KR102511823B1 - 아민기가 풍부한 양이온성 고분자 전해질을 활용한 센서전극 및 고성능 바이오센서와 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

아민기가 풍부한 양이온성 고분자 전해질을 활용한 센서전극 및 고성능 바이오센서와 그 제조방법이 개시된다. 일 실시 예에 따른 바이오센서 제조방법에 따르면, 전극에 폴릴알릴아민을 코팅 하거나, 준비 또는 합성된 전극 물질을 폴릴알릴아민으로 캡슐화 함에 따라, 다양한 효소, 항체 또는 압타머를 고정화 해서 고성능 바이오센서를 제조할 수 있다.

Description

아민기가 풍부한 양이온성 고분자 전해질을 활용한 센서전극 및 고성능 바이오센서와 그 제조방법 {NH2-riched cationic polymer electrolyte-based sensor electrode and biosensor and fabrication method thereof}

본 발명은 센서전극 및 바이오센서와 그 제조기술에 관한 것이다.

일반적인 바이오센서는 생체 체내물질이나 바이오마커 검출을 위한 효소, 항체, 압타머(Aptamer) 등을 고정화 할 수 있는 결합 부위(binding sites)가 충분하지 않아 성능이 떨어지기 때문에, 저 농도 바이오마커를 검출하는 데 많은 한계점을 가진다. 이러한 단점을 개선하기 위하여 대개의 바이오센서 연구는 그래핀, 나노입자 등의 증폭매체(amplifying matrix) 물질과, 효소, 항체, 압타머 등의 검출물질을 개발하는 데 초점이 맞춰져 있다.

최근에 그래핀, MXene 등과 같은 2D 구조를 갖는 물질의 나노 스케일의 구조적 특성 및 장점을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 흑린(Black Phosphorus: BP, 이하 'BP'라 칭함)은 표면활성(surface activity), 생체적합성, 높은 캐리어 이동도(carrier mobility) 등을 갖는 등 우수한 성능을 나타내는 것이 검증되었다. 하지만, 일반 환경에서 쉽게 변형 및 성능저하가 일어나는 단점을 가지며, BP의 기능적으로 비활성 상태를 나타내는 계면으로 인하여 표면에 효소, 항체, 압타머를 고정화 하는 등의 기능화(functionalization) 하는 방법이 매우 복잡하다는 단점을 가진다.

일 실시 예에 따라, 검출 대상을 검출하는 효소, 항체, 압타머 등의 검출 물질을 고정화하기 위한 부위(site)가 많은 소재를 코팅하거나 화합물로 제조하는 방법을 제안한다.

일 실시 예에 따른 바이오센서 제조방법은, 임의의 기판 상에 전극 물질을 코팅하거나, 기판 상에 레이저 조사를 통해 전극 물질을 형성하여 전극을 제조하는 단계와, 제조된 전극에 폴리알릴아민을 코팅하는 단계를 포함한다.

코팅하는 단계에서, 폴리알릴아민 및 유기용매를 섞어서, 상기 전극이 형성된 기판 상에 코팅할 수 있다.

유기용매는 n-methyl-2-pyrrolidone(NMP)일 수 있다. 코팅 방법은 스핀코팅, 딥코팅, 스프레이코팅 및 드롭코팅 중 적어도 하나일 수 있다.

바이오센서 제조방법은, Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-Hydroxysuccinimide(NHS)의 혼합용액을 전극 상에 코팅하는 단계와, 검출 대상을 검출하기 위한 검출 물질을 고정화 하는 단계와, 세척 및 건조 단계를 더 포함할 수 있다.

다른 실시 예에 따른 바이오센서 제조방법은, 전극 물질을 준비 또는 합성하는 단계와, 준비 또는 합성된 전극 물질을 폴리알릴아민으로 캡슐화 하는 단계를 포함한다.

전극 물질을 준비하거나 합성하는 단계는, NaOH, 전극 물질 및 DMF를 혼합(Mixing) 하는 단계와, NaOH:전극 물질:DMF 혼합용액을 초음파 처리하는 단계와, 혼합물을 원심분리(Centrifugation) 하는 단계를 포함할 수 있다.

캡슐화 하는 단계는, 원심분리 이후 상청액(supernatant)을 PAAMI와 혼합(Mixing) 하는 단계와, 혼합용액을 상온에서 교반 하는 단계와, 교반한 용액을 소정의 전극 기판 상에 코팅하는 단계를 포함할 수 있다.

