의 발병 위험이 있는 대상체는, 예를 들어 석면증 및 규폐증과 같은 환경 또는 직업상 오염물질에 노출된 대상체' 궐련을 피우는 대상체; 결합 조질 질환, 예컨대 RA, SLE, 피부경화증, 사르코이드증, 또는 베게너육아종증이 있는 대상체; 감염이 있는 대상체; 예를 들어, 아미오다론, 블레오마이신, 부설판, 메토트렉세이트, 및 나이트로푸란토인을 포함한 특정 약제를 복용하는 대상체; 흉부에 방사선 요법을 받는 대상체; 및 가족 구성원이 폐섬유증을 앓고 있는 대상체를 포함한다.
이러한 병태에 따라 화합물을 사용함으로써 치료될 수 있는 다른 폐 병태는 폐기종, 천식, 기관지 확장증, 및 낭포성 섬유증을 포함한다. 폐질환은 또한 담배 연기; 먼지, 연기, 또는 매연에의 직업상 노출; 감염; 또는 염증의 원인이 되는 오염물질에의 의해 악화될 수 있다.
폐질환의 증상은 숨가쁨, 천명, 흉민, 폐의 과도한 점액으로 인해 아침에 맨 먼저 목을 깨끗하게 해야 하는 것, 투명하거나, 백색이거나, 황색이거나 녹색일 수 있는 가래를 생성하는 만성 기침, 청색증, 빈번한 호흡기 감염, 에너지 결여, 및 의도하지 않은 체중 감소를 포함할 수 있다. 폐섬유증의 증상은 특히 운동 동안 숨가쁨; 건조하고 마른 기침; 빠르고 얕은 호흡; 점진적이면서 의도하지 않은 체중 감소; 피로; 관절 및 근육 통증; 및 손가락 또는 발가락의 곤봉지를 포함할 수 있다.
치료 전, 동안, 및 후 폐 기능은, 예를 들어 호기 예비량(expiratory reserve volume: ERV), 노력성 폐활량(forced vital capacity: FVC), 노력성 호기량(forced expiratory volume: FEV), 총 폐용량(total lung capacity: TLC), 폐활량(vital capacity: VC), 잔기량(residual volume: RV), 및 기능적 잔기량(functional residual capacity: FRC)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 폐포 모세혈관 막을 통한 기체 교환은 일산화탄소에 대한 확산 능력(diffusion capacity for carbon monoxide: DLCO)을 사용하여 측정될 수 있다. 운동 능력은 대용물로서 측정될 수 있다. 말초 모세혈관 산소 포화도(SpO2)가 또한 측정될 수 있으며, 정상 산소 수준은 전형적으로 95% 내지 100%이다. 90% 미만의 SpO2 수준은 대상체가 저산소혈증이 있음을 시사한다. 80% 미만의 값은 중요한 것으로 간주되며, 뇌 및 심장 기능을 유지하고 심장 또는 호흡 정지를 피하기 위해 개입을 필요로 한다.
치료의 이점은 이러한 임의의 효과의 진행을 저해하거나 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 세놀리틱 작용제의 투여는 전신, 또는 폐 또는 그 주위의 부위에서 국소적일 수 있으며, 이는 예를 들어 에어로졸 또는 분말로 흡입, 또는 삽관에 의한다. 최적으로, 작용제는 SpO2 수준 및 운동 능력을 개선시킬 것이다.
죽상동맥경화증의 치료
세놀리틱 화합물은, 예를 들어 대상체에서 죽상경화판의 형성, 확대, 또는 진행을 저해함으로써, 죽상동맥경화증의 치료에 사용될 수 있다. 세놀리틱 화합물은 또한 대상체의 하나 이상의 혈관에 존재하는 죽상경화판의 안정성을 향상시켜, 혈관이 파열되고 폐색되는 것을 저해하는 데 사용될 수 있다.
죽상동맥경화증은 중형 및 대형 동맥의 내강을 침식하는 고르지 못한 혈관내막 플라크를 특징으로 하며; 플라크는 지질, 염증 세포, 평활근 세포, 및 결합 조직을 함유한다. 죽상동맥경화증은 관상동맥, 경동맥, 및 대뇌동맥, 이들의 대동맥 및 분지, 및 사지의 주요 동맥을 포함한, 대형 및 중형 동맥에 영향을 미칠 수 있다.
죽상동맥경화증은 동맥 벽의 두께를 증가시킬 수 있다. 플라크의 성장 또는 파열이 혈류를 감소시키거나 방해할 때 증상이 나타나며; 증상은 이환된 동맥에 따라 달라질 수 있다. 죽상경화판은 안정적이거나 불안정할 수 있다. 안정적인 플라크는 퇴행하거나, 정지 상태로 유지되거나, 협착 또는 폐색을 유발할 수 있을 때까지 때때로 수십년에 걸쳐 서서히 성장한다. 불안정한 플라크는 상기 플라크가 혈류역학적으로 상당한 협착을 유발하기 훨씬 전에 자발적인 미란, 열창, 또는 파열에 취약하여, 급성 혈전증, 폐색, 및 경색을 유발한다. 임상적 사건은 혈관조영술에서 심각한 것으로 나타나지 않은 불안정한 플라크로 인해 발생할 수 있으며; 따라서 플라크 안정화는 이환율 및 사망률을 감소시키는 방법이 될 수 있다. 플라크 파열 또는 미란은 주요 심혈관 사건, 예컨대 급성 관상동맥 증후군 및 뇌졸중으로 이어질 수 있다. 붕괴된 플라크는 지질, 대식세포 함량이 더 높을 수 있으며, 온전한 플라크보다 더 얇은 섬유질 캡(fibrous cap)을 가질 수 있다.
죽상동맥경화증 및 다른 심혈관 질환의 진단은 증상, 예를 들어 협심증, 흉부 압박, 팔 또는 다리의 무감각 또는 쇠약, 말하기 어려움 또는 불분명한 발음, 얼굴 근육 처짐, 다리 통증, 고혈압, 신부전 및/또는 발기부전, 병력, 및/또는 환자의 신체 검사를 기반으로 할 수 있다. 진단은 혈관조영술, 초음파검사, 또는 다른 영상 테스트에 의해 확인될 수 있다. 심혈관 질환의 위험이 있는 대상체는 임의의 하나 이상의 소인 요인, 예컨대 심혈관 질환의 가족력이 있는 대상체, 및 다른 위험 요인, 예를 들어 고혈압(high blood pressure), 이상지질혈증, 고콜레스테롤, 당뇨병, 비만 및 궐련 흡연, 좌식 생활방식, 및 고혈압(hypertension)을 포함한 소인 요인이 있는 대상체를 포함한다. 병태는, 예를 들어 혈관조영술, 심전도검사, 또는 스트레스 테스트에 의해 평가될 수 있다.
세놀리틱 작용제를 이용한 치료의 잠재적 이점은 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상, 예컨대 플라크의 빈도, 플라크로 덮이는 혈관의 표면적, 협심증, 및 운동 부하 감소의 완화 또는 이의 진행의 중지를 포함한다.
정의
"노화 세포"는 전형적으로 복제되는 세포 유형으로부터 유래된 것으로 일반적으로 생각되지만, 노화 또는 세포 상태의 변화를 유발하는 다른 사건의 결과로 더 이상 복제할 수 없다. 문맥에 따라, 노화 세포는 p16, 또는 p16, 노화-연관 β-갈락토시다제, 및 리포푸신으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커; 때때로 이들 마커 중 둘 이상, 및 노화-연관 분비형 프로파일(SASP), 예컨대 인터류킨 6, 및 염증성, 혈관기원 및 세포외 기질 변형 단백질(이에 제한되지는 않음)의 다른 마커를 발현하는 것으로 확인될 수 있다. 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 청구범위에서 언급된 노화 세포는 암 세포를 포함하지 않는다.
