KR102517033B1 - Endothelin receptor antagonist- encapsulated nanoparticle and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same as an active ingredient - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입한 나노입자, 및 이의 암에 대한 치료 용도와 항암제의 항암 효과 증진 용도에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 암조직에 축적되어 엔도텔린 수용체 길항제를 방출하게 되고, 종양 미세환경에서 주요한 역할을 하는 종양 관련 섬유아세포, 내피세포 및 암세포에 동시에 작용하여, 섬유화 과정 억제와 세포외 기질의 생성 억제를 통하여 종양 내 미세환경을 제어함으로써 면역관문 억제제와 같은 항암제의 반응률과 치료 효과를 현저히 증진시킬 수 있다.The present invention relates to nanoparticles encapsulated with an endothelin receptor antagonist, and uses thereof to treat cancer and enhance anticancer effects of anticancer agents. The nanoparticles of the present invention accumulate in cancer tissues to release endothelin receptor antagonists, and simultaneously act on tumor-related fibroblasts, endothelial cells, and cancer cells that play a major role in the tumor microenvironment, inhibiting the fibrotic process and improving the extracellular matrix. By controlling the intratumoral microenvironment through suppression of production, the response rate and therapeutic effect of anticancer drugs such as immune checkpoint inhibitors can be remarkably improved.

Description

엔도텔린 수용체 길항제를 봉입한 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Endothelin receptor antagonist- encapsulated nanoparticle and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same as an active ingredient}Endothelin receptor antagonist-encapsulated nanoparticle and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same as an active ingredient}

본 발명은 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입한 나노입자, 및 이의 암에 대한 치료 용도와 항암제의 항암 효과 증진 용도에 관한 것이다.The present invention relates to nanoparticles encapsulated with an endothelin receptor antagonist, and uses thereof to treat cancer and enhance anticancer effects of anticancer agents.

최근 항암 치료 방법은 항암화학요법에서 체내 면역체계를 활성화시킴으로써 면역세포가 암세포를 공격하도록 하는 면역항암요법(Cancer immunotherapy)으로 패러다임이 변화하고 있으며, 이러한 면역항암요법은 종양의 다양한 비정상적인 특징들을 동시에 타겟 할 수 있으며, 장기적인 치료 효과를 나타낸다는 장점이 있다. 면역항암 치료제는 크게 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitor), 면역세포 치료제, 치료용 항체 및 항암 백신 등으로 분류할 수 있으며, 특히 면역관문 억제제는 적용 가능한 암종이 다양하고, 부작용이 적으며, 고령 환자에게도 투여 가능하여 임상에서 각광받고 있다.Recently, the paradigm of anticancer treatment is changing from chemotherapy to cancer immunotherapy, which activates the body's immune system to allow immune cells to attack cancer cells. This immunotherapy targets various abnormal characteristics of tumors at the same time. It can be done, and has the advantage of showing long-term therapeutic effects. Immuno-oncology drugs can be largely classified into immune checkpoint inhibitors, immune cell therapies, therapeutic antibodies, and anti-cancer vaccines. It can also be administered to patients and is in the spotlight in clinical practice.

면역관문 억제제를 이용한 면역항암요법 또는 항암면역치료란 암세포의 생존을 위한 면역 회피 기전으로 발현되는 PD-1, PD-L1, CTLA-4 등의 면역관문 분자를 해당 항체(anti-PD-1 항체, anti-PD-L1 항체 등)를 사용하여 면역 반응 회피신호를 차단시킴으로써 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 방법이다.Immunotherapy or chemoimmunotherapy using immune checkpoint inhibitors is the use of immune checkpoint molecules such as PD-1, PD-L1, and CTLA-4, which are expressed as immune evasion mechanisms for the survival of cancer cells, using the corresponding antibody (anti-PD-1 antibody). , anti-PD-L1 antibody, etc.) to activate T cells to attack cancer cells by blocking immune response avoidance signals.

그러나, 면역관문 억제제의 등장과 함께 생존율 및 치료 효과가 크게 향상되었지만, 15-30%의 소수의 환자들만이 anti-PD-L1/PD-1 항체에 대한 항암 효과를 보이는 한계가 있었다. 면역관문 억제제에 대한 반응성이 없는 환자들에서 T 세포의 감작 및 활성화가 이루어졌으나, T 세포가 종양으로 침투하는 단계에서의 결함이 관찰되었다. 특히, 면역세포가 존재하고 활성화되었더라도 T 세포가 종양의 실질 조직을 통과하지 못하고 종양의 외부에 머무르는 경우, anti-PD-L1/PD-1 항체에 대한 임상적 반응률이 낮게 나타났다. T 세포의 이동은 종양 미세환경(Tumor microenvironment, TME)의 구조에 영향을 받아 종양의 간질이 고밀도로 구성될수록 암조직에 분포하는 T 세포의 수가 적게 관찰되며, 항암면역치료에 대한 반응성 또한 낮은 것으로 보고되었다. 따라서, 면역관문 억제제에 대한 반응률을 높이기 위해서는 활성화된 T 세포가 종양 내부로 효과적으로 이동할 수 있도록, 종양 미세환경을 제어할 수 있는 전략이 필요한 실정이다.However, with the advent of immune checkpoint inhibitors, survival rates and therapeutic effects have greatly improved, but only a small number of patients (15-30%) show anti-cancer effects against anti-PD-L1/PD-1 antibodies. T cell sensitization and activation were achieved in patients who did not respond to immune checkpoint inhibitors, but defects in T cell infiltration into tumors were observed. In particular, even if immune cells are present and activated, when T cells do not pass through the parenchymal tissue of the tumor and remain outside the tumor, the clinical response rate to the anti-PD-L1/PD-1 antibody is low. The migration of T cells is affected by the structure of the tumor microenvironment (TME), and the higher the density of the tumor stroma, the smaller the number of T cells distributed in cancer tissue is observed, and the response to chemoimmunotherapy is also low. reported Therefore, in order to increase the response rate to immune checkpoint inhibitors, there is a need for a strategy capable of controlling the tumor microenvironment so that activated T cells can effectively migrate into the tumor.

대한민국 등록특허 제10-1943230호Republic of Korea Patent No. 10-1943230

이에 본 발명자들은 T 세포나 항암제의 종양 내로의 침투를 저해하는 종양 미세환경의 구성성분을 제어하고, 더불어 암세포의 엑소좀 분비를 억제시킴으로써 면역관문 억제제를 비롯한 항암제에 의한 암 치료 효과를 극대화시킬 수 있는 종양 내 미세환경을 제어할 수 있는 나노입자를 제조하여, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention control the components of the tumor microenvironment that inhibit the penetration of T cells or anticancer agents into tumors, and suppress the secretion of exosomes from cancer cells, thereby maximizing the effect of cancer treatment by anticancer agents including immune checkpoint inhibitors. The present invention was completed by preparing nanoparticles capable of controlling the microenvironment within a tumor.

따라서, 본 발명의 목적은 내부에 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입하는 나노입자를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide nanoparticles encapsulating an endothelin receptor antagonist therein.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the nanoparticles as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for enhancing the anticancer effect of an anticancer agent comprising the nanoparticle as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising the nanoparticles as an active ingredient.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. will be.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함하는 생체적합성의 양친매성 고분자를 포함하고, 내부에 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입하고 있는 것을 특징으로 하는 나노입자를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention comprises a biocompatible amphiphilic polymer comprising a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer, characterized in that the endothelin receptor antagonist is encapsulated therein Provide nanoparticles.

발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔도텔린 수용체 길항제는 엔도텔린 A 수용체(ETA)와 엔도텔린 B 수용체(ETB) 모두에 대하여 길항 작용을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the invention, the endothelin receptor antagonist endothelin A receptor (ET A ) and endothelin B receptor (ET B ) may exhibit an antagonistic action for both, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 암브리센탄(ambrisentan), 설피속사졸(sulfisoxazole), BQ-123, BQ-788, 지보텐탄(zibotentan), 시타센탄(sitaxentan), 아트라센탄(atrasentan), 테조센탄(tezosentan) 및 A192621로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the endothelin receptor antagonist is macitentan, bosentan, ambrisentan, sulfisoxazole, BQ-123, BQ-788, Jibo It may be selected from the group consisting of zibotentan, sitaxentan, atrasentan, tezosentan, and A192621, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 친수성 고분자는 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 마난(mannan), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin), β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 글리코겐(glycogen), 아밀로오스(amylose), 베타글루칸(β-glucan), 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 후코이단(fucoidan), 콘드로이틴(chondroitin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 다당류 고분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the hydrophilic polymer is carboxymethyl dextran, chitosan, gelatin, collagen, mannan, dextran sulfate , α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, hyaluronic acid, alginate, glycogen, amylose, β-glucan , hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, fucoidan, chondroitin, and a polysaccharide polymer selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드, 폴리옥사졸린, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리비닐알코올, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리티로신, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the hydrophilic polymer is polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyoxazoline, poly(N-vinylpyrrolidone), polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, polyserine, It may be selected from the group consisting of polythreonine, polytyrosine, polylysine, polyarginine, polyhistidine, polyaspartic acid, polyglutamic acid, and combinations thereof, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 소수성 고분자는 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid), 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카보네이트, 폴리오르소에스테르, 소수성 폴리아미노산, 소수성 비닐계열 고분자 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the hydrophobic polymer is a polylactic acid-glycolic acid copolymer (Poly (lactic-co-glycolic acid), polyphosphazene, polylactide, polycaprolactone, polyanhydride, It may be selected from the group consisting of polymalic acid, polyalkylcyanoacrylate, polyhydroxybutyrate, polycarbonate, polyorthoester, hydrophobic polyamino acid, hydrophobic vinyl-based polymer, and combinations thereof, but is not limited thereto. no.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 암 미세환경을 제어하여 T 세포 또는 항암제의 종양 내 침투를 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the nanoparticles can control the cancer microenvironment to enhance the penetration of T cells or anticancer drugs into tumors, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 암 미세환경의 제어는 암 미세환경의 세포외 기질의 분해; 암 미세환경의 세포외 기질의 생성 억제; 종양 관련 섬유아세포(Cancer-associated fibroblast)의 발현 억제; 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the control of the cancer microenvironment comprises degradation of the extracellular matrix of the cancer microenvironment; inhibiting the production of extracellular matrix in the cancer microenvironment; inhibition of expression of cancer-associated fibroblast; Or it may be a combination thereof, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 내부에 봉입한 엔도텔린 수용체 길항제를 암조직에서 방출하여 암세포의 엑소좀 분비를 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the nanoparticles can release the endothelin receptor antagonist encapsulated therein from cancer tissue to inhibit secretion of exosomes from cancer cells, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the nanoparticles as an active ingredient.