바이오센서 제조방법은, Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-Hydroxysuccinimide(NHS)의 혼합용액을 전극 상에 코팅하는 단계와, 검출 대상을 검출하기 위한 검출 물질을 고정화 하는 단계와, 세척 및 건조 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시 예에 따른 센서전극은, 기판과, 기판 상에 형성된 전극 물질과, 전극 물질이 형성된 기판 상에 코팅되는 폴리알릴아민을 포함한다.

다른 실시 예에 따른 센서전극은, 준비 또는 합성된 전극 물질과, 준비 또는 합성된 전극 물질을 캡슐화 하는 폴릴알릴아민을 포함한다.

일 실시 예에 따른 센서전극 및 바이오센서와 그 제조방법에 따르면, 전극 물질에 PAAMI이 코팅된 센서전극 또는 전극 물질과 PAAMI를 캡슐화한 센서전극에 기초한 바이오센서는 용이하고 비용 효율적이다.

전극 물질에 PAAMI를 코팅 하거나, 전극 물질을 PAAMI와 캡슐화 한 바이오센서를 통해, 체내 생체물질(젖산, 포도당, 콜레스테롤, 아스코르브산 등의 대사 및 다양한 체내 존재하는 생체물질)과 바이오마커(질병 또는 암과 관련이 있는 특정 인자, Interleukin-6, Carcinoembryonic Antigen, Prostate-specific antigen, IgG 등)를 포함하는 검출대상을 모두 검출할 수 있다. 예를 들어, PAAMI의 도입은 비공유 π-π 상호작용 및 정전기적 물리적 흡착에 의해 센서 기판상의 LAG 부위를 안정화시키는 데 도움이 되었으며, 고정화 된 항체에 적합한 NH₂가 풍부한 부위를 제공하여 IgG 항원 검출에 대해 높은 특이성을 나타냈다. 실험을 통해 최적화된 조건 하에서, 감지 플랫폼은 허용 가능한 선형 범위 및 더 낮은 검출 한계, 더 나은 선택성, 합리적인 재현성 및 IgG 검출을 위한 인간 혈청에서 허용 가능한 타당성을 나타냈다.

실험 분석에 기초하여, 제안된 바이오센서는 임상 진단 센터에서 IgG와 같은 바이오마커와 체내 생체물질의 현장 진단을 위해 사용될 수 있다. 또한, 제안된 감지 프로토콜은 관련 검출물질로 처리한 후 넓은 검출 한계 및 동적 범위를 갖는 임상 바이오마커와 체내 생체물질을 감지하는데 사용될 수 있다.

일 실시 예에 따른 센서전극 및 바이오센서와 그 제조방법에 따르면, 비공유 정전기 상호작용을 사용하여 전극 물질을 PAAMI로 나노입자 단위로 코팅하여 성공적으로 캡슐화 함에 따라, 주변 요인으로 인한 전극 물질의 저하를 효율적으로 극복하고 전하 전달 속도를 높이며 생체 분자 고정을 촉진할 수 있다.

전극 물질, 예를 들어 BP의 성공적인 캡슐화는, XPS, Raman, TEM, AFM 및 Zeta 전위 측정에 의해 확인된다. Raman 스펙트럼의 Ag¹/Ag² 비율> 0.6, CV를 사용한 안정성 분석 및 Zeta 전위 측정은 PAAMI에 의한 전극 물질의 성공적인 캡슐화를 종합적으로 증명한다. 캡슐화 된 전극 물질-PAAMI를 상업적인 전극에 적용하여 면역 감지 플랫폼을 제조할 수 있다. 물리적 및 전기 화학적 특성을 기반으로 개발된 제조 프로세스 및 전략이 전극 물질을 효율적으로 캡슐화 할 수 있음을 보장할 수 있다. 또한 NH₂가 채워진 캡슐화 된 전극 물질은 전기 화학적 효소 감지 바이오 센서로 사용하기에 적합하다.

도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 적층 방식을 이용한 센서전극 및 바이오센서의 제조 프로세스를 도시한 도면,
도 2는 본 발명의 일 실시 예에 따른 화합물을 이용한 센서전극 및 바이오센서 제조 프로세스를 도시한 도면,
도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따른 적층 기반 바이오센서의 성능 분석을 도시한 도면,
도 4는 본 발명의 일 실시 예에 따른 BP의 TEM 이미지: 왼쪽(a, c, e, g)와, BP의 고해상도 TEM 이미지: 오른쪽(b, d, f, h)를 도시한 도면,
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 BP-PAAMI 혼합물의 물성 분석을 도시한 도면,
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 BP-PAAMI 혼합물 기반의 바이오센서 특성 분석결과를 도시한 도면이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

본 발명의 실시 예들을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이며, 후술되는 용어들은 본 발명의 실시 예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예를 상세하게 설명한다. 그러나 다음에 예시하는 본 발명의 실시 예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 다음에 상술하는 실시 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시 예는 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공된다.