"노화와 연관", "노화와 관련" 또는 "나이와 관련"된 질환, 장애, 또는 병태는 대상체에게 불리한 하나 이상의 증상 또는 징후와 함께 제시되는 생리학적 상태이다. 상태가 "적어도 부분적으로 노화 세포에 의해 유발되거나 매개"되는 경우, 상태는 "노화와 연관"된 것이다. 이는 이환된 조직에서 노화 세포의 적어도 일부의 제거가 환자의 이익에 유해한 증상 또는 징후의 실질적인 경감 또는 감소를 초래하도록 이환된 조직 또는 그 주위에서 SASP의 적어도 하나의 구성요소가 상태의 병태생리에서 역할을 하는 것을 의미한다. 본 개시내용에 따라 방법 및 생성물을 사용하여 잠재적으로 치료 또는 관리될 수 있는 노화 연관 장애는 본 개시내용 및 논의에서 언급된 이전 개시내용에 언급된 장애를 포함한다. 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어는 암을 포함하지 않는다.
단백질 기능 또는 Bcl 기능의 저해제는 표적 세포에서 이미 발현된 표적 단백질이 단백질 또는 Bcl 패밀리 구성원이 보통 표적 세포에서 수행하는 효소, 결합, 또는 조절 기능을 실질적으로 수행하지 못하게 하는 화합물이다. 이는 표적 세포의 제거 또는 세포가 또 다른 화합물 또는 사건의 독성에 더 민감하게 만드는 것을 초래한다. 화합물은 하기 실시예 1에 따른 분석에서 테스트될 때 IC50이 1,000 nM(1.0　μM) 미만인 경우, 상기 화합물은 본 개시내용에서 "Bcl 저해제" 또는 "Bcl 활성을 저해"하는 화합물로서 자격이 있다. 상황에 따라, 100nM 또는 10nM 미만, 또는 100nM 내지 1 nM의 활성이 종종 바람직하다.
용어 "Bcl" 또는 "Bcl 단백질"은 Bcl-2, Bcl-xL, 및 Bcl-w로 예시되는, Bcl 단백질의 패밀리를 말한다. 본 개시내용의 Bcl 저해제는 Bcl-2, Bcl-xL, 및 Bcl-w 중 적어도 하나를 저해할 수 있을 것이다. 전형적으로 반드시 그런 것은 아니지만, 이들 Bcl 단백질 중 하나의 저해제는 다른 2가지를 어느 정도 저해할 것이다. 본 개시내용에서 제공되는 화합물은 임의의 Bcl 패밀리 구성원의 활성에 대하여 테스트되어, Bcl-2, Bcl-xL, 또는 Bcl-w에 대해 저해 활성을 가지고 이들에 대해 잠재적으로 특이적인 화합물을 확인할 수 있다. 이와 같은 저해제는 목록에 있는 다른 2가지 Bcl 패밀리 구성원에 대한 IC50보다 이 목록에 있는 표적 Bcl에 대한 IC50가 적어도 10배 더 우수할 것이다.
화합물, 조성물 또는 작용제가 노화 세포, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 복제 세포, 또는 SASP 마커가 없는 휴지기 세포를 제거하는 경우, 이는 전형적으로 "세놀리틱"으로 지칭된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 화합물 또는 조합은 병태의 초기 제시 또는 진행중인 병적 측면에서 역할을 하거나, 이의 해결을 저해하는 노화 연관 분비형 표현형의 일부로서 병리학적 가용성 인자 또는 매개체의 방출을 감소시키는 경우 화합물 또는 조합은 효과적으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "세놀리틱"은 주로 노화 세포를 제거하기보다는 저해함으로써 작용하는 화합물(노화 세포 저해제)이 뒤이은 이점을 가지는 유사한 방식으로 사용될 수 있도록 하는 기능적 저해를 말한다. 본 개시내용에서 모델 세놀리틱 조성물 및 작용제는 하기 실시예 2에 따른 분석에서 테스트될 때 EC50이 1　μM 미만이다. 0.1　μM 미만, 또는 1　μM 내지 0.1　μM의 활성이 바람직할 수 있다. 선택성지수(SI)(동일한 조직 유형의 비-노화 세포와 비교한 노화 세포의 EC50)는 상황에 따라 1, 2, 5, 또는 10보다 더 좋을 수 있다.
혼합된 세포 집단 또는 조직으로부터 노화 세포의 선택적인 제거 또는 "배제"는 노화 표현형을 보유하는 모든 세포를 제거할 것을 필요로 하지 않으며; 단지 치료 후 남아있는 조직에서 초기에 노화 세포의 비율이 치료 후 남아있는 조직에서 초기에 비-노화 세포의 비율보다 실질적으로 더 높다.
본 개시내용에 따른 병태의 성공적인 "치료"는 치료중인 대상체에게 유익한 임의의 효과를 가질 수 있다. 이는 병태, 또는 병태로 인한 임의의 유해한 징후 또는 증상의 중증도, 기간, 또는 진행의 감소를 포함한다. 치료는 또한 비성공적일 수 있으며, 이는 병태의 전형적인 징후와 증상의 개선을 초래하지 못한다. 치료법의 동시 목적은 치료되는 대상체의 표적 조직 또는 다른 곳에 대한 부작용을 최소화하는 것이다. 일부 상황에서, 세놀리틱 작용제는 또한, 예를 들어 병력으로 인한 유전적 감수성으로 인해 대상체가 감수성이 있는 병태의 제시를 예방하거나 저해하는 데 사용될 수 있다.
"치료 유효량"은 (i) 특정 질환, 병태, 또는 장애를 치료, (ii) 특정 질환, 병태, 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화, 개선, 또는 제거, (iii) 본 명세서에 기재된 특정 질환, 병태, 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 방지 또는 지연, (iv) 특정 질환, 병태 또는 장애의 진행을 방지 또는 지연, 또는 (v) 치료 이전의 병태에 의해 유발된 손상을 적어도 부분적으로 역전시키는 본 개시내용의 화합물의 양이다.
화합물의 "인산화" 형태는 산소 원자를 통해 코어 구조에 공유 결합된 하나 이상의 포스페이트기를 보유하는 화합물이며, 상기 산소 원자는 전형적으로 반드시 그런 것은 아니지만 인산화 전에 분자에 존재하였다. 예를 들어, 하나 이상의 -OH 또는 -COOH기는 수소 대신에 -OPO3H2 또는 -CnPO3H2(여기서, n은 1 내지 4임)인 포스페이트기로 치환될 수 있다. 일부 인산화 형태에서, 포스페이트기는 생체내에서 (예를 들어, 효소 분해에 의해) 제거될 수 있으며, 이 경우 인산화 형태는 비-인산화 형태의 전구 약물일 수 있다. 비-인산화 형태는 이와 같은 포스페이트기를 가지지 않는다. 탈인산화 형태는 적어도 하나의 포스페이트기가 제거된 후 인산화된 분자의 유도체이다.