나아가, 본 발명은 상기 나노입자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering the nanoparticle to a subject in need thereof.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 나노입자의 암에 대한 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a preventive, ameliorative or therapeutic use of the nanoparticles for cancer.

더욱이, 본 발명은 암의 예방, 개선 또는 치료용 제제의 제조를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공한다.Moreover, the present invention provides the use of the nanoparticles for the manufacture of an agent for preventing, ameliorating or treating cancer.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the cancer is lung cancer, gastric cancer, glioma, liver cancer, melanoma, kidney cancer, urothelial cancer, head and neck cancer, Merkel-cell carcinoma, prostate cancer, hematological cancer, breast cancer, It may be selected from the group consisting of colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, brain cancer, ovarian cancer, bladder cancer, bronchial cancer, skin cancer, cervical cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, bone cancer, and combinations thereof, but is not limited thereto no.

또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing the anti-cancer effect of an anti-cancer agent comprising the nanoparticle as an active ingredient.

나아가, 본 발명은 상기 나노입자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항암제의 항암 효과 증진방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for enhancing the anticancer effect of an anticancer agent comprising the step of administering the nanoparticle to a subject in need thereof.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 나노입자의 항암제의 항암 효과 증진 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of enhancing the anticancer effect of the nanoparticles of an anticancer agent.

더욱이, 본 발명은 항암제의 항암 효과 증진용 제제의 제조를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공한다.Moreover, the present invention provides the use of the nanoparticles for the manufacture of an agent for enhancing the anti-cancer effect of an anti-cancer agent.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암제는 항체, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the anticancer agent may be selected from the group consisting of antibodies, proteins, peptides, polypeptides and compounds, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항암제는 면역관문 억제제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the anticancer agent may be an immune checkpoint inhibitor, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-1, PD-L1 및 CTLA-4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역관문 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the immune checkpoint inhibitor may be an antibody that specifically binds to one or more immune checkpoint proteins selected from the group consisting of PD-1, PD-L1 and CTLA-4, but is limited thereto It is not.

또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising the nanoparticles as an active ingredient.

나아가, 본 발명은 상기 나노입자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis comprising administering the nanoparticle to a subject in need thereof.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 나노입자의 암 전이 억제 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides the use of the nanoparticles for inhibiting cancer metastasis.

더욱이, 본 발명은 암 전이 억제용 제제의 제조를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공한다.Moreover, the present invention provides the use of the nanoparticles for the manufacture of an agent for inhibiting cancer metastasis.

본 발명의 나노입자는 암조직에 축적되어 엔도텔린 수용체 길항제를 방출하게 되고, 종양 미세환경에서 주요한 역할을 하는 종양 관련 섬유아세포, 내피세포 및 암세포에 동시에 작용하여, 섬유화 과정 억제와 세포외 기질의 생성 억제를 통하여 종양 내 미세환경을 제어함으로써 면역관문 억제제와 같은 항암제의 반응률과 치료 효과를 현저히 증진시킬 수 있다.The nanoparticles of the present invention accumulate in cancer tissues to release endothelin receptor antagonists, and simultaneously act on tumor-related fibroblasts, endothelial cells, and cancer cells that play a major role in the tumor microenvironment, inhibiting the fibrotic process and improving the extracellular matrix. By controlling the intratumoral microenvironment through suppression of production, the response rate and therapeutic effect of anticancer drugs such as immune checkpoint inhibitors can be remarkably improved.

도 1a 내지 1c는 본 발명의 나노입자의 물리화학적 특성(도 1a 및 1b) 및 세포독성(도 1c) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 내지 2f는 본 발명의 나노입자의 항암 치료 효능을 나타낸 도로서, 도 2a는 실험 스케줄을 나타내며, 도 2b는 종양 접종 후 시간 경과에 따른 각 물질 투여군에서의 종양 부피 변화를 보여주고, 도 2c는 종양 접종 후 시간 경과에 따른 각 물질 투여군의 체중 변화를 보여주며, 도 2d는 각 물질이 정맥 투여된 암 동물모델에 있어, 각 동물 개체 별 종양 부피의 변화를 보여주고, 도 2e는 각 물질 투여군의 종양 무게 분포를 보여주며, 도 2f는 암 동물모델의 주요 장기 및 암 조직에 대하여 H&E 염색을 실시하여 얻은 각 물질 투여에 따른 병리 조직학적 평가 결과를 보여준다.
도 3a 내지 3e는 종양 미세환경의 세포외 기질 성분과 종양 관련 섬유아세포에 대한 각 물질 투여군의 제어능을 보여주는 도로서, 도 3a 및 3b는 각 물질 투여군의 암 조직을 masson's trichrome 염색하여 확인한 콜라겐 생성 영역을 보여주며, 도 3c는 각 물질 투여군의 암조직에서 파이브로넥틴의 형성 정도를 면역형광법을 이용하여 확인한 결과를 보여주고, 도 3d 및 3e는 암조직에서 종양 관련 섬유아세포의 발현 정도를 면역형광법을 이용하여 확인한 결과를 보여준다.
도 4a 내지 4e는 본 발명의 나노입자의 종양 미세환경 제어능을 나타낸 도로서, 도 4a 및 4b는 각 물질 투여군의 암조직의 저산소 환경 정도를 면역형광법을 이용하여 확인한 결과를 보여주고, 도 4c는 암조직을 절단하였을 때 벌어지는 정도에 비례하는 고체 스트레스에 대한 결과를 나타내며, 도 4d는 각 물질 투여군에서 측정한 암조직 내 TGF-β1의 양을 보여주고, 도 4e는 종양 동물 모델에서 채취한 혈액에서 엑소좀을 분리하고, 엑소좀 PD-L1의 수준을 ELISA로 측정한 결과를 보여준다.
도 5a 내지 5c는 본 발명의 나노입자 및 면역관문 억제제의 병용 투여 이후 체내 암 조직 내 T 세포 군집에 대한 분석 결과를 나타낸 도로서, 도 5a 및 5b는 각 물질 투여군에서의 암조직의 T 세포 군집의 특성을 보여주며, 도 5c는 각 물질 투여군의 암조직에서의 T 세포의 분포를 면역형광법을 이용하여 확인한 결과를 보여준다.
도 2 내지 5에서 각 물질 투여군은 다음과 같다:
DPBS: 식염수 투여군,
MCT: 엔도텔린 수용체 길항제 약물 투여군,
M-NP: 본 발명의 엔도텔린 수용체 길항제-봉입 나노입자 투여군,
Ab: 항 PD-1 항체 투여군,
MCT+Ab: 엔도텔린 수용체 길항제 약물과 항 PD-1 항체의 병용 투여군,
M-NP+Ab: 본 발명의 엔도텔린 수용체 길항제-봉입 나노입자와 항 PD-1 항체의 병용 투여군.
도 6은 본 발명의 종양 내 미세환경을 제어하는 엔도텔린 수용체 길항제-봉입 나노입자의 개요도 및 이를 활용한 면역관문 억제제 기반의 항암 치료방법을 보여주는 도이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 나노입자의 암 전이 억제 효과를 보여주는 도로서, 도 7a는 세포 이동 분석(migration assay) 결과를 보여주고, 도 7b는 세포 침윤 분석(invasion assay) 결과를 보여준다.1a to 1c are diagrams showing the results of analysis of physicochemical properties (FIGS. 1a and 1b) and cytotoxicity (FIG. 1c) of the nanoparticles of the present invention.
Figures 2a to 2f show the anticancer treatment efficacy of the nanoparticles of the present invention, Figure 2a shows the experimental schedule, Figure 2b shows the change in tumor volume in each substance administration group over time after tumor inoculation, 2c shows the change in body weight of each substance administration group over time after tumor inoculation, and FIG. 2d shows the change in tumor volume for each individual animal in a cancer animal model in which each substance was intravenously administered. The tumor weight distribution of the substance administration group is shown, and FIG. 2f shows the histopathological evaluation results according to each substance administration obtained by performing H&E staining on major organs and cancer tissues of the cancer animal model.
3a to 3e are diagrams showing control ability of each material administration group for tumor microenvironmental extracellular matrix components and tumor-related fibroblasts, and FIGS. 3a and 3b are collagen production confirmed by masson's trichrome staining of cancer tissues of each material administration group. Fig. 3c shows the result of confirming the degree of fibronectin formation in cancer tissue of each substance administration group using immunofluorescence, and Figs. 3d and 3e show the expression level of tumor-related fibroblasts in cancer tissue. The results confirmed using the fluorescence method are shown.
4a to 4e are diagrams showing the tumor microenvironment control ability of the nanoparticles of the present invention, and FIGS. 4a and 4b show the results of confirming the hypoxic environment of cancer tissue in each substance administration group using immunofluorescence, and FIG. 4c Shows the results of solid stress proportional to the degree of spread when cancer tissue is cut, Figure 4d shows the amount of TGF-β1 in cancer tissue measured in each substance administration group, Figure 4e is collected from a tumor animal model Exosomes are isolated from blood and the level of exosome PD-L1 is measured by ELISA.
5a to 5c are diagrams showing the analysis results of T cell populations in cancer tissues in vivo after combined administration of the nanoparticles of the present invention and immune checkpoint inhibitors, and FIGS. 5a and 5b are T cell populations of cancer tissues in each substance administration group. 5c shows the results of confirming the distribution of T cells in cancer tissues of each substance administration group using immunofluorescence.
2 to 5, each substance administration group is as follows:
DPBS: saline administration group,
MCT: endothelin receptor antagonist drug administration group,
M-NP: endothelin receptor antagonist-encapsulated nanoparticle administration group of the present invention,
Ab: anti-PD-1 antibody administration group,
MCT+Ab: endothelin receptor antagonist drug and anti-PD-1 antibody combined administration group,
M-NP+Ab: combination administration group of the endothelin receptor antagonist-encapsulated nanoparticles of the present invention and anti-PD-1 antibody.
6 is a schematic diagram of the endothelin receptor antagonist-encapsulated nanoparticles controlling the intratumoral microenvironment of the present invention and a diagram showing an immune checkpoint inhibitor-based anti-cancer treatment method using the same.
Figures 7a and 7b are diagrams showing the cancer metastasis inhibitory effect of the nanoparticles of the present invention, Figure 7a shows the result of cell migration assay (migration assay), Figure 7b shows the result of cell invasion assay (invasion assay).