본 발명은 전극 상에 전극 물질(흑린: Black Phosphorus: BP, 이하 'BP'라 칭함), 그래핀, MXene, 레이저 합성 그래핀(Laser induced graphene: LIG, 이하 'LIG'라 칭함), 레이저 가공 그래핀(laser ablated graphene: LAG, 이하 'LAG'라 칭함), 탄소나노튜브(Carbon Nano Tube: CNT, 이하 'CNT'라 칭함), 금속나노입자, 금속산화물입자 등)을 안정적으로 증착하고, 특정 바이오마커 또는 체내 생체물질을 검출할 수 있도록 표면을 기능화(functionalization) 하여, 고성능의 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 아민기가 풍부한 양이온성 고분자 전해질을 가지는 폴리알릴아민(Polyallylamine: PAAMI, 이하 'PAAMI'라 칭함)이 코팅되거나 PAAMI로 캡슐화 된 센서전극 및 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것이다. PAAMI가 코팅 되거나 PAAMI로 캡슐화 된 바이오센서를 통해 검출대상을 검출할 수 있다. 이때, 검출대상은 체내 생체물질과 바이오마커를 포함한다. 체내 생체물질은 젖산, 포도당, 콜레스테롤, 아스코르브산 등의 대사 및 다양한 체내 존재하는 생체물질 등이 있다. 바이오마커는 질병 또는 암과 관련이 있는 특정 인자, Interleukin-6, Carcinoembryonic Antigen, Prostate-specific antigen, IgG 등이 있다.

도 1을 참조로 하여 적층(Layer-by-layer) 방식을 이용하여 PAAMI를 코팅하는 센서전극 및 바이오센서의 제조 프로세스에 대해 설명하고, 도 2를 참조로 하여 화합물을 이용하여 PAAMI로 캡슐화 되는 센서전극 및 바이오센서 제조방법에 대해 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 적층 방식을 이용한 센서전극 및 바이오센서의 제조 프로세스를 도시한 도면이다.

도 1을 참조하면, 임의의 기판 상에 전극 물질을 코팅하여 전극을 제조하거나, 기판 상에 레이저 조사를 통해 전극 물질을 형성하여 전극을 제조(도 1a) 한 후, 패시베이션(Passivation)을 수행한다(도 1b). 기판은 예를 들어, 폴리이미드(polyimide: PI, 이하 PI라 칭함)가 있다. PI는 내열성, 내화학성, 전기절연성, 내마모성이 뛰어난 고분자 소재이다. 전극 물질은 예를 들어, 그래핀, MXene, LIG, LAG, CNT, 금속나노입자, 금속산화물입자 등이 있다. 도 1a에서는 CO₂ 마이크로레이저 인그레이빙(Microlaser Engraving)을 통해 PI 필름을 소성(burning) 하고 패시베이션함에 따라 그래핀 소재 전극인 LAG를 제조하는 예를 도시하고 있다.

이어서, PAAMI와 유기용매의 용액을 1:0.5 ~ 1:4의 비율로 섞어서, 상기 전극이 형성된 기판 상에 코팅한다. 코팅 방법은 스핀코팅, 딥코팅, 스프레이코팅, 드롭코팅 등의 다양한 증착 방법을 사용할 수 있다. 아미노기를 갖는 양이온성 중합체인 PAAMI을 사용하여 고정된 항체에 대한 아민기(-NH₂)가 풍부한 부위를 도입하였다. PAAMI는 양이온성 고분자 전해질로, 전극 상에 효소 및 항체와 같은 단백질 고정화에 필요한 아민기를 풍부하게 만들어줄 뿐만 아니라, 정전기적 흡착을 통한 안정성 및 전극의 전하전달속도를 크게 향상시키는 소재이다.

양이온성 고분자 전해질인 PAAMI는 물질 표면에서 π-π 결합과 정전기적 상호작용을 통해 흡착이 되며, 정전기적 반발력으로 인하여 물에서 입자들이 그래핀 기반 물질들이 서로 응집되는 것을 방해한다. 또한, 아민기가 매우 풍부한 양이온성 고분자 전해질인 PAAMI는 효소, 항체 및 압타머 등의 바이오마커 검출 단백질을 고정화할 수 있다.

효소와 항체의 주성분인 단백질에 존재하는 아민기(-NH₂)는 LAG 전극 상에 존재하는 카르복실기(-COOH)과 아미드결합을 생성하여 단단하게 고정화하는 데 매우 중요한 역할을 수행한다.

