KR102510013B1

KR102510013B1 - 생체분자의 고감도 검출을 위한 고밀도 정렬 cnt 기반의 바이오센서 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102510013B1
Application number: KR1020200068515A
Authority: KR
Inventors: 박찬범; 박 스티브; 김가영; 김민지; 김다원; 김수영
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2023-03-15
Also published as: KR20210151547A

Abstract

본 발명은 생체분자의 고감도 검출을 위한 고밀도 정렬 CNT 기반의 바이오센서의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 바이오센서 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서 제조방법을 통해, 비표적 분자에 대한 교차반응성 없이 펨토몰 수준으로 존재하는 표적 분자의 검출이 가능한 현재 보고된 최고 수준의 성능을 갖는 바이오센서를 제조할 수 있다.
특히, 환자의 샘플에 수 펨토몰 수준으로 존재하는 바이오마커를 정확히 검출해 낼 수 있으며, 기존의 침습적이거나 시간적/금전적으로 경제적이지 못한 신경퇴행성질환의 바이오마커 검출 및 진단방법을 벗어나 적은 비용으로 정확도 높은 바이오마커의 검출 및 진단이 가능하다. 본 발명의 바이오센서의 제조방법 및 바이오센서는 신경퇴행성질환뿐만 아니라, 낮은 농도 및 간섭 물질의 존재로 검출이 어려웠던 바이오마커들의 정확도 높은 검출을 통해 다양한 의료 분야의 진단, 예후 예측, 발병 가능성 예측 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 의료 목적 이외에도, 표적 분자의 검출을 통해 환경, 식품, 군사, 산업, 연구 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생체분자의 고감도 검출을 위한 고밀도 정렬 CNT 기반의 바이오센서 및 이의 용도{Densely aligned Carbon Nanotubes-based Biosensor for accurate sensing of Biomolecules and Use thereof}

본 발명은 생체분자의 고감도 검출을 위한 고밀도 정렬 CNT 기반의 바이오센서의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 바이오센서 및 이의 용도에 관한 것이다.

개선과 의학기술의 발달로 인한 인간수명의 연장은 고령화 사회의 도래를 초래하였다. 이에 따라 단순 수명연장뿐만 아니라 삶의 질 향상을 위한 관심이 증가하고 있고 이에 따라 건강관리나 건강검진의 수요는 매년 기하급수적으로 증가하고 있다. 하지만 기존의 검사는 채혈에서부터 결과를 받기까지 비교적 오랜 시간이 걸리고 병원을 방문해야 하는 등 불편함을 감수해야 한다.

최근 이러한 문제를 해소하고 질병의 조기 진단 및 자가 검진을 가능하게 하는 바이오센서의 연구가 활발히 진행되고 있다. 바이오센서란 특정 생물학적 분석대상 물질의 존재 유무와 그 농도를 측정할 수 있는 장치를 말한다. 특정한 생물학적 물질을 이용하여 분석대상 물질과의 반응에서 나타나는 전기화학적 반응, 열에너지, 형광 및 색 변화 등을 사람이 인식 가능한 신호로 변화시켜주는 장치와 결합되어 구성된다(한국과학 기술정보연구원(박영서)).

지난 수십 년간 탄소나노튜브의 합성, 성장 및 다양한 응용분야에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 중 나노튜브를 트랜스듀서로 이용하는 바이오센서가 많은 관심을 받고 있다. 나노튜브를 이용한 바이오센서는 전기적인 신호를 처리하기 때문에 표지 필요 없고, 장치의 소형화가 가능하며, 검출시간이 빠르고, 실시간 검출이 가능하다. 하지만 CNT 기반의 바이오센서가 상용화 단계에 접어들기 위해 서는 해결해야 할 과제들이 많이 남아있다. 특히 CNT 표면처리 기술은 다양한 기술들이 개발 중이지만 아직 체계적이고 상용화에 이를 만큼 진행되지 못하였으며, 특히 CNT 기반의 바이오센서 기술은 초보적인 단계에 있다. 따라서 나노튜브 기반의 바이오센서에 대한 특성과 현황에 대한 이해가 필요하다

탄소동소체의 한 종류인 탄소나노튜브(CarbonNanotube, CNT)는 직경이 수 내지 수십 nm이며, 길이가 수백 μm에 서 수 mm인 물질로 1991년 Iijima 박사에 의해 Nature 저널에 보고된 이후 우수한 열적, 전기적, 물리적 성질과 높은 종횡비 때문에 다양한 분야에서 연구가 진행되어왔다.

탄소나노튜브를 기반으로 한 다양한 나노소자의 응용은 세계의 많은 연구기관에서 수 많은 논문, 특허 등으로 나오고 있는 실정이다. 미국 하버드 대학교의 그룹의 연구원들은 2009년 전계효과 트랜지스터형 바이오센서에서 탄소나노튜브를 채널로 이용하여, 바이오 물질의 표면전하의 변화를 고감도로 정한 결과를 소개하였다(Charles M. Liber 등. Science,2001, 293, 1289). 이후 기술이 발달하면서 효소 반응에 의해 표면에 큰 전하의 변화를 측정하다가 단백질-단백질 결합의 미세한 표면전하의 변화를 측정하게 되었고 최근에는 단백질의 접근에 따른 표면장의 변화를 측정하는 수준에 이르렀다. 2005년 충남대학교와 화학연구원의 연구진들이 탄소나노튜브 전계효과 트랜지스터(CNT-FET)를 이용한 바이오센서의 개념을 소개하였다. 이는 탄소나노튜브 표면에 CDI-Tween20을 링커로 하여 DNA 압타머 (aptamer)를 부착시켜 압타머 자체의 음전하가 표적 물질과 결합하였을 때 음전하가 사라지면서 탄소 나노튜브를 통한 전기 전도도가 감소하는 특징을 이용하는 것으로서, 특정 타깃 분자를 10 nM 수준으로 측정하여, 고성능의 CNT-FET 바이오센서를 구현하였다(Hye-Mi So 등, J. AM. Chem. Soc., 2005, 34, 11906). 상기와 같은 꾸준한 연구가 지속되어, 탄소나노튜브 표면과 검출에 필요한 바이오 물질간의 결합 거리가 가까울수록 감도의 증가를 얻을 수 있다는 사실을 발표하고 CNT-FET 센서를 이용하여 1.8 nM의 IgE 검출에 성공하여 산업적 응용 가능성을 증대시켰다(Kenzo Maehashi 등, Anal. Chem., 2007, 79, 782).

그러나, 이러한 많은 연구의 노력에도 불구하고 아직까지 탄소나노튜브를 이용한 바이오센서의 응용은 검출물질이 1nM이하와 같은 저농도를 가지는 경우에 대한 연구결과는 거의 보고된 바 없다.

한편, 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)은 중추신경계의 뇌와 척수 세포가 퇴화 또는 소실 등의 이유로 인하여 표현적인 기능장애로 나타나는 질환을 의미한다. 중추 신경계의 신경세포 뉴런은 운동을 조절하고 감각정보를 처리하며 기억, 의사결정 등의 다양한 기능을 수행하는 데 신경퇴행성질환은 이러한 뉴런과 수초의 이상으로 기능 이상 및 장애가 발생되는 질병이다. 미국 국립 보건원의 National Institute of Neuro-logical Disorders and Stroke에 의하면 600 종류 이상의 신경퇴행성질환이 있는 것으로 알려져 있다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 가장 흔한 형태(전체 치매질환의 60~80%)의 치매성 질환으로 1906년 독일의 정신과 의사인 알로이스 알츠하이머(Alois Alzheimer)에 의해 알려졌다. 세계적으로 알츠하이머병은 65세 이상의 10명 중 1명꼴로 발병하여 점진적인 기억상실 및 인지기능 장애를 일으킨다. 인간을 대상으로 처치 가능한 알츠하이머병의 근본적인 치료방법은 거의 전무한 수준이며 임상 수준에서는 증상을 완화시키고 진행을 지연시키는 방안이 사용되고 있어, 발병의 예측 및 조기진단이 특히 중요하며, 조기 진단만으로 알츠하이머로 인해 겪는 고통을 1/3으로 줄일 수 있다고 최근 보고된 바 있다.

알츠하이머와 같은 신경퇴행성질환의 주요한 병리학적 특징은 아밀로이드 베타(Amyloid-β, Aβ) 펩타이드 및 신경 섬유가 뒤엉켜 생성되는 신경성 플라크(neuritic plaques)이다(Karran, E., et al. Nat. Rev. Drug Discov. 10, 698 (2011); 6. Bieschke, J. et al. Nat. Chem. Biol. 8, 93 (2011)). Aβ 펩타이드의 응집은 미세소관 연관 타우 단백질(tau protein)의 과인산화 및 세포 내 타우 응집체의 형성을 포함하는 병원성 캐스케이드를 개시함으로써, 시냅스 기능장애, 뉴런 사망 및 인지능력의 손실을 초래한다(Polanco, J. C. et al. Nat. Rev. Neurol. 14, 22 (2017)). 종단 및 단면 연구(longitudinal and cross sectional study)에 따르면(Blennow, K. et al. Alzheimer’s Dement. 11, 58-69 (2015); Benzinger, T. L. S. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, E4502 (2013)), Aβ42의 수준, 인산화 타우 단백질(p-tau), 및 총 타우 단백질의 수준은 알츠하이머 증상이 나타나기 10~15년 전부터 변화하기 시작하며, 임상 연구에 따르면 알츠하이머 환자의 뇌척수액(CSF)에서 t-tau 단백질의 농도는 정상 대조군보다 2~3 배 높은 반면, Aβ42는 건강한 환자와 비교할 때 AD환자에서 약 40% 감소하는 경향을 나타낸다(Shaw, L. M., et al. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 295 (2007)).

최근 혈장 내 알츠하이머 바이오마커 수준과 뇌의 병리학적 변화 사이의 강한 상관관계가 보고되었다(Nakamura, A. et al. Nature 554, 249 (2018); Park, J.-C. et al. Brain 142, 771-786 (2019)). 요추천자(lumbar puncture)를 통한 CSF 샘플링 과정은 침습성 및 접근성 부족과 같은 심각한 단점을 가지고 있기 때문에(13), 검증된 혈액 기반의 바이오마커 패널은 일차 진료 환경(Primary care setting)에서 알츠하이머 환자의 최소 침습적 진단과 질병 진행의 지속적인 모니터링을 가능하도록 한다. 위와 같은 혈장 내 바이오마커의 가능성 및 유용함에도 불구하고, 혈장 내 바이오마커의 농도는 CSF 내의 바이오마커의 농도보다 10~102배 낮으며, 혈액 또는 혈장 시료에는 많은 종류의 간섭 물질들이 높은 수준으로 포함되어 있어 정확도 및 신뢰도 높은 바이오마커의 검출이 어려우며(14), 광학 장치 또는 질량 분석을 기반으로 하는 방법의 경우 고가의 특수장비가 필요하며, 유용성 및 간편성이 떨어진다(Nakamura, A. et al. Nature 554, 249 (2018); Zhu, L. et al. Adv. Mater. 29, 1700057 (2017)).

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 바이오마커 포함 농도가 매우 낮고, 많은 종류의 간섭물질이 높은 농도로 포함된 시료로부터 보다 정확도 및 신뢰도 높은 바이오센서를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 랭뮤어-블로젯(langmuir-blodgett) 방법을 개량 및 최적화하여 고밀도-단방향 CNT 필름 기반의 바이오센서를 제작하였으며, 상기 바이오센서가 현재까지 보고된 CNT 기반의 바이오마커 감지 플랫폼 중 가장 뛰어난 정밀도, 민감도 및 정확도로 표적 바이오마커의 검출이 가능한 것을 확인하였다.

나아가, 상기 고밀도-단방향 CNT 기반의 바이오센서가 유사밀도의 비정렬 CNT 기반의 바이오 센서보다 2배에서 3배 높은 최저수준(펨토몰)의 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ), 6배 낮은 디바이스간 저항 변동계수(<6%) 등 현저히 뛰어난 특성을 나타내는 것을 확인하여, 단방향의 높은 정렬도가 탄소나노튜브간의 접합을 방지하여, 바이오센서의 민감도 및 정확도를 향상시키는 것을 확인하였다.

또한, 상기 고밀도-단방향 CNT 기반의 바이오센서 어레이를 사용하여, 인간 혈장에 수 펨토몰 수준으로 포함되어 있는 복합 알츠하이머 바이오마커(Aβ40, Aβ42, p-tau 및 t-tau)를 교차 반응성 없이 검출 및 정량하였으며, 계산된 t-tau/Aβ42, p-tau/Aβ42 및 Aβ42/Aβ40의 진단 기준 값을 기반으로하여, 평균감도 90%이상 평균정확도 88.6% 이상의 높은 민감도 및 정확도를 가지고 알츠하이머 환자와 정상대조군을 구분 동정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 많은 종류의 간섭 물질이 높은 농도로 존재하는 시료 또는 샘플에 펨토몰 수준으로 함유된 표적 분자의 검출이 가능한 매우 높은 정밀도, 민감도, 및 정확도를 가지는 바이오센서의 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된 바이오센서를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 대상으로부터 분리된 샘플에 포함된 신경퇴행성질환의 바이오마커를 검출하여, 높은 민감도, 선택도 및 정확도로 신경퇴행성질환의 예측 및 진단이 가능한 바이오센서 및 상기 바이오센서를 사용한 진단방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소나노튜브(CNT)를 콘쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer)로 랩핑하는 단계; 콘쥬게이트화 폴리머로 랩핑된 CNT를 액체-공기 계면에서 압축 및 후퇴 사이클을 반복하여 고밀도-단방향 CNT를 수득하는 단계; 상기 고밀도-단방향 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사(transfer)하는 단계; 상기 필름에서 콘쥬게이트화 폴리머를 제거하는 단계; 고밀도-단방향 CNT 필름에 소스 및 드레인 전극을 패턴화하여 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 제조하는 단계; 및 패턴화된 고밀도-단방향 CNT 필름에 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질을 고정하는 단계를 포함하는 고밀도-단방향 탄소나노튜브(CNT) 필름 기반 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 바이오센서 및 상기 바이오센서를 둘 이상 포함하는 바이오센서 어레이를 제공한다.