본 발명은 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함하는 생체적합성의 양친매성 고분자를 포함하고, 내부에 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입하고 있는 것을 특징으로 하는 나노입자를 제공한다.The present invention provides nanoparticles comprising a biocompatible amphiphilic polymer including a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer, and encapsulating an endothelin receptor antagonist therein.

본 명세서에서 사용된 용어, "엔도텔린 수용체 길항제"란 생체 내의 엔도텔린 수용체 분자에 작용하여 이의 기능을 억제 또는 저해하는 약물을 의미한다.As used herein, the term "endothelin receptor antagonist" means a drug that acts on endothelin receptor molecules in vivo to inhibit or inhibit their functions.

본 발명에 있어서, 상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 암브리센탄(ambrisentan), 설피속사졸(Sulfisoxazole), BQ-123, BQ-788, 지보텐탄(zibotentan), 시타센탄(sitaxentan), 아트라센탄(atrasentan), 테조센탄(tezosentan) 및 A192621로 이루어진 군으로부터 선택된 엔도텔린 수용체 길항제일 수 있다.In the present invention, the endothelin receptor antagonist is macitentan, bosentan, ambrisentan, sulfisoxazole, BQ-123, BQ-788, zibotentan , sitaxentan, atrasentan, tezosentan, and an endothelin receptor antagonist selected from the group consisting of A192621.

본 발명에서는 엔도텔린 수용체 길항제로서 엔도텔린 A 수용체(ETA)와 엔도텔린 B 수용체(ETB) 모두에 대하여 길항 작용을 나타내는 엔도텔린 수용체 길항제를 사용할 수 있다. 예를 들어, ETA와 ETB 모두에 대하여 길항 작용을 나태는 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 테조센탄(tezosentan) 등을 포함한다.In the present invention, as an endothelin receptor antagonist, an endothelin receptor antagonist exhibiting antagonistic action against both the endothelin A receptor (ET A ) and the endothelin B receptor (ET B ) may be used. For example, endothelin receptor antagonists that antagonize both ET A and ET B include macitentan, bosentan, tezosentan, and the like.

본 발명의 나노입자는 생체적합성의 양친매성 고분자로 제조되며, 이의 내부에 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "생체적합성"은 넓은 의미로 목적하는 기능과 생체에 대한 안전성을 겸비한 것을 말하며, 좁은 의미로는 생체에 대한 생물학적 안전성, 즉 독성이 없으며 멸균 가능한 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 상기 "생체적합성의 양친매성 고분자"라 함은 생체에서 목적하는 기능을 발휘하며, 재료 자체의 독성이 없고 멸균 가능한 물질이라고 할 수 있다.The nanoparticles of the present invention are made of a biocompatible amphiphilic polymer, and an endothelin receptor antagonist is encapsulated therein. As used herein, the term "biocompatibility" refers to combining a desired function and safety to a living body in a broad sense, and in a narrow sense means biological safety to a living body, that is, non-toxic and sterilizable. Therefore, in the present invention, the "biocompatible amphiphilic polymer" can be referred to as a material that exhibits a desired function in a living body, has no toxicity, and can be sterilized.

본 발명에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함한다. 상기 친수성 고분자는 다당류 고분자일 수 있으며, 예를 들어, 상기 다당류 고분자는 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 마난(mannan), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin), β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 글리코겐(glycogen), 아밀로오스(amylose), 베타글루칸(β-glucan), 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 후코이단(fucoidan), 콘드로이틴(chondroitin) 및 이들의 조합을 포함한다.In the present invention, the amphiphilic polymer includes a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer. The hydrophilic polymer may be a polysaccharide polymer, for example, the polysaccharide polymer is carboxymethyl dextran, chitosan, gelatin, collagen, mannan, dextran sulfate (dextran sulfate), α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, hyaluronic acid, alginate, glycogen, amylose, beta-glucan ( β-glucan), hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, fucoidan, chondroitin, and combinations thereof.

또한, 상기 친수성 고분자는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드, 폴리옥사졸린, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리비닐알코올, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리티로신, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산 및 이들의 조합을 포함한다.In addition, the hydrophilic polymer may be, for example, polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyoxazoline, poly(N-vinylpyrrolidone), polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, polyserine, polythreonine, polytyrosine, polylysine, polyarginine, polyhistidine, polyaspartic acid, polyglutamic acid, and combinations thereof.

상기에 열거한 친수성 고분자 외에 나노입자 제조에 이용 가능하거나 이용되고 있는 친수성 고분자라면 제한 없이 본 발명의 나노입자 제조에 사용할 수 있다.In addition to the above-listed hydrophilic polymers, any hydrophilic polymer available or being used for the preparation of nanoparticles can be used for the preparation of nanoparticles of the present invention without limitation.

본 발명에 있어서, 상기 소수성 고분자는, 예를 들어, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid), 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카보네이트, 폴리오르소에스테르, 소수성 폴리아미노산, 소수성 비닐계열 고분자 및 이들의 조합을 포함한다. 친수성 고분자와 마찬가지로, 상기에 열거한 소수성 고분자 외에 나노입자 제조에 이용 가능하거나 이용되고 있는 소수성 고분자라면 제한 없이 본 발명의 나노입자 제조에 사용할 수 있다.In the present invention, the hydrophobic polymer is, for example, poly(lactic-co-glycolic acid), polyphosphazene, polylactide, polycaprolactone, polyanhydride, polymalic acids, polyalkylcyanoacrylates, polyhydroxybutyrates, polycarbonates, polyorthoesters, hydrophobic polyamino acids, hydrophobic vinyl-based polymers, and combinations thereof. In addition to the hydrophobic polymer, any hydrophobic polymer available or being used for the preparation of nanoparticles may be used for the preparation of the nanoparticles of the present invention without limitation.

본 발명의 나노입자는 암 미세환경을 제어하여 T 세포 또는 항암제의 종양 내 침투를 증진시킬 수 있다. 이와 같은 T 세포와 항암제의 종양 내 침투를 증진시킴으로써 T 세포와 항암제에 의한 암 세포 사멸 효과를 증진시킬 수 있다.The nanoparticles of the present invention can control the cancer microenvironment and enhance the penetration of T cells or anticancer drugs into tumors. By enhancing the infiltration of such T cells and anticancer agents into the tumor, the cancer cell killing effect by T cells and anticancer agents can be enhanced.

본 발명에 있어서, 상기 암 미세환경의 제어는 암 미세환경의 세포외 기질의 분해; 암 미세환경의 세포외 기질의 생성 억제; 종양 관련 섬유아세포(Cancer-associated fibroblast)의 발현 억제; 또는 이들의 조합일 수 있다.In the present invention, the control of the cancer microenvironment includes degradation of the extracellular matrix of the cancer microenvironment; inhibiting the production of extracellular matrix in the cancer microenvironment; inhibition of expression of cancer-associated fibroblast; or a combination thereof.