유기용매로서, n-methyl-2-pyrrolidone(NMP, 이하, 'NMP'라 칭함)를 사용할 수 있다. NMP는 낮은 독성, 높은 생분해성 및 높은 용해도로 인해 PAAMI 분산을 위한 용매로 사용될 수 있다. 도 1c에서는 연소된 LAG 전극을 상이한 시간 간격 동안 1:1-2 비로 PAAMI 및 NMP 유기용매의 용액에 침지시켰다. CV를 사용하여, 용매에 침지된 전극에 대해 1시간 동안 1:1의 비로 최고의 전기 화학적 성능을 측정하였다.

이어서, 0.1 ~ 0.3 V 범위 내에서 작업전극(Working Electrode: WE) 및 상대전극(Counter Electrode: CE) 상에 Pt 나노입자(PtNPs)를 도금할 수 있다. 작업전극(WE)은 100~400초, 상대전극(CE)은 1000~4000초 동안 도금할 수 있다. 도금을 위해 사용되는 용액은 1-10 mM의 H₂PtCl₆과 20-100 mM H₂SO₄ 혼합용액을 사용할 수 있다. 기준전극(Reference Electrode: RE)에는 Ag/AgCl을 도금할 수 있다. 바이오센서의 측정 치수 및 광학 이미지는 각각 도 1e, 도 1f에 도시되어 있다.

이어서, Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC, 이하 'EDC'라 칭함)와 N-Hydroxysuccinimide(NHS, 이하 'NHS'라 칭함)의 혼합용액을 전극 상에 코팅한다. 예를 들어, 5-20 mM 농도의 EDC와 10-40 mM 농도의 NHS의 혼합용액을 전극 상에 떨어트리고, 약 1시간 이상 건조시킨다. EDC-NHS의 혼합용액은 효소, 항체, 압타머 등과 같은 검출 물질을 고정화 하기 위해 사용된다.

이어서, 검출 대상을 검출하기 위한 검출 물질을 고정화 한다. 검출 대상은 체내 생체물질(젖산, 포도당, 콜레스테롤, 아스코르브산 등의 대사 및 다양한 체내 존재하는 생체물질)과 바이오마커(예를 들어, 질병 또는 암과 관련이 있는 특정 인자, Interleukin-6, Carcinoembryonic Antigen, Prostate-specific antigen, IgG 등) 등이 있다. 검출 물질은 효소, 항체, 압타머 등과 같이, 체내 생체물질 또는 바이오마커를 검출할 수 있는 물질을 의미한다.

예를 들어, 면역글로불린 G(immunoglobulin G:　IgG, 이하 'IgG'라 칭함] 항체 용액을 작업전극 상에 떨어트리고, 3-8°C에서 12-24 시간 동안 인큐베이션 한다. IgG는 항체 개별형 중 하나로 혈류에 가장 많은 항체이다. 사람의 경우 혈청에 있는 면역글로불린 총량 중 75%를 차지한다. 또한, 그 외 다양한 체내 생체물질 또는 바이오마커 검출을 위한 효소, 항체, 압타머 등을 대신 사용하는 것이 가능하다.

이어서, 세척 및 건조를 수행한다. 예를 들어, 0.1-3 μg/ml 농도의 bovine serum albumin(BSA, 이하 'BSA'라 칭함) 용액으로 부드럽게 세척하여 작업전극의 불특정 영역을 차단한 후, N₂ 가스 등으로 건조시킨다. 도 1g는 [Fe(CN)₆]^-3/-4에서의 최종장치에 의한 CV 측정을 도시하고 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시 예에 따른 화합물을 이용한 센서전극 및 바이오센서 제조 프로세스를 도시한 도면이다.

도 2를 참조하면, 전극 물질이 주변 환경에 노출되었을 때 쉽게 변성되는 경우 화합물을 이용하여 센서전극 및 바이오센서를 제조할 수 있다. 이를 위해, 전극 물질을 준비하거나 전극 물질을 합성한 후, 준비되거나 합성된 전극 물질을 PAAMI으로 캡슐화(encapsulation)하여 센서전극을 제조한다. 전극 물질은 예를 들어, 그래핀, MXene, LIG, LAG, CNT, 금속나노입자, 금속산화물입자 등이 있다. 이하, 본 명세서에서는 'BP'를 위주로 설명하나, 다른 전극 물질로 대체할 수 있음을 명시한다.

BP 합성 및 캡슐화를 예로 들면, BP를 합성하고, 합성된 BP를 PAAMI으로 캡슐화하여 센서전극을 제조할 수 있다. 세부적으로, 도 2a는 BP 합성(Synthesis of BP)을 도시한 것이고, 도 2b는 BP의 캡슐화(Encapsulation of BP)를 도시한 도면이다.