본 발명은 또한, 분리된 샘플로부터 상기 바이오센서를 사용하여 p-tau, t-tau, Aβ40 및 Aβ42를 검출하는 단계; 검출된 각각의 신경퇴행성질환의 바이오마커를 정량하는 단계; 및 t-tau/Aβ42, p-tau/Aβ42 및 Aβ42/Aβ40 (M/M)값이 정상 대조군의 값보다 높은 경우, 대상을 신경퇴행성질환의 위험군으로 동정(identify)하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단방법을 제공한다.

본 발명의 바이오센서 제조방법을 통해, 비표적 분자에 대한 교차반응성 없이 펨토몰 수준으로 존재하는 표적 분자를 선택적으로 인식할 수 있는 종래 보고된 탄소나노튜브 기반의 바이오센서 중 최고 수준의 정밀도, 민감도 및 정확도를 갖는 바이오센서를 제조할 수 있다.

특히, 신경퇴행성질환 환자의 혈장 샘플에 수 펨토몰 수준으로 존재하는 바이오마커를 별다른 처리 없이 상기 바이오센서만으로도 정확히 검출해 낼 수 있으며, 기존의 침습적이거나 시간적/금전적으로 경제적이지 못한 신경퇴행성질환의 바이오마커 검출 및 진단방법을 벗어나 적은 비용으로 정확도 높은 바이오마커의 검출 및 진단이 가능하도록 한다.