또한, 본 발명의 나노입자는 내부에 봉입한 엔도텔린 수용체 길항제를 암조직에서 방출하여 암세포의 엑소좀 분비를 억제할 수 있다. 상기 용어, "엑소좀 분비 억제"는 암의 엑소좀 생성 및/또는 분비의 억제를 의미한다. 암은 엑소좀을 생성 및 분비하며, 분비된 엑소좀은 항암 면역반응을 억제하는데 필요한 단백질 등의 물질(예를 들어, PD-L1)을 포함하고 있다. 이와 같은 암 엑소좀이 분비됨으로써 항암 면역반응이 억제되고, 면역관문 억제제에 의한 치료 효과가 떨어지게 된다. 또한, 엑소좀의 PD-L1은 혈류를 통해 T 세포의 기능을 억제하는 주된 원인으로 알려져 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 종양 동물 모델의 혈액에서 추출한 엑소좀에 존재하는 엑소좀(exosomal) PD-L1의 수준을 측정하였으며, 측정 결과 본 발명의 엔도텔린 수용체 길항제를 봉입하는 나노입자의 투여에 의하여 암 엑소좀의 분비가 저해됨을 확인하였다(실시예 4 참조).In addition, the nanoparticles of the present invention can release the endothelin receptor antagonist encapsulated therein from cancer tissue, thereby suppressing the exosome secretion of cancer cells. The term "inhibition of exosome secretion" means inhibition of exosome production and/or secretion in cancer. Cancer produces and secretes exosomes, and the secreted exosomes contain substances such as proteins (eg, PD-L1) required to suppress anticancer immune responses. The secretion of such cancer exosomes suppresses the anti-cancer immune response and reduces the therapeutic effect of immune checkpoint inhibitors. In addition, exosome PD-L1 is known to be the main cause of suppressing the function of T cells through the bloodstream. In one embodiment of the present invention, the level of exosomal PD-L1 present in exosomes extracted from the blood of tumor animal models was measured, and as a result of the measurement, administration of nanoparticles encapsulating the endothelin receptor antagonist of the present invention It was confirmed that the secretion of cancer exosomes was inhibited by (see Example 4).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the nanoparticles of the present invention as an active ingredient.

또한, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing the anti-cancer effect of an anti-cancer agent comprising the nanoparticles of the present invention as an active ingredient.

또한, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising the nanoparticles of the present invention as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법, 항암제의 항암 효과 증진방법 및 암 전이 억제방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing or treating cancer, a method for enhancing the anticancer effect of an anticancer agent, and a method for inhibiting cancer metastasis, including the step of administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.

본 명세서에서 사용된 용어, "암"은 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 암 조직을 형성하고, 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다. 상기 암은 발생한 부위에 존재하는 원발암과 상기 발생 부위로부터 신체의 다른 장기로 퍼져나간 전이암으로 구분될 수 있다.As used herein, the term "cancer" refers to a problem in the normal division, differentiation, and death control function of cells, which abnormally proliferates, infiltrates surrounding tissues and organs, forms cancerous tissues, and destroys existing structures. means the state of being transformed. The cancer can be divided into primary cancer existing at the site of occurrence and metastatic cancer that has spread to other organs of the body from the site of occurrence.

본 명세서에서 사용된 용어, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.As used herein, the term "individual" means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse , and mammals such as cattle.

본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.In the present invention, "administration" means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.

본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, "prevention" refers to any action that suppresses or delays the onset of a desired disease, and "treatment" means that a desired disease and its associated metabolic abnormalities are improved or treated by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. Any action that is beneficially altered, and "improvement" means any action that reduces a parameter related to a desired disease, for example, the severity of a symptom, by administration of the composition according to the present invention.

본 명세서에서 사용된 용어, "전이(metastasis)"는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다. 전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암 등 각종 암 질환이 유발될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있다.As used herein, the term "metastasis" refers to a state in which a malignant tumor has spread from an organ to other tissues away from it. As a malignant tumor that started in one organ progresses, it spreads from an organ, which is the primary site where it first occurred, to other tissues, and spreading from the primary site to other tissues can be referred to as metastasis. Metastasis can be said to be a phenomenon accompanying the progression of malignant tumors, and metastasis may occur while acquiring new genetic traits as malignant tumor cells proliferate and cancer progresses. Metastasis can occur when tumor cells that have acquired new genetic traits invade blood vessels and lymph glands, circulate along the blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues. Depending on the tissue in which metastasis occurs, various cancer diseases such as liver cancer, kidney cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, and pancreatic cancer may be induced. The composition according to the present invention can prevent and treat the spread of cancer by inhibiting metastasis.

본 명세서에서 사용된 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암 전이를 억제시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "inhibition" refers to any activity that suppresses the cancer metastasis by administration of the composition according to the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 포함한다. 본 발명의 나노입자는 암 미세환경을 제어하여 T 세포의 종양 내 침투를 증진시킴으로써, T 세포에 의한 항암 효과를 얻는 원리에 근거하므로, 본 발명의 약학적 조성물은 암의 종류에 관계 없이 모든 종류의 암에 대하여 효과를 발휘할 수 있다.In the present invention, the cancer is lung cancer, gastric cancer, glioma, liver cancer, melanoma, kidney cancer, urothelial cancer, head and neck cancer, Merkel-cell carcinoma, prostate cancer, hematological cancer, breast cancer, colon cancer, colon cancer , rectal cancer, pancreatic cancer, brain cancer, ovarian cancer, bladder cancer, bronchial cancer, skin cancer, cervical cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, bone cancer, and combinations thereof. Since the nanoparticles of the present invention are based on the principle of obtaining an anticancer effect by T cells by controlling the cancer microenvironment and enhancing the infiltration of T cells into tumors, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for all types of cancer regardless of the type of cancer. may be effective against cancer.

또한, 본 발명의 약학적 조성물을 다른 항암제와 병용 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 나노입자는 암 미세환경을 제어하여 병용 투여된 항암제의 암조직으로의 침투를 증진시키므로, 항암제의 종류에 제한 없이 병용 투여된 항암제의 암 치료 효과를 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물과 병용 투여 가능한 항암제의 범위에는 항체, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 및 화합물 등 암세포 또는 암조직에 작용하여 항암 효과를 나타내는 물질이라면 제한 없이 포함될 수 있다.In addition, when the pharmaceutical composition of the present invention is administered in combination with other anticancer agents, the nanoparticles included in the pharmaceutical composition of the present invention control the cancer microenvironment to enhance the penetration of the co-administered anticancer agent into cancer tissue, It is possible to enhance the cancer treatment effect of concomitantly administered anticancer drugs without limitation to the type of. Therefore, the range of anticancer agents that can be co-administered with the pharmaceutical composition of the present invention can include without limitation any substance that acts on cancer cells or cancer tissues, such as antibodies, proteins, peptides, polypeptides and compounds, to exhibit anticancer effects.

예를 들어, 상기 항암제에는 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신(mitomycin), C 브레오마이신(C Bleomycin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan) 등이 있다.For example, the anticancer agent includes mechloethamine, chlorambucil, phenylalanine, mustard, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (carmustine: BCNU), lomustine (CCNU), streptozotocin, busulfan, thiotepa, cisplatin, carboplatin, dactinomycin: actinomycin D), doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone, plicamycin, mitomycin, C breomycin C Bleomycin, vincristine, vinblastine, paclitaxel, docetaxel, etoposide, teniposide, topotecan and iridothecan ( iridotecan), etc.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "면역관문 억제제"는 하나 이상의 면역관문 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 억제, 방해 또는 조절하는 물질을 나타낸다. 면역관문 단백질은 T 세포의 활성화 또는 기능을 조절한다. 다수의 면역관문 단백질, 예를 들면, PD-1, PD-L1 및 CTLA-4 등이 공지되어 있다(Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). 이들 단백질은 T 세포 반응의 공-자극성 또는 억제성 상호작용에 관여한다. 면역관문 억제제는 항체를 포함하며, 항체로부터 기원할 수 있다.In the present invention, the anticancer agent may be an immune checkpoint inhibitor. As used herein, the term “immune checkpoint inhibitor” refers to a substance that wholly or partially inhibits, interferes with, or modulates one or more immune checkpoint proteins. Immune checkpoint proteins regulate the activation or function of T cells. A number of immune checkpoint proteins are known, such as PD-1, PD-L1 and CTLA-4 (Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). These proteins are involved in co-stimulatory or inhibitory interactions of T cell responses. Immune checkpoint inhibitors include antibodies and may be derived from antibodies.

본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제인 항체는 PD-1(Programmed cell death 1) 또는 PD-L1(PD-1 ligand 1)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab) 및 세미플리맙(Cemiplimab)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 더발루맙(Durvalumab)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체일 수 있다.In the present invention, the immune checkpoint inhibitor antibody may be an antibody that specifically binds to programmed cell death 1 (PD-1) or PD-1 ligand 1 (PD-L1). For example, the antibody specifically binding to PD-1 may be an antibody selected from the group consisting of Pembrolizumab, Nivolumab, and Cemiplimab. Also, for example, the antibody specifically binding to PD-L1 may be an antibody selected from the group consisting of Atezolizumab, Avelumab, and Durvalumab.