도 2a에 도시된 바와 같이, NaOH:BP:DMF 혼합용액(농도비율: 1mg:1-3mg:1ml)(Mixing)을 5-10 시간 동안 10-20 °C 의 저온 조건에서 초음파 처리한다(Probe sonication). 이어서, 상기 혼합물을 2000 rpm 이상에서 5분 이상 원심분리한다(Centrifugation).

이어서, 도 2b에 도시된 바와 같이, BP의 캡슐화를 수행한다. 예를 들어, 원심분리 이후 상청액(supernatant)을 PAAMI와 1:1-2의 비율로 혼합한다(Mixing with PAAMI). 그리고 혼합용액을 상온에서 10-20시간 동안 교반한다(Stirred at 1500 rpm).

이어서, 교반한 용액을 소정의 전극 기판(금속, 유기물, 산화물 전극 등) 상에 코팅한다. 코팅방법은 스핀코팅, 딥코팅, 스프레이코팅, 드롭코팅 등의 다양한 증착 방법 등이 있다.

이어서, EDC-NHS 혼합용액을 전극 상에 코팅한다. 예를 들어, 5-20 mM 농도의 EDC와 10-40 mM 농도의 NHS의 혼합용액을 전극 상에 떨어트리고, 약 1시간 이상 건조시킨다. EDC-NHS의 혼합용액은 효소, 항체, 압타머 등과 같은 검출 물질을 고정화 하기 위해 사용된다.

이어서, 검출 대상을 검출하기 위한 검출 물질을 고정화 한다. 예를 들어, IgG 항체 용액을 작업전극 상에 떨어트리고, 3-8°C에서 12-24 시간 동안 인큐베이션 한다.

이어서, 세척 및 건조를 수행한다. 예를 들어, 0.1-3 μg/ml 농도의 BSA 용액으로 부드럽게 세척하여 작업전극의 불특정 영역을 차단한 후, N₂ 가스 등으로 건조시킨다.

도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따른 적층 기반 바이오센서의 성능 분석을 도시한 도면이다.

도 3a는 성능 최적화를 위한 침지시간(dipping time)에 따른 cyclic voltammetry 분석 결과이고, 도 3b는 각 전극 소재 별 임피던스 분석 결과이고, 도 3c 및 도 3d는 IgG 농도에 따른 differential pulse voltammetry 전류응답 특성 및 피크전류 변화를 도시한 것이고, 도 3e는 선택성 분석결과이며, 도 3f는 재현성 분석결과이다.

도 3a는 PAAMI 처리에 대한 침지 시간 최적화를 보여준다. PAAMI 처리 30분 후, 전기 화학적 성능이 증가되었다. 처리 60분 후에 추가로 증가되었다. 90 분 동안, 피크 전류는 약간 증가하였고, 이는 PAMMI 흡착이 포화되었음을 나타냈다. 이 결과는 실제 FESEM 이미지와 일치한다. 공지된 전기 화학 임피던스 분광법을 사용하여 단계적 전기 화학 분석을 수행하였다.

도 3b로부터, 베어(bare) LAG는 PAAMI 처리 후 222Ω으로 감소된 590Ω의 더 높은 전하 전달 저항(charge transfer resistance)(Rct)을 갖는다는 것이 명백하다. Rct 값은 LAG / PAAMI / PtNPs 단계에서 190Ω으로 더욱 감소하여 PtNP가 LAG 부위에 성공적으로 증착되었음을 나타낸다. 과잉 증착으로 인해 응집이 발생하고 PAAMI의 항원 결합 부위가 차단된다. 따라서 이러한 문제를 고려하여 전류 측정 전착 기술을 사용하여 -0.2V에서 200초를 선택했다.

전극의 입자 밀도가 낮아서 전하 전달 저항은 크게 감소하지 않았다. 항체 고정화 후, 항체에 의해 전극 표면 상에 형성된 절연 층으로 인해 Rct 값이 280 Ω으로 약간 증가하였다. LAG / PAAMI / PtNPs / Ab / BSA 단계에서, Rct 값은 이전에 보고 된 바이오센서와 일치하는 BSA의 차단 층으로 인해 291Ω으로 더 증가했다.