본 발명의 바이오센서의 제조방법 및 바이오센서는 신경퇴행성질환뿐만 아니라, 낮은 농도 및 간섭 물질의 존재로 검출이 어려웠던 바이오마커들의 정확도 높은 검출을 통해 다양한 의료 분야의 진단, 예후 예측, 발병 가능성 예측 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 의료 목적 이외에도, 표적 분자의 검출을 통해 환경, 식품, 군사, 산업, 연구 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 AD 바이오마커의 검출을 위해 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이를 개략적으로 나타낸 것이다. 상기 고밀도-단방향 CNT는 바이오센서가 펨토몰 수준의 민감도 및 높은 센서간 신뢰성을 나타내도록 하며, 혈장에서 바이오센서를 검출하는 경우 약88.6%의 정확도를 나타내었다.
도 2는 랭뮤어 블로젯 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 2a는 DCE 용매에 분산된 CNT를 수면에 띄운 것을 나타낸 것이며, 도 2b는 이동 막대를 사용하여 CNT에 압축을 하는 것을 나타낸 것이다. 본 발명에서는 압축-후퇴를 반복하여 고밀도-단방향 정렬된 CNT를 제조하였다.
도 3은 물과 DCE의 표면장력을 나타낸 개략도이다. DCE는 CH2Cl2의 화학식을 갖는 비극성 용매이므로, 물에 불용성이고 수면에 잘 퍼진다. 정량적으로 확산계수 (S) 는 다음 식에 의해 계산될 수 있다:
S = γW - (γD + γW-D)
여기서 물의 표면장력(γW)=72.3 mN/m, DCE의 표면장력(γD)=28.2 mN/m, 및 물과 DCE사이의 표면장력(γW-D)=32.1 mN/m이다. 확산계수(S)가 양의 값이면 용액이 물에 분산퍼지며, 계산된 확산계수는 12.0 mN/m로 CNT가 물-공기 계면에서 잘 분산될 수 있음을 나타낸다.
도 4a는 일정한 표면 압력(π = 35 mN/m)에서 압축-후퇴 사이클의 횟수를 달리하여 제작된 CNT 필름의 SEM 이미지이다. 10회 이상의 사이클링으로 제조된 CNT 필름은 고밀도-단방향 정렬된 CNT를 나타냈으며, 10회 이하의 경우 다수의 루프를 확인할 수 있다.
도 4b는 일정한 압축-후퇴 사이클 횟수(10회)에서 최종 압력을 달리하여 제작된 CNT 필름의 SEM 이미지이다. 35mN/m 이상의 최종 압력으로 압축된 CNT 필름은 고밀도-단방향 정렬된 CNT를 나타냈으며, 그 이하의 압력으로 압축된 경우 다수의 루프를 확인할 수 있다. 도 4a 및 4b에서 스케일바는 1μm이다.
도 5는 압축-후퇴 사이클동안 등온 곡선(Isotherm curves)을 나타낸 것이다. 도 5a는 총 10회의 압축-후퇴 사이클, 최종 압력 35mN/m에 도달할 때까지 단계적으로 압력을 증가시켰으며, 각각의 그래프는 1, 3 및 10 사이클을 반복한 경우에 등온 곡선을 나타낸다. 점진적인 압력 증가에 의한 압축-후퇴 사이클은 무시할만한 히스테리시스를 나타낸다. 도 5b는 표면 압력 35mN/m의 한번의 압축시의 등온곡선이며, 큰 히스테리시스를 나타낸다.
도 6은 제조된 고밀도-단방향 CNT 필름의 특성을 나타낸다. 도 6a 및 6b는 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 필름의 SEM 및 AFM 이미지를 나타내며 스케일바는 각각 250nm 및 500nm을 나타낸다. 도 6c는 633nm 입사 레이저 및 CNT 피름의 정렬 방향 사이의 다양한 각도에서 기록된 고밀도-단방향 CNT 필름의 편광 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다. 삽입된 그림은 1595cm-1에서 라만 강도의 각도 의존성을 나타낸다. 파란색 실선은 cos2α function과 일치한다. 도 6d는 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 디바이스와 유사한 밀도의 랜덤 네트워크 CNT 디바이스의 감지성능을 비교하여 나타낸 것이다. 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 및 랜덤 네트워크 CNT의 밀도는 각각 345 및 339 CNTs/μm이다. 각각의 데이터 포인트마다 다른 디바이스의 세트가 사용되었으며, 2번의 추가적인 반복실험을 통해 데이터 재현성을 확인하였다. 모든 값은 평균 ± SD 값이다. 도 6e는 고밀도-단방향 CNT 디바이스 어레이의 CV를 나타낸 것으로, 랜덤 네트워크 CNT 디바이스 어레이의 CV보다 약 6배 낮은 값을 나타내어 디바이스간 신뢰도가 현저히 높음을 검증하였다.
도 7은 단일 압축으로 전사된 CNT 필름의 SEM 이미지이다. 압축-후퇴 사이클을 통해 제조된 CNT 필름과 비교하여, 많은 수의 루프가 CNT 필름에서 관찰되었다. 스케일 바는 500nm이다.
도 8은 랜덤 네트워크 CNT 필름의 특성을 나타낸 것이다. 도 6a는 종래의 스핀 코팅방법을 사용하여 제조된 랜덤 네트워크 CNT 필름의 SEM 및 AFM이미지이다. 랜덤 네트워크 CNT 필름을 제조할 때, 본 발명의 CNT 필름과 동일한 CNT 용액을 사용했다. 각 SEM 및 AFM 이미지의 스케일 바는 250nm 및 500nm을 나타낸다. 도 8b는 633nm 입사 레이저 및 CNT 피름의 정렬 방향 사이의 다양한 각도에서 기록된 고밀도-단방향 CNT 필름의 편광 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다. 삽입된 그림은 1595cm-1에서 라만 강도의 각도 의존성을 나타낸다. 회전 각도가 증가하더라도 라만 강도의 변화경향이 관측되지 않았다.
도 9는 열처리 전 후의 PmPV 및 PmPV-랩핑된 CNT 필름의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 각각의 피크는 PmPV 중합체 구조에서 특징적인 작용기를 나타낸다. Ar 대기의 열처리에 의한 어닐링에 의해 PmPV가 효과적으로 제거되었음을 확인하였다.
도 10은 아르곤(Ar) 대기의 450℃의 열처리를 통한 어닐링으로 PmPV를 제거하기 전(a), 후(b)의 SEM 및 AFM 이미지를 나타낸 것이다. 열처리를 통한 어닐링은 LB 증착된 CNT의 컬링 또는 롤링을 유발하지 않았다. SEM 및 AFM 이미지의 스케일바는 각각 1μm 및 500nm을 나타낸다.
도 11은 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질의 고정을 통한 CNT 디바이스의 기능화를 나타낸 것이다. 도 11a는 바이오 리셉터로 CNT의 표면을 기능화하는 과정을 나타내는 개략도이다. 바이오 리셉터로 고정하기 전에 UV-ozone 처리를 통해 CNT 디바이스의 표면을 카르복실기로 기능화하였다. 도 11b는 UV-ozone 유도된 산화에서 고밀도-단방향 CNT 필름 및 랜덤 네트워크 CNT 필름의 ID/IG 값의 변화를 나타낸 것이다. UV-ozone 처리 시간이 증가함에 따라 ID/IG의 값이 점차 증가하였다. 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다 (n = 3).
도 12는 순수, horn 초음파, 및 UV-ozone 처리된 CNT 필름의 ID/IG 값을 비교한 것이다. CNT 용액의 제조를 위해 사용된 초음파 처리는 CNT의 결함 비를 증가 시켰지만 UV- 오존 처리 된 CNT보다 훨씬 적은 정도에 불과했다. UV 오존 처리된 CNT 필름의 평균 ID/IG는 약 1.0인 반면 초음파 처리된 CNT 필름의 평균 ID/IG는 0.19에 불과했다. 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다 (n = 3).
도 13은 UV-ozone 처리 전(a) 및 후(b)의 고밀도-단방향 CNT 필름의 X-선 광전자 분광 스펙트럼(X-ray photoelectron spectroscopic (XPS) spectra)을 나타낸 것이다. UV-ozone 처리를 통한 CNT의 산화 후, C=O에 할당 된 XPS 피크가 새롭게 나타났으며 CNT 표면상의 산소 분자의 함량은 7.4 %에서 16.9 %로 점차 증가하였다.
도 14는 CNT 표면에 공유결합된 FITC(Fluorescence intensity of fluorescein isothiocyanate)-표지된 항-IgG 분자의 형광 강도를 나타낸 것이다(λex= 490 nm, λem=525 nm). 카르복실기로 기능화된 CNT 필름을 카 보디이미드 가교제(carbodiimide crosslinker)를 사용하여 FITC- 표지된 항-IgG와 접합시켰다. 접합여부는 EDC 및 설포-NHS의 농도가 증가함에 따라 형광 강도의 증가에 의해 확인되었다. EDC : 설포-NHS의 농도비는 1 : 2.5였다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(n=3).
도 15는 다른 밀도를 가지는 랜덤 네트워크 CNT 디바이스(279, 339 및 508 CNTs/μm)와 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 디바이스의 성능을 비교한 것이다. 도 15a는 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 필름의 평면도 TEM 이미지 이다. 7개의 TEM 이미지와 24개의 라인을 분석하여 평균 라인 밀도를 분석하였다. TEM 이미지의 빨간 사각형은 개별 CNT의 끝을 나타낸다. 좌측 상단의 이미지와 오른쪽 이미지의 스케일 막대는 각각 25nm 및 10nm이며, 하단 TEM 이미지의 스케일 바는 5nm이다. 도 15b는 IgG에 노출된 고밀도-단방향 CNT 및 랜덤 네트워크 CNT 바이오센서 어레이의 저항변화를 나타낸 것이다. 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 어레이(345 CNTs/μm)는 유사한 밀도(339 CNTs/μm) 또는 더 높은 밀도(508 CNTs/μm)를 갖는 랜덤 네트워크 바이오센서 어레이보다 2배 더 높은 감도를 나타냈다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(n=3).
도 16은 유사한 밀도(16a, 16b) 또는 유사한 초기 저항(16c, 16d)를 갖는 랜덤 네트워크 CNT 바이오센서 어레이와 비교하여 고밀도-단방향 CNT 바이오 센서 어레이의 항 IgG의 양 및 감도를 나타낸 것이다. CNT 길이에 영향을 미치지 않는 비파괴성 박막 형성 방법 및 동일한 CNT 솔루션을 사용했기 때문에 모든 어레이에서 CNT의 길이가 유사하다. FITC-표지된 항-IgG의 형광을 525 nm에서 측정하였다(λex= 490 nm). 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(n=3).
도 17은 랜덤 네트워크 CNT 필름의 SEM 이미지이다. 튜브간 접합은 빨간 원으로 표시되었다. 랜덤 네트워크의 CNT 필름은 대략 134.57 튜브간 접합/μm의 밀도를 갖는다. 스케일 바는 250nm이다.
도 18은 CNT의 평균 길이를 나타낸 것이다. 도 18a는 랜덤 네트워크 CNT 필름의 SEM 이미지이다. 스케일바는 2.5μm이다. 도 18b는 SEM 이미지에서 350CNT의 길이를 나타낸 것이다. CNT의 평균 길이는 1.10±0.64μm이다.
도 19는 고밀도-단??항 CNT 필름 및 랜덤 네트워크 CNT 필름의 박막형성 절차를 나타낸 개략도이다. 동일한 CNT 소스(OCSiAL Co., USA) 및 동일한 CNT 솔루션을 사용했기 ??문에, 전체 절차(예, 스핀 코팅 방법(랜덤 네트워크 CNT 필름) 및 랭뮤어 블로젯 전사방법(고밀도-단방향 CNT 필름))는 마일드 조건에서 수행되었으며, 랜덤 네트워크 필름의 CNT의 길이는 LB 전사된 필름의 것과 동일할 것으로 예상된다. 고밀도-단방향 CNT 필름 및 랜덤 네트워크 CNT 피?a의 AFM 이미지에서 스케일바는 260nm 및 1μm을 나타낸다.
도 20은 CNT의 표면 커버리지(밀도)가 다른 LB-전사 CNT 기반 센서 어레이의 성능을 비교한 것이다. 도 20a는 표면 커버리지가 다른 LB-전사 CNT 기반 바이오센서 어레이의 저항 변화를 나타낸 것이다. 자동화된 이미지 분석을 사용하여 CNT의 표면 커버리지를 추정했으며, 각 데이터 포인트마다 다른 디바이스 세트가 사용되었다. 2개의 추가 반복실험을 통해 데이터의 재현성을 확인하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(n=3). CNT의 표면 커버리지를 96.5%로 유지하기 위해 최종 압력을 350mN/m로 고정시켰다(스케일바 250nm). 도 20b는 CNT 필름에 고정된 FITC-표지된 항-IgG의 형광강도를 나타낸 것이다. FITC-표지된 항-IgG의 형광강도를 525nm에서 측정 하였다(λex = 490nm). 2개의 추가 반복실험을 통해 데이터의 재현성을 확인하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(n=3).
도 21은 고밀도-단방향(a) 또는 랜덤 네트워크(b) CNT 디바이스의 저항을 나타낸 막대 그래프이다. 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이는 랜덤 네트워크 CNT 센서 어레이보다 20.4배 낮은 저항을 나타냈다. 도 21c는 고밀도-단방향 CNT 디바이스 및 어레이의 저항에 대한 변동계수(CV)에 관한 것으로 각각 13.3% 및 7.4% 이며, 이는 랜덤 네트워크 CNT 디바이스 및 어레이보다 2 내지 3배 낮았다.
도 22는 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이에 사용되는 항체를 나타낸 것이다. 각각의 항체는 상응하는 바이오마커의 특정 서열에 결합한다. 1 2F4 및 11A50-B10 항체는 각각 Aβ42 및 Aβ40의 C-말단을 인식한다. Tau5의 에피토프는 타우 단백질(t-tau)의 아미노산 210-241 내에 있다. M7004D06 항체는 181 잔기에서 인산화 된 인간 타우(p-tau)에 반응한다.
도 23은 AD 바이오마커 및 인간 IgG(hlgG, 음성대조군) 추가시 밀도가 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항변화를 나타낸 것이다. Aβ42 및 Aβ40의 농도는 각각 2.22 x 10⁶ fM 및 2.31 x 10⁶ fM이었다. t-tau 및 p-tau의 경우, 농도는 각각 2.18 x 10⁵ fM 및 3.57 x 10⁶ fM이었다. 인간 IgG의 농도는 6.55 x 10⁶ fM이었다. 측정은 3 회 수행되었으며 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 24는 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 감지응답에 대한 바이오마커 열변성의 영향을 나타낸 것이다. 도 24a는 25℃에서 45℃로 온도가 상승함에 따른 Aβ42의 구조적 변화를 나타낸 것이다. 열 변성 후, CD 스펙트럼에서 200nm 및 216nm에서 강한 피크가 관찰되었으며, 이는 Aβ42의 고유구조가 β-sheet 2차 구조로 변화하였음을 의미한다. 다양한 온도에서 열적으로 변성된 Aβ42에 노출되는 경우 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항 변화를 나타낸 것이다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸 것이다(n=3).
도 25는 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 전달곡선을 나타낸 것이다. 도 25a는 액체 이온 게이트가 있는 고밀도-단방향 CNT 디바이스의 개략도이다. 게이트 전극으로 Ag/AgCl 기준 전극을 사용하였으며, 전해질로 1μM PBS 버퍼(pH7.4)를 사용하였다. 도 25b 내지 25e는 일정한 Vds = - 10mV에서 (B) Aβ42, (C) Aβ40, (D) t-tau, and (E) p-tau에 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이가 노출하여 측정된 전달곡선이다. 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 온/오프 비율은 약 10³이다.
도 26은 AD 핵심 바이오마커에 대한 CNT 센서 어레이의 민감도를 나타낸 것이다. 도 26a 내지 26d는 (a) Aβ42, (b) Aβ40, (c) t-tau 및 (d) p-tau의 농도가 증가함에 따라 조밀하게 정렬 된 CNT 센서 어레이의 저항 변화를 나타낸 것이다. 각 데이터 포인트는 다른 디바이스 세트를 사용하여 얻었다. 인간 IgG를 음성대조군으로 사용하였다. 도 26e는 인간 혈장에서 다양한 개별 AD 바이오마커 및 이들의 혼합물에 대해 고밀도-단방향 바이오센서 어레이의 선택성을 나타낸 것이다. Aβ42 및 Aβ40의 농도는 각각 22.2 및 23.1 fM이었다. t-tau 및 p-tau의 경우, 농도는 각각 21.8 fM 및 360 fM이었다. 측정은 3회 수행되었고 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 27은 (a) Aβ42, (b) Aβ40, (c) t-tau 및 (d) p-tau에 노출되는 경우 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항 변화에 대한 변동 계수(CV)를 나타낸 것이다. 모든 경우에 CV의 값은 10% 미만으로 나타났으며 이는 상기 고밀도-단방향 CNAT 바이오센서 어레이가 AD 바이오 마커를 검출하는데 높은 정밀도를 가짐을 의미한다.
도 28은 사람 혈장에서 스파이크된 (a) Aβ42, (b) Aβ40, (c) t-tau 및 (d) p-tau의 농도가 증가함에 따라 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항변화를 나타낸 것이다. . 각각의 데이터 포인트마다 다른 디바이스의 세트가 사용되었으며, 2번의 추가적인 반복실험을 통해 데이터 재현성을 확인하였다. 모든 값은 평균 ± SD 값이다.
도 29는 다양한 개별 AD 바이오마커 및 이의 혼합물에 노출되는 경우 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항변화를 나타낸 것이다. Aβ42 및 Aβ40의 농도는 각각 22.2 및 23.1 fM이었다. t-tau 및 p-tau의 경우, 농도는 각각 21.8 fM 및 360 fM이었다. IgG, IgM, 혈청 알부민 및 트랜스페린의 농도는 1nM이었다. 측정은 3회 수행되었고 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 30은 다른 Aβ응집체 종에 노출되는 경우, 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항변화를 나타낸 것이다. 문헌 (Science 2003, 300, 486; J. Biol. Chem. 2007, 282, 1031)에 따라 올리고머 Aβ 종 (oligomeric Aβ species)및 원섬유성 Aβ 종(fibrillar Aβ species)을 제조하고, (A) A11 항체 및 (B) OC 항체를 사용하여 CNT 채널을 변형시켰다. A11 항체는 Aβ 올리고머의 일반적인 에피토프를 인식하지만, 단량체 또는 원섬유성 Aβ 종에는 결합하지 않는다. 대조적으로 OC 항체는 원섬유성 Aβ 종에 결합한다. 측정은 3회 수행되었고 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 31은 AD 환자(n=20) 및 건강한 대조군(n=20)의 혈장 내의 Aβ42(A, B 및 C), Aβ40(D, E 및 F), t-tau(G, H 및 I) 및 p-tau(J, K 및 L)의 워터폴 플롯(Waterfall plots), 박스 플롯(box plots), 및 측정된 AUC 값 및 수준을 나타내는 ROC 커브를 나타낸 것이다. 박스에서, 데이터의 25번째, 50번째(중앙값) 및 75번째 백분위 수가 표시된다. 수염(whisker)은 평균 ±1.5 표준 편차를 나타낸다. 유의미한 차이는 p-value로 표시하였다. 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 통계분석을 수행하였으며, n.s.는 유의미하지 않음을 나타낸다.
도 32는 혈장 여과액 및 네이티브 임상 혈장 시료에 노출되는 경우 센서 어레이의 저항 변화를 나타낸 것이다. 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이는 혈장 내 다른 단백질과 결합되거나 결합되지 않은 Aβ42 및 Aβ42를 모두 검출할 수 있다. CD63 단백질을 표적으로 하는 항체는 미국 BD biosciences(Cat#. 556019)로부터 얻었다. Aβ42를 표적으로 하는 항체는 12F4 항체를 사용했다. 측정은 3회 수행되었고 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 33은 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 임상적 관련성을 나타낸다. AD 환자(n=20) 및 건강한 대조군(n=20)의 혈장 내의 Aβ42/ Aβ40(A, B); t-tau/Aβ42(C, D) 및 p-tau/Aβ42(E, F)의 추정된 수준을 나타내는 워터폴 플롯(Waterfall plots) 및 박스 플롯(box plots)을 나타낸다. 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 통계분석을 수행하였으며, ****p<0.000001이다. 박스에서, 데이터의 25번째, 50번째(중앙값) 및 75번째 백분위 수가 표시된다. 수염(whisker)은 평균 ±1.5 표준 편차를 나타낸다. 도 33G는 복합 바이오 마커(Aβ42/ Aβ40; t-tau/Aβ42 및 p-tau/Aβ42) 및 단일 바이오마커(Aβ42, t-tau 및 p-tau)를 예측 변수로 사용한 경우 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 수신기 작동 특성 곡선(Receiver operating characteristic curves)을 나타낸 것이다.
도 34는 ROC 곡선을 그리는데 사용된 진단 파라미터를 나타낸 것이다. 민감도(sensitivity), 선택도(selectivity) 및 정확도(accuracy)는 하기의 식으로 계산되었다(TP = true positive, TN = true negative, FP = false positive, FN = false negative):
민감도(sensitivity) = TP/(TP+FN);
선택도(selectivity) = TN/(TN+FP); 및
정확도(accuracy) = (TP+TN)/(TP+TN+FP+FN).
ROC 곡선의 각 점은 특정 임계 농도에서 얻은 진양성 비율(true positive rate, 민감도) 및 위양성 비율(false positive rate, 특이도(specificity))를 나타낸다. ROC 곡선이 왼쪽 상단에 가까울수록 감지 플랫폼(바이오센서)의 진단정확도가 높아진다.
도 35는 지금까지 보고된 종래의 CNT 기반 바이오센서의 검출한계를 나타낸 것이다. CNT 기반의 트랜스듀서의 제조 기술에 따라 분류하였으며, 논문에 표시된 질량농도(Mass concentration)는 각 바이오마커의 분자량을 사용하여 몰농도(molarity)로 변환하였다. 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 바이오센서는 기존의 모든 센서의 LOD 값보다 현저히 낮은 LOD 값을 나타냈다. [3]의 경우, LOD 값은 추가 증폭기 없이 측정된 값을 기준으로 표시되며, 해당 문헌에서 감지신호는 80 pg / mL 이하의 IgG 농도에서 나타나지 않는다.
각 점의 참조문헌은 아래와 같다:
[1] ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7, 584; [2] Biosens. Bioelectron. 2016, 86, 308; [3] J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3010; [4] Appl. Phys. Lett. 2016, 109, 243504; [5] Biosens. Bioelectron. 2015, 63, 325; [6] Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100, 4854; [7] J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2188; [8] Nano Lett., 2018, 18, 4130; [9] Lab Chip, 2010, 10, 2052; [10] J. Phys. Chem. C, 2012, 116, 19490; [11] Biosens. Bioelectron. 2013, 43, 143; [12] Sens. Actuators, B, 2017, 249, 691; [13] Biosens. Bioelectron. 2010, 25, 1989; [14] ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8, 9600.
도 36은 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이와 ELISA 간의 감지신호를 비교한 것이다. ELISA는 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 보다 혈장에서 t-tau 단백질의 검출에 대한 민감도가 낮게 나타났다. ELISA를 통해 측정 가능한 농도는 2.72 pM 이상인 반면, 2.1 fM 내지 2.1pM 범위의 농도에서 t-tau 단백질의 대수 농도(R2 > 0.99)와 본 발명의 바이오센서 어레이의 저항 변화는 선형 의존성을 나타내었다. 측정은 3회 수행되었고 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 37은 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이와 이전에 보고된 감지 플랫폼을 사용하여 임상 혈액에서 검출된 AD 바이오마커 목록이다(Nat. Commun. 2019, 10, 1144; Nature, 2018, 554, 249; Adv. Mater. 2017, 29, 1700057). 본 발명의 바이오센서 어레이는 임상 혈액 샘플에서 Aβ 펩티드뿐만 아니라 타우 단백질 (t-tau 및 p-tau)을 정확하게 검출 할 수 있다(APP: 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein), IRS-1: 인슐린 수용체 기질 1(insulin receptor substrate 1), CHL1: L1의 근접 상동체(close homolog of L1), NCAM: 신경세포 부착분자(neuronal cell adhesion molecule)). APP, IRS-1, CHL1, NCAM 및 tau 단백질에 대한 감지 플랫폼의 민감도는 정의된 용액에서 확인하였다.
도 38는 인접한 디바이스를 분리(disconnecting)하기 전 및 후의 센서 어레이 내의 각각의 디바이스의 저항을 나타낸 것으로, 각각의 CNT 디바이스의 저항은 필름의 분리 전 후가 유사하였다.
도 39는 ELISA 표준 곡선을 사용한 t-tau 농도의 정량 결과이다. t-tau 단백질 샘플의 추정 농도(nominal concentrations : 340, 680 fM)는 각각 310.675 fM ± 106 및 718.9 fM ± 170이었다. 측정은 3회 수행되었고 모든 값은 평균 ± SD를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

탄소나노튜브(Carbon Nano Tube; CNT) 기반의 바이오센서를 제작하는데 있어 가장 문제가 되는 부분은 탄소나노튜브 박막(필름)의 형성에 있다. CNT 기반의 바이오센서에 존재하는 탄소나노튜브의 농도에 따라 소자간 전류특성과 감도가 달라질 수 있다. 1997년 네덜란드의 데커(Dekker)에 의해 최초 탄소나노튜브 트랜지스터 제작의 방법은 용액 속에 분산시킨 탄소나노튜브를 기판상에서 건조시키는 방법{Nature (1997) 384, 474}을 사용한 이후 전기영동, 유체역학 및 직접 성장법 등에 의해 제작되었지만 상용적으로 이용할 수 있는 수준으로 제작하기 어려웠다. 최근 대한민국 등록특허 제10-0675334호의 랭뮤어-블로젯(Langmuir-Blodgett) 방법을 이용한 탄소나노튜브 필름의 제작방법이 등록된 바 있으며, 이후, 랭뮤어-블로젯 방법을 이용한 탄소나노튜브 기반의 바이오센서가 대한민국 등록특허 제10-1130947호에서 등록된 바 있으나, 1pM 수준의 검출 한계(LOD)를 나타내는 것으로 보고되며, 펨토몰 수준의 표적 분자, 특히, 바이오마커의 검출이 가능한 탄소나노튜브 기반의 바이오센서는 보고된 없다.