본 개시내용에 따른 "소분자" Bcl 저해제는 분자량이 20,000 달톤 미만이고, 종종 10,000, 5,000, 또는 2,000 달톤 미만이다. 소분자 저해제는 항체 분자 또는 올리고뉴클레오타이드가 아니며, 전형적으로 5개 이하의 수소 결합 공여체(질소-수소 및 산소-수소 결합의 총 수), 및 10개 이하의 수소 결합 수용체(모든 질소 또는 산소 원자)를 가진다.
"전구약물"은 활성제를 방출하기 위해 신체 내에서 전환을 필요로 하는 작용제의 유도체이다. 전환은 효소 전환일 수 있다. 때때로, 전환은 고리화 전환, 효소 전환 및 고리화 전환의 조합이다. 반드시 그런 것은 아니지만, 전구약물은 빈번하게 활성제로 전환될 때까지 약리적으로 비활성 상태이다.
달리 언급되거나 요구되지 않는 한, 본 개시내용에 언급된 화합물 구조 각각은 동일한 구조를 가지는 공액 산 및 염기, 이들 화합물의 결정질 및 비정질 형태, 약제학적으로 허용가능한 염, 및 전구약물을 포함한다. 이는, 예를 들어 화합물의 다형체, 용매화물, 수화물, 용매화되지 않은 다형체(무수물을 포함함), 및 인산화 및 비인산화 형태를 포함한다.
참조문헌에 의한 포함
미국 및 유효한 다른 관할권에서 모든 목적을 위해, 본 개시내용에서 인용된 각각의 모든 간행물 및 특허 문헌은, 각각의 이와 같은 간행물 또는 문헌이 본 명세서에 참조로 포함된 것으로 구체적이면서 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참조로 포함된다.
미국 특허 제10,130,628호(Laberge 등) 및 US　20170266211　A1(David 등)은 본 명세서에 모든 목적을 위하여 포함되며, 이는 세놀리틱 작용제의 확인 및 제형, 노화 세포에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 생각되는 다양한 병태를 치료하기 위한 이의 용도를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 미국 특허 제8,691,184호, 제9,096,625호 및 제9,403,856호(Wang 등)은 본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참조로 포함되며, 이는 Bcl 라이브러리에 있는 화합물의 특성, 이의 제조 및 용도를 포함한다. 미국 특허 출원 15/675,171(2017년 8월 11일 출원) 및 62/579,793(2017년 10월 31일 출원)은 본 명세서에 모든 목적을 위하여 포함되며, 이는 노화 세포의 활성을 제거 또는 감소시키고 다양한 안과 병태를 치료할 수 있는 화합물의 확인, 제형, 및 용도를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1: Bcl 저해의 측정
Bcl-2 및 Bcl-xL 활성을 저해하는 후보 화합물의 능력을 직접 결합에 의해 분자 수준에서 측정할 수 있다. 이 분석은 PerkinElmer Inc.(미국 메사추세츠주 월섬 소재): 문헌[Eglin et　al., Current Chemical Genomics, 2008, 1, 2-10] 참조)가 시판하는 산소 채널링을 기반으로 한 동질 분석 기술을 사용한다. 테스트 화합물을 표적 Bcl 단백질 및 비오틴으로 표지화한 상응하는 동족 리간드를 나타내는 펩타이드와 결합시킨다. 그 다음 혼합물을 발광 공여체 비드 및 발광 수용체 비드를 보유하는 스트렙타비딘과 결합시키며, 이는 화합물이 펩타이드가 Bcl 단백질에 결합하는 것을 저해하는 경우 발광을 비례적으로 감소시킨다.
Bcl-2, Bcl-xL 및 Bcl-w는 Sigma-Aldrich Co.(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 입수 가능하다. 비오티닐화 BIM 펩타이드(Bcl-2에 대한 리간드) 및 BAD 펩타이드(Bcl-xL에 대한 리간드)가 US　2016/0038503　A1에 기재되어 있다. AlphaScreen® 스트렙타비딘 공여체 비드 및 항--6XHis AlphaLISA® 수용체 비드는 퍼킨엘머로부터 입수 가능하다.
분석을 수행하기 위해, 화합물의 1:4 계열 희석물을 DMSO 중에서 준비한 다음, 분석 완충액 중에서 1:100으로 희석하였다. 96-웰 PCR 플레이트에서, 하기를 순서대로 합한다: 10㎕ 펩타이드(120nM BIM 또는 60nM BIM), 10㎕ 테스트 화합물, 및 10㎕ Bcl 단백질(0.8nM Bcl-2/W 또는 0.4nM Bcl-XL). 분석 플레이트를 암실에서 24시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 다음 날, 공여체 비드와 수용체 비드를 합하고, 5㎕를 각각의 웰에 첨가한다. 암실에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 측정하고, 각각의 테스트 화합물에 의한 친화성 또는 저해 정도를 결정한다.
실시예 2: 섬유아세포에서 세놀리틱 활성의 측정
명칭이 CCL-186인 인간 섬유아세포 IMR90 세포를 세포를 3% O2, 10% CO2, 및 약 95% 습도의 대기에서 FBS 및 Pen/Strep을 American Type Culture Collection (ATCC®)으로부터 입수할 수 있다. 함유하는 DMEM 중에 75% 미만의 컨플루언시로 유지시킨다. 세포를, 방사선 조사된 세포(사용 전 방사선 조사 후 14일 동안 배양) 및 휴지기 세포(사용 전 4일 동안 고밀도에서 배양)의 그룹으로 나눈다.
제0일에, 방사선 조사된 세포를 다음과 같이 준비한다. IMR90 세포를 세척하고, ㎖당 50,000개 세포의 밀도로 T175 플라스크에 넣은 다음, 10 내지 15 ㏉에서 방사선 조사한다. 방사선 조사 후, 세포를 96-웰 플레이트에 100㎕로 도말한다. 제1일, 제3일, 제6일, 제10일, 및 제13일에, 각각의 웰의 배지를 흡인하고, 새로운 배지로 교체한다.
제10일에, 건강한 휴지기 세포를 다음과 같이 준비한다. IMR90 세포를 세척하고, 3㎖의 TrypLE 트립신-함유 시약(Thermofisher Scientific, 미국 메사추세츠주 월섬 소재)과 합한 다음, 세포가 모여서 플레이트로부터 분리되기 시작할 때까지 5분 동안 배양한다. 세포를 분산시키고, 계수한 다음 ㎖당 50,000개 세포의 농도로 배지 중에 준비한다. 100㎕의 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 도말한다. 제13일에 배지를 변경한다.
제14일에, 테스트 저해제 화합물을 다음과 같이 세포와 합한다. 각각의 테스트 화합물의 DMSO 계열 희석물을 96-웰 PCR 플레이트에서 원하는 최종 농도의 200배로 준비한다. 사용 직전에, DMSO 스톡을 1:200으로 희석하여 예열된 완전 배지로 만든다. 배지를 각각의 웰에서 세포로부터 흡인하고, 배지를 함유하는 100㎕/웰의 화합물을 첨가한다.
테스트를 위한 후보 세놀리틱 작용제를 세포와 함께 6일 동안 배양하고, 제17일에 동일한 화합물 농도로 배양 배지를 신선한 배지로 교체한다. Bcl 2 저해제를 세포와 함께 3일 동안 배양한다. 분석 시스템은 열안정성 루시퍼라제의 특성을 사용하여 안정적인 발광 신호를 생성하는 동시에 세포 용해 동안 방출되는 내인성 ATP아제를 저해하는 반응 조건을 가능하게 한다. 배양 기간의 종료시, 100㎕의 CellTiter-Glo® 시약(Promega Corp., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 각각의 웰에 첨가한다. 세포 플레이트를 오비탈 쉐이커에 30초 동안 놓고, 발광을 측정한다.