분석 파라미터를 최적화한 후, 제조된 바이오센서를 PBS 용액에서 전위 윈도우 (0-0.5) V, 진폭 0.05 V, 펄스 폭 0.05 초, 샘플 폭 0.0067 초 및 펄스주기 1 초에서 차동펄스전압전류법(DPV)을 사용하여 테스트한다. 5Х10^-3m [Fe(CN)₆]^{-3 /-4} 산화환원 프로브를 함유하는 상이한 농도의 IgG 용액의 주입 후, 검출 전류는 점진적으로 감소하였다. 이는 작동 전극 표면 상에 절연성 면역 복합체 층의 형성을 나타냈다. 결과적으로, 도 3c에 도시된 바와 같이 전류의 감소가 있었다. 바이오센서는 도 3d에 도시된 바와 같이 검출 한계가 6pg mL^-1 인 0.012-15 및 15-352 ng mL^-1 사이의 선형 관계를 나타냈다.

분석 성능은 다른 바이오센서와 비교하여 항-IgG / PtNPs / PAAMI / LAG 바이오센서가 충분한 검출을 나타내는 것으로 관찰되었다. 항-IgG / PtNPs / PAAMI / LAG의 선택성 실험은, IgG(15ng mL^-1), 주사 없음(no injection: NI), 전립선 특이 항원(prostate specific antigen: PSA)(25ng mL^-1), 도파민(DA, 0.1×10^-9 mL^-1), 아스코르브산(AA, 15×10^-6 mL^-1), 글루탐산(glu, 50×10^-6 mL^-1) 및 트롬빈(throm, 50 μg mL^-1)을 사용하였다. 모든 측정은 5Х10^-3 m [Fe(CN)₆]^{-3 /-4}에서 DPV 기술을 사용하여 3 회 관찰되었다. 도 3e에 도시된 15ng mL^-1 IgG 주사의 경우, 검출 전류가 상당히 감소하였고, 이는 본 발명의 바이오센서가 IgG에 대해 높은 선택성을 가짐을 시사한다. 또한, AA(0.1×10^-6m mL^-1) 주입 시, 검출 전류가 약간 증가했으며, 이는 전극의 PtNP에 의한 AA의 비 효소 산화로 인해 발생했을 수 있다.

본 발명의 바이오센서의 재현성을 도 3f에 도시된 바와 같이 5×10^-3m [Fe(CN)₆]^{-3 /-4}에서 25ng mL^-1 IgG의 존재 하에 7 개의 샘플로 검사 하였다. 본 발명의 바이오센서는 1.63 %의 상대 표준 편차를 나타내었으며, 이는 제안된 전략이 재현 가능함을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 일 실시 예에 따른 BP의 TEM 이미지: 왼쪽(a, c, e, g)와, BP의 고해상도 TEM 이미지: 오른쪽(b, d, f, h)를 도시한 도면이다.

도 4를 참조하면, BP 부위의 몇 층이 합성되었음을 보여준다. BP 부위의 결정 구조는 고해상도 TEM을 사용하여 추가로 조사되었다. 평면 간 거리는 각각 (002), (004), (021) 및 (020) 평면의 결정 방향에 해당하는 0.22, 0.27, 0.32 및 0.55 nm 인 것으로 밝혀져 있다. 따라서 이러한 이미지는 벌크 BP에서 성공적인 BP 나노 시트 합성을 보여준다

도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 BP-PAAMI 혼합물의 물성 분석을 도시한 도면이다.

세부적으로, 도 5a는 BP의 P2p XPS 스펙트럼, 도 5b는 BP-PAAMI의 P2p XPS 스펙트럼, 도 5c 및 도 5e는 BP와 PAAMI의 P2p, O1s, N1s intensity 비교 그래프, 도 5f는 BP-PAAMI의 Raman 스펙트럼 비교를 도시한 것이다.

준비된 BP 및 BP-PAAMI 혼합물(composite)의 화학적 상태를 이해하기 위해서, 도 5a 내지 도 5d에 도시된 바와 같이 X선 광방출분광법(XPS)을 사용하였다. 도 5a, 도 5b는 BP 및 BP-PAAMI의 p2p 코어 레벨 스펙트럼을 보여준다. BP 및 BP-PAAMI에 대한 p2p 스펙트럼은 각각 약 (130.48 eV 및 131.31 eV) 및 (130.16 eV 및 131.10 eV)에서 2p^3/2 및 2p^1/2 이중선(doubles)으로 디컨볼루트(deconvoluted) 되었다. 광대역은 BP의 경우 (133.44eV, 134.28eV 및 134.70eV) 및 BP-PAAMI의 경우 (132.24eV, 133.17eV, 133.74eV)에서 P-O-P, O=P-O 및 P-O로 추가로 디컨볼루트 될 수 있다. 또한, 135.30 eV 및 134.62 eV의 서브 밴드(sub-bands)는 각각 BP 및 산화된 BP (즉, PO^x, x <5)에 할당될 수 있다.