나아가 종래의 탄소나노튜브와 바이오센서의 민감도의 연관성은 탄소나노튜브의 밀도와 관련이 있는 것으로 생각되어 왔으며, 주로 밀도의 조절을 통한 민감도의 증가에 연구의 초점이 집중되어 있다. 한국 특허 제 10-0539318호, 제 10-0573851호 등에서, 고밀도 CNT 기반의 바이오칩에 바이오 리셉터를 고밀도로 고정시켜 검출 밀도를 높이는 방법을 개시하나 탄소나노튜브 자체의 밀도와 검출 민감도의 연관성을 개시하고 있지는 않으며, 탄소나노튜브의 밀도와 바이오센서의 민감도를 연구한 다른 논문에 의하면(Ishikawa, F. N. et al. Importance of controlling nanotube density for highly sensitive and reliable biosensors functional in physiological conditions. ACS Nano 4, 6914-6922 (2010)), 오히려 저밀도 디바이스가 검출 한계(LOD) 및 반응 크기에서 높은 감도를 나타내며, 최적화된 저밀도 CNT 기반의 바이오센서가 1pM의 검출한계를 나타낸다고 보고한다. 최근의 대한민국 등록특허 제10-2032264호는 정렬된 탄소나노튜브의 조립 방법을 개시하고 있으나, "전자빔 리소그래피를 통해 필름을 패턴화"하는 과정을 발명의 주요한 특징으로 한다. 리소그래피는 정교함을 요하는 기술로서, 고도의 전문성과 복잡한 설계 및 절차가 수반되어, 비용 및 제조효율 면에서 불리한 측면이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 랭뮤어-블로젯 방법의 최적화를 통해, 정교한 나노리소그래피 기술을 통한 CNT의 패턴화 없이도 균일한 밀도 및 정렬도의 고밀도-단방향 CNT 필름을 제조하였으며, 상기 고밀도-단방향 CNT 필름으로 바이오센서를 제작하였다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 제조한 고밀도-단방향 CNT 기반의 알츠하이머 진단용 바이오센서를 개략적으로 나타낸 것이다. 구체적으로, 기존의 랭뮤어-블로젯 방법과 같이 액체-공기 계면상에서 한번에 압력을 주어 CNT의 밀도를 증가시킨 상태에서 기판을 들어올려 고밀도의 CNT 필름을 형성하는 경우, CNT의 자기 응집 및 루프 형성이 진행되어, 큰 히스테리시스를 나타내는 데 반해, 압축-후퇴 사이클링을 통한 점진적인 압력의 증가아래에서, 랭뮤어-블로젯 방법을 수행하는 것이 CNT의 패킹과 정렬을 향상시켜 히스테리시스를 거의 나타내지 않고, 결과적으로 현재까지 보고된 탄소나노튜브 기반의 표적 분자 감지 플랫폼 중 최저수준(펨토몰)의 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ), 낮은 변동계수(<6%), 높은 스파이크 회수수준(>93%)을 나타내는 것을 비교/확인하여, CNT의 밀도뿐만 아니라 밀도 및 정렬도의 동시 최적화가 표적 분자의 검출 민감도 및 정확도를 현저히 상승시킬 수 있음을 검증하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는 고밀도-단방향 탄소나노튜브(CNT) 필름 기반 바이오센서의 제조방법에 관한 것이다:

(a) 탄소나노튜브(CNT)를 콘쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer)로 랩핑하는 단계;

(b) 콘쥬게이트화 폴리머로 랩핑된 CNT를 액체-공기 계면에서 압축 및 후퇴 사이클을 반복하여 고밀도-단방향 CNT를 수득하는 단계;

(c) 상기 고밀도-단방향 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사(transfer)하는 단계;

(d) 상기 필름에서 콘쥬게이트화 폴리머를 제거하는 단계;

(e) 고밀도-단방향 CNT 필름에 소스 및 드레인 전극을 패턴화하여 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 제조하는 단계; 및

(f) 패턴화된 고밀도-단방향 CNT 디바이스에 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질을 고정하는 단계.

본 발명의 용어 "탄소나노튜브(Carbon Nano Tube; CNT)"는 지구상에 다량으로 존재하는 탄소로 이루어진 탄소 동소체로서 하나의 탄소가 다른 탄소원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질이며, 튜브의 직경이 나노미터(nm=10억분의 1미터) 수준으로 극히 작은 영역의 물질이다. 본 명세서에서, 상기 "탄소나노튜브"는 "CNT"와 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "고밀도"는 탄소나노튜브의 자가응집 및 루프형성이 억제되어 매우 밀집하게 패킹되어 있는 것을 의미하며, 전체 면적 대비 탄소나노튜브의 면적이 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80프로 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 의미한다. "단방향"은 대부분의 탄소나노튜브가 동일한 방향(단방향)으로 정렬된 것을 의미하며, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80프로 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 탄소나노튜브가 단방향으로 정렬되어, 광학이방성을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서의 제조방법은 (a) 탄소나노튜브(CNT)를 콘쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer)로 랩핑하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CNT는 단일벽 탄소나노튜브(Single-wall carbon nanotube; SWCNT)와 다중벽 탄소나노튜브(multi-wall carbon nanotube; MWCNT)일 수 있으며, 본 발명에 있어서, 바람직하게는 단일벽 탄소나노튜브인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 고밀도-단방향 CNT 필름을 제조하기 위한 CNT는 미국의 OSCiAI에서 제조된 SWCNT를 사용하였다.

본 발명에 사용되는 CNT는 특별히 제한되지 않으며, 시판되는 제품을 구입하여 사용하거나, 통상의 방법에 의해 제조하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, CNT는 아크 방전법(arc discharge)과 레이저 증발법(laser techniques), 화학 기상 증착법(chemical vapor decomposition; CVD) 및 고압 일산화탄소 불균형화(high-pressure carbon monoxide disproportionation; HiPCO)를 포함하는 종래 기술분야에 공지된 방법을 통해서 합성될 수 있다. 아크 방전법과 레이저 증발법은 고체 상태의 탄소(carbon source)를 전기(arc)나 레이저(laser)를 사용하여 열분해(pyrolysis)시켜서 고온의 기체 상태의 카본으로부터 CNT를 제조하는 방법이고, CVD방식은 전이 금속 계열의 촉매(catalyst)를 이용하여 기체 상태의 카본(gaseous carbon)을 기질(substrate) 표면에서 성장시키는 방법이다(Nikolaev, Pavel (April 2004), Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 4 (4): 307-316).

본 발명의 일 실시예에서, 상기 CNT를 poly[(m-phenylenevinylene)-co-(2,5-dioctoxy-p-phenylenevinylene)]로 랩핑하여 CNT의 분산력을 증가시켰다. 탄소나노튜브는 일차원적 시스템으로서, 고유의 특성을 충분히 활용하기 위해서는 튜브 하나하나가 분리되어야 하는데, 탄소나노튜브는 튜브간의 반데르발스 인력으로 인해 다발을 형성하기 쉽고 분리가 잘되지 않아 추가적인 개질을 통해 분산력을 증가시키는 것이 중요하다.

본 발명에 있어서, 탄소나노튜브의 개질을 위해, 기능화 방법을 사용할 수 있으며, 상기 기능화(functionalization)에는 예를 들어, 결함 그룹 기능화(defect group functionalization), 공유 기능화(covalent functionalization) 및 비공유 기능화 (noncovalent functionalization) 등이 있다(Sun Hwa Lee, et al., Polymer Science and Technology Vol. 18, No. 6, December 2007).

본 발명의 용어 “비공유 기능화”는 수소결합(hydrogen bond), 반데르발스 결합(van der Waals bond), 전하 이동(charge transfer), 쌍극자 상호작용(dipole- dipole interaction), π 전자 상호작용(π-π stacking interaction) 등과 같은 비공유 결합을 이용하여 탄소나노튜브 표면과 상호작용하는 물질을 통해 특성을 개질하거나 원하는 기능을 부여하는 방법이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 고분자 사슬 내에 벤젠 고리를 갖는 컨쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer)로 랩핑하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 컨쥬게이트화 폴리머는 탄소나노튜브와 π 전자 상호작용을 통해 탄소나노튜브를 랩핑(wrapping)하며, 이를 통해, 탄소나노튜브의 분산력 증가, 전기전도도의 향상과 같은 특성의 개질효과를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 상기 컨쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer)는 이중결합 및 단일결합의 교대 체인의 골격을 특징으로 하는 유기거대분자로, 오버랩되는 p-오비탈은 비편재화된 π-전자 시스템을 생성하여 유용한 광학적 전자적 특성을 나타낸다. 상기 컨쥬게이트화 폴리머는 예를 들어, poly(metaphenylene vinylene)(PmPV), poly(arylenethynylene)s (PPE), poly{(2,6-pyridinylenevinylene)-co-[(2,5-dioctyloxy-p-phenylene) vinylene]}(PPvPV), Poly{(5-alkoxym-phenylenevinylene)(PAmPV), poly-3-dodecilthiophene (P3DDT), Polyfluorinated dibenzodioxins (PFDD), poly(9,9-dioctylfluorene-alt-pyridine) (PFOPy), poly(9,9-dioctylfluorenyl-2,7diyl) (PFO), Poly(3-dodecylthiophene-2,5-diyl) (P3DDT), Poly(3-alkylthiophene) (P3AT) 등이 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 실시예와 같이, poly(metaphenylene vinylene)(PmPV)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.본 발명에 있어서, CNT를 컨쥬게이트화 폴리머로 랩핑하기 위해 유기용매에 상기 컨쥬게이트화 폴리머 및 CNT를 현탁시킨 뒤 소니케이션(sonication)하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 25mg의 디클로로에탄(DCE)에 2.5mg의 CNT 및 2.5mg의 PmPV를 현탁시키고, 70%의 진폭의 horn 소니케이터를 사용하여 1시간 동안 현탁액을 소니케이션하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 분산용매로서 유기용매를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 디클로로에탄(DCE)을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, CNT의 특성, 조건 등에 따라 다른 유기용매(예, 톨루엔 등)를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 컨쥬게이트화 폴리머로서 P3DDT, PFDD, PFOPy, PFO, P3DDT 또는 P3AT를 사용하는 경우, 분산용매로서 톨루엔을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서의 제조방법은 (b) 콘쥬게이트화 폴리머로 랩핑된 CNT를 액체-공기 계면에서 압축 및 후퇴 사이클을 반복하여 고밀도-단방향 CNT를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 기존의 랭뮤어-블로젯(Langmuir-Blodgett; LB) 방법을 개량하여 고밀도-단방향 CNT 필름을 제조하였다. 종래의 랭뮤어-블로젯 방법이 액체-공기 계면상의 물질을 단번에 압축한 뒤, 필름으로 전사하는 방식임에 반해, 본 발명에서는 PmPV 랩핑된 CNT에 단축으로 힘을 가하는 이동막대의 압축 및 후퇴를 반복하여, 고밀도-단방향 CNT를 제조하였으며, 단일 압축으로 생성된 CNT 필름이 자가 응집 및 루프의 형성이 많이 일어나는 것에 반해, 압축 및 후퇴 사이클을 형성할 수 있는 압축 및 후퇴 사이클링의 조건의 임계값을 확인하였다.