본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제인 항체는 CTLA4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항체는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다.In the present invention, the immune checkpoint inhibitor antibody may be an antibody that specifically binds to CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4). For example, the antibody specifically binding to CTLA4 may be ipilimumab.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 PD-1, PD-L1, CTLA4 등의 면역관문 단백질에 대해 특이적으로 결합하여 면역관문 억제 활성을 나타내는 물질이다. 본 발명의 항체-약물 접합체에 있어서, 약물에 접합되는 항체의 범위에는 완전한 형태의 항체뿐만 아니라, 항체 분자의 항원 결합 부위도 포함된다.As used herein, the term "antibody" is a substance that exhibits immune checkpoint inhibitory activity by specifically binding to immune checkpoint proteins such as PD-1, PD-L1, and CTLA4. In the antibody-drug conjugate of the present invention, the scope of the antibody conjugated to the drug includes not only the complete antibody but also the antigen-binding portion of the antibody molecule.

본 발명의 약학적 조성물은 항암제(예컨대, 면역관문 억제제)와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered concurrently, separately, or sequentially with an anticancer agent (eg, immune checkpoint inhibitor), or may be administered singly or multiple times.

본 발명의 약학적 조성물 내의 상기 유효성분의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.The content of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the progress of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 50% by weight based on the total composition weight. It may be % by weight, but is not limited thereto. The content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. The excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다. The pharmaceutical compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods. , tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate, It can be formulated and used in the form of external preparations such as warning agents, lotions, pasta agents, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or aerosols, and the external agents are creams, gels, patches, sprays, ointments, and warning agents. , lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1928, 2208, 2906, 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제가 사용될 수 있다.Corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, sucrose, glucose, fructose, di-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, phosphoric acid as additives for tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention Calcium monohydrogen, calcium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, purified lanolin, microcrystalline cellulose, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, kaolin, urea, colloidal silica gel, hydroxypropyl starch, hydroxypropylmethyl excipients such as cellulose, 1928, 2208, 2906, 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose phthalate acetate, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethyl cellulose, sodium methyl cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin Binders such as hydroxycellulose, hydroxypropyl starch, hydroxymethylcellulose, purified shellac, starch arc, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone may be used, Hydroxypropyl Methyl Cellulose, Corn Starch, Agar Powder, Methyl Cellulose, Bentonite, Hydroxypropyl Starch, Sodium Carboxymethyl Cellulose, Sodium Alginate, Calcium Carboxymethyl Cellulose, Calcium Citrate, Sodium Lauryl Sulfate, Silicic Anhydride, 1-Hydroxy Propyl cellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, amylose, guar gum, sodium bicarbonate, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate, gelled starch, gum arabic, disintegrants such as amylopectin, pectin, sodium polyphosphate, ethyl cellulose, white sugar, magnesium aluminum silicate, di-sorbitol solution, and light anhydrous silicic acid; Calcium stearate, magnesium stearate, stearic acid, hydrogenated vegetable oil, talc, lycopod, kaolin, petrolatum, sodium stearate, cacao butter, sodium salicylate, magnesium salicylate, polyethylene glycol 4000, 6000, liquid paraffin, hydrogenated soybean oil (Lubri wax), aluminum stearate, zinc stearate, sodium lauryl sulfate, magnesium oxide, macrogol, synthetic aluminum silicate, silicic anhydride, higher fatty acid, higher alcohol, silicone oil, paraffin oil, polyethylene glycol fatty acid ether, starch, sodium chloride, Lubricants such as sodium acetate, sodium oleate, dl-leucine, and light anhydrous silicic acid may be used.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.Additives for the liquid formulation according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (tween esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, and the like may be used.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.In the syrup according to the present invention, a solution of white sugar, other sugars, or a sweetener may be used, and aromatics, coloring agents, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickeners, etc. may be used as necessary.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. may be used as needed.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1828, 2906, 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.Acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose, 1828, 2906, 2910, etc. may be used as the suspending agent according to the present invention. Surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O3), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, twins, nijuntinamide, hexamine, and dimethylacetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumins, peptones, and gums; tonicity agents such as sodium chloride; Stabilizers such as sodium bisulfite (NaHSO 3 ) carbon dioxide gas, sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 3 ), sodium sulfite (Na 2 SO 3 ), nitrogen gas (N 2 ), ethylenediaminetetraacetic acid; Sulfating agents such as sodium bisulfide 0.1%, sodium formaldehyde sulfoxylate, thiourea, ethylenediamine disodium tetraacetate, acetone sodium bisulfite; analgesics such as benzyl alcohol, chlorobutanol, procaine hydrochloride, glucose, and calcium gluconate; Suspending agents such as Siemesis sodium, sodium alginate, Tween 80, aluminum monostearate may be included.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.The suppository according to the present invention includes cacao butter, lanolin, witapsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lannet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolen (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Buytyrum Tego-G -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxycote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hyde Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neosupostal-N, Paramound-B, Suposiro (OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), suppository type IV (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), Supostal (N, Es), Wecobi (W, R, S, M, Fs), testosterone triglyceride base (TG-95, MA, 57) and The same mechanism can be used.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc. ) or by mixing lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included. there is. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.The pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실험재료 및 실험방법Experiment material and experiment method

1. 입자 제조1. Particle Preparation

본 발명의 입자를 제조하기 위하여 나노침전법을 활용하였다. 구체적으로, PEG-PLGA(10 mg)을 아세토니트릴(acetonitrile) 1 ml에 녹이고, 이를 초순수(2 ml)에 점적한 후 아세토니트릴을 증발시켰다. 이후 0.2 μm 필터링 후 원심분리 하여 나노입자(NP로 명명)를 얻었다. 엔도텔린 수용체 길항제-봉입 나노입자(M-NP로 명명)의 경우 엔도텔린 수용체 길항제인 마시텐탄(MCT) 1 mg을 아세토니트릴(0.5 ml)에 녹여 PEG-PLGA가 들어있는 초순수, 아세토니트릴 공용매에 점적하였다.A nanoprecipitation method was utilized to prepare the particles of the present invention. Specifically, PEG-PLGA (10 mg) was dissolved in 1 ml of acetonitrile, and it was dropwise added to ultrapure water (2 ml) and then acetonitrile was evaporated. Thereafter, nanoparticles (named NP) were obtained by centrifugation after 0.2 μm filtering. For endothelin receptor antagonist-encapsulated nanoparticles (named M-NP), 1 mg of macitentan (MCT), an endothelin receptor antagonist, was dissolved in acetonitrile (0.5 ml) in ultrapure water containing PEG-PLGA, acetonitrile co-solvent Dropped on.

2. 물리화학적 특성 분석2. Physical and chemical characterization

제조된 입자의 크기 분포를 분석하기 위하여, PBS에 1 mg/ml 농도로 NP 및 M-NP를 분산하여 동적광산란측정을 통해 입자의 크기 분포를 확인하였다. 입자의 형태를 분석하기 위하여, Uranyl acetate 염색하여 투과전자현미경을 통해 입자의 형태를 관찰하였다. 제조된 입자의 광학적 특성을 평가하기 위하여, PLGA, MCT, M-NP를 아세토니트릴과 NaOH 공용매에 녹인 후 UV-Vis 분광광도계를 통해 흡광을 측정하였다.In order to analyze the size distribution of the prepared particles, NP and M-NP were dispersed at a concentration of 1 mg/ml in PBS and the size distribution of the particles was confirmed through dynamic light scattering measurement. In order to analyze the shape of the particles, they were stained with uranyl acetate and observed using a transmission electron microscope. In order to evaluate the optical properties of the prepared particles, after dissolving PLGA, MCT, and M-NP in acetonitrile and NaOH co-solvent, absorbance was measured using a UV-Vis spectrophotometer.

제조된 입자의 세포 독성을 확인하기 위하여, 4T1 세포를 96-웰 플레이트에 1 x 104/웰의 수로 분주하였다. 각 웰에 12.5, 20, 50, 100 μg/ml의 농도로 MCT, NP, M-NP를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT assay를 통해 세포 독성을 평가하였다.To confirm the cytotoxicity of the prepared particles, 4T1 cells were seeded in a 96-well plate at a number of 1 x 10 4 /well. Each well was treated with MCT, NP, and M-NP at concentrations of 12.5, 20, 50, and 100 μg/ml, and then cultured for 24 hours. Then, cytotoxicity was evaluated by MTT assay.

3. 동물실험 평가3. Animal testing evaluation

암 동물모델의 암 크기 측정을 위하여, 캘리퍼를 이용하여 장축(a), 단축(b)을 측정하였으며, 암 부피는 다음과 같이 계산되었다.To measure the size of the cancer animal model, the long axis ( a ) and short axis ( b ) were measured using a caliper, and the cancer volume was calculated as follows.

암 부피(v) = a x b 2 x 0.5Arm volume (v) = a x b 2 x 0.5

동물의 무게는 저울을 이용하여 매일 같은 시각에 측정하였다. 암 무게는 도 2a에 나타난 것과 같이 실험이 끝난 동물을 희생시킨 후 암 조직을 분리하여 저울을 이용하여 측정하고, 사진을 촬영하였다.The weight of the animals was measured at the same time every day using a scale. As shown in FIG. 2a , after the animals were sacrificed, cancer tissues were separated, measured using a scale, and photographs were taken.

4. 종양미세환경 분석4. Tumor microenvironment analysis

암조직 내의 콜라겐 분포를 확인하기 위하여, 암 조직을 절편으로 만들어 masson's trichrome 염색을 진행하고, 광학현미경을 이용하여 콜라겐 영역을 관찰하였다. 이후 ImageJ 프로그램을 사용하여 collagen+ area를 정량하여 도식하였다. 암조직 내 세포외 기질의 주요 구성성분인 파이브로넥틴(fibronectin), 섬유아세포와 저산소 환경을 확인하기 위하여 각각의 마커를 이용하여 면역형광염색을 통해 발현량의 변화를 관찰하였다. 이를 위해 암조직을 냉동 섹션하여 절편으로 제작하였으며, 각각 형광이 접합된 파이브로넥틴, αSMA, HIF-1α 항체로 표지한 후 공초점 형광현미경을 이용하여 시료를 관찰하였다. 정량적 분석은 ImageJ 프로그램을 활용하여 진행하였다. 암조직 내 TGF-β1 정량을 위해 암조직을 gentleMACSTM Dissociator를 이용하여 균질 현탁액으로 만들고, 총 단백질 양을 BCA assay를 통해 정량하였다. 이후 TGF-β1 ELISA 키트를 활용하여 각 암조직 내에 존재하는 TGF-β1 수준을 검증하였다.In order to confirm the distribution of collagen in the cancer tissue, the cancer tissue was sectioned and stained with Masson's trichrome, and the collagen region was observed using an optical microscope. Then, the collagen + area was quantified and plotted using the ImageJ program. In order to identify fibronectin, a major component of the extracellular matrix in cancer tissue, fibroblasts, and hypoxic environment, changes in expression level were observed through immunofluorescence staining using each marker. To this end, cancer tissues were frozen and sectioned, and the samples were observed using a confocal fluorescence microscope after labeling with fluorescently conjugated fibronectin, αSMA, and HIF-1α antibodies, respectively. Quantitative analysis was performed using the ImageJ program. For the quantification of TGF-β1 in cancer tissue, the cancer tissue was made into a homogeneous suspension using gentleMACS TM Dissociator, and the total protein amount was quantified through BCA assay. Then, the TGF-β1 ELISA kit was used to verify the level of TGF-β1 present in each cancer tissue.

엑소좀의 PD-L1(exosomal PD-L1)을 검증하기 위하여, 마우스의 혈액으로부터 혈장을 분리하였다. 이후 2,000 g로 20분 동안 원심분리 한 후 다시 16,500 g로 45분간 원심분리 하여 세포 잔여물 및 마이크로베시클을 제거하였다. 이후 엑소좀 분리 키트(Invitrogen)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다. 이후 PD-L1 ELISA assay(R&D systems)를 통해 exosomal PD-L1을 정량하였다.In order to verify exosomal PD-L1 (exosomal PD-L1), plasma was separated from mouse blood. After centrifugation at 2,000 g for 20 minutes, centrifugation was performed again at 16,500 g for 45 minutes to remove cell residues and microvesicles. Then, the exosomes were isolated using an exosome isolation kit (Invitrogen). Then, exosomal PD-L1 was quantified through PD-L1 ELISA assay (R&D systems).

5. 종양 미세환경 내 면역세포 분석5. Analysis of immune cells in the tumor microenvironment

종양 미세환경 내 면역세포를 분석하기 위하여, 암조직을 절개하여 얻은 후 CD45 비드(bead)를 활용하여 종양 침윤형 림프구를 분리하였다. 이후 분리된 림프구를 CD3 및 CD8로 염색한 후 유세포 분석기를 활용하여 종양 침윤형 세포독성 T 세포의 군집을 확인하였다. 정량적 결과는 Guava easyCyteTM 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한 암조직을 면역화학염색법을 통해 CD3 및 CD8 염색을 진행하였고, 공초점 형광현미경을 이용하여 종양 침윤형 세포독성 T 세포의 분포를 확인하였다.In order to analyze immune cells in the tumor microenvironment, tumor-infiltrating lymphocytes were isolated using CD45 beads after dissecting cancer tissues. Thereafter, the separated lymphocytes were stained with CD3 and CD8, and a population of tumor-infiltrating cytotoxic T cells was confirmed using flow cytometry. Quantitative results were analyzed using the Guava easyCyte TM program. In addition, cancer tissue was stained with CD3 and CD8 through immunochemical staining, and the distribution of tumor-infiltrating cytotoxic T cells was confirmed using a confocal fluorescence microscope.

6. 암 전이능 억제 효과 검증6. Verification of cancer metastasis inhibitory effect

암 전이능 억제 효과를 검증하기 위하여, 세포 이동 분석(migration assay)를 진행하였다. 이를 위해 transwell 챔버(corning)에 4T1 세포 1.5 x 105을 분주한 뒤 아래 웰에 500 nM의 MCT 및 ET-1 등 샘플이 포함된 배지를 처리하였다. 이후 15시간 동안 배양하였다. 배양 이후 세포를 고정액을 이용해 고정시키고, Giemsa 염색 용액을 이용하여 염색한 후 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포 침윤 분석(invasion assay)의 경우 transwell 챔버를 Matrigel(300 μg/ml)로 코팅한 후 세포 이동 분석에서와 동일한 과정으로 진행하였다.In order to verify the effect of suppressing cancer metastasis, cell migration assay was performed. To this end, 1.5 x 10 5 of 4T1 cells were dispensed into a transwell chamber (corning), and then the lower well was treated with a medium containing samples such as 500 nM MCT and ET-1. After that, it was cultured for 15 hours. After culturing, the cells were fixed using a fixative, stained using a Giemsa staining solution, and observed using an optical microscope. In the case of cell invasion assay, the transwell chamber was coated with Matrigel (300 μg/ml) and then proceeded with the same process as in the cell migration assay.

실험결과Experiment result

실시예 1. 엔도텔린 수용체 길항제-봉입 나노입자(M-NP)의 제조 및 물리화학적 특성과 세포 독성 분석Example 1. Preparation of endothelin receptor antagonist-encapsulated nanoparticles (M-NP) and analysis of physicochemical properties and cytotoxicity

제조된 나노입자의 크기 분포 및 형태를 제타사이저(Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK) 및 투과 전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM; Talos F200X; FEI Company, USA)을 사용하여 측정하였다.The size distribution and shape of the prepared nanoparticles were measured using a Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK) and a transmission electron microscope (TEM; Talos F200X; FEI Company, USA).

그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 나노입자는 마시텐탄 봉입 전 후 모두 수용액 상에서 단분산성을 나타내었으며, 지름은 50 nm 내외로 확인되었다(도 1a). 또한, TEM 사진을 통해 입자의 형태를 확인한 결과, 구형의 입자를 형성하고 있었다(도 1a).As a result, as shown in FIG. 1a, the nanoparticles exhibited monodispersity in aqueous solution before and after macitentan encapsulation, and the diameter was confirmed to be around 50 nm (FIG. 1a). In addition, as a result of confirming the shape of the particles through a TEM photograph, spherical particles were formed (FIG. 1a).

UV-Vis 분광광도계를 활용한 광학적 평가에서 MCT 및 M-NP는 265 nm에서 특징적으로 흡광을 보이는 것을 확인하였다(도 1b). 이는 MCT의 흡광특성에 의한 것으로, PEG-PLGA 고분자 내부에 MCT가 성공적으로 봉입되었음을 의미한다. 반면, PEG-PLGA 고분자의 경우 265 nm에서 흡광을 나타내지 않았다.In the optical evaluation using a UV-Vis spectrophotometer, it was confirmed that MCT and M-NP showed characteristic absorption at 265 nm (Fig. 1b). This is due to the light absorption characteristics of MCT, and means that MCT was successfully encapsulated inside the PEG-PLGA polymer. On the other hand, the PEG-PLGA polymer did not show any absorption at 265 nm.

또한, 세포 독성 확인 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, 약물을 봉입하지 않은 PEG 나노입자(NP)는 유방암 세포주(4T1)에 독성을 유발하지 않았으며, 마시텐탄 및 마시텐탄을 봉입하고 있는 나노입자는 고농도로 처리하였을 때 세포독성을 유발하는 거동을 나타내었다(도 1c).In addition, as a result of confirming the cytotoxicity, as shown in FIG. 1c, the PEG nanoparticles (NP) that did not encapsulate the drug did not induce toxicity to the breast cancer cell line (4T1), and macitentan and nanoparticles encapsulating macitentan exhibited the behavior of inducing cytotoxicity when treated at high concentrations (FIG. 1c).