도 5c는 BP 및 BP-PAAMI의 O1s XPS 스펙트럼을 보여준다. 상대적으로 더 높은 BP 강도는 더 높은 산화 또는 더 높은 산소 부분의 존재를 나타낸다. BP-PAAMI 피크는 상대적으로 덜 강하다. 결과적으로 O1s 스펙트럼은 PAAMI를 사용한 BP의 성공적인 캡슐화를 보여준다.

반면에 BP-PAAMI에 대한 N1s 스펙트럼의 상대 피크 강도는 BP의 것보다 상당히 높으며, 이는 도 5d에 도시된 바와 같이 -NH₂ 기가 풍부한 PAAMI에 의한 캡슐화에 기인한다. 따라서, XPS 분석 결과에서 BP는 PAAMI로 성공적으로 캡슐화되었다고 요약할 수 있다.

BP의 성공적인 박리(exfoliation)를 확인하고 포스포렌 층(phosphorene layer)을 특성화하기 위해, 도 5f에 도시된 바와 같이 라만 분광법(Raman spectroscopy)을 사용한다. Ag² (평면에서) 포논 모드(phonon modes)의 민감도의 청색 또는 적색 편이가 BP 층의 감소 또는 증가를 제공하기 때문에, 벌크 BP(bulk BP)에 대한 라만 산란도가 더 나은 비교를 위해 테스트되었다. 벌크 BP의 Ag¹ (평면 밖), B_2g (평면 내) 및 Ag² (평면 내) 포논 모드는 각각 ~ 353.8cm^-1, ~ 424.5cm^-1 및 ~ 452.4cm^-1에서 얻어진다. 이에 비해, BP의 경우 및 BP-PAAMI 값은 각각 ~ 361.7cm^-1, ~ 438.5cm^-1 및 ~ 466.3cm^-1이며, 이는 다른 연구와 일치한다. 또한 벌크 BP, BP 및 BP-PAAMI의 Ag¹/Ag² 값은 각각 ~ 0.54, ~ 0.74 및 ~ 0.76이었다. Ag¹/Ag² 비율 값> 0.6은 낮은 산화에 대한 유망한 증거를 제시하기 때문에, 제조된 PAAMI 캡슐화된 BP-PAAMI는 결과적으로 주변 요인에 대한 높은 저항성을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 BP-PAAMI 혼합물 기반의 바이오센서 특성 분석결과를 도시한 도면이다.

세부적으로, 도 6a는 PAAMI 농도 최적화를 위한 cyclic voltammetry 특성 비교, 도 6b는 cyclic voltammetry 안정성 테스트 결과(25회 반복), 도 6c는 BP-PAAMI, BP-PAAMI-Ab, BP-PAAMI-Ab-BSA의 cyclic voltammetry 특성 비교, 도 6d 및 도 6e는 diffusion controlled process 분석을 위한 scan rate에 따른 전류 변화 특성 비교, 도 6f 및 도 6g는 differential pulse voltammetry를 이용한 IgG 검출 및 농도에 따른 피크전류 변화, 도 6h는 선택성 분석 결과, 도 6i는 재현성 분석 결과를 도시한 것이다.

BP:PAAMI 비율을 최적화하기 위해 준비된 BP 솔루션을 세 가지 비율 (1 : 1), (1 : 2) 및 (2 : 1)로 PAAMI와 혼합하였다. 준비된 복합 용액을 세척된 GCE 전극에 적하 주조(drop cast) 하고, 실온에서 밤새 건조시킨 후 5mM [Fe(CN)₆] ^{-3 /-4}를 갖는 PBS 용액에서 3개 샘플의 CV 값을 측정하였다. CV 분석 결과에 따르면, 비율 (1:2) 샘플은 도 6a에 도시된 바와 같이 우수한 전기 화학적 성능을 나타낸다. 이것은 양이온 고분자 전해질이 많을수록 전자 전달 속도가 증가한다는 것을 나타낸다. 따라서, 추가 실험을 위해 (1:2) 비율이 선택되었다.

제조된 복합재의 화학적 안정성은 도 6b에 도시된 바와 같이 5mM [Fe(CN)₆]^-3/-4 산화 환원 프로브를 보유한 PBS 용액에서 100mV/s 스캔 속도로 50 개의 세그먼트에 대해 CV를 사용하여 추가로 테스트되었다. CV 2μA의 50 세그먼트 후 전류 감소를 보여주며, 이는 본 발명의 복 BP-PAAMI 혼합물이 더 나은 화학적 안정성을 나타냄을 나타낸다.