따라서 본 발명에 있어서, 상기 압축 및 후퇴 사이클은 바람직하게는 약 5회 이상, 가장 바람직하게는 약 10회 이상 반복하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 압축 및 후퇴 사이클의 압력은 동일하게 유지되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 35mN/m이상의 압력으로 압축하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 압축 및 후퇴 사이클은 각 사이클이 반복될 때마다 압력이 증가하며, 최종적으로 약 0 mN/m 초과 약 100 mN/m이하의 압력으로 압축하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 최종적으로 35 mN/m 이상 100mN/m 이하의 압력으로 압축하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 액체 표면에 컨쥬게이트화 폴리머 랩핑된 CNT를 분산하여 띄울 수 있는 것이라면, 모두 사용 가능하며, 액체는 물(H₂0)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서의 제조방법은 (c) 상기 고밀도-단방향 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사(transfer)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 기판(substrate)은 상기 (b) 단계에서, 압축 및 후퇴 사이클링을 통해 고밀도-단방향 CNT가 표면에 필름형태로 전사될 수 있는 베이스 기재를 의미한다. 상기 기판은 전도성 기재인 경우, 바람직하게는 카본 전극, 금속 전극, 실리콘, 인듐주석산화물(ITO), 불소주석산화물(FTO) 또는 이를 포함하는 유리판 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 SiO₂ (100 nm)/Si 기판일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판이 비전도성 기재인 경우, 플라스틱 기판등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 일반적인 랭뮤어-블로젯 방법과 같이 최종 사이클의 압축 상태에서 천천히 중앙에 위치한 기판을 끌어올려 고밀도-단방향 CNT를 필름으로 전사하며, 바람직하게는 기판을 0 mm/min 초과 약 150 mm/min이하, 더욱 약 2mm/min의 속도로 들어올려, 고밀도-단방향 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 압축 및 후퇴 사이클링을 통해 제조된 약 1.5nm 높이의 고밀도-단방향 CNT의 형태를 SEM으로 확인한 결과, 자기응집 및 루프의 형성이 현저히 억제되어, 매우 조밀하게 패킹된 것을 확인하였으며, 라만 스펙트럼 분석결과 탄소나노튜브가 단방향으로 정렬되어 광학 이방성을 명백하게 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 CNT 필름은 단일층(single layer) 또는 다중층(multilayer)일 수 있으며, 바람직하게는 단일층인 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 전사된 필름은 바람직하게는 약 1 내지 3 nm의 두께인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전사된 필름은 전체 면적 대비 탄소나노튜브의 면적이 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80프로 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전사된 필름은 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80프로 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 탄소나노튜브가 단방향으로 정렬된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 라만 분광법을 수행한 결과 Rotation angle에 따른 Raman Ig peak이 cos2(alpha)의 관계를 나타내어, 대부분의 탄소나노튜브가 단방향으로 정렬되었음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 전사된 필름은 광학 이방성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 구체적으로는 라만 스펙트럼에서 G-밴드의 강도가 회전각이 증가함에 따라 점차 감소하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 G-밴드의 각도(α) 의존성은 cos2α 함수와 일치하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전사된 필름은 아르곤(Ar) 대기 조건에서 열처리 후 컬링 또는 롤링 없이 정렬이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서의 제조방법은 (D) 상기 필름에서 콘쥬게이트화 폴리머를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 필름에서 콘쥬게이트화 폴리머를 제거하는 단계는 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질을 부착 또는 접합하기 위해 수행될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 콘쥬게이트화 폴리머의 제거방법으로 아르곤(Ar) 조건에서 550℃에서 1.5시간동안 샘플을 열처리하는 열처리 어닐링 방식을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 콘쥬게이트화 폴리머의 종류, 조건에 따라 통상의 기술자에 의해 종래에 알려진 다양한 방법 또는 변형되어 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서의 제조방법은 (e) 고밀도-단방향 CNT 필름에 소스 및 드레인 전극을 패턴화하여 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 제조된 고밀도-단방향 CNT 필름 표면에 금속 소스(source) 및 드레인(drain) 전극(contact, Cr/Au=5/50nm)을 증착하여 패턴화하였으며, Cr / SiO2 = 5/50 nm 레이어를 단순 진공 증착하여 상기 전극을 패시베이션 하여, 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 제조하였다. 또한, 상기 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 기반으로 제조된 바이오센서가 추가적으로 복잡하고 값비싼 포토리쏘그래피 등의 기술을 사용하지 않고도 효과적으로 측면 응답이 차단되어 바이오센서로서 현저한 성능을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 용어. "고밀도-단방향 CNT 디바이스"는 소스 전극-CNT 채널-드레인 전극으로 구성된 CNT 필름 상의 패턴화 그룹을 의미한다. 상기 고밀도-단방향 CNT 디바이스는 소스 전극, CNT 채널 및 드레인 전극 이외에도 필요에 따라 추가적인 구성(예, 리퀴드 게이트 전압을 걸기 위한 게이트 전극 등)을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, FET 기반의 바이오센서의 제작을 위해 게이트 전극을 추가로 패?Θ?할 수 있다.

본 발명의 용어, "디바이스 어레이"는 하나의 필름상에 복수의 디바이스가 어레이된 것을 의미한다. 상기 "바이오센서 어레이"는 상기 디바이스 어레이가 표적 분자에 특이적으로 결합하는 분자로 기능화된 디바이스 어레이를 의미하며, "바이오센서 칩", "바이오센서 어레이 칩" 등과 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고밀도-단방향 CNT 디바이스는 CNT 필름의 균일한 밀도 및 정렬도로 인해 디바이스간의 저항변화 변동계수가 매우 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 디바이스간 저항변화 변동계수는 10% 미만인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 6% 미만인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는, 상기 고밀도-단방향 CNT 필름을 패턴화하여, 둘 이상의 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 검출하고자 하는 표적 분자의 종류 수 또는 사용하고자하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 물질의 종류 수에 따라 복수, 바람직하게는 둘 이상의 디바이스를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 패턴화된 고밀도-단방향 CNT 필름을 패시베이션(passivation)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "패시베이션(passivation)"이란, 반도체 디바이스의 표면이나 접합부에 일정한 처리를 통해 디바이스 특성을 안정화 하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 패시베이션(passivation)은 종래에 공지된 다양한 방법을 통해 제한없이 수행될 수 있다. 예를 들어 추가 레이어의 증착을 통해 패시베이션을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 추가 레이어는 Si₃N₄ 레이어, Cr/SiO₂ 레이어 및 인 유리 레이어로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서의 제조방법은 (f) 패턴화된 고밀도-단방향 CNT 디바이스에 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질을 고정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 제조된 고밀도-단방향 CNT 디바이스의 뛰어난 전기적 특성을 확인한 뒤, 바이오센서로 제조하기 위해 신경퇴행성질환의 바이오마커인 Aβ40, Aβ42, p-tau 및 t-tau 항체를 CNT 필름상에 고정하였다. 상기 항체를 고정시키기 위해, sulfo-NHS-기능화 방법을 사용하였다. 구체적으로, UV-오존을 처리한 뒤, 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide 및 sulfo-NHE를 함유하는 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)와 함께 인큐베이션하여, 상기 고밀도-단방향 CNT 필름에 카르복실기를 도입하고, 항체의 아미노기와 아미노 결합을 통해 고정하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계는 물리적 또는 화학적 방법을 포함하는 종래에 공지된 모든 고정 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 고정 방법은 Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41, 1853-1859 및 Angew.Chem. Int. Ed, 2015, 54, 12562에 상세히 개시되어 있다. 예를 들어, 상기 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질은 공유결합, 수소결합, 양성이온결합(zwitterion interaction) 등과 같은 직접적인 상호작용을 통해 CNT 디바이스에 고정될 수 있으며, 링커, 스페이서 등을 통해 간접적으로 고정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계는 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질을 고정하기 위해 CNT 필름의 표면을 개질하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 개질 방법은 Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41, 1853-1859에 상세히 개시되어있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 개질은 바람직하게는 카르복실기의 도입인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 카르복실기의 도입은 종래에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 질산 및 황산의 혼합용액의 처리, Sulfo-NHS-기능화 또는 UV-ozone 처리 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질"은 표적 분자와 특이적 결합으로 상호작용할 수 있는 물질을 지칭한다. 검출 영역에 고정된 분자에 검출대상물질이 특이적 결합에 의해 상호작용하게 되면 전극의 일함수를 변하게 하며, 이는 탄소나노튜브와 검출 영역간의 접촉 저항을 변화시키게 된다. 이 접촉 저항의 변화는 전류의 흐름에 영향을 미치게 되며 이를 이용하여 표적 분자의 검출이 이루어진다.

본 발명의 고밀도-단방향 CNT 디바이스 상에는 수많은 특정 물질을 고정화시킬 수 있다. 특정 물질이 고정화된 고밀도-단방향 CNT 디바이스는, 고정된 물질과 상호작용하는 물질을 검출하는 바이오센서에 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 검출되는 시그널의 증폭이나 특정을 목적으로 하여 특정 물질과 상호작용한 물질과 더욱 상호작용 하는 물질을 효소 또는 전기 화학적 반응이나 발광 반응을 갖는 물질, 하전을 갖는 고분자 및 입자 등으로 표지하는 것도 가능하고, 이들은 이뮤노 에세이나 인터칼레이레터 등을 이용한 DNA 해석의 영역에서는 표지화 측정법으로서 널리 사용되고 있는 방법이다.

본 발명의 용어 "상호작용"은 특별히 한정되지 않지만, 통상은 공유 결합, 소수결합, 수소 결합, 반데르 발스 결합 및 정전력에 의한 결합 중 적어도 하나로부터 생기는 분자 간에 작용하는 힘에 의한 작용을 나타낸다. 단, 본 명세서에서 말하는 「상호작용」이라는 용어는 매우 광의로 해석해야 하며, 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안 된다. 공유 결합으로는, 배위 결합, 쌍극자 결합을 포함한다. 또, 정전력에 의한 결합이란, 정전 결합 외에, 전기적 반발도 포함한다. 또, 상기 작용의 결과 생기는 결합 반응, 합성 반응, 분해 반응도 상호작용에 함유된다. 상호작용의 구체예로는, 항원과 항체간의 결합 및 해리, 단백질 리셉터와 리간드간의 결합 및 해리, 접착 분자와 상대방 분자간의 결합 및 해리, 효소와 기질간의 결합 및 해리, 아포 효소와 보효소간의 결합 및 해리, 핵산과 그에 결합하는 단백질간의 결합 및 해리, 핵산과 핵산간의 결합 및 해리, 정보 전달계에 있어서의 단백질끼리 사이의 결합과 해리, 당 단백질과 단백질간의 결합 및 해리, 또는 당쇄와 단백질간의 결합 및 해리, 세포 및 생체 조직과 단백질간 의 결합 및 해리, 세포 및 생체 조직과 저분자 화합물간의 결합 및 해리, 이온과 이온 감응성 물질간의 상호작용 등을 들 수 있는데, 이 범위로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 분자는 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 잇다.

본 발명의 용어 “바이오마커”는 생물학적으로 정상인 과정과 병리적인 과정을 객관적으로 측정 평가할 수 있는 지표를 의미한다. 예를 들어, 혈압, 맥박 또는 콜레스테롤과 DNA, 단백질, 호르몬 등이 바이오마커로 사용될 수 있으며, 단백질, DNA, 호르몬 등의 인산화, 메틸화 와 같은 추가적인 변이상태도 바이오마커로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 그 용도를 불문하고 모든 생체 지표가 이에 해당할 수 있으며, 특히 샘플에 수 펨토몰 수준으로 포함된 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오마커는 신경퇴행성질환의 바이오마커일 수 있으며, 예를 들어, 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 바이오마커와 특이적으로 상호작용하는 물질은 이뮤노글로불린 또는 이의 단편, 바이오리셉터, 효소와 그 파생물, 핵산, 천연 또는 인공의 펩티드, 인공 폴리머, 당질, 지질, 무기 물질 또는 유기 배위자, 바이러스, 세포, 약품 등을 들 수 있고, 여기서 상기 바이오리셉터는 표적 바이오 물질과 결합하여 이를 검출할 수 있는 프로브 역할을 하는 생물학적 물질로서, 핵산(DNA, RNA, PNA, LNA 및 그 혼성체), 압타머, 단백질(효소, 기질, 항원, 항체, 리간드 등), 바이러스 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 분자가 바이오마커인 경우, 특이적으로 상호작용하는 물질은 항체 또는 항원 결합 단편인 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 단백질 분자의 집합, 하나의 항체 단백질 분자 또는 이의 유도체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)를 모두 포함하는 개념으로, 바람직하게는 단클론 항체이며, 온전한 전체 항체(Whole antibody) 형태를 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

완전한 항체는 일반적으로, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

본 발명에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 표적 바이오마커를 인식하여 결합할 수 있는 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, dsFv 및 Fv 등을 포함하는 개념으로, 본 명세서에서는 “항체 단편”과 동일한 의미로 혼용되어 사용된다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 방법으로 제조된 바이오센서 어레이를 사용하여 임상 혈액 샘플에 수 펨토몰 수준으로 포함된 알츠하이머 바이오마커를 검출했으며, 그 정밀도, 민감도 및 정확도가 종래에 공지된 어떠한 CNT 기반의 바이오센서보다 뛰어남을 확인하였다. 나아가, 알츠하이머 바이오마커의 다중 감지 및 판단 값 계산을 통해 매우 높은 민감도, 선택도 및 정확도로 환자와 정상대조군을 동정해 낼 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법으로 제조된 바이오센서 어레이에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "바이오센서"는 전달요소와 상호작용하는 생물학적 물질을 사용하거나 생물학적 체계를 모방하여, 특정한 정량적 또는 반정량적 분석 정보를 제공할 수 있는 검출/감지 장치를 의미한다. 바이오센서는 검출/감지 결과를 측정 가능한 신호로 전환하기 위해 전기화학(electrochemical), 압전기(piezoelectric), 열량측정(calorimetric)과 시각적(optical) 변환 등을 사용한다. 전기화학적 변환은 가장 흔한 방법으로 탁하고 복잡한 매질에서도 사용 가능하며 검출 요소가 저비용이며 소형화 할 수 있는 장점이 있으며 실제 활용되는 변환기 종류로 전계효과 트랜지스터(field effect transistor, FET)와 전기화학형광(electrochemiluminescence)이 대표적이다.

전기적 특성을 이용한 탄소나노튜브 기반의 바이오 센서는 감지 반응이 일어나는 위치(전계효과, 쇼트키 등), 형성구조(단일 탄소나노튜브, 네트워크 소자 등), 사용하는 단자(Terminal)의 수(트랜지스터형, 저항형), 채널공정의 순서(나노튜브와 전극의 공정 순서), 또는 모양(손가락형, 면형 등) 등에 따라 구분된다. 구분될 수 있으며, 감지반응이 탄소나노튜브 상에서 일어나는 경우 전계효과 방식, 탄소나노튜브가 채널이고 감지가 전극에서 일어나는 경우 쇼트키 효과 방식으로 구분된다.

본 발명의 방법으로 제조된 바이오센서는 고밀도-단방향 CNT 기반의 바이오센서라면 그 형식에 제한되지 않으며, 바람직하게는 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 필름의 전기적 특성을 활용한 바이오센서, 예를 들어 전계효과 방식. 트랜지스터형 또는 저항형 바이오센서로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 저항형 바이오센서를 제작 및 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 바이오 센서는 표적 분자의 검출 및 정량에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법으로 제조된 바이오센서는 단자의 수에 따라, 소스 및 드레인 전극으로 구성된 2단 소자인 경우 저항형 바이오센서일 수 있으며, 소스 및 드레인 전극에 게이트가 더해진 트랜지스터형 바이오센서일 수 있다.