실시예 2. 질병 동물모델에서 M-NP의 항암 치료 효능 평가Example 2. Evaluation of anticancer treatment efficacy of M-NP in disease animal models

본 발명의 나노입자(M-NP)를 이용한 면역 항암 치료 효능을 평가하기 위하여, 종양 동물모델을 제조하였다. 간략히 설명하면, 유방암 세포주인 4T1 세포를 마우스 유방의 지방 패드에 접종(2 X 105 세포)하여 유방암 동물모델을 제조하였다. M-NP를 마시텐탄 기준으로 1 mg/kg의 투여량으로 정맥 주사하였으며, 대조군은 식염수만 또는 마시텐탄(MCT)을 1 mg/kg의 투여량으로 정맥 주사하였다. 또한, 항체 병용 투여군에는 3일에 한 번씩 anti-PD-1 항체를 5 mg/kg의 용량으로 복강 주사함으로써 항체를 투여하지 않은 군과의 치료 효능 평가를 수행하였다. 구체적인 실험 스케줄은 도 2a에 나타내었다.In order to evaluate the efficacy of immunocancer therapy using the nanoparticles (M-NP) of the present invention, a tumor animal model was prepared. Briefly, a breast cancer animal model was prepared by inoculating (2 X 10 5 cells) 4T1 cells, a breast cancer cell line, into the fat pad of a mouse breast. M-NP was intravenously injected at a dose of 1 mg/kg based on macitentan, and the control group was intravenously injected with saline only or macitentan (MCT) at a dose of 1 mg/kg. In addition, the antibody combination administration group was intraperitoneally injected with anti-PD-1 antibody at a dose of 5 mg/kg once every 3 days, and the therapeutic efficacy of the group not administered with the antibody was evaluated. The specific experimental schedule is shown in Figure 2a.

실험 결과, M-NP와 PD-1 항체를 모두 투여한 병용 투여군의 경우 식염수를 투여한 대조군과 비교하였을 때 종양의 부피가 약 10배 억제되었으며, anti-PD-1 항체 단독 투여군과 비교했을 때에도 종양의 부피가 약 5배 억제되어 높은 암 치료 효능을 나타내었다(도 2b, 2d 및 2e). 모든 투여군에서 체중에 유의적인 차이는 없었다(도 2c).As a result of the experiment, in the case of the combined administration group administered with both M-NP and PD-1 antibody, the tumor volume was suppressed by about 10 times compared to the control group administered with saline, and even when compared to the anti-PD-1 antibody alone administration group The tumor volume was inhibited by about 5 times, indicating high cancer treatment efficacy (FIGS. 2b, 2d and 2e). There was no significant difference in body weight in all administration groups (FIG. 2c).

주요 장기 및 암 조직을 적출하여 H&E(hematoxylin and eosin) 염색법으로 조직을 염색하여 조직병리학적 분석을 진행한 결과, M-NP와 항체를 병용 투여한 군의 주요 장기에서 독성은 미미하였으며, 암조직에서는 타 투여군과 비교하였을 때 넓은 세포사 영역이 관찰되었다(도 2f).Major organs and cancer tissues were extracted, and tissues were stained with H&E (hematoxylin and eosin) staining and histopathological analysis was performed. In comparison with other administration groups, a wide area of cell death was observed (FIG. 2f).

상기의 실험 결과는 M-NP와 항체를 병용 투여하였을 때 효과적으로 암 성장을 저해시킬 수 있음을 보여준다.The above experimental results show that the combined administration of M-NP and antibody can effectively inhibit cancer growth.

실시예 3. 질병 동물모델에서 M-NP의 종양 미세환경 구성성분에 미치는 영향 평가Example 3. Evaluation of the effect of M-NP on components of the tumor microenvironment in disease animal models

본 발명의 M-NP의 종양 미세환경 제어능을 평가하기 위하여, 질병 동물모델에서 치료 효능 평가가 완료된 동물모델을 희생시킨 후 각 투여군의 암조직을 대상으로 masson's trichrome 염색을 진행하고, 콜라겐 영역을 비교 평가하였다. 실험 결과, 종양 미세환경의 세포외 기질의 주요 구성성분인 콜라겐의 생성 영역을 비교한 결과, M-NP 투여군의 암조직에 형성된 콜라겐 영역은 M-NP가 투여되지 않은 타 투여군에 비하여 약 3배 낮았다(도 3a 및 3b).In order to evaluate the ability to control the tumor microenvironment of the M-NP of the present invention, masson's trichrome staining was performed on the cancer tissue of each administration group after sacrificing the animal model for which the therapeutic efficacy was evaluated in the disease animal model, and the collagen area was comparative evaluation. As a result of the experiment, as a result of comparing the collagen production area, which is a major component of the extracellular matrix of the tumor microenvironment, the collagen area formed in the cancer tissue of the M-NP-administered group was about 3 times greater than that of the other M-NP-administered group. low (Figs. 3a and 3b).

또한, 면역형광법을 이용하여 암조직에서 세포외 기질의 주요 구성성분인 파이브로넥틴의 발현을 확인한 결과, M-NP 투여군에서 파이브로넥틴의 형성이 현저히 감소하였다(도 3c).In addition, as a result of confirming the expression of fibronectin, a major component of the extracellular matrix, in cancer tissues using immunofluorescence, the formation of fibronectin was significantly reduced in the M-NP-administered group (FIG. 3c).

나아가, 종양 미세환경의 주요 구성성분인 종양 관련 섬유아세포(Cancer-associated fibroblast)의 발현을 면역형광법을 이용하여 관찰한 결과, M-NP 투여군에서 종양 관련 섬유아세포가 대조군에 비해 약 3배 정도 낮게 발현되었다(도 3d 및 3e).Furthermore, as a result of observing the expression of cancer-associated fibroblasts, a major component of the tumor microenvironment, using immunofluorescence, the number of tumor-associated fibroblasts in the M-NP-administered group was about 3 times lower than that in the control group. was expressed (Figs. 3d and 3e).

실시예 4. 질병 동물모델에서 M-NP의 종양 미세환경 제어능 평가Example 4. Evaluation of tumor microenvironment control ability of M-NP in disease animal models

본 발명의 나노입자가 저산소 환경, 고체 스트레스, 사이토카인 및 엑소좀 분비에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 질병 동물모델에서 치료 효능 평가가 완료된 동물 모델을 희생시킨 후 종양을 적출하였다.In order to evaluate the effect of the nanoparticles of the present invention on the hypoxic environment, solid state stress, cytokine and exosome secretion, tumors were removed after sacrificing animal models for which treatment efficacy was evaluated in disease animal models.

먼저, 종양 미세환경의 특징인 저산소 환경의 변화를 평가하기 위하여, 각각의 종양을 면역형광법으로 염색하여 평가하였다. 그 결과, M-NP 투여군의 종양에서 다른 물질 투여군에 비하여 약 4배 정도 낮은 수준의 저산소 환경이 구성되었음을 확인하였다(도 4a 및 4b).First, in order to evaluate changes in the hypoxic environment, which is a characteristic of the tumor microenvironment, each tumor was stained and evaluated by immunofluorescence. As a result, it was confirmed that a hypoxic environment of about 4 times lower level was formed in the tumors of the M-NP-administered group compared to the other material-administered groups (FIGS. 4a and 4b).

이에 따른 종양조직의 섬유화 감소에 의한 고형 스트레스 변화를 확인하기 위하여, 각각의 종양의 opening test를 수행하였다(도 4c). 그 결과, M-NP 투여군의 종양의 고형 스트레스가 약 3배 이하 수준으로 확인되었다.In order to confirm the change in solid stress caused by the reduction in fibrosis of the tumor tissue according to this, an opening test was performed for each tumor (FIG. 4c). As a result, the solid stress of the tumor in the M-NP-administered group was confirmed to be about 3 times or less.

또한, 종양의 섬유화 과정을 촉진시켜 세포외 기질의 구성을 고밀도로 만들고 종양 관련 섬유아세포의 활성을 촉진시키는 사이토카인 중 하나인 TGF-β1의 양을 측정하였다. 그 결과, 종양 관련 섬유아세포의 생성이 억제된 M-NP 투여군에서 종양 내의 TGF-β1의 분비가 억제되었음을 확인하였다(도 4d).In addition, the amount of TGF-β1, which is one of the cytokines that promote the fibrosis process of tumors to make the structure of the extracellular matrix dense and promote the activity of tumor-associated fibroblasts, was measured. As a result, it was confirmed that the secretion of TGF-β1 in the tumor was suppressed in the M-NP administration group in which the production of tumor-associated fibroblasts was suppressed (FIG. 4d).

다음으로, 면역관문 억제제의 암 치료 효과를 저해시키는 엑소좀의 PD-L1(exosomal PD-L1)의 분비를 확인하기 위하여, 종양 동물모델의 혈액으로부터 엑소좀을 추출하여 ELISA로 확인하였다. 그 결과, M-NP 투여군에서 혈액 내 엑소좀에 존재하는 PD-L1의 양이 약 2배 정도 감소하였으며, 이는 나노입자에 봉입된 마시텐탄이 암세포에 작용하여 엑소좀의 분비를 억제시키기 때문이다(도 4e).Next, in order to confirm the secretion of exosomal PD-L1 (exosomal PD-L1) of exosomes that inhibits the cancer treatment effect of immune checkpoint inhibitors, exosomes were extracted from the blood of tumor animal models and confirmed by ELISA. As a result, the amount of PD-L1 present in exosomes in the blood decreased by about 2 times in the M-NP-administered group. (Fig. 4e).

실시예 5. M-NP 투여에 따른 T 세포 군집 및 종양 내 분포 변화 평가Example 5. Evaluation of changes in T cell population and intratumoral distribution according to M-NP administration

나노입자의 병용 치료 효능을 평가하기 위하여, 본 발명의 나노입자 및 면역관문 억제제를 유방암 동물모델에 병용 투여하였다. 그 결과, 면역관문 억제제와 본 발명의 나노입자를 병용투여 하였을 때 CD8+ T 세포의 군집이 식염수 투여군과 비교하여 약 3배 정도 증가하였음을 확인하였다(도 5a 및 5b).In order to evaluate the efficacy of the combination treatment of nanoparticles, the nanoparticles and immune checkpoint inhibitors of the present invention were administered in combination to breast cancer animal models. As a result, it was confirmed that when the immune checkpoint inhibitor and the nanoparticles of the present invention were co-administered, the population of CD8 + T cells increased about 3-fold compared to the saline-administered group (FIGS. 5a and 5b).

또한, 면역 형광법을 이용하여 암 조직에서 T 세포의 분포를 확인한 결과, M-NP와 면역관문 억제제를 병용 투여한 군에서는 면역관문 억제제만 투여한 군에 비하여 T 세포의 분포가 더 넓었음을 확인하였다(도 5c).In addition, as a result of confirming the distribution of T cells in cancer tissues using immunofluorescence, it was confirmed that the distribution of T cells was wider in the group administered with M-NP and immune checkpoint inhibitors than in the group administered with only immune checkpoint inhibitors. (FIG. 5c).

상기 결과를 통하여 엔도텔린 수용체 길항제인 마시텐탄을 함유한 나노입자는 종양 미세환경에서 주요한 역할을 하는 종양 관련 섬유아세포, 내피세포, 암세포에 동시에 작용하여 섬유화 과정 억제 및 세포외 기질 조성물의 생성 억제를 통해 종양 내 미세환경을 제어함으로써 면역관문 억제제의 반응률과 치료 효과를 증진시키고, 그에 따라 다양한 병용 치료기술 개발에 적용 가능할 것으로 판단된다.Through the above results, nanoparticles containing macitentan, an endothelin receptor antagonist, simultaneously act on tumor-related fibroblasts, endothelial cells, and cancer cells, which play a major role in the tumor microenvironment, to inhibit the fibrotic process and inhibit the production of extracellular matrix compositions. By controlling the microenvironment within the tumor through this method, the response rate and therapeutic effect of immune checkpoint inhibitors are improved, and accordingly, it is considered that it can be applied to the development of various combination treatment technologies.

실시예 6. 암 전이 억제 효과Example 6. Cancer metastasis inhibitory effect

M-NP의 암 전이 억제효과를 규명하기 위하여, 세포의 이동 및 침윤 분석(in vitro migration and invasion assay)을 진행하였다. 그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, M-NP는 4T1 세포의 ET-1 의존적 이동(migration)을 억제하였다(M-NP: non-treated 대비 약 2배). 세포 이동 분석(migration assay)에서와 유사한 경향으로, 침윤 분석(invasion assay)에서도 M-NP는 4T1 세포의 침윤을 효과적으로 억제하였다(도 7b). 이러한 결과는 M-NP의 암 전이 억제 효과를 보여준다.In order to investigate the cancer metastasis inhibitory effect of M-NP, an in vitro migration and invasion assay was performed. As a result, as shown in FIG. 7a, M-NP inhibited ET-1-dependent migration of 4T1 cells (M-NP: about twice that of non-treated cells). Similar to the trend in the cell migration assay, M-NP effectively inhibited the invasion of 4T1 cells in the invasion assay (FIG. 7b). These results show the inhibitory effect of M-NP on cancer metastasis.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not limiting.

Claims (16)

나노입자를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제 병용 투여용 약학적 조성물로서,
상기 나노입자는 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함하는 생체적합성의 양친매성 고분자를 포함하고,
상기 나노입자 내부에 엔도텔린 수용체(Endothelin receptor) 길항제를 봉입하고 있으며,
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 소수성 고분자는 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 테조센탄(tezosentan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
상기 면역관문 억제제는 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for combined administration of immune checkpoint inhibitors, comprising nanoparticles as an active ingredient,
The nanoparticles include a biocompatible amphiphilic polymer including a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer,
An endothelin receptor antagonist is encapsulated inside the nanoparticle,
The hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyethylene oxide, and combinations thereof,
The hydrophobic polymer is selected from the group consisting of poly(lactic-co-glycolic acid), polylactide, and combinations thereof,
The endothelin receptor antagonist is selected from the group consisting of macitentan, bosentan, tezosentan, and combinations thereof,
The pharmaceutical composition, characterized in that the immune checkpoint inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-1 protein. 제1항에 있어서,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 엔도텔린 A 수용체(ETA)와 엔도텔린 B 수용체(ETB) 모두에 대하여 길항 작용을 나타내는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.According to claim 1,
The endothelin receptor antagonist is an endothelin A receptor (ET A ) and an endothelin B receptor (ET B ) characterized in that it exhibits an antagonistic action, a pharmaceutical composition. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 나노입자는 암 미세환경을 제어하여 T 세포 또는 항암제의 종양 내 침투를 증진시키는 것을 특징으로 하고, 상기 항암제는 면역관문 억제제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.According to claim 1,
The nanoparticles control the cancer microenvironment to enhance the infiltration of T cells or anticancer agents into tumors, and the anticancer agents are immune checkpoint inhibitors. 제7항에 있어서,
상기 암 미세환경의 제어는 암 미세환경의 세포외 기질의 분해; 암 미세환경의 세포외 기질의 생성 억제; 종양 관련 섬유아세포(Cancer-associated fibroblast)의 발현 억제; 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.According to claim 7,
Control of the cancer microenvironment includes degradation of the extracellular matrix of the cancer microenvironment; inhibiting the production of extracellular matrix in the cancer microenvironment; inhibition of expression of cancer-associated fibroblast; Or a combination thereof, characterized in that the pharmaceutical composition. 제1항에 있어서,
상기 나노입자는 내부에 봉입한 엔도텔린 수용체 길항제를 암조직에서 방출하여 암세포의 엑소좀 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.According to claim 1,
The nanoparticle is a pharmaceutical composition, characterized in that to release the endothelin receptor antagonist encapsulated therein from cancer tissue to inhibit exosome secretion of cancer cells. 제1항에 있어서,
상기 나노입자의 직경은 40 내지 100 nm 인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.According to claim 1,
The pharmaceutical composition, characterized in that the nanoparticles have a diameter of 40 to 100 nm. 나노입자; 및
면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 나노입자는 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함하는 생체적합성의 양친매성 고분자를 포함하고,
상기 나노입자 내부에 엔도텔린 수용체(Endothelin receptor) 길항제를 봉입하고 있으며,
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 소수성 고분자는 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 테조센탄(tezosentan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고,
상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하며,
상기 면역관문 억제제는 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.nanoparticles; and
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient,
The nanoparticles include a biocompatible amphiphilic polymer including a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer,
An endothelin receptor antagonist is encapsulated inside the nanoparticle,
The hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyethylene oxide, and combinations thereof,
The hydrophobic polymer is selected from the group consisting of poly(lactic-co-glycolic acid), polylactide, and combinations thereof,
The endothelin receptor antagonist is characterized in that it is selected from the group consisting of macitentan, bosentan, tezosentan, and combinations thereof,
The cancer is characterized by breast cancer,
The pharmaceutical composition, characterized in that the immune checkpoint inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-1 protein. 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물로서,
상기 나노입자는 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함하는 생체적합성의 양친매성 고분자를 포함하고,
상기 나노입자 내부에 엔도텔린 수용체(Endothelin receptor) 길항제를 봉입하고 있는 것을 특징으로 하고,
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 소수성 고분자는 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 테조센탄(tezosentan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며,
상기 항암제는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)이고,
상기 면역관문 억제제는 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for enhancing the anticancer effect of an anticancer agent comprising nanoparticles as an active ingredient,
The nanoparticles include a biocompatible amphiphilic polymer including a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer,
Characterized in that an endothelin receptor antagonist is encapsulated inside the nanoparticle,
The hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyethylene oxide, and combinations thereof,
The hydrophobic polymer is selected from the group consisting of poly(lactic-co-glycolic acid), polylactide, and combinations thereof,
The endothelin receptor antagonist is characterized in that it is selected from the group consisting of macitentan, bosentan, tezosentan, and combinations thereof,
The anticancer agent is an immune checkpoint inhibitor,
The pharmaceutical composition, characterized in that the immune checkpoint inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-1 protein. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 나노입자; 및
면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 전이 억제용 약학적 조성물로서,
상기 나노입자는 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자에 접합된 소수성 고분자를 포함하는 생체적합성의 양친매성 고분자를 포함하고,
상기 나노입자 내부에 엔도텔린 수용체(Endothelin receptor) 길항제를 봉입하고 있으며,
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 소수성 고분자는 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
상기 엔도텔린 수용체 길항제는 마시텐탄(macitentan), 보센탄(bosentan), 테조센탄(tezosentan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
상기 면역관문 억제제는 PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.nanoparticles; and
A pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, comprising an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient,
The nanoparticles include a biocompatible amphiphilic polymer including a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer conjugated to the hydrophilic polymer,
An endothelin receptor antagonist is encapsulated inside the nanoparticle,
The hydrophilic polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyethylene oxide, and combinations thereof,
The hydrophobic polymer is selected from the group consisting of poly(lactic-co-glycolic acid), polylactide, and combinations thereof,
The endothelin receptor antagonist is selected from the group consisting of macitentan, bosentan, tezosentan, and combinations thereof,
The pharmaceutical composition, characterized in that the immune checkpoint inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-1 protein.
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