바이오센서의 제조 단계는 CV를 사용하여 확인된다. BP-PAAMI 처리 후, 산화 환원 피크 전류는 도 6c에 도시된 바와 같이 크게 증가한다. 항체 고정 후, 산화 환원 전류는 항체의 절연 거동으로 인해 약간 감소한다. 마지막으로, BSA 처리 후, 현상된 전극 상단에 형성된 차단 층으로 인해 산화 환원 전류가 훨씬 더 감소했는데, 이는 이전 연구와 일치한다.

BP:PAAMI 변형 바이오센서의 확산 제어 과정을 확인하기 위해 10 ~ 125mV/s 스캔 속도로 5mM [Fe(CN)₆]^-3/-4 산화 환원 프로브가 있는 PBS 용액에서 CV를 채취했다. 도 6d에 도시된 바와 같이, 산화 환원 피크 전류(redox peak currents) 대(vs) 스캔 속도(scan rate)의 제곱근(square root) 간의 관계는 상관계수(R²) 값이 0.989 (양극) 및 0.995 (음극) 인 선형관계를 보여준다. GCE/BP : PAAMI 전극은 확산 제어 프로세스를 의미하는 선형 관계를 나타낸다.

분석 매개 변수를 최적화한 후 제안된 바이오센서를 사용하여 펄스 폭 0.05 초, 진폭 0.05V 및 샘플 폭 0.0167초에서 잘 확립된 차동펄스전압전류법(DPV)을 사용하여 IgG 바이오마커를 검출했다. IgG 바이오마커를 보유한 용액을 0 ~ 748 ng / mL의 다양한 농도로 주입하고 10분 동안 자기적으로 교반했다. 결국, 해당 농도에 대한 DPV 반응이 도 6f에 도시된 바와 같이 기록되었다.

BP-PAAMI / anti-IgG에 대한 간섭 실험은 IgG (15ng mL^-1), 블랭크(blank), 아스코르브산(AA, 15 μM L^-1), 전립선 특이항원(PSA, 25ng mL^-1), 도파민(DA, 0.1nM L^-1), 요산(UA, 0.35mM L^-1), 트롬빈(throm, 50μg mL^-1) 및 AA + IgG (15μM L^-1 + 15 ng mL^-1, 각각)의 존재에서 평가되었다. 모든 측정은 5mM [Fe(CN)₆]^-3/-4의 존재 하에 DPV 방법을 사용하여 3 회 수행되었다.

도 6h에 표시된 15ng mL^-1 IgG 주입 후 DPV 피크 전류가 크게 감소하여 개발된 바이오센서가 다른 간섭물질 중에서 IgG를 구별할 수 있음을 나타낸다. 또한, (AA + IgG) 주입 후 피크 전류도 감소했다. 따라서 바이오센서 표면은 많은 수의 항체를 고정시킬 수 있으며, 이는 차례로 IgG 바이오마커에 대한 높은 선택성을 나타낸다.

제안된 바이오센서의 재현성은 도 6i에 도시된 바와 같이 5mM [Fe(CN)₆]^-3/-4에서 25ng mL^-1 IgG의 존재 하에 8 개의 샘플로 입증되었다. 재료 합성 및 캡슐화의 단순성으로 인해 준비된 바이오센서는 3.59 %의 상대 표준 편차를 보여 개발된 전략을 재현할 수 있음을 나타낸다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

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6. 전극 물질을 준비하거나 합성하는 단계; 및
   준비 또는 합성된 전극 물질을 폴리알릴아민으로 캡슐화 하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
7. 제 6 항에 있어서, 전극 물질을 준비하거나 합성하는 단계는
   NaOH, 전극 물질 및 DMF를 혼합(Mixing) 하는 단계;
   NaOH:전극 물질:DMF 혼합용액을 초음파 처리하는 단계; 및
   혼합물을 원심분리(Centrifugation) 하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
8. 제 6 항에 있어서, 캡슐화 하는 단계는
   원심분리 이후 상청액(supernatant)을 PAAMI와 혼합(Mixing) 하는 단계;
   혼합용액을 상온에서 교반 하는 단계; 및
   교반한 용액을 소정의 전극 기판 상에 코팅하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
9. 제 6 항에 있어서, 바이오센서 제조방법은
   Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-Hydroxysuccinimide(NHS)의 혼합용액을 전극 상에 코팅하는 단계;
   검출 대상을 검출하기 위한 검출 물질을 고정화 하는 단계; 및
   세척 및 건조 단계;
   를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
10. 삭제
11. 준비 또는 합성된 전극 물질; 및
    준비 또는 합성된 전극 물질을 캡슐화 하는 폴릴알릴아민;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서전극.

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