상기 전계효과를 적용한 바이오센서의 원천특허로는 미국특허 제4,020,830호가 있으며 이온선택 전극을 통한 화학 분자를 검출하는 기술이 개시된다. 이후 미국특허 제4,238,757호에서 항체를 게이트 전극에 고정시켜 단백질을 검출하는 바이오센서가 발표되면서 미국특허 제4,777,019호, 제4,778,769호, 제5,114,674호, 제5,719,033호, 제7,001,792호 및 대한민국 특허공개 제2002-0082357호, 제2005-0087955호, 제2006-0089101호, 제2007-0101436호, 제2007-0022165호, 제2008-0051030호, 제2007-0088921호와 같이 다양한 원천기술이 발표되었다. 특히 생물 분자를 게이트 물질 표면에 고정시켜야 하는 바이오센서의 특성상 많은 농도의 생물 분자를 표면에 높은 강도로 결합시키기 위해 확장형 탐지 게이트 형태의 원천기술이 미국특허 제5,078,855호, 제7,361,946호 및 대한민국 특허공개 10-2007-0101436에 각각 발표되었다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 분자는 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 잇다. 예를 들어, 혈압, 맥박 또는 콜레스테롤과 DNA, 단백질, 호르몬 등이 바이오마커로 사용될 수 있으며, 단백질, DNA, 호르몬 등의 인산화, 메틸화 와 같은 추가적인 변이상태도 바이오마커로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 그 용도를 불문하고 모든 생체 지표가 이에 해당할 수 있으며, 특히 샘플에 수 펨토몰 수준으로 포함된 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오마커는 신경퇴행성질환의 바이오마커, 바람직하게는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단용 바이오마커일 수 있으며, 예를 들어, 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오센서는 복수의 표적 분자를 동시에 검출할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이오센서는 하나의 고밀도-단방향 CNT 필름 상에 복수의 디바이스가 패턴화되고, 각각의 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 물질이 각각의 디바이스에 고정된, 복수의 디바이스를 포함하는 바이오센서 어레이인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오 센서는, 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단용 바이오마커, 바람직하게는 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상, 더욱 바람직하게는 둘 이상, 가장 바람직하게는 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein) 모두를 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 검출된 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein)을 정량하여, t-tau/Aβ42 값, p-tau/Aβ42 값 및 Aβ42/Aβ40 값(M/M)을 계산한 결과, 알츠하이머 환자에서 상기 값들이 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 바이오센서는 검출된 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 또는 총 타우 단백질(t-tau protein)을 정량하여 t-tau/Aβ42 값, p-tau/Aβ42 값 또는 Aβ42/Aβ40 값(M/M)을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 제조방법으로 제조된 바이오센서의 바이오마커 검출 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 제조방법으로 제조된 바이오센서의 질병의 예측 또는 진단용도에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 혈압, 맥박 또는 콜레스테롤과 DNA, 단백질, 호르몬 등일 수 있으며, 단백질, DNA, 호르몬 등의 인산화, 메틸화 와 같은 변이체도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 그 용도를 불문하고 모든 생체 지표가 이에 해당할 수 있으며, 특히 샘플에 수 펨토몰 수준으로 포함된 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 신경퇴행성질환의 바이오마커, 바람직하게는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단용 바이오마커일 수 있으며, 예를 들어, 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 대상으로 분리된 샘플로부터 상기 방법으로 제조된 바이오센서를 사용하여 하나 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 단계; 검출된 표적 바이오마커를 정량하는 단계를 포함하는 질병의 예측 또는 진단방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 대상으로 분리된 샘플로부터 상기 방법으로 제조된 바이오센서를 사용하여 p-tau, t-tau, Aβ40 및 Aβ42를 검출하는 단계; 검출된 각각의 신경퇴행성질환의 바이오마커를 정량하는 단계; 및 t-tau/Aβ42, 7ㅣㅣ군으로 동정(identify)하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

본 발명의 용어 “예측”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자가 특정 질병 또는 질환을 앓을 가능성을 예상하여 위험군 또는 비위험군 등으로 판정하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 “대상”은 진단 대상을 의미한다. 상기 대상은 동물뿐 아니라, 세포, 조직, 기관과 같은 질병에 감염될 수 있는 모든 대상을 의미한다. 바람직하게는 상기 대상은 인간이다. 본 발명에서 상기 질병은 바람직하게는 신경퇴행성질환 더욱 바람직하게는 알츠하이머일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 대상으로부터 분리된 표적 바이오마커를 포함하는 샘플이면 모두 이용가능하며, 대상으로부터 분리된다는 의미는 혈액, 조직샘플, 대변, 소변 및 객담 등 환자로부터 분리된 환자의 신체 또는 분비물의 전체 도는 또는 이의 일부임을 의미한다. 상기 환자로부터 분리된 환자의 신체 또는 분비물 전체 또는 이의 일부는 환자의 신체로 다시 돌려주지 않는 것이 바람직하다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서의 제조 및 특성분석

본 발명자들은 물-공기 인터페이스에서 CNT를 압축한 뒤 실리콘 기판으로 전사하는 Langmuir-Blodgett (LB) 전사방법을 사용하여, 고밀도-단방향 CNT 필름을 제조했다(도 1 및 2). 고밀도-단방향 CNT 단층을 수득하기 위해, 물 서브페이즈(sub-phase)에 떠있는 poly[(m-phenylenevinylene)-co-(2,5-dioctoxy-p-phenylenevinylene)] (PmPV) 랩핑된 CNT에 단축으로 힘을 가하는 이동막대의 압축 및 후퇴를 반복했다. 고밀도-단방향 CNT 단일층 필름의 형성에 대한 상세한 기본 메커니즘은 도 3에 상세히 설명되어있다. 고밀도-단방향 CNT 단일층 필름을 형성하기위한 LB 사이클링의 임계 수가 각 사이클 마다 표면 압력이 증가하여 35mNm-1에 도달하는 10번의 압축 후퇴 사이클임을 확인했다 (도 4). 10사이클의 압축 및 후퇴동안 기록된 표면 압력 등온선 곡선(the surface pressure isotherm curves)에 따르면(도 5). 각 사이클에서 히스테리시스가 무시할만한 수치로 나타났다.

대조적으로, 한번에 35mN m-1의 표면 압력으로 CNT를 압축하는 경우 등온선 곡선의 큰 히스테리시스를 유발했다(도 5B). 상기 결과는 다중 사이클링을 통해 CNT의 자기 응집 및 루프 형성을 억제할 수 있음을 의미한다. 도 6A 및 도 7에 도시된 바와 같이, 반복된 LB 압축 후퇴 사이클에 의해 제조된 CNT 필름은 고도로 패킹되고 단방향으로 정렬된 CNT를 나타내지만, 단일 LB 사이클로 전사된 CNT 필름은 다수의 루프가 형성된 것으로 확인되었다. 지형 프로파일의 원자력 현미경 분석에 따르면(도 6B), 본 발명의 방법으로 제조된 고밀도-단방향 CNT 필름의 높이는 ~1.5nm이며, 상기 고밀도-단방향 CNT 필름이 단일층임을 의미한다. CNT 필름의 정렬을 분석하기 위해 높은 종횡비로 재료의 이방성을 측정할 수 있는 편광 라만 분광법을 사용했다.

도 8에 나타난 바와 같이, 랜덤 네트워크 CNT 필름의 라만 스펙트럼은 0° (정렬 방향에 평행 한 레이저)에서 90° (정렬 방향에 수직 한 레이저)로 편광 각도의 변화에 따라 무시할만한 변화를 나타냈다. 대조적으로, 고밀도-단방향 CNT 필름은 명백한 광학 이방성을 나타냈다; 라만 스펙트럼에서, G-밴드의 강도는 회전 각이 증가함에 따라 점차 감소했다(도 6C). 이러한 G-밴드의 각도 (α) 의존성은 cos2α 함수와 일치하며, 이는 본 발명의 방법으로 제조된 CNT 필름의 CNT가 거의 모두 단방향으로 정렬되었음을 의미한다.

이어서, 상기 고밀도-단방향 CNT 필름의 PmPV 부분을 제거하기 위해 CNT 필름을 아르곤(Ar) 대기에서 550℃로 1.5시간동안 열처리하여 어닐링하였고, 이는 푸리에 변환 적외선 분석에 의해 확인되었다 (도 9). LB 증착된 CNT는 아르곤(Ar) 대기 조건에서 열처리 후 컬링 또는 롤링 없이 정렬이 유지된다는 점에서 가치가 있다(도 10).

상기 방법을 통해 제조된 고밀도-단방향 CNT 필름위에 소스(source) 및 드레인(drain) 전극을 패터닝하여, 디바이스 어레이를 설계했다. 상기 디바이스의 CNT 채널은 분석물 특이적 항체로 기능화하여 바이오센서 어레이를 제작하였다(도 11 내지 14); 면역 글로불린 G(IgG)를 첨가할 때, 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 저항 변화를 조사하였다. 도 6d와 도 15에 나타낸 바와 같이, 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이의 저항 변화는 IgG의 로그 농도에 선형 의존성을 나타냈다. 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이는 IgG에 대해 높은 감도를 나타냈다. 상기 감도 값은 유사한 CNT 밀도를 갖는 랜덤 네트워크 샘플의 감도보다 2.29배 더 높았다. 또한 고밀도-단방향 CNT 센서 어레이는 유사한 초기 저항을 갖는 랜덤 네트워크 CNT 샘플보다 1.88배 더 높은 감도를 나타냈다(도 16B, 16D). CNT 상에 고정된 항 IgG의 양은 모든 어레이에 대해 유사하다는 점에 주목할만하다 (도 16A, 16C). 고밀도-단방향 CNT 와 랜덤 네트워크 필름에서의 CNT 길이의 유사성을 고려하면, 상기 결과는 랜덤 네트워크 CNT 샘플에서의 고저항성 튜브간 접합에 의한 것임을 의미한다(도 17 내지 19). 고저항성 튜브간 접합은 종래 문헌에서 보고된 바와 같이 (Liu, Y., Sauer, J. & Dutton, R. W., J. Appl. Phys. 103, 084701 (2008); Ishikawa, F. N. et al., ACS Nano 4, 6914-6922 (2010); Nirmalraj, P. N., Lyons, P. E., De, S., Coleman, J. N. & Boland, J. J., Nano Lett. 9, 3890-3895 (2009)), CNT 장치의 초기 저항을 증가시키고 바이오센서 어레이를 표적에 덜 민감하게 만든다.

바이오센서 어레이의 감도에 대한 CNT 밀도의 영향을 추가로 조사하여 CNT 필름의 CNT 밀도과 바이오센서 어레이의 감도가 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다(도 20A). 이러한 결과는 CNT의 밀도가 증가함에 따라 CNT에 고정된 표적 분자 특이적 물질(바이오리셉터)의 양이 많아지기 때문이다(도 20B). 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이는 감도가 높을 뿐 아니라 디바이스간 편차가 낮다. 도 6E에 도시된 바와 같이, 고밀도-단방향 CNT 디바이스 어레이의 저항 변화의 변동 계수(coefficient of variation; CV)는 6% 미만인 반면, 랜덤 네트워크 CNT 디바이스 어레이의 CV 값은 적어도 6배가 높은 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 각 디바이스당 CNT 수의 균일성에 기인하며, 이는 디바이스 어레이의 저항에 대한 낮은 CV값으로 입증된다(도 21).

실시예 2: 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이를 사용한 알츠하이머(AD) 핵심 바이오마커의 검출

본 발명자들은 AD 핵심 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 고밀도-단방향 CNT 디바이스 어레이를 채택하였으며, 각각의 바이오마커를 특이적으로 포획하는 바이오리셉터(항체)를 각각의 디바이스의 CNT 채널에 고정하였다.

센서 어레이에 사용된 항체에 대한 자세한 정보는 하기 표 1에 개시하였다(도 22).

표적	항체 (제조사, 카탈로그 번호)	설명
Aβ42	클론 12F4 (Biolegend, Cat #. 805501)	β-amyloid의 C-말단과 반응하며, 42번째 아미노산의 이소형 말단에 특이적.
Aβ40	클론 11A50-B10 (Biolegend, Cat #. 805401)	β-amyloid의 C-말단과 반응하며, 40번째 아미노산의 이소형 말단에 특이적.
t-tau	클론 Tau-5 (Millipore, Cat #. 577801)	타우 단백질의 인산화 및 비인산화 이소형을 모두 인식함. Tau-5의 에피토프는 타우 단백질의 210 내지 241번째 아미노산에 있음
p-tau₁₈₁	클론 M7004D06 (Biolegend, Cat #. 80846602)	181번째 잔기가 인산화된 인간 타우(human tau)를 인식

도 23은 바이오마커에 노출되는 경우에 고밀도- 단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이의 저항 변화를 나타낸 것이다. 바이오리셉터(항체)에 대한 표적 바이오마커의 특이적 결합은 바이오센서의 저항을 11%이상 증가시키는 반면, 비-타겟 바이오마커(즉 인간 IgG)에는 유의한 반응을 나타내지 않았다. 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이는 각각의 항체의 에피토프가 마스킹되지 않은(또는 손상되지 않은)경우에, 천연 및 변성 바이오마커 둘 모두를 검출할 수 있다는데 주목할 만 하다(도 24).

표적 바이오마커에 의해 증가되는 바이오센서 어레이의 저항의 기본 메커니즘을 확인하기 위해, 추가적인 리퀴드-이온 게이트(liquid-ion gate)를 적용하여, 고밀도-단방향 CNT 디바이스의 전달 특성을 분석했다(도 25a). 도 4B-E에 도시된 바와 같이, 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이의 전달 곡선은 전형적인 p형 반도체 특성을 나타낸다. 바이오센서 어레이에 표적 AD 바이오마커가 추가되는 경우 네거티브 게이트 전압에서 소스-드레인 전류를 감소시키며, 포지티브 게이트 전압영역은 영향을 받지 않는다. 상기 결과는 항체에 의해 포착된 표적 AD 바이오마커가 CNTs에 대한 산란 중심으로 작용하여 (Gruner, G., Chem. 384, 322-335 (2006)), 바이오센서의 컨덕턴스를 감소시켰음을 나타낸다.