실시예 3: HUVEC 세포 및 다른 노화 세포에서 세놀리틱 활성의 측정
단일 로트 유래의 인간 제정맥(HUVEC) 세포를 ATCC의 Endothelial Cell Growth Kit™-VEGF가 보충된 혈관 세포 기저 배지에서 대략 8배의 집단으로 확장시킨 다음 동결보존하였다. 분석 시작 9일 전, 노화 집단을 위한 세포를 해동하고 대략 27,000/㎠로 파종하였다. 모든 세포를 5% CO2 및 3% O2가 있는 가습 인큐베이터에서 배양하고, 배지를 48시간마다 변경하였다. 파종 2일 후, 세포에 방사선을 조사하여 X-레이 공급원으로부터 12 ㏉의 방사선을 전달하였다. 분석 시작 3일 전, 비-노화 집단을 위한 세포를 해동하고 노화 집단에 대한 것과 같이 파종하였다. 분석 1일 전, 모든 세포를 트립신으로 처리하고 5,000/웰의 노화 세포 및 10,000/웰의 비-노화 세포를 별도의 플레이트에 55㎕/웰의 최종 부피로, 384-웰 플레이트에 파종하였다. 각각의 플레이트에서, 중앙 308개의 웰에는 세포가 포함되어 있고, 웰의 외부 주위는 70㎕/웰의 탈이온수로 채웠다.
분석 당일, 화합물을 10mM 스톡으로부터 배지 내로 희석하여 최고 농도의 작업 스톡을 제공한 다음, 이의 분취량을 배지에서 추가로 희석하여 나머지 2가지 작업 스톡을 제공하였다. 분석을 시작하기 위해, 5㎕의 작업 스톡을 세포 플레이트에 첨가하였다. 최종 테스트 농도는 20, 2, 및 0.2μM이었다. 각각의 플레이트에서, 양성 대조군 3개 웰 및 비처리(DMSO) 대조군 5개와 함께 100가지의 테스트 화합물을 단일 농도에서 3중으로 분석하였다. 화합물을 첨가한 후, 플레이트를 3일 동안 인큐베이션으로 돌려보냈다.
CellTiter-Glo™ 시약(Promega)을 사용하여 총 ATP 농도를 측정함으로써 세포 생존을 간접적으로 평가하였다. 생성된 발광을 EnSpire™ 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 정량화하였다. 화합물의 각각의 농도에 대한 상대적인 세포 생존력을 동일한 플레이트에 있어서 비처리 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.
잠재적인 우세 화합물의 후속 용량 반응을 위해, 노화 및 비-노화 세포의 384-웰 플레이트를 상기 기재한 바와 같이 준비하였다. 화합물을 DMSO 중 10포인트의 1:3 계열 희석물로 준비한 다음 배지에서 12×로 희석하였다. 그 다음 이 작업 스톡의 5 마이크로리터를 세포 플레이트에 첨가하였다. 3일의 인큐베이션 후, DMSO 대조군에 대한 세포 생존율을 상기 기재한 바와 같이 계산하였다. 모든 측정은 4중으로 수행하였다.
다른 세포주 및 1차 세포 배양물을 생체내에서 의도된 표적 조직에 맞춘 IMR90 섬유아세포 또는 HUVEC 세포에 대한 대안으로 사용할 수 있다. 한 가지 예는 안질환의 치료용으로 의도된 화합물을 스크리닝 하기 위해 배양된 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)의 사용이다. 상기 세포를 선택된 세포주에 대해 알려진 프로토콜에 따라 배양하고, 유사한 방식으로 방사선 조사하여 이들 세포를 노화시킨다.
실시예 4: 골관절염 모델에서 세놀리틱 작용제의 효능
이 실시예는 골관절염의 치료를 위한 마우스 모델에서 MDM2 저해제의 테스트를 예시한다. 임상 치료법에 사용하기 위한 Bcl 저해제를 테스트하고 개발하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 조정될 수 있다.
모델을 다음과 같이 구현하였다. C57BL/6J 마우스는 한쪽 뒷다리의 전방십자인대를 절단하여 그 다리의 관절에서 골관절염을 유도하는 수술을 받았다. 수술 후 3주 및 4주 동안, 2주 동안 격일(q.o.d.) 관절 내 주사에 의해 수술한 무릎 당 5.8 ㎍의 뉴트린-3A(n=7)로 마우스를 처리하였다. 수술 후 4주 종료시, 마우스의 관절을 노화 세포의 존재에 대하여 모니터링하고, 기능에 대하여 평가한 다음, 염증의 마커에 대해 모니터링하고, 조직학적 평가를 하였다.
수행한 연구에 2가지 대조군 마우스 그룹을 포함하였으며, 하나의 그룹은 모의 수술(n = 3)(즉, ACL 절단을 제외한 수술 절차를 따름)을 받고 GCV(간시클로버) 처리군과 유사한 관절내 비히클 주사를 받은 C57BL/6J 또는 3MR 마우스를 포함하고; 하나의 그룹은 ACL 수술을 받고 GCV-처리 그룹과 유사한 관절내 비히클 주사(n=5)를 받은 C57BL/6J 또는 3MR 마우스를 포함하였다. 뉴트린-3A 처리 마우스의 수술된 마우스 관절 유래의 RNA를 SASP 인자(mmp3, IL-6) 및 노화 마커(p16)의 발현에 대해 분석하였다. qRT-PCR을 수행하여 mRNA 수준을 검출하였다.
도 2A, 도 2B 및 도 2C는 각각 조직에서 p16, IL-6, 및 MMP13의 발현을 나타낸다. OA 유도 수술은 이들 마커의 발현 증가와 연관되었다. 뉴트린-3A로의 처리는 대조군의 수준 미만으로 발현을 감소시켰다. 뉴트린-3A를 이용한 처리는 관절에서 노화 세포를 소거하였다.
마우스가 어느 다리를 선호하는지를 결정하기 위해 체중 부하 테스트에 의해 사지 기능을 수술 4주 후 평가하였다. 측정하기 전에 적어도 3번 마우스가 챔버에 적응하도록 하였다. 각각의 저울에 하나의 뒷발로 서 있도록 마우스를 챔버 내에서 움직이도록 하였다. 각각의 뒷발에 실린 체중을 3초에 걸쳐 측정하였다. 각각의 시점에서 각각의 동물에 대해 적어도 3번의 별개 측정을 하였다. 결과는 반대측 비수술 사지에 대한 수술 사지에 실린 체중의 백분율로 표현하였다.
도 3A는 기능 연구의 결과를 나타낸다. 골관절염 유도 수술을 받은 비처리 마우스는 수술한 뒷다리보다 비수술 뒷다리를 선호하였다(△). 그러나, 뉴트린-3A로 노화 세포를 소거하면 수술을 받은 마우스에서 이러한 효과가 사라졌다(▽).
도 3B, 도 3C 및 도 3D는 이들 실험으로부터 관절 조직의 조직병리를 나타낸다. ACL 수술에 의해 유도된 골관절염은 프로테오글리칸 층의 파괴를 유발하였다. 뉴트린-3A를 사용한 노화 세포의 소거로 이러한 효과가 완전히 사라졌다.
실시예 5: 당뇨망막병증을 위한 모델에서 세놀리틱 작용제의 효능
이 실시예는 눈 뒤쪽 질환, 구체적으로 당뇨망막병증의 치료를 위한 마우스 모델에서 Bcl 저해제의 테스트를 예시한다. 임상 요법에 사용하기 위한 세놀리틱 작용제를 테스트하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 조정될 수 있다.
모델 화합물 UBX1967(Bcl-xL 저해제)의 효능을 마우스 산소-유도 망막증(OIR) 모델에서 연구하였다(Scott and Fruttiger, Eye (2010) 24, 416-421, Oubaha et　al, 2016). C57Bl/6 마우스 새끼들과 이들의 CD1 위탁모를 출생 후 제7일(P7)에서 P12까지 높은 산소 환경(75% O2)에 노출시켰다. P12에, 1% DMSO, 10% Tween-80, 20% PEG-400 중에 제형화된 1㎕의 테스트 화합물(200, 20, 또는 2μM)을 동물에게 유리체내로 주사하고, P17까지 실내 공기로 돌려보냈다. P17에 눈을 적출하고 혈관 염색 또는 qRT-PCR을 위해 망막을 절개하였다. 무혈관 또는 신생혈관 영역을 결정하기 위하여, 망막을 편평하게 장착하고, 1mM CaCl2 중에 1:100으로 희석된 아이소렉틴 B4(IB4)으로 염색하였다. 노화 마커(예를 들어, Cdkn2a, Cdkn1a, Il6, Vegfa)의 정량적 측정을 위해 qPCR을 수행하였다. RNA를 단리하고 역전사에 의해 cDNA를 생성하였으며, 이를 선택된 전사체의 qRT-PCR에 사용하였다.
도 4A 및 도 4B는 유리체내(intravitreal: IVT) 투여 UBX1967이 모든 용량 수준에서 신생혈관형성 및 맥관소멸의 정도에서 통계적으로 유의한 개선을 초래하였음을 나타낸다.
UBX1967의 효능을 또한 스트렙토조토신(STZ) 모델에서 연구하였다. 6주 내지 7주의 C57BL/6J 마우스를 칭량하고 이의 기준 혈당을 측정하였다(Accu-Chek™, Roche). 마우스에 STZ(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 5일 연속 55 ㎎/㎏으로 복강내 주사하였다. 연령 일치 대조군에는 완충액만 주사하였다. 마지막 STZ 주사 1주일 후에 혈당을 다시 측정하였고, 마우스의 비-공복 혈당이 17 mM(300 ㎎/ℓ)을 초과하는 경우 마우스를 당뇨병으로 간주하였다. STZ 처리 당뇨병 C57BL/6J 마우스에 STZ 투여 8 및 9주 후에 1㎕의 UBX1967(2μM 또는 20μM, 0.015% 폴리솔베이트-80, 0.2% 인산나트륨, 0.75% 염화나트륨 중 현탁액으로 제형화됨, pH 7.2)을 유리체내로 주사하였다. STZ 처리 10주 후에 망막 에반스 블루(Retinal Evans blue) 투과 분석을 수행하였다.
도 4C 및 도 4D는 이 프로토콜에 대한 결과를 나타낸다. UBX1967의 유리체내(IVT) 투여 후 망막 및 맥락막 혈관 누출은 두 가지 용량 수준 모두에서 혈관 투과성을 개선시켰다.
녹내장과 관련된 테스트에서 망막 신경절 세포 손상의 다른 모델을 사용할 수 있으며, 여기서 안압(IOP) 증가는 망막 신경절 세포 손실 및 시신경 손상을 유발하는 것으로 생각된다. 전임상 종에서, 전방 압력은 자기 마이크로비드 폐색(Ito et　al., Vis Exp. 2016 (109): 53731)을 포함한 여러 가지 확립된 모델 및 다른 녹내장 모델(Almasieh and Levin, Annu Rev Vis Sci. 2017)에서 보고된 바와 같이 망막 뉴런 손실을 초래할 수 있다. 추가적으로, 허혈-재관류는 세포 노화를 초래할 수 있는 망막 손상을 유발하는 것으로 입증되었다. 이와 같은 모델에서 망막 노화의 존재는 테스트 화합물의 유리체내 주사 후 세놀리시스(senolysis)의 영향을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
실시예 6: 폐질환 모델에서 세놀리틱 작용제의 효능
이 실시예는 폐질환의 치료를 위한 마우스 모델, 구체적으로 특발성 폐섬유증(IPF)에 대한 모델에서 저해제의 테스트를 예시한다. 임상 요법에 사용하기 위한 Bcl 저해제를 테스트하고 개발하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 조정될 수 있다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에 대한 모델로서, 마우스를 궐련 연기에 노출시켰다.
연기에 노출시킨 마우스에 대한 세놀리틱 작용제의 효과를 노화 세포 소거, 폐 기능, 및 조직병리에 의해 평가하였다.
이 연구에서 사용된 마우스는, US　2017/0027139　A1 및 문헌[Demaria et　al., Dev Cell. 2014 December 22; 31(6): 722-733]에 기재된 3MR 주를 포함한다. 3MR 마우스는 전구약물 간시클로버(GCV)를 세포에 치명적인 화합물로 전환시키는 티미딘 키나제를 인코딩하는 이식유전자를 가진다. 이식유전자의 효소를 p16 프로모터의 제어 하에 배치하여, 상기 효소가 노화 세포에서 특이적으로 발현되도록 한다. GCV를 이용한 마우스의 처리로 노화 세포가 제거된다.
이 연구에서 사용된 다른 마우스는, US　2015/0296755　A1 및 문헌[Baker et　al., Nature 2011 Nov 2;479(7372):232-236]에 기재된 INK-ATTAC 주를 포함한다. INK-ATTAC 마우스는 p16 프로모터의 제어 하에 전환가능한 카스파제 8을 인코딩하는 이식유전자를 가진다. 카스파제 8은 스위치 화합물 AP20187을 이용하여 마우스를 처리함으로써 활성화될 수 있으며, 이에 따라 카스파제 8은 노화 세포에서 아포토시스를 직접적으로 유도하여 마우스로부터 노화 세포를 제거한다.
실험을 수행하기 위해, 6주령 3MR(n=35) 또는 INK-ATTAC(n=35) 마우스를, 챔버에서 측류와 주류 궐련 연기의 조합물을 생성하고, 상기 조합물을 다양한 양의 공기를 연기 혼합물과 혼합시키는 수집 및 혼합 챔버로 이동시키는 자동 제어 궐련 연기생성 기계인 Teague TE-10 시스템으로부터 생성된 궐련 연기에 만성적으로 노출시켰다. 존스 홉킨스 대학(Johns Hopkins University)의 COPD 핵심 시설에서 COPD 프로토콜을 조정하였다(Rangasamy et　al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1248-1259; Yao et　al., 2012, J. Clin. Invest. 122:2032-2045).
마우스는 6개월 동안 주 5일, 하루에 총 6시간의 궐련 연기 노출을 받았다. 각각의 불을 붙인 궐련(궐련당 10.9㎎의 총 입자상물질(TPM), 9.4 ㎎의 타르, 및 0.726㎎의 니코틴, 및 11.9㎎의 일산화탄소를 함유하는 3R4F 연구용 궐련[켄터키 대학교, 미국 켄터키주 렉싱턴 소재])을 2초 동안 피우고, 1분에 한번씩 총 8번 피웠으며, 이때 유속은 1.05 ℓ/분이어서, 35㎤의 표준 퍼프(puff)를 제공하였다. 연기 기계를 조정하여 한 번에 2개의 궐련에서 연기가 나게 함으로써 측류 연기(89%) 및 주류 연기(11%)의 혼합물을 생성하였다. 연기 챔버 대기를 총 부유 미립자(80 내지 120 ㎎/㎥) 및 일산화탄소(350 ppm)에 대해 모니터링하였다.