고밀도-단방향 CNT 기반 센서 어레이의 민감도 및 정확도를 정량적으로 평가하기 위해 AD 바이오마커 농도를 변화시켜 바이오센서 어레이의 저항 변화를 확인하였다. 그 결과, 상기 바이오센서 어레이의 저항 변화와 10⁰ 내지 10⁶fM 사이의 바이오마커의 로그 농도 사이에 강력한 선형 상관관계를 확인하였다(도 26a 및 26d) 회귀선 결정 계수 (The coefficients of determination of the regression line, R2)는 0.99를 초과하였으며, 저항 변화에 대한 CV 값은 10% 미만이었다(도 27). 선형 회귀 분석의 결과에 기초하여, AD 바이오마커에 대한 센서 어레이의 LOD(검출 한계) 및 LOQ(정량 한계)는 각각 3.3 및 10의 신뢰 수준으로 평가되었다.

하기 표 2에 도시된 것과 같이, 4개의 AD 바이오마커에 대한 LOD 및 LOQ 값은 2.13 내지 2.72fM의 범위이며, 이는 AD 환자의 혈액의 일반적인 바이오마커 수준보다 102 내지 103배 낮은 값이다(Nakamura, A. Et al. Nature 554, 249 (2018); Zetterberg, H. et al. Ther. 5, 9 (2013); Janelidze, S. et al. Sci. Rep. 6, 26801 (2016)). 수득한 혈장에서 스파이크된 AD 바이오마커를 검출하여 센서 어레이의 정확성을 추가로 조사하였다(도 28). 표적 바이오마커의 로그 농도와 어레이의 저항 변화의 선형 의존성이 관찰 되었으며(R2>0.99), 스파이크된 AD 바이오마커의 회수율은 101-104fM는 임상적 농도 범위 내에서 93%를 초과하였다. 상기 결과는 고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서 어레이가 혈장의 간섭 물질들에 의해 방해받지 않으면서 펨토몰 수준의 표적 AD 바이오마커를 정확하고 확실하게 검출할 수 있음을 보여준다.

AD 바이오마커에 대한 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이의 성능

검증 파라미터		AD 바이오마커
검증 파라미터		Aβ42	Aβ40	t-tau	p-tau
정밀도 (Precision)	변이 계수 (Coefficient of variation, %)	5.24 (1.46-8.60)	5.16 (1.72-8.73)	6.92 (2.53-8.78)	6.36 (3.39-8.58)
민감도 (Sensitivity)	검출 한계 (Limit of detection, fM)	2.13	2.20	2.45	2.72
민감도 (Sensitivity)	정량한계 (Limit of quantification, fM)	9.86	10.9	15.1	20.7
정확도 (Accuracy)	스파이크 회수율* (Spike recovery*,% (range))	93.0 (87.3-99.5)	97.4 (91.0-103)	97.6 (91.7-102.1)	96.4 (91.1-98.8)

*인간 혈장

실시예 3: 임상 혈액 샘플에서 AD 바이오마커의 다중 감지

고밀도-단방향 CNT 센서 어레이의 다중 감지 능력을 입증하기 위해, 본 발명자들은 각각 t-tau, p-tau181, Aβ42 및 Aβ40에 특이적인 서로 다른 항체에 의해 기능화된 바이오센서 어레이를 제조하였다. 혼합된 AD 바이오마커를 첨가한 후, 표적화된 각각의 AD 바이오마커 특이적 인식 요소를 함유한 바이오센서에서만 저항의 상당한 변화가 관찰 되었다(도 29). 대조적으로, 나노몰 농도에도 불구하고 인간 혈장(예를 들어, IgG, 면역 글로불린 M, 인간 알부민 혈청 및 트랜스페린)의 비표적 물질에 대해서는 반응이 나타나지 않았다. 또한 다양한 Aβ 응집체 종(예, 단량체종, 올리고머 및 원섬유성 응집체)을 구별하는 바이오센서 어레이의 기능을 확인하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, 조밀하게 정렬된 CNT 센서 어레이는 서로 다른 비표적 Aβ종에 의한 간섭 없이 각각 올리고머 및 원섬유성 Aβ종을 구별하였다. 수득한 혈장에 스파이크된 AD 바이오마커의 다중 검출을 추가로 수행하였다. 도 26E에 도시된 바와 같이, 바이오센서 어레이는 단일 및 혼합 AD 바이오마커 모두 펨토몰 농도까지 정확하게 구별하였다. 혈장 내에 수백개의 비 표적 단백질이 존재함에도 불구하고 리커버리 수준은 모든 경우에 92% 이상으로 확인 되었다. 이러한 결과는 고밀도-단방향 CNT 기반의 다중 감지 플랫폼이 다른 비표적 단백질에 의해 간섭받지 않고 표적 AD 바이오마커를 선택적으로 인식할 수 있음을 의미한다.

이어서, AD 환자 및 건강한 대조군으로부터의 샘플을 사용하여 고밀도-단방향 CNT 기반 감지 플랫폼의 임상 적용 가능성을 조사 하였다. 대상의 상세한 인구 통계학적 특성은 하기 표 3과 같다.

대상의 인구통계학적 특성

	AD 환자	건강한 대조군
대상 수(명)	20	20
성비 (남/여)	9/11	11/9
나이 (mean ± SD) (범위)	72.5 ± 4.38 (65-81)	70.8 ± 3.07 (67-79)

도 31에 나타난 바와 같이, AD 환자로부터 얻은 혈장 샘플에서 t-tau 및 p-tau181의 평균 농도는 대조군 보다 각각 2.40 및 3.34 배 높은 것으로 밝혀졌다(p <0.001, 일원 분산 분석 (ANOVA)). 또한 AD 환자의 혈장에서 Aβ42의 추정 평균 농도는 정상 대조군보다 2.97 배 높았으나 (p <0.001, 일원 분산 분석). 혈장에서 Aβ40의 수준은 두 그룹에서 비슷 하였다 (p = 0.26, 일원 분산 분석). AD 바이오마커의 측정 된 혈장 수준은 하기 표 4에 나열되어 있으며, 이는 이전 임상 연구에서보고 된 값과 유사하다(Nakamura, A. Et al. Nature 554, 249 (2018); Park, J.-C. Et al. Brain 142, 771-786 (2019); Zetterberg, H. et al. Ther. 5, 9 (2013); Janelidze, S. et al. Sci. Rep. 6, 26801 (2016)).

	AD 바이오마커
	Aβ42	Aβ40	t-tau	p-tau ₁₈₁
AD 환자, pgmL^-1	6.49 ± 5.02	184 ± 67.8	32.2 ± 16.4	28.7 ± 17.9
건강한 대조군, pgmL^-1	19.3 ± 15.5	159 ± 78.0	13.4 ± 13.2	8.60 ± 10.5

본 발명의 센서어레이의 저항은 혈장 여과액뿐만 아니라 원래 혈장 샘플에 노출되는 경우 모두에서 증가하였기 때문에, 본 발명의 센서 어레이는 혈장의 다른 단백질과 결합되거나 결합되지 않은 Aβ42를 모두 검출할 수 있음에 주목할만하다(도 32). 종래 문헌에 따르면, 다수의 바이오마커의 조합을 시험하는 것이 정상인 사람들중에서 AD에 위험이 있는 자를 예측하는데 있어서 단일 바이오마커를 검출하는 것보다 우수하다(Craig-Schapiro, R. Et al. PLoS ONE 6, e18850 (2011)). 이를 위해, AD 환자 및 정상 대조군의 혈장에서 검출된 복합 바이오마커를 정량하여 t-tau/Aβ42, p-tau181/Aβ42 및 Aβ42/Aβ40 (M/M) 값을 계산하였다. 복합 바이오마커의 수준에서 AD그룹과 정상 대조군 사이의 유의한 차이가 발견되었으며 (p <0.000001, 일원 분산 분석), 단일 바이오마커 수준은 0.001 수준에서 유의한 것으로 확인되었다(도 33a 내지 33f 및 도 31).

AD 환자를 건강한 대조군과 구별할 수 있는 다중 검출용 바이오센서 어레이의 능력을 평가하기 위해, 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristics, ROC) 분석을 수행하였다(도 33g 및 표 5). ROC 분석은 감지 플랫폼의 진단 민감도, 특이성 및 정확성을 평가히기 위한 표준 통계법이다(도 34)(27~29). 복합 바이오마커를 예측 인자로 사용함으로써, 평균 AD 감도 90.0%, 선택도 90.0% 및 평균정확도 88.6%로 AD 환자 및 건강한 대조군을 성공적으로 구별하였다. 대조적으로 단일 바이오마커가 단독으로 분류마커로 사용될 때 본 발명의 바이오센서 어레이는 비교적 낮은 민감도, 선택성 및 정확도(70% 내지 88.3% 번위)를 나타냈다. 각 바이오마커에 대한 ROC 곡선 아래의 면적(AUC) 값을 추가로 확인했다. AUC 파라미터는 감지 플랫폼의 진단 정확도를 정량화하며, 1.0은 완벽한 임상 예측을 나타낸다(Rifai, N., Gillette, M. A. & Carr, S. A. Nat. Biotechnol. 24, 971-983 (2006) 및 31. Peveler, W. J. et al. Adv. Mater. 30, 1800634 (2018)). 복합 바이오마커의 추정 된 AUC 값은 0.93을 초과하는 반면, 개별 바이오마커는 0.80 내지 0.87 범위의 더 작은 AUC 값을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 전반적으로, 이들 결과는 임상 샘플에서 t-tau / Aβ42, p-tau / Aβ42 및 Aβ42 / Aβ40 수준의 정량이 고밀도-단방향 CNT 바이오센서 어레이는 AD 환자를 ~ 90.2%의 정확도로 건강한 대조군과 구별할 수 있다.

바이오마커	Cut-off 값	민감도* *(Sensitivity, %)**	선택도* *(Selectivity, %)**	정확도* *(Accuracy, %)**	AUC
Aβ42	≤7.94	80.0	70.0	73.2	0.800
t-tau	>11.2	90.0	70.0	80.5	0.815
p-tau	>7.23	95.0	70.0	80.5	0.870
Aβ42/Aβ40	≤0.075	90.0	90.0	87.8	0.925
t-tau/Aβ42	>2.34	90.0	90.0	90.2	0.955
p-tau/ Aβ42	>2.14	90.0	90.0	87.8	0.942

*민감도(Sensitivity)= 전체 양성 값(total positive value) 대비 진양성 값(true positive value)의 비율.*선택도(Selectivity) = 전체 음성 값(total negative value) 대비 진음성 값(true negative value)의 비율.

*정확도(Accuracy)= 전체 값(total value) 대비 전체 진실 값(true value)의 비율.

*Cut-off 값은 Youden index로 결정됨

실시예 4: 본 발명의 바이오센서의 효과 및 의의

상기 결과들에 따르면, 본 발명의 실시예에서 제조한 고밀도-단방향 CNT 기반의 바이오센서는 높은 디바이스간 신뢰성(CV<6%) 및 펨토몰 수준의 LOD를 나타내었다. 고밀도-단방향 바이오센서 어레이는 이전에 보고된 탄소나노튜브 기반의 표적 분자 감지 플랫폼 중 최저수준(펨토몰)의 검출 한계(LOD)를 나타내었다(도 35).

본 발명은 랭뮤어-블로젯의 최적화를 통해 정교한 나노리소그래피기술 없이 모든 기판에 고밀도-단방향 CNT 필름을 전사시킬 수 있다. 본 발명의 바이오센서는 혈장에 수백개의 간섭 물질이 존재함에도 불구하고, 높은 스파이크 회수수준(>93%)을 나타낸다. 고밀도-단방향 CNT 바이오센서는 당업계에서 사용되는 샌드위치형 효소-결합 흡착면역 분석법(sandwich-type, enzyme-linked immunosorbent assay)보다 10~100배이상 더 감도가 뛰어나다(도 36)(Kang, J.H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q. & Shaw, L. M., Clin. Chem. 59, 903-916 (2013)). 또한 AD 바이오마커를 검출하기 위해 많이 사용되는 표면 증강 라만 분광법(surface enhanced Raman spectroscopy) 및 형광 측정(fluorescence measurements)에 기초한 다른 감지 플랫폼보다도 10 ~ 100배 이상 낮은 LOD 값을 나타내었다.

나아가 표면 플라즈몬 공명에 기초한 고감도 광학 분석 플랫폼이 보고된 바 있으나(36), 이는 혈장에서 Aβ42에 대한 감지 플랫폼의 임상적 관련성만을 검증하는데 그치고 있으나, 본 발명은 4가지 다른 유형의 혈장 내 알츠하이머 바이오마커에 대한 고밀도-단방향 CNT 기반의 AD 바이오센서의 진단 정확도를 검증하는 것이다(도 37).

이전에 보고된 전기적 감지 플랫폼은 단일 AD 바이오마커만을 인식하고 있으며, 본 발명의 바이오센서보다 약 10배 이상 낮은 감도를 나타냈다. 아래 표 6에 도시된 것과 같이, 광학 장치 또는 질량 분석법을 기반으로하는 분석 기법의 경우 고가의 특수 장비가 필요하므로 감지 플랫폼의 유용성과 단순성이 제한되는데 반해, 본 발명의 바이오센서 및 바이오센서 어레이는 통합 된 센서 및 판독 회로를 갖춘 소형 휴대용 장치로 쉽게 응용 및 사용될 수 있다.