제7일에 시작하여, (10) INK-ATTAC 및 (10) 3MR 마우스를 각각 AP20187(주당 3회) 또는 간시클로버(5일 연속 처리 후 16일 약물 중단, 실험 종료시까지 반복함)로 처리하였다. 동일한 수의 마우스가 상응하는 비히클을 받았다. 남아있는 30마리의 마우스(15마리의 INK-ATTAC 및 15마리의 3MR)를 각각의 유전자 변형주 5마리씩으로 균일하게 나누어 3가지 상이한 치료 그룹으로 배치하였다. 하나의 그룹(n=10)은 뉴트린-3A(PBS 중 10% DMSO/3% Tween-20™ 중에 용해된 25 ㎎/㎏, 14일 연속 처리 후 14일 약물 중단, 실험 종료시까지 반복함)를 받았다. 하나의 그룹(n=10)은 ABT-263(나비토클락스)(15% DMSO/5% Tween-20 중에 용해된 100 ㎎/㎏, 7일 연속 처리 후 14일 약물 중단, 실험 종료시까지 반복함)을 받고, 마지막 그룹(n=10)은 ABT-263과 동일한 처리 요법 후 ABT-263에 사용한 비히클(15% DMSO/5% Tween-20)만을 받았다. 궐련 연기에 노출되지 않은 추가 70마리의 동물을 실험에 대한 대조군으로서 사용하였다.
2개월의 궐련 연기(CS) 노출 후, 폐 기능을 MouseSTAT PhysioSuite™ 펄스 옥시미터(켄트 사이언티픽(Kent Scientific))를 사용하여 산소 포화도를 모니터링함으로써 평가하였다. 동물을 아이소플루란(1.5%)으로 마취하고 발가락 클립을 적용하였다. 30초 동안 마우스를 모니터링하고 이 기간 동안의 평균 말초 모세관 산호 포화도(SpO2) 측정값을 계산하였다.
도 5는 결과를 나타낸다. AP2018, 간시클로버, ABT-263(나비토클락스), 또는 뉴트린-3A를 통한 노화 세포의 소거는 비처리 대조군과 비교하여 2개월의 궐련 연기 노출 후 마우스에서 SpO2 수준의 통계적으로 유의한 증가를 초래하였다.
실시예 7: 전신투여될 때 죽상동맥경화증에서 세놀리틱 작용제의 효능
이 실시예는 죽상동맥경화증의 치료를 위한 마우스 모델에서 MDM2 저해제의 테스트를 예시한다. 테스트 화합물을 국소보다는 전신으로 투여한다. 이 모델은 저밀도 지단백질에 대한 수용체가 결핍된 LDLR-/- 마우스주에서 수행된다. 본 명세서에 기재된 실험은 임상 요법에 사용하기 위한 다른 종류의 저해제를 테스트하고 개발하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 조정될 수 있다.
두 그룹의 LDLR-/- 마우스(10주령)에게 제0주에서 시작하여 연구 전체에 걸쳐 지방에서 42%의 칼로리를 가지는 고지방 식이(HFD)(할란 테크라드(Harlan Teklad) TD.88137)를 공급한다. 두 그룹의 LDLR-/- 마우스(10주령)에게 정상적인 사료(-HFD)를 공급한다. 제0주 내지 제2주에, 한 그룹의 HFD 마우스와 -HFD 마우스를 뉴트린-3A(25 ㎎/㎏, 복강내)로 처리한다. 하나의 처리 사이클은 14일 처리, 14일 휴식이다. 한 그룹의 HFD 마우스 및 한 그룹의 -HFD 마우스에 비히클을 투여한다. 제4주(시점 1)에, 한 그룹의 마우스를 희생시키고 플라크 중 노화 세포의 존재를 평가한다. 남아있는 마우스의 일부에 대해, 뉴트린-3A 및 비히클 투여를 제4주 내지 제6주에 반복한다. 제8주(시점 2)에, 마우스를 희생시키고 플라크 중 노화 세포의 존재를 평가한다. 나머지 마우스를 제8주 내지 제10주에 뉴트린-3A 또는 비히클로 처리한다. 제12주(시점 3)에, 마우스를 희생시키고 플라크의 수준 및 플라크 중 노화 세포의 수를 평가한다.
-HFD를 공급한 마우스와 비교해서, HFD를 공급하고 뉴트린-3A 또는 비히클로 처리한 LDLR-/- 마우스에서 혈장 지질 수준을 시점 1에서 측정한다(그룹당 n=3). 혈장을 오후 중반에 수집하고 순환 지질 및 지단백질에 대해 분석하였다.
시점 1의 종료시, HFD를 공급하고 뉴트린-3A 또는 비히클로 처리한 LDLR-/- 마우스를 희생시키고(모든 그룹, n=3), SASP 인자 및 노화 세포 마커의 RT-PCR 분석을 위해 대동맥궁을 절개하였다. 값을 GAPDH에 대해 정규화하고 정상 식이 중인 연령 일치, 비히클-처리 LDLR-/- 마우스에 대한 배수 변화로 표현하였다. 데이터는 HFD를 공급한 LDLR-/- 마우스에서 뉴트린-3A를 이용한 노화 세포의 소거가 한번의 처리 사이클 후 여러 SASP 인자 및 노화 세포 마커인 MMP3, MMP13, PAI1, p21, IGFBP2, IL-1A, 및 IL-1B의 발현을 감소시켰음을 나타낸다.
시점 2의 종료시, HFD를 공급하고 뉴트린-3A 또는 비히클로 처리한 LDLR-/- 마우스(모든 그룹에 대해 n=3)를 희생시키고, SASP 인자 및 노화 세포 마커의 RT-PCR 분석을 위해 대동맥궁을 절개하였다. 값을 GAPDH에 대해 정규화하고 정상 식이 중인 연령 일치, 비히클-처리 LDLR-/- 마우스에 대한 배수 변화로 표현하였다. 데이터는 HFD 마우스 내 대동맥궁에서 일부 SASP 인자 및 노화 세포 마커의 발현을 나타낸다. HFD를 공급한 LDLR-/- 마우스에서 뉴트린-3A의 다중 처리 사이클을 이용한 노화 세포의 소거는 대부분 마커의 발현을 감소시켰다.
시점 3의 종료시, HFD를 공급하고 뉴트린-3A 또는 비히클로 처리한 LDLR-/- 마우스(모든 그룹에 대해 n=3)를 희생시키고, 대동맥을 절개하고 수단(Sudan) IV로 염색하여 지질의 존재를 검출하였다. 마우스의 체성분을 MRI로 분석하고, 순환 혈액 세포를 Hemavet™로 계수하였다.
도 6은 결과를 나타낸다. 뉴트린-3A를 이용한 처리는 하행 대동맥에서 플라크가 덮는 표면적을 약 45%만큼 감소시켰다. 혈소판 및 림프구 수는 뉴트린-3A와 비히클 처리 마우스 간에 동등하였다. 뉴트린-3A를 이용한 처리는 또한 고지방 식이를 공급한 마우스에서 질량과 체지방 구성을 감소시켰다.