실시예의 재료 및 방법

화학물질 및 재료

단일벽 탄소나노튜브(Single-walled CNT)는 미국의 OSCiAI에서 얻었다. 인간 Aβ42 펩타이드, 인간 Aβ40 펩타이드 및 인간 tau441 단백질은 미국의 rPeptide Co.로부터 구입하였다. 합성 p-tau181 펩타이드(서열 Q165ANATRIPAKTPPAPKTphosphoPPSSGEPPKS191)은 한국의 펩트론에 의해 제공되었다. p-tau181, Aβ42의 C-말단 및 Aβ40의 C-말단에 결합하는 각각의 단일클론 항체 클론 M7004D06(p-tau 181 항체), 클론 12F4(Aβ42 항체) 및 클론 11A50-B10(Aβ40 항체)는 BioLegend, Inc.에서 구매하였다. 인산화 또는 비인산화 이소형의 타우 단백질을 모두 인식하는 항체 클론 Tau-5는 미국의 EMD Millipore로부터 얻었다. 항체 Tau-5의 에피토프는 타우 단백질의 아미노산 210-241 내에 있다. N하이드록시설포숙신이미드(Nhydroxysulfosuccinimide; sulfo-NHE)는 미국의 Thermo Fisher Scientific, Inc.에서 구입하였다. 본 발명의 실시예에서 사용된 다른 모든 화학물질은 미국 Sigma-Aldrich Chemical Co.에서 구입했다.

고밀도-단방향 CNT 디바이스의 제조.

25mg의 디클로로에탄(DCE)에 2.5mg의 CNT 및 2.5mg의 PmPV를 현탁시키고, 70%의 진폭의 horn 소니케이터를 사용하여 1시간 동안 현탁액을 소니케이션하였다. 31,665xg에서 1시간동안 원심분리한 뒤, 상등액을 테플론 여과지(Teflon filter paper, Sigma- Aldrich Chemical Co., USA)를 사용하여 수회 여과하고 깨끗한 DCE에 다시 분산하였다. 최종 현탁액을 1/6으로 희석하고 사용 전에 희석된 현탁액을 10분간 소니케이션하였다. 이후 탈-이온수를 LB 증착 트로프(LB deposition trough, KSV NIMA, KN 2001, Finland)에 채우고 물-공기 계면에 800μl의 CNT 현탁액을 떨어트렸다. 용매를 10분동안 증발시킨 후, 압축 후퇴사이클을 15mm/min의 속도로 반복하였다. 그 이후, 기판을 2mm/min의 속도로 끌어올려 SiO₂(100nm)/Si 부유 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사하였다.

랜덤 네트워크 CNT 필름은 1000rpm에서 스핀코팅방법을 사용하여 제조되었다. 제조된 CNT 필름을 550℃에서 1.5시간동안 어닐링하여 CNT 상의 PmPV부분을 제거하였다.

고밀도-단방향 CNT 기반 바이오센서의 제조

e-빔 증발기(e-beam evaporator; SNTECK Co. Ltd, Korea)를 사용하여 상기 제조된 고밀도-단방향 CNT 디바이스의 필름 표면에 금속(Cr/Au=5/50nm)을 증착하여 금속 소스 및 드레인 전극을 패턴화하였다. 각각의 CNT 채널의 폭 및 길이는 각각 1.6mm 및 200μm였다. 예상치 못한 측면 응답을 차단하기 위해 추가 레이어의 후속 증착 (Cr / SiO2 = 5/50 nm)으로 금속 전극을 패시베이션하였다. 인접한 CNT 소자 사이의 CNT 존재가 개별 CNT 소자의 저항에 영향을 미치지 않기 때문에, Si 웨이퍼(Si wafer)에서 인접한 CNT 소자를 분리하기 위한 추가적인 에칭(etching) 단계를 수행하지 않았다는 점이 하나의 장점이다(도 38). AD 바이오마커의 다중 검출을 위해 폴리디메틸실록세인(Polydimethylsiloxane; PDMS) 웰을 제조된 바이오센서에 장착하였다.

고밀도-단방향 CNT 필름의 기능화

패턴화된 고밀도-단방향 CNT 필름의 표면에 카르복실기를 도입하기 위해, UV-오존 클리너 (Ahtech LTS Co., Ltd, Korea)를 사용하여 UV-오존에 상기 제조된 CNT 디바이스 어레이를 노출시켰다. 7분동안 UV-오존을 처리한 후, 각각의 CNT 소자를 200mM의 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 및 1M의 sulfo-NHE를 함유하는 0.1 M의 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) 버퍼(pH 5.0) 용액에서 실온으로 30분간 인큐베이션 하였다.

CNT 측벽에서, UV-ozone에 의해 유도된 sp2 C-C 결합의 파손은 criegee`s 메커니즘을 통해 발생된다. CNT를 UV 광(185nm)에 노출 시키면 [2+3] 첨가환화(cycloaddition)에 의해 CNT 측벽에 화학흡착(chemisorb)되는 오존 분자가 생성된다. 또한, 254nm의 UV 광은 오존 분자를 해리하여, CNT상에 자발적으로 카르보닐기를 생성한다. Criegee`s 메커니즘에 대한 설명은 J. Phys. Chem. B 2002, 106, 2136; Angew. Chem., Int. Ed. 1975, 14, 745에 개시되어 있으며, 본 실시예에서는 이에 약간의 수정을 하여 수행했다.

이후, 잔류 물질을 제거하기 위해, 각 CNT 소자를 10mM 인산염 완충 식염수(phosphatebuffered saline; PBS, pH 7.4)로 세척했다. 10mM PBS에 용해된 항체 용액(항-Aβ42, 항-t-tau, 항-Aβ40 및 항-p-tau181) 300 μg/ml을 제조 하였다. 제조된 각각의 항체 용액을 sulfo-NHS-기능화된 CNT 소자에 떨어트리고 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해, 바이오센서 칩을 Tween-20(0.5 wt.%)를 함유하는 10mM PBS로 세척하였다. 이어서 3 wt.%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 및 0.5 wt.%의 Tween 20 혼합액을 4℃에서 1.5시간동안 각각의 CNT 바이오센서에 적용하였다.

바이오마커의 준비 및 바이오마커 감지 절차

Aβ40(1mg) 및 Aβ42(1mg)를 480μl의 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol에 용해시키고 실온에서 밤새 유지시켰다. 상기 용해액을 Protein Lobind 튜브 (Eppendorf AG, Germany)에 분배하고, 2시간동안 진공건조 하였다. 인간 타우(human tau, 100μg) 및 합성 p-tau 181(1mg)을 탈 이온수에 용해시켰다. 추가 실험을 위해 용액을 앨리??하고 -20℃에서 보관하였다. PBS 용액(10mM, pH7.4)을 사용하여 각 바이오마커의 저장용액을 연속적으로 희석하여, 펨토몰(Femtomolar) 내지 피코몰(picomolar) 농도의 바이오마커 시료를 제조하였다. 각 바이오마커의 저장농도는 100μg/mL이었다. 효소-연결 면역흡착 분석법 (Invitrogen, Catalog Number KHB0041, Total Tau Human ELISA Kit)을 사용하여, 바이오마커의 농도를 정량화했다(도 39). 각 바이오마커에 특이적으로 결합하는 바이오리셉터(항체)를 고정시킨 CNT 디바이스에 적용하고 실온에서 15분동안 배양하였다. 인간 혈장에서 AD 바이오마커를 검출하기 위해 혈장을 1/10로 희석했다. 센서칩의 저항은 digital multimeter (Fluke 83 V, Fluke Co., USA)를 사용하여 측정하였다.

임상 샘플

AD 환자 및 건강한 인간의 혈장 샘플은 각각 한국 바이오 뱅크 네트워크의 회원인 충북 바이오뱅크 및 충남대학교 병원에서 제공받았다. 임상 연구는 2018년10월25일 한국과학기술연구원(IRB)의 윤리위원회와 기관검토위원회에 의해 승인되었다(IRB-18-283). 모든 참가자로부터 연구를 위한 샘플의 사용에 대한 사전 동의를 받았으며, 각 참가자의 샘플 10μL를 분석에 사용하였다.

측정 및 특성화

10kV 가속 전압의 원자력 현미경(AFM, Veeco Instruments, USA) 및 S-4800 현미경(Hitachi High-technologies Co., Japan)을 사용하여 합성된 CNT 필름의 형태를 확인하였다. 분산 라만 분광기(dispersive Raman spectroscope, Horiba Jobin-Yvon Ltd, France) 및 X-선 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscope, Thermo VG Scientific, Inc., UK)를 사용하여 CNT 필름의 UV-오존 유도된 기능화를 분석하였다. 또한, Victor 3 마이크로플레이트 판독기(Perkin-Elmer, Inc., USA)를 사용하여 CNT에 고정화된 플루오레세인이소티오시안산염 접합 항체(fluorescein isothiocyanate-conjugated antibody)의 형광을 측정하였다. liquid-gated 정렬된 CNT-기반센서의 전달곡선을 측정하기 위해, PDMS 웰을 Ag/AgCl 기준 전극이 배치된 개별 소자의 상부에 밀봉하여 생리학 버퍼(physiological buffer)를 유지하였다. 모든 전달 곡선은 파라미터 분석기(Keithley 4200A-SCS, Keithley Instruments, Inc., USA)로 측정되었다.

LOD 및 LOQ는 다음의 방정식을 사용하여 계산했다:

κ × σ/S

상기 σ는 선형회귀의 표준편차, 상기 S는 회귀선의 기울기, 상기 κ는 통계적 신뢰수준이다. LOD 및 LOQ 수준을 결정하기 위해 신뢰수준은 각각 3.3 및 10으로 설정하였다. ROC 분석은 MedCalc 통계 소프트웨어 버전 14.8.1 (MedCalc Software, Belgium)을 사용하여 수행되었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 고밀도-단방향 탄소나노튜브(CNT) 필름 기반 바이오센서의 제조방법:
(a) 탄소나노튜브(CNT)를 콘쥬게이트화 폴리머(conjugated polymer)로 랩핑하는 단계;
(b) 콘쥬게이트화 폴리머로 랩핑된 CNT를 액체-공기 계면에서 압축 및 후퇴 사이클을 반복하여 고밀도-단방향 CNT를 수득하는 단계;
(c) 상기 고밀도-단방향 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사(transfer)하는 단계;
(d) 상기 필름을 어닐링(annealing)하여 콘쥬게이트화 폴리머를 제거하는 단계;
(e) 고밀도-단방향 CNT 필름에 소스 및 드레인 전극을 패턴화하여 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 형성하는 단계; 및
(f) 패턴화된 고밀도-단방향 CNT 디바이스에 표적 바이오마커와 특이적으로 상호작용하는 물질을 고정하는 단계,
여기서, 상기 압축 및 후퇴 사이클은 10회 이상 반복하여 수행하며, 각 사이클이 반복될 때마다 압력을 증가시켜 최종적으로 35mN/m 내지 100mN/m의 압력으로 압축하는 것을 특징으로 함.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 콘쥬게이트화 폴리머는 poly(metaphenylene vinylene)(PmPV), poly(arylenethynylene)s (PPE), poly{(2,6-pyridinylenevinylene)-co-[(2,5-dioctyloxy-p-phenylene) vinylene]}(PPvPV), Poly {(5-alkoxym-phenylenevinylene)(PAmPV), poly-3-dodecilthiophene (P3DDT), Polyfluorinated dibenzodioxins (PFDD), poly(9,9-dioctylfluorene-alt-pyridine) (PFOPy), poly(9,9-dioctylfluorenyl-2,7diyl) (PFO), Poly(3-dodecylthiophene-2,5-diyl) (P3DDT) 및 Poly(3-alkylthiophene) (P3AT) 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 기판을 0 mm/min 초과 100 mm/min 이하의 속도로 들어올려, 고밀도-단방향 CNT를 기판 표면에 필름으로 전사하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 필름은 광학 이방성을 나타내는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는, 상기 고밀도-단방향 CNT 필름을 패턴화하여, 둘 이상의 고밀도-단방향 CNT 디바이스를 형성하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 패턴화된 고밀도-단방향 CNT 필름을 패시베이션(passivation)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (f) 단계의 표적 바이오마커와 특이적으로 상호작용하는 물질은 효소, 항원, 항체 또는 항원 결합 단편, 압타머, 핵산, 단백질, 지질 및 탄수화물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 (f) 단계는 각각의 디바이스의 고밀도-단방향 CNT 필름에 상이한 표적 바이오마커와 특이적으로 결합하는 둘 이상의 분자를 각각 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조된 표적 바이오마커 검출용 바이오센서.
제11항에 있어서, 상기 표적 바이오마커는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단용 바이오마커인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제12항에 있어서, 상기 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단용 바이오마커는 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 및 총 타우 단백질(t-tau protein)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제13항에 있어서, 검출된 아밀로이드-β 40, 아밀로이드-β 42, 인산화 타우 단백질(p-tau protein) 또는 총 타우 단백질(t-tau protein)을 정량하여 t-tau/Aβ42 값, p-tau/Aβ42 값 또는 Aβ42/Aβ40 값(M/M)을 제공하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 검출용 바이오센서.
제11항의 바이오센서를 둘 이상 포함하는 바이오센서 어레이.
대상으로 분리된 샘플로부터 제11항의 바이오센서 또는 제15항의 바이오센서 어레이를 사용하여 p-tau, t-tau, Aβ40 및 Aβ42를 검출하는 단계;
검출된 각각의 신경퇴행성질환의 바이오마커를 정량하는 단계; 및
t-tau/Aβ42, p-tau/Aβ42 및 Aβ42/Aβ40 (M/M)값이 정상 대조군의 값보다 높은 경우, 대상을 신경퇴행성질환의 위험군으로 동정(identify)하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.
제16항에 있어서, 상기 샘플은 대상으로부터 분리된 혈액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성질환의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.