실시예 8: 시험관내 및 생체내에서 암 세포에 대한 세포독성의 측정
인터류킨-3(IL-3)-의존성 전림프구성 FL5.12 뮤린 세포주에서 화합물의 세포 활성을 평가할 수 있다. IL-3의 회수는 프로아포토시스 인자(proapoptotic factor)인 Bim 및 Puma의 상향 조절에 의해 FL5.12 아포토시스를 유도한다. Bcl-2(FL5.12-Bcl-2) 또는 Bcl-xL(FL5.12-Bcl-xL)의 과발현은 Bim 및 Puma의 격리에 의한 IL-3 회수의 영향으로부터 보호한다. 화합물은 Bcl-2 또는 Bcl-xL의 과발현에 의해 제공되는 보호를 역전시킨다. 화합물은 FL5.12 세포가 프로아포토시스 자극을 받지 않는 IL-3의 존재 하에 세포 사멸을 유도하는 데 효과적이지 않다. IL-3 회수 하에 FL5.12-Bcl-2 또는 FL5.12-Bcl-xL 세포를 살해하는 화합물의 능력은 카스파제 저해제 ZVAD의 존재 하에 약화될 수 있으며, 이는 세포 살해가 카스파제 의존성임을 나타낸다.
BH3 모방 유도 세포독성이 세포내 Bcl-2 패밀리 단백질-단백질 상호작용의 파괴에 기인할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 공동-면역침전 연구를 수행할 수 있다. 화합물은 FL5.12-Bcl-xL 세포에서 Bim:Bcl-xL 상호작용의 용량-의존적 감소를 유도한다. FL5.12-Bcl-2 세포에서 Bim:Bcl-2 복합체의 파괴에 대해서도 유사한 결과가 또한 관찰되며, 이는 화합물이 Bim과 같은 프로아포토시스 인자를 격리시키는 Bcl-xL 및 Bcl-2의 능력을 약화시킴으로써 IL-3-의존적 세포 사멸을 회복시킨다는 것을 나타낸다.
암 세포를 특이적으로 살해하는 본 개시내용에 열거된 화합물의 능력의 테스트는 다른 확립된 세포주를 사용하여 유사한 분석으로 테스트될 수 있다. 상기 다른 확립된 세포주는 헬라(HeLa) 세포, OVCAR-3, LNCaP, 및 밀리포어 시그마(Millipore Sigma; 미국 매사추세츠주 벌린턴 소재)로부터 입수 가능한 임의의 인증된 암 세포주를 포함한다. 화합물이 동일한 조직 유형의 비-암성 세포보다 적어도 5배 낮은, 바람직하게는 25배 또는 100배 낮은 농도에서 세포에 대해 치명적이면 화합물은 암 세포를 특이적으로 살해한다. 대조군 세포는 테스트 중인 암 세포주와 유사한 형태학적 특성 및 세포 표면 마커를 가지지만, 암의 징후는 없다.
생체내에서, 민감성 SCLC(H889) 및 혈액학적 (RS4;11) 세포주로부터 확립된 측면 이종이식 모델에서, 또는 사용자가 특히 관심을 갖는 암 유형에 따라 다른 종양-형성 암 세포주를 사용하여 화합물을 평가한다. 경구 또는 정맥내 투여시, 화합물은 H889(SCLC) 또는 RS4;11(ALL) 종양을 보유하는 모든 동물에서 처리 종료 후 몇 주 동안 지속되는 빠르고 완전한 종양 반응(CR)을 유도한다. H146 SCLC 종양을 보유하는 마우스의 유사한 처리는 동물에서 빠른 퇴행을 유도할 수 있다.
실시예 9: 합성
본 발명의 화합물은 도 1에 나타낸 합성 도식을 사용하거나 적용함으로써 제조될 수 있다.
실시예 10: 모델 화합물의 생화학적 및 세포 활성
시험관내 분석에서 Bcl-2에 대한 리간드 결합의 저해에 대하여 화합물을 평가하였다. Bcl 동형단백질에 대한 펩타이드 리간드 결합의 저해를 결정하기 위한 동종 분석인 실시에 1에 기재된 방법에 따라 직접 결합 분석에서 Bcl-xL 활성의 저해에 대하여 화합물을 평가하였다. 선택된 화합물에 대해 얻은 EC50 값은 표 2A 및 표 2B에 표시되어 있다.
Figure 112023003352653-pct00050

Figure 112023003352653-pct00051

Figure 112023003352653-pct00052
실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 인간 세포에서의 노화 세포 살해 활성에 대하여 화합물을 평가하였다. 세포주는 인간 기관지 상피(HBE) 세포, 소기도 상피(SAE) 세포, 및 인간 망막 미세혈관 내피(HRMEC) 세포였다. 이와 같은 세포 유형은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 각각 수탁 번호 CRL-2741, PCS-301-010, 및 PCS-1101-010으로 입수할 수 있다.
3가지 상이한 세포주에서 선택된 화합물에 대해 수득한 LD50 값은 표 3A 및 표 3B에 표시되어 있다.
Figure 112023003352653-pct00053
Figure 112023003352653-pct00054

Figure 112023003352653-pct00055
Figure 112020139363786-pct00027
본 개시내용에서 제시된 여러 가설은 독자가 본 발명의 다양한 양태를 이해할 수 있는 전제를 제공한다. 이러한 전제는 독자의 지적 풍부함을 위해 제공된다. 본 발명의 실시는 가설의 상세한 이해 또는 적용을 요구하지 않는다. 달리 언급된 경우를 제외하고, 본 개시내용에서 제시된 가설의 특성은 청구된 발명의 적용 또는 실시를 제한하지 않는다.
예를 들어, 노화 세포의 제거가 명시적으로 요구되는 경우를 제외하고, 화합물은 노화 세포에 대한 화합물의 효과에 관계없이 기재된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용에 언급된 많은 노화-관련 병태가 주로 노인 환자에서 발생하지만, 노화 세포의 발생과 노화 세포가 매개하는 병태생리는 다른 사건, 예컨대 방사선 조사, 다른 유형의 조직 손상, 다른 유형의 질환, 및 유전적 이상으로 생길 수 있다. 본 발명은 달리 명시적으로 나타내거나 요구하지 않는 한, 나타낸 병태를 가지는 모든 연령의 환자에 대하여 실시될 수 있다.
본 개시내용의 화합물의 작용 메커니즘에 대한 논의는 또한 독자의 지적 풍부함을 위해 제공되며, 어떠한 제한을 의미하는 것이 아니다. 달리 언급된 경우를 제외하고, 화합물이 표적 세포 내부 또는 치료된 대상체에서 어떻게 작용하는지에 관계없이, 하기 청구된 바와 같이 화합물은 노화 또는 암 세포를 제거하는 데 또는 질환 상태의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시내용에 언급된 화합물 및 조성물이 노화 세포를 제거하고 노화-연관 병태 및 암을 치료하는 맥락에서 예시되지만, 본 명세서에 기재된 신규한 화합물 및 이의 유도체는 실험실 용도, 노화-관련 병태의 치료, 자동차 윤활유로서, 및 진단용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 목적을 위해 제조될 수 있다.
본 발명이 구체적인 실시예 및 예시를 참조하여 기재되었지만, 일상적인 개발 및 최적화의 문제로서 그리고 당업자의 이해 범위 내에서 특정 상황 또는 의도된 사용에 맞추기 위해 변경이 가해질 수 있고 균등물로 대체될 수 있으며, 이에 의해 청구되는 것 및 이의 균등물의 범주를 벗어나지 않고 본 발명의 이점을 달성할 수 있다.
본 명세서에 제시된 본 발명의 다른 기술적 양태는 추가적인 구별되는 특징을 제공하기 위해 청구범위에 포함될 수 있다.

Claims (34)

  1. 하기의 화합물:
    Figure 112022060210456-pct00043

    (R)-5-(4-클로로페닐)-1-아이소프로필-2-메틸-4-(3-(4-(4-((4-((1-(페닐티오)-4-(4-(포스포노옥시)피페리딘-1-일)부탄-2-일)아미노)-3-((트라이플루오로메틸)설폰일)페닐)설폰아미도)페닐)피페라진-1-일)페닐)-1H-피롤-3-카복실산.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
KR1020207036888A 2018-06-13 2019-06-13 노화 세포에 의해 유발되거나 매개되는 병태의 임상 관리에서의 사용 및 암 치료를 위한 bcl 패밀리 길항제인 아실 설폰아마이드 KR102520382B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862684681P 2018-06-13 2018-06-13
US62/684,681 2018-06-13
PCT/US2019/037067 WO2019241567A1 (en) 2018-06-13 2019-06-13 Acyl sulfonamides that are bcl family antagonists for use in clinical management of conditions caused or mediated by senescent cells and for treating cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210020930A KR20210020930A (ko) 2021-02-24
KR102520382B1 true KR102520382B1 (ko) 2023-04-11

Family

ID=68841874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207036888A KR102520382B1 (ko) 2018-06-13 2019-06-13 노화 세포에 의해 유발되거나 매개되는 병태의 임상 관리에서의 사용 및 암 치료를 위한 bcl 패밀리 길항제인 아실 설폰아마이드

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20200354336A9 (ko)
EP (2) EP3807245B1 (ko)
JP (2) JP2021528392A (ko)
KR (1) KR102520382B1 (ko)
CN (1) CN112469696A (ko)
AU (1) AU2019287528A1 (ko)
CA (1) CA3101878A1 (ko)
ES (1) ES2965890T3 (ko)
WO (1) WO2019241567A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4244231A1 (en) * 2020-11-10 2023-09-20 Unity Biotechnology, Inc. Crystalline solid meglumine salt inhibitor of bcl and methods of making and using same
CA3215235A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Sharon KLIER Methods of treating retinal vasculopathies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127135A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Unity Biotechnology, Inc. Compounds and uses in treatment of senescence-associated conditons

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1685140A4 (en) * 2003-11-18 2009-02-25 Novogen Res Pty Ltd PRODRUGS BASED ON ISOFLAVONOIDS, COMPOSITIONS THEREOF AND THERAPEUTIC PROCESSES INVOLVING THEM
US8563735B2 (en) 2008-12-05 2013-10-22 Abbvie Inc. Bcl-2-selective apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune diseases
US9006284B2 (en) * 2009-08-27 2015-04-14 Bionomics Limited Combination therapy for treating proliferative diseases
TWI535712B (zh) 2010-08-06 2016-06-01 阿斯特捷利康公司 化合物
AU2012209295B2 (en) 2011-01-25 2016-06-30 The Regents Of The University Of Michigan Bcl-2/Bcl-xL inhibitors and therapeutic methods using the same
WO2012177927A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research Transgenic animals capable of being induced to delete senescent cells
US9901080B2 (en) 2012-08-23 2018-02-27 Buck Institute For Research On Aging Transgenic mouse having a transgene that converts a prodrug into a cytotoxic compound in senescent cells
US20160038503A1 (en) 2012-11-21 2016-02-11 David Richard Methods and compositions useful for treating diseases involving bcl-2 family proteins with isoquinoline and quinoline derivatives
EP3689886A1 (en) * 2013-01-16 2020-08-05 The Regents of The University of Michigan Bcl-2/bcl-xl inhibitors and their use in the treatment of cancer
BR112015026702A2 (pt) 2013-04-21 2018-02-06 Yeda Res And Developmente Co Ltd métodos de extermínio de células senescentes
SG10201805670QA (en) 2014-01-28 2018-08-30 Buck Inst Res Aging Methods and compositions for killing senescent cells and for treating senescence-associated diseases and disorders
WO2015116735A1 (en) 2014-01-28 2015-08-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and combinations for killing senescent cells and for treating senescence-associated diseases and disorders
EP3139942B1 (en) 2014-05-05 2019-12-18 Bioventures, Llc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING ANTIAPOPTOTIC Bcl-2 PROTEINS AS ANTI-AGING AGENTS
US20180000816A1 (en) 2015-02-06 2018-01-04 Unity Biotechnology, Inc. Use of a Heterocyclic Bcl-xL Inhibitor and Related Analogs for Removing Senescent Cells in the Treatment of Eye Diseases and Other Age-Related Conditions
US10195213B2 (en) 2015-03-13 2019-02-05 Unity Biotechnology, Inc. Chemical entities that kill senescent cells for use in treating age-related disease
WO2016185481A2 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method of targeting senescent cells
WO2019033122A1 (en) * 2017-08-11 2019-02-14 Unity Biotechnology, Inc. TREATMENT OF PULMONARY DISEASES USING PHARMACEUTICAL AGENTS THAT ELIMINATE SENESCENT CELLS
EP3441069B1 (en) 2017-08-11 2023-04-05 Unity Biotechnology, Inc. Treatment of diabetic retinopathy using pharmaceutical agents that eliminate senescent cells
US10588916B2 (en) 2017-10-31 2020-03-17 Unity Biotechnology, Inc. Technology to inhibit vascular changes that lead to vision loss in the eye

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127135A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Unity Biotechnology, Inc. Compounds and uses in treatment of senescence-associated conditons

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
참고문헌(Prodrug Overview, 2004)*

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021528392A (ja) 2021-10-21
CA3101878A1 (en) 2019-12-19
US20200199103A1 (en) 2020-06-25
JP2023085268A (ja) 2023-06-20
US20220017485A1 (en) 2022-01-20
US20200317640A1 (en) 2020-10-08
KR20210020930A (ko) 2021-02-24
US10981892B2 (en) 2021-04-20
US20200354336A9 (en) 2020-11-12
EP3807245B1 (en) 2023-10-25
EP3807245A1 (en) 2021-04-21
AU2019287528A1 (en) 2021-01-28
WO2019241567A1 (en) 2019-12-19
EP4335516A3 (en) 2024-05-01
ES2965890T3 (es) 2024-04-17
EP4335516A2 (en) 2024-03-13
EP3807245A4 (en) 2021-07-07
CN112469696A (zh) 2021-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190175623A1 (en) Chemical compounds for treating atherosclerosis by stabilizing atherosclerotic plaques or delaying atherogenesis
JP2023085268A (ja) 老化細胞によって引き起こされるかまたは媒介される状態の臨床管理における使用のためおよびがんを治療するための、Ｂｃｌファミリーアンタゴニストであるアシルスルホンアミド
US10703745B2 (en) Acyl phosphonamidates and acyl benzylamines that are Bcl family antagonists for use in clinical management of conditions caused or mediated by senescent cells and for treating cancer
US20200392105A1 (en) Acyl Sulfonamides that are BCL Family Antagonists for Use in Clinical Management of Conditions Caused or Mediated by Senescent Cells and for Treating Cancer
US20210070788A1 (en) Phospholidines that are Bcl Family Antagonists for Use in Clinical Management of Conditions Caused or Mediated by Senescent Cells and for Treating Cancer
US10738042B2 (en) Phosphonamidates that are Bcl family antagonists for use in clinical management of conditions caused or mediated by senescent cells and for treating cancer
CA3043103C (en) Peptide-based proteasome inhibitors for treating conditions mediated by senescent cells and for treating cancer

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant