KR102509351B1 - Composition for crop management comprising Streptomyces sp. mutant U67-46 or its culture medium, and method for controlling pests using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 작물관리용 조성물 및 이를 이용한 해충방제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for crop management comprising a Streptomyces genus mutant U67-46 strain or a culture medium thereof, and a pest control method using the same.
화학 살충제는 해충방제 효율이 높아 해충으로부터 식물을 보호하기 위해 가장 널리 사용되고 있다. 그러나, 동시에 독성 잔류물이 축적되어 토양 및 수질 오염을 발생시키고, 해충의 살충제 내성 발달로 인해 환경, 인간 및 비표적 유기체에 부정적인 영향을 끼치고 있다. 또한 합성 살충제의 사용은 해충의 번식과 2차 해충의 증식으로 이어지며 궁극적으로 자연적 해충 포식자를 죽임으로써 생태계의 생태학적 균형을 파괴한다. 이러한 종래 화학 살충제의 문제점을 보완하기 위해 안전하고 환경 친화적인 생물학적 방제제의 개발이 요구되고 있다.Chemical insecticides are most widely used to protect plants from pests due to their high pest control efficiency. At the same time, however, toxic residues accumulate, resulting in soil and water pollution, negative impacts on the environment, humans and non-target organisms due to pesticide resistance development in pests. In addition, the use of synthetic pesticides leads to the proliferation of pests and secondary pests, ultimately destroying the ecological balance of the ecosystem by killing natural pest predators. In order to overcome the problems of these conventional chemical insecticides, the development of safe and environmentally friendly biological control agents is required.
해충 관리를 위한 생물학적 방제로서 생물농약 대사산물은 환경 친화적이고, 선택적이며, 분해 가능하고, 독성이 없는 천연물이므로, 이에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 미생물에서 유래한 생물학적 방제제(biological control agent) 중 방선균류(actinomycetes)는 살충제로 사용하기 위한 다양한 형태의 활성 화합물을 생산하기 때문에 가장 중요한 미생물 자원 중 하나이다. 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.)은 토양에 서식하면서 살충 활성을 나타내는 방선균의 주요 군이다. Biopesticide metabolites as biological control for pest management are environment-friendly, selective, degradable, and non-toxic natural products, so many studies are being conducted on them. Among biological control agents derived from microorganisms, actinomycetes are one of the most important microbial resources because they produce various types of active compounds for use as insecticides. Streptomyces genus ( Streptomyces spp. ) is a major group of actinomycetes that live in soil and exhibit insecticidal activity.
야생형 균주에서 2차 대사산물을 생산하고 적용하는 것은 경제적인 관점에서 효율적이지 않다. 따라서 야생형 균주의 활성을 향상시키고 효율을 높이는 방법이 요구된다. UV 조사법은 미생물 균주 개량에 있어 간편하고 안전하여 널리 사용되고 있다. 또한 2차 대사산물의 질(활성)과 양은 대사산물이 배양되는 배지, 온도, 교반 속도, 배지의 초기 pH, 발효 기간 등 다양한 환경적 요인에 따라 영향을 받는다.Production and application of secondary metabolites in wild-type strains is not economically efficient. Therefore, a method for improving the activity and efficiency of the wild-type strain is required. The UV irradiation method is widely used because it is simple and safe in improving microbial strains. In addition, the quality (activity) and quantity of secondary metabolites are affected by various environmental factors such as the culture medium in which the metabolites are grown, temperature, agitation speed, initial pH of the medium, and fermentation period.
이와 같은 점들을 고려하여, 본 발명자들은 해충방제 활성이 높은 스트렙토마이세스 속 균주를 선별하고, 돌연변이 유발을 통해 균주의 활성을 증가시키며, 이 균주 또는 이의 배양액을 이를 포함한 작물관리용 조성물의 해충방제 효과를 확인하고, 이 균주가 우수한 해충방제 활성을 나타내는 배양 조건을 확립하였다. In view of these points, the present inventors select a strain of the genus Streptomyces with high pest control activity, increase the activity of the strain through mutagenesis, and use this strain or its culture solution for pest control of a crop management composition including the same The effect was confirmed, and culture conditions in which this strain showed excellent pest control activity were established.
본 발명의 목적은, 해충방제 활성이 높은 미생물 균주 또는 이의 배양액을 함유하는 조성물 및 이를 이용한 해충방제 방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a composition containing a microbial strain having high pest control activity or a culture medium thereof, and a pest control method using the same.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem (s), and another problem (s) not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 작물관리용 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention Streptomyces ( Streptomyces sp. ) Provides a composition for crop management, comprising a mutant U67-46 strain (KCTC14896BP) or a culture medium thereof as an active ingredient.
상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액은 해충의 산란을 억제하거나 유충에 대한 살충 활성을 가지는 것 일 수 있다.The genus Streptomyces ( Streptomyces sp. ) Mutant strain U67-46 strain (KCTC14896BP) or a culture solution thereof may inhibit spawning of pests or have insecticidal activity against larvae.
상기 작물관리용 조성물은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액의 1 내지 30배 희석액을 포함하는 것 일 수 있다.The crop management composition may include a 1 to 30-fold dilution of the Streptomyces sp. mutant U67-46 strain (KCTC14896BP) or its culture medium.
상기 작물관리용 조성물은 배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대해 적용하는 것 일 수 있다.The crop management composition may be applied to one or two or more plants selected from the group consisting of cabbage, cabbage, red cabbage, radish, turnip, rapeseed, leaf mustard, broccoli, collard, kale, and horseradish.
상기 작물관리용 조성물은 나비목 해충으로서, 담배거세미나방(Spodoptera litura), 파밤나방(Spodoptera exigua), 도둑나방(Mamestra brassicae), 배추좀나방(Plutella xylostella), 배추순나방(Hellula undalis), 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 해충에 대해 적용하는 것 일 수 있다.The composition for crop management is a lepidopteran pest, tobacco weeding moth ( Spodoptera litura ), Plum moth ( Spodoptera exigua ), thief moth ( Mamestra brassicae ), Chinese cabbage moth ( Plutella xylostella ), Chinese cabbage moth ( Hellula undalis ) and cabbage white butterfly ( Pieris rapae ) It may be applied to one or more pests selected from the group consisting of.
상기 균주는 온도 25 내지 35℃에서 배양되는 것 일 수 있다.The strain may be cultured at a temperature of 25 to 35 ° C.
상기 균주는 교반 속도 200 내지 350rpm에서 배양되는 것 일 수 있다.The strain may be cultured at an agitation speed of 200 to 350 rpm.
상기 균주는 M3 또는 GS33 배지에서 배양되는 것 일 수 있다.The strain may be cultured in M3 or GS33 medium.
상기 균주는 1 내지 7일 동안 배양되는 것 일 수 있다.The strain may be cultured for 1 to 7 days.
본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액을 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알; 또는 식물의 전부 또는 일부, 또는 식물의 종자; 또는 상기 해충 또는 식물의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충방제 방법을 제공한다.The present invention Streptomyces genus ( Streptomyces sp. ) Mutant strain U67-46 strain (KCTC14896BP) or a culture solution thereof to pests, pest larvae or pest eggs; or all or part of a plant, or a seed of a plant; Or it provides a pest control method comprising the step of contacting the habitat of the pest or plant.
상기 식물은 배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 것 일 수 있다.The plant may be one or two or more selected from the group consisting of cabbage, cabbage, red cabbage, radish, turnip, rapeseed, leaf mustard, broccoli, collard, kale, and horseradish.
상기 해충은 나비목 해충으로서, 담배거세미나방(Spodoptera litura), 파밤나방(Spodoptera exigua), 도둑나방(Mamestra brassicae), 배추좀나방(Plutella xylostella), 배추순나방(Hellula undalis), 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 것 일 수 있다.The pest is a lepidopteran pest, and tobacco weeding moth ( Spodoptera litura ), Plum moth ( Spodoptera exigua ), thief moth ( Mamestra brassicae ), Chinese cabbage moth ( Plutella xylostella ), Chinese cabbage moth ( Hellula undalis ) and cabbage white butterfly ( Pieris rapae ).
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 작물관리용 조성물은 나비목 해충의 산란 억제 및 살유충을 효과적으로 수행하는 효과가 있다.According to the present invention, the Streptomyces sp. strain U67-46 mutant strain or a composition for crop management containing a culture medium thereof has an effect of effectively inhibiting spawning and killing larvae of lepidopteran pests.
또한, 본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 작물관리용 조성물을 해충 또는 식물에 접촉시켜 해충방제를 효과적으로 수행하는 효과가 있다.In addition, according to the present invention, the Streptomyces sp. (Streptomyces sp.) There is an effect of effectively performing pest control by contacting the composition for crop management containing the mutant U67-46 strain or its culture medium to pests or plants.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 해충방제 활성이 우수한 박테리아 균주를 스크리닝하기 위해, 배추좀나방에 대한 유충 치사율이 80% 이상인 6개 균주의 살유충 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 배양액의 적정 희석배율을 확인하기 위해, 희석 배율에 따른 배추좀나방의 유충 치사율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 배양액의 2배 희석액 처리 5일 후 배추유모(A)의 상태를 무처리 대조군(B)과 비교한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 균주 KR0006 배양액의 배추좀나방 산란 억제 및 유충 방제 활성을 확인하기 위하여, KR0006 배양여액을 처리하지 않은 배추유모와 처리한 배추유모에 배추좀나방 성충을 각각 접종한 후 배추유모의 생육상태를 비교한 사진이다[A: 무처리 대조군 6일 경과, B: 1차 처리군 6일 경과, C: 무처리 대조군 10일 경과(A에서 4일 더 경과, 총 10일 경과), D: 2차 처리군 4일 경과(B에 2차 처리한 후 4일 경과, 1차 처리 이후 총 10일 경과)]
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006의 16S rRNA의 유전자 염기서열 분석에 근거한 계통수를 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006에 의해 생산된 유효 살충 활성 물질의 분리 및 정제 방법을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 배양액의 조 추출물(crude extract)에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과(a)와 물질의 UV spectrum(b)를 나타낸 것이다.
도 8은 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 활성을 증가시키기 위한 UV 돌연변이 방법을 나타낸 것이다.
도 9는 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이 균주 U67-46을 온도 30℃, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1에서 6일 동안의 M3와 GS33 배지에서 배양함에 따른 유충 치사율을 나타낸 것이다.1 is a graph comparing the larval activity of six strains having a larval mortality rate of 80% or more against diamondback moth in order to screen bacterial strains having excellent pest control activity according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a graph showing the mortality rate of diamondback moth larvae according to the dilution ratio in order to confirm the appropriate dilution ratio of the strain KR0006 culture medium according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a photograph comparing the state of the cabbage hair (A) with the untreated control group (B) after 5 days of treatment with a 2-fold dilution of the strain KR0006 culture medium according to an embodiment of the present invention.
4 is a diagram showing the inhibition of spawning and larval control activity of the strain KR0006 culture medium according to an embodiment of the present invention, in which the KR0006 culture filtrate-untreated cabbage oil and the treated cabbage oil were treated with cabbageworm adult larvae, respectively. This is a picture comparing the growth status of cabbage hairs after inoculation [A: 6 days in the untreated control group, B: 6 days in the first treatment group, C: 10 days in the untreated control group (4 more days in A, total 10 days),
Figure 5 shows a phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence analysis of strain KR0006 according to an embodiment of the present invention.
6 shows a method for separating and purifying an effective insecticidal active substance produced by strain KR0006 according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows the high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis result (a) and the UV spectrum (b) of the substance for the crude extract (crude extract) of the strain KR0006 culture medium according to an embodiment of the present invention.
8 shows a UV mutation method for increasing the activity of strain KR0006 according to an embodiment of the present invention.
Figure 9 shows the larval mortality according to culturing the mutant strain U67-46 according to an embodiment of the invention in M3 and GS33 media for 6 days at a temperature of 30 ° C, agitation speed of 300 rpm, and an initial pH of 7.1.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.Before describing the present invention in detail, the terms or words used in this specification should not be construed as unconditionally limited in a conventional or dictionary sense, and in order for the inventor of the present invention to explain his/her invention in the best way It should be noted that concepts of various terms may be appropriately defined and used, and furthermore, these terms or words should be interpreted as meanings and concepts corresponding to the technical spirit of the present invention.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.That is, the terms used in this specification are only used to describe preferred embodiments of the present invention, and are not intended to specifically limit the contents of the present invention, and these terms represent various possibilities of the present invention. It should be noted that it is a defined term.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.In addition, in this specification, it should be noted that singular expressions may include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise, and similarly, even if they are expressed in plural numbers, they may include singular meanings. do.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.Throughout this specification, when a component is described as "including" another component, it does not exclude any other component, but further includes any other component, unless otherwise stated. It can mean you can do it.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.In addition, in the following description of the present invention, a detailed description of a configuration that is determined to unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, for example, the known technology including the prior art, may be omitted.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 작물관리용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for crop management comprising Streptomyces sp. ) mutant U67-46 strain (KCTC14896BP) or a culture solution thereof as an active ingredient.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주(본 명세서에서 'U67-46 균주' 또는 '균주 U67-46'과 혼용됨) 또는 이의 배양액은 해충방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 해충방제 활성은 바람직하게는 해충의 산란을 억제하거나 유충에 대한 살충 활성일 수 있다.The Streptomyces genus mutant U67-46 strain (in this specification, 'U67-46 strain' or 'strain U67-46' and mixed) or a culture solution thereof is characterized in that it has pest control activity. The pest control activity may preferably inhibit spawning of pests or may be insecticidal activity against larvae.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주는 토양 샘플에서 해충방제 활성이 높은 스트렙토마이세스 속 KR0006 균주(본 명세서에서 'KR0006 균주' 또는 '균주 KR0006'와 혼용됨)를 선별한 후 두 차례에 걸친 돌연변이 유발을 통해 해충방제 활성이 현저히 증대된 변이 균주이다.The mutant U67-46 strain of the genus Streptomyces is selected from the soil sample to the KR0006 strain of the genus Streptomyces having high pest control activity (in this specification, 'KR0006 strain' or 'strain KR0006') is selected, and then twice It is a mutant strain whose pest control activity is remarkably increased through mutagenesis.
본 발명의 일 실시예에서, 배추좀나방에 대해 80% 이상의 유충 치사율을 나타내는 박테리아 균주들을 스크리닝 하여 가장 높은 활성을 나타내는 스트렙토마이세스 속 KR0006 균주를 선별하였다. In one embodiment of the present invention, bacterial strains exhibiting a larval mortality rate of 80% or more for diamondback moth were screened to select the KR0006 strain of the genus Streptomyces showing the highest activity.
도 1을 참조하면, 배추좀나방에 대해 80% 이상의 유충 치사율을 나타내는 6종의 균주 중 KR0006 균주가 가장 높은 유충 치사율을 나타냄을 확인할 수 있다. Referring to FIG. 1, it can be confirmed that the KR0006 strain exhibits the highest larval mortality rate among 6 strains exhibiting a larval mortality rate of 80% or more for diamondback moth.
본 발명의 일 실시예에서, KR0006 균주 배양액을 희석배율에 따른 유충 치사율을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, the KR0006 strain culture was confirmed for larval mortality according to the dilution ratio.
도 2를 참조하면, KR0006 균주 배양액 처리 후 5일 경과한 결과 1 내지 5배 희석액으로 90% 이상의 유충 치사율이 관찰된 반면, 10배 이상 희석액으로 처리 시 30% 미만의 치사율을 나타내었다. 도 3을 참조하면, 2배 희석액으로 처리 시 5일 경과한 결과 유충 치사율은 100% 임을 확인하였다. 구체적으로는, KR0006 균주 배양액의 유충 생육억제 활성을 확인하기 위하여 KR0006 균주 배양여액을 분무 처리한 배추유모(A)와 처리하지 않은 무처리 배추유묘(B)에 배추좀나방 유충을 각각 10마리씩 접종하고 접종 5일 후 유묘의 생육상태 및 살충수를 비교한 결과, 접종 초기의 유충에 의한 섭식흔이 약간 존재하나 KR0006 배양여액을 분무 처리한 배추에서 100%의 유충 방제 활성을 확인하였다.Referring to FIG. 2, as a result of 5 days after treatment with the KR0006 strain culture solution, a mortality rate of 90% or more was observed with a 1 to 5-fold dilution, whereas a mortality rate was less than 30% when treated with a 10-fold or more dilution. Referring to FIG. 3, it was confirmed that the larval mortality rate was 100% after 5 days of treatment with the 2-fold dilution solution. Specifically, in order to confirm the larval growth inhibitory activity of the KR0006 strain culture solution, 10 diamondback moth larvae were inoculated into cabbage oil sprayed with KR0006 strain culture filtrate (A) and untreated cabbage seedlings (B), respectively. As a result of comparing the growth status and number of insecticides of
본 발명의 일 실시예에서, KR0006 균주 배양액의 배추좀나방 산란 억제 및 유충 생육억제 활성을 확인하였다. 구체적으로는 KR0006 배양여액을 처리하지 않은 배추유모와 처리한 배추유모에 배추좀나방 성충을 각각 접종한 후 배추유모의 생육상태를 비교하였다.In one embodiment of the present invention, the activity of inhibiting diamondback moth spawning and larval growth was confirmed by the KR0006 strain culture medium. Specifically, the growth status of the cabbage hairs was compared after inoculating the cabbage hairs with Chinese cabbage hairs that were not treated with the KR0006 culture filtrate and the cabbage hairs with the treatment, respectively.
도 4는 (A) KR0006 배양여액을 처리하지 않은 배추유모에 배추좀나방 성충을 접종한 후 6일 경과된 무처리 대조군, (B) KR0006 배양여액을 1차 분무 처리한 배추유묘에 50마리의 배추좀나방 성충을 접종한 후 6일 경과된 1차 처리군, (C) A에서 4일이 더 경과된(총 10일 경과된) 무처리 대조군, (D) 1차 처리군에 KR0006 배양여액을 2차 분무 처리한 후 4일 경과한 2차 처리군을 비교한 것이다. 1차 처리 후 6일 경과한 (B)는 배추좀나방의 산란 억제로 인하여 유충의 발생이 현저히 저해되어 배추의 섭식흔이 관찰되지 않았고, 무처리 후 10일 경과한 (C)는 유충으로 인해 유묘의 생육이 완전히 저해된 반면, 2차 처리 후 4일 경과한 (D)는 1차 처리에 의한 산란 억제로 유충발생이 현저히 적고 2차 처리 시 유충의 방제효과가 100%로 이루어져 유충에 의한 섭식흔이 발견되지 않았다. 따라서, KR0006 균주 배양액 처리 후 10일 경과 결과 나방과 유충을 100% 폐사시켰으며, 이로써 나방 산란과 유충 성장 및 발달에 대한 완전한 억제 효과가 있음을 확인하였다.Figure 4 shows (A) an
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KR0006 균주의 분류학적 구분을 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열을 다른 스트렙토마이세스 균주의 염기서열과 비교하였다. 도 5는 KR0006 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것으로, KR0006 균주는 스트렙토마이세스 시네레오루버(Streptomyces cinereoruber) NBRC 12756 균주와 99% 일치하는 경향을 나타내므로 스트렙토마이세스 시네레오루버의 아속으로 분류될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene was compared with that of other Streptomyces strains for taxonomic classification of the KR0006 strain. 5 shows a phylogenetic tree of the KR0006 strain, and the KR0006 strain is classified as a subgenus of Streptomyces cinereoruber because it shows a tendency to match 99% with the
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KR0006 균주 배양액에 포함된 활성 화합물을 확인하기 위하여 도 6과 같이 KR0006 균주 배양액을 추출, 분리 및 정제하였다. In one embodiment of the present invention, in order to confirm the active compounds contained in the KR0006 strain culture medium, the KR0006 strain culture medium was extracted, separated and purified as shown in FIG. 6 .
도 7을 참조하면, HPLC 분석 결과 5개의 피크(HP-1, HP-2, HP-3, HP-4, HP-5)가 확인되었고, 표 1을 참조하면 NMR 분석 및 고분해능 전자분무 이온화 질량분석을 통해 316-HP2는 안티마이신 A3a, 316-HP3은 안티마이신 A8a, 316-HP5는 안티마이신 A1a로 확인되었다. Referring to FIG. 7, as a result of HPLC analysis, five peaks (HP-1, HP-2, HP-3, HP-4, HP-5) were identified. Referring to Table 1, NMR analysis and high resolution electrospray ionization mass Analysis identified 316-HP2 as antimycin A3a, 316-HP3 as antimycin A8a, and 316-HP5 as antimycin A1a.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KR0006 균주의 해충 방제 활성을 향상시키기 위해 도 8과 같이 UV 처리를 수행하여 돌연변이 균주를 생성하였다. 1차 돌연변이 균주들의 배양액 처리 후 경과 시간에 따른 유충 치사율을 표 2로 나타내었다. In one embodiment of the present invention, in order to improve the pest control activity of the KR0006 strain, a mutant strain was generated by performing UV treatment as shown in FIG. 8. Table 2 shows the larval mortality according to the elapsed time after treatment of the culture medium of the primary mutant strains.
표 2를 참조하면, 돌연변이 균주 U67는 배양액 처리 24시간 후 70% 살충율을 나타내었고, 처리 48시간 이내에 100% 살충율을 나타내어 다른 돌연변이 균주 및 야생 균주와 비교하여 가장 높은 활성을 나타내었다. Referring to Table 2, the mutant strain U67 exhibited a 70% insecticidal rate after 24 hours of treatment with the culture medium and a 100% insecticidal rate within 48 hours of treatment, showing the highest activity compared to other mutant strains and wild strains.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 1차 돌연변이 균주 U67에 2차 UV 처리를 수행하여 돌연변이 균주를 생성하였다. 2차 돌연변이 균주 배양액의 희석 배율에 따른 유충 치사율을 야생형 및 1차 돌연변이 균주 U67과 비교하여 표 3으로 나타내었다. In one embodiment of the present invention, a secondary UV treatment was performed on the primary mutant strain U67 to generate a mutant strain. The larval mortality according to the dilution ratio of the culture medium of the secondary mutant strain is shown in Table 3 compared to wild type and primary mutant strain U67.
표 3을 참조하면, 2차 돌연변이 균주 U67-46이 20배 희석액에서 1차 돌연변이 균주 U67에 비해 살충 활성이 4배 정도로 향상되었음을 확인할 수 있다. 따라서 야생형 및 1차 돌연변이 균주에 비해 살충 활성이 현저히 증가한 2차 돌연변이 균주 U67-46을 본 발명에 따른 해충방제 활성을 가지는 균주로 선발하였다. Referring to Table 3, it can be seen that the insecticidal activity of the secondary mutant strain U67-46 is improved by about 4 times compared to the primary mutant strain U67 in a 20-fold dilution. Therefore, the second mutant strain U67-46, which has significantly increased insecticidal activity compared to the wild type and the first mutant strain, was selected as a strain having pest control activity according to the present invention.
본 발명에 따른 작물관리용 조성물은 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액의 1 내지 30배 희석액을 포함하는 것을 특징으로 한다. The crop management composition according to the present invention is characterized by comprising a 1 to 30-fold dilution of the Streptomyces genus mutant U67-46 strain or its culture medium.
상기 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 해충 방제용으로 사용하는 경우 1 내지 30배 희석액을 사용하는 것이 바람직하며, 1 내지 20배 희석액을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.When the U67-46 strain or its culture is used for pest control, it is preferable to use a 1 to 30-fold dilution, and more preferably to use a 1-20-fold dilution.
표 3을 참조하면, 균주 U67-46 배양액의 1 내지 30배 희석액은 60% 이상의 해충 방제율을 나타내고, 1 내지 20배 희석액은 100%의 해충 방제율을 나타낸다. 야생형은 20배 희석액의 경우 15±4b%, 30배 희석액의 경우 0%, 균주 U67은 20배 희석액의 경우 25±3c%, 30배 희석액의 경우 0%를 나타내었으나, 균주 U67-46은 1 내지 20배 희석액의 경우 100% 살충율을 나타내었고, 30배 희석액의 경우에도 65±10b%의 살충율로 야생형과 균주 U67에 비해 현저히 우수한 효과를 나타내었다. Referring to Table 3, a 1 to 30-fold dilution of the strain U67-46 culture medium exhibits a pest control rate of 60% or more, and a 1- to 20-fold dilution exhibits a pest control rate of 100%. The wild type showed 15 ± 4b% in the case of a 20-fold dilution and 0% in the case of a 30-fold dilution, and the strain U67 showed 25 ± 3c% in the case of a 20-fold dilution and 0% in the case of a 30-fold dilution, but the strain U67-46 showed 1 In the case of a 20-fold dilution, 100% insecticidal rate was exhibited, and even in the case of a 30-fold dilution, an insecticidal rate of 65 ± 10 b% was significantly superior to that of the wild type and strain U67.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 작물관리용 조성물은 배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대해 적용하여 해충에 대한 방제를 할 수 있다. Composition for crop management comprising the Streptomyces genus mutant U67-46 strain or its culture medium as an active ingredient according to the present invention is cabbage, cabbage, red cabbage, radish, turnip, rapeseed, mustard, broccoli, collards, kale, It can be applied to one or two or more plants selected from the group consisting of horseradish to control pests.
최근 상기 작물들에 대한 해충 피해 발생 및 면적이 넓어지고 있는 것은 십자화과 주요 채소인 양배추, 배추, 무 등의 재배면적이 늘어나고 있고, 비닐하우스 등 시설재배를 통한 채소의 연중재배가 이루어지면서 먹이 조건이 좋아졌을 뿐만 아니라 채소류의 재배가 단지화되고 연작되면서 진딧물류 등 채소의 해충방제를 위한 약제의 집중살포로 천적이 감소하였고, 해충의 세대기간이 연간 9~12세대로 짧고 발생횟수가 많아 약제에 대한 저항성이 빠르게 발달되어 해충방제 효과가 떨어지기 때문이다.Recently, the occurrence and area of pest damage to the above crops is expanding. In addition, as the cultivation of vegetables became complex and continued, natural enemies decreased due to the intensive spraying of pesticides for pest control of vegetables such as aphids. This is because resistance develops quickly and pest control effectiveness decreases.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 작물관리용 조성물은 나비목 해충으로서, 구체적으로 밤나방과의 담배거세미나방(Spodoptera litura), 파밤나방(Spodoptera exigua), 도둑나방(Mamestra brassicae), 집나방과의 배추좀나방(Plutella xylostella), 명나방과의 배추순나방(Hellula undalis), 흰나비과의 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 해충에 대해 적용하여 해충에 대한 방제를 할 수 있다.The composition for crop management comprising the Streptomyces genus mutant U67-46 strain or a culture solution thereof as an active ingredient according to the present invention is a lepidopteran pest, specifically, a tobacco weeding moth of the night moth family ( Spodoptera litura ), Plum moth ( Spodoptera exigua ), thief moth ( Mamestra brassicae ), Chinese cabbage moth ( Plutella xylostella ), Chinese cabbage moth ( Hellula undalis ), it is possible to control pests by applying to one or more pests selected from the group consisting of White Butterfly ( Pieris rapae ).
상기 해충들은 약제에 대한 저항성이 빠르게 발현되어 방제 효과가 쉽게 떨어진다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 작용 특성이 다른 약제를 교대로 살포하는 방안 등이 이용되고 있으나 한계가 있다. 이에 본 발명과 같은 미생물을 이용한 해충방제 제제가 요구되고 있다.The pests quickly develop resistance to drugs, and the control effect is easily reduced. In order to solve this problem, a method of alternately spraying drugs having different action characteristics has been used, but has limitations. Accordingly, pest control agents using microorganisms such as those of the present invention are required.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 온도 25 내지 35℃에서 배양되는 것이 바람직하고, 온도 27 내지 35℃에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 균주 U67-46가 상기 범위 이외의 온도에서 배양되는 경우 배양액의 해충방제 활성이 낮아질 수 있다.The U67-46 strain of the genus Streptomyces according to the present invention is preferably cultured at a temperature of 25 to 35 ° C, more preferably at a temperature of 27 to 35 ° C. When the strain U67-46 is cultured at a temperature outside the above range, the insect control activity of the culture solution may be lowered.
본 발명의 일 실시예에서, 배양 온도 및 배양 일수에 따라 생산된 균주 U67-46의 배양액을 처리 3일 후 유충 생존율을 조사하였다. In one embodiment of the present invention, the survival rate of larvae was investigated after 3 days of treating the culture solution of strain U67-46 produced according to the culture temperature and the number of days of culture.
표 4를 참조하면, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1, M3 배지에서, 배양 온도 30℃인 경우 3-4일 배양할 때 최대 살충 활성(100%)을 나타내었고, 배양온도 27℃인 경우 5일 간 배양할 때 최대 살충 활성(100%)을 나타내었으며, 배양온도 35℃인 경우 2일 간 배양할 때 최대 살충 활성(96.7%)을 나타내었다.Referring to Table 4, at an agitation speed of 300 rpm, initial pH 7.1, in M3 medium, maximum insecticidal activity (100%) was exhibited when cultured for 3-4 days at a culture temperature of 30 ° C, and 5 days at a culture temperature of 27 ° C. It showed the maximum insecticidal activity (100%) when cultured, and showed the maximum insecticidal activity (96.7%) when cultured for 2 days at a culture temperature of 35 ° C.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 교반 속도 200 내지 350rpm에서 배양되는 것이 바람직하고, 교반 속도 250 내지 350rpm에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 균주 U67-46가 상기 범위 이외의 교반 속도로 배양되는 경우 배양액의 해충방제 활성이 낮아질 수 있다.The U67-46 strain of the genus Streptomyces according to the present invention is preferably cultured at an agitation speed of 200 to 350 rpm, more preferably at an agitation speed of 250 to 350 rpm. When the strain U67-46 is cultured at an agitation speed outside the above range, the pest control activity of the culture solution may be lowered.
본 발명의 일 실시예에서, 배양 시 교반 속도 및 배양 일수에 따라 생산된 균주 U67-46의 배양액 처리 3일 후 유충 생존율을 조사하였다. In one embodiment of the present invention, the survival rate of larvae after 3 days of treatment with the culture solution of strain U67-46 produced according to the agitation speed and the number of days in culture was investigated.
표 5를 참조하면, 배양 온도 30℃, 초기 pH 7.1, M3 배지에서, 교반 속도 300rpm인 경우 3-4일 배양할 때 최대 살충 활성(100%)이 나타내었고, 교반 속도 250rpm인 경우 5일 간 배양할 때 최대 살충 활성(98.7%)을 나타내었으며, 교반 속도 350rpm인 경우 3일 간 배양할 때 최대 살충 활성(95.1%)를 나타내었다.Referring to Table 5, the maximum insecticidal activity (100%) was shown when cultured for 3-4 days at a culture temperature of 30 ° C, initial pH 7.1, and M3 medium at a stirring speed of 300 rpm, and for 5 days at a stirring speed of 250 rpm. It showed the maximum insecticidal activity (98.7%) when cultured, and showed the maximum insecticidal activity (95.1%) when cultured for 3 days at an agitation speed of 350 rpm.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 초기 pH 6.5 내지 7.5에서 배양되는 것이 바람직하고, 초기 pH 7 내지 7.5에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 균주 U67-46가 상기 범위 이외의 pH에서 배양되는 경우에는 균 생육이 저조해 질 수 있다. The U67-46 strain of the genus Streptomyces according to the present invention is preferably cultured at an initial pH of 6.5 to 7.5, more preferably at an initial pH of 7 to 7.5. When strain U67-46 is cultured at a pH outside the above range, bacterial growth may be reduced.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 M3 또는 GS33 배지에서 배양되는 것이 바람직하고, M3 배지에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. The U67-46 strain of the genus Streptomyces according to the present invention is preferably cultured in M3 or GS33 medium, more preferably cultured in M3 medium.
본 발명의 일 실시예에서, 배지 종류에 따른 균주 U67-46의 배양액을 처리한 후 경과 일수에 따른 유충 치사율을 조사하였다. In one embodiment of the present invention, the mortality rate of larvae according to the number of days after treatment of the culture solution of strain U67-46 according to the type of medium was investigated.
도 10을 참조하면, 전체 배양 기간에서 M3 배지를 사용하는 경우 GS33 배지 보다 유충 치사율이 높게 나타났다.Referring to FIG. 10, when M3 medium was used during the entire culture period, larval mortality was higher than that of GS33 medium.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 1 내지 7일 동안 배양되는 것이 바람직하고, 3일 내지 5일 동안 배양되는 것이 더욱 바람직하다.The U67-46 strain of the genus Streptomyces according to the present invention is preferably cultured for 1 to 7 days, more preferably for 3 to 5 days.
표 3, 4 및 도 10을 참조하면, 3일 내지 5일 동안 배양될 때 높은 살충 활성을 나타내었다. Referring to Tables 3, 4 and 10, it showed high insecticidal activity when cultured for 3 to 5 days.
본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액을 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알; 또는 식물의 전부 또는 일부, 또는 식물의 종자; 또는 상기 해충 또는 식물의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충방제 방법을 제공한다.The present invention Streptomyces genus ( Streptomyces sp. ) Mutant strain U67-46 strain (KCTC14896BP) or a culture solution thereof to pests, pest larvae or pest eggs; or all or part of a plant, or a seed of a plant; Or it provides a pest control method comprising the step of contacting the habitat of the pest or plant.
상기 식물은 배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 것 일 수 있다.The plant may be one or two or more selected from the group consisting of cabbage, cabbage, red cabbage, radish, turnip, rapeseed, leaf mustard, broccoli, collard, kale, and horseradish.
상기 해충은 나비목 해충으로서, 구체적으로 밤나방과의 담배거세미나방(Spodoptera litura), 파밤나방(Spodoptera exigua), 도둑나방(Mamestra brassicae), 집나방과의 배추좀나방(Plutella xylostella), 명나방과의 배추순나방(Hellula undalis), 흰나비과의 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 것 일 수 있다.The pest is a lepidopteran pest, specifically, a tobacco weeding moth of the night moth family ( Spodoptera litura ), Plum moth ( Spodoptera exigua ), thief moth ( Mamestra brassicae ), Chinese cabbage moth ( Plutella xylostella ), Chinese cabbage moth ( Hellula undalis ), it may be one or two or more species selected from the group consisting of Pieris rapae .
실시예Example
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to explain the present invention in detail. However, the embodiments according to the present invention can be modified in many different forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the embodiments described below. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
<재료 및 방법><Materials and methods>
1. 스트렙토마이세스의 분리 및 발효 배양1. Isolation and fermentation culture of Streptomyces
전국 각지에서 8-20cm 깊이의 토양층에서 채취한 토양 시료에서 총 850종의 스트렙토마이세스가 분리되었다. 표준 연속 희석법에 따라 각 시료 1g을 증류수 9ml에 희석하고 5분간 볼텍싱하여 균질화하였다. 그 다음, 연속 희석을 하여 10-3까지 희석하였다. 이 희석액의 100μL 분취량을 부식산-비타민 한천[0.5g MgSO4, 5g Na2HPO4, 0.2g CaCO3, 10g 부식산(humic acid), 20g KCL, 5g 사이클로헥시미드(cycloheximide), 20g 세균 한천(bacteriological agar) 및 1L 증류수]에 플레이팅 했다. 포자가 형성될 때까지 14일 동안 암실에서 27℃에서 배양하였다. 형태적 특성에 근거하여 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.)의 단일 콜로니들을 동정하였으며 베넷 한천 배지(Bennet's agar medium)[1 g 효모 추출물, 10 g 포도당, 1 g 쇠고기 추출물, 2 g 펩톤, 20 g 세균 한천, 1 L 증류수)에서 25℃에서 7일 동안 발효 배양하였다. M3 액체 배지(CaCO3 6g, 포도당 20g, 소이톤 20g, 용해성 전분 40g, 증류수 1L)를 사용하여 균주를 유지 및 배양하였다. 스트렙토마이세스 균주들을 27℃, 초기 pH 6.9에서 7일 동안 회전식 진탕기(250rpm)에서 배양하였다. 발효 배양액을 4℃에서 10분 동안 8000rpm에서 원심분리하고 상층액을 사용하여 살충 활성을 추가로 진화시켰다.A total of 850 strains of Streptomyces were isolated from soil samples collected from soil layers at depths of 8 to 20 cm across the country. According to the standard serial dilution method, 1 g of each sample was diluted in 9 ml of distilled water and homogenized by vortexing for 5 minutes. Then, it was diluted up to 10 -3 by serial dilution. A 100 μL aliquot of this dilution was added to humic acid-vitamin agar [0.5 g MgSO 4 , 5 g Na 2 HPO 4 , 0.2 g CaCO 3 , 10 g humic acid, 20 g KCL, 5 g cycloheximide, 20 g Bacteriological agar and 1L distilled water]. It was cultured at 27°C in the dark for 14 days until spores were formed. Single colonies of the genus Streptomyces ( Streptomyces spp. ) were identified on the basis of morphological characteristics, and Bennet's agar medium [1 g yeast extract, 10 g glucose, 1 g beef extract, 2 g peptone, 20 g Bacterial agar, 1 L distilled water) was fermented and cultured at 25 ° C for 7 days. The strain was maintained and cultured using M3 liquid medium (CaCO 3 6 g, glucose 20 g, soytone 20 g, soluble starch 40 g, distilled water 1 L). Streptomyces strains were cultured on a rotary shaker (250 rpm) for 7 days at 27° C., initial pH 6.9. The fermentation broth was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 4° C. and the supernatant was used to further evolve insecticidal activity.
2. 해충 관리2. Pest Control
배추좀나방(diamondback moth, Plutella xylostella)는 어린 배추 잎을 먹였으며 12시간 명/12시간 암주기로 25℃의 일정한 온도와 65% 상대 습도를 제공했다.Diamondback moth ( Plutella xylostella ) was fed young cabbage leaves and provided a constant temperature of 25°C and relative humidity of 65% with a 12-h light/12-h dark cycle.
3. 살충 분석3. Insecticidal assay
배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 대한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.) 배양액의 살충 활성은 잎 디스크 및 전체 식물 섭식 분석을 수행하여 테스트되었다. The insecticidal activity of Streptomyces spp. cultures against diamondback moth ( Plutella xylostella ) larvae was tested by performing leaf disc and whole plant feeding assays.
잎 디스크 섭식 분석: 배추 잎 디스크(직경 3cm)를 방선균 배양여액에 30초 동안 침지한 후 풍건하고 배추좀나방 2령충(10마리 유충/잎 디스크)을 접종하였으며 증류수를 무처리 대조군으로 사용하였다. 배추좀나방 유충에 살충활성은 처리 3일 후(이하, 처리 후 경과 일수를 'DAT' 라고 함) 잎 디스크에 생존한 유충의 수를 조사하여 살충율을 계산하였으며 유충의 생육상태를 무처리 대조구와 비교하여 관찰하였다. 모든 생물검정 실험은 3번 반복하여 수행되었다.Leaf disc feeding assay: Cabbage leaf discs (3 cm in diameter) were immersed in actinomycete culture filtrate for 30 seconds, air-dried, and inoculated with diamondback moth second instars (10 larvae/leaf disc), and distilled water was used as an untreated control. The insecticidal activity on diamondback moth larvae was determined by examining the number of surviving larvae on leaf discs after 3 days of treatment (hereafter, the number of days elapsed after treatment is referred to as 'DAT') to calculate the insecticidal rate, and the growth status of the larvae was compared to the untreated control group. observed in comparison with All bioassay experiments were performed in triplicate.
전체 식물 섭식 분석: 원예용 토양을 사용하여 온실 조건(주간/야간 = 30/25 ± 5℃, 명/암 = 14/10 h)에서 10일 동안 자란 배추(2개체/컵) 잎에 KR0006의 배양여액 10mL을 분무한 후 배추좀나방 2령(10개 유충/식물)을 접종하였다. 유충 섭식 억제 활성은 5 DAT에 배추 유묘의 생육상태를 달관조사하였으며 유충의 살충율을 계산하였다.Whole plant feeding assay: KR0006 on leaves of Chinese cabbage (2 individuals/cup) grown for 10 days in greenhouse conditions (day/night = 30/25 ± 5 °C, light/dark = 14/10 h) using horticultural soil. After spraying 10 mL of the culture filtrate, 2 instars of diamondback moth (10 larvae/plant) were inoculated. The growth status of Chinese cabbage seedlings was investigated for larval feeding inhibition activity at 5 DAT, and the insecticidal rate of larvae was calculated.
배추좀나방의 산란억제 및 유충 방제 효과를 알아보기 위하여 30Х25Х30(폭Х길이Х높이)의 투명 상자를 이용하여 성충을 접종하였다. 먼저, 원예용 토양, 온실 조건(주간/야간 = 30/25 ± 5℃, 명/암 = 14/10 h) 하 10일 동안 키운 배추 유묘(40개체/트레이)에 KR0006 배양 상등액을 각 50mL 분무하여 풍건한 후 유리 캐비넷에 넣고 트레이 당 50마리의 성충 나방을 접종하였다. 6 DAT에 처리구의 산란 억제 효과는 산란을 통한 생성 유충의 개체 수 확인 및 섭식에 의한 잎의 섭식흔을 통해 조사하였다. 또한 접종 6일 후 2차 배양여액을 처리하고 4일 후 무처리 대조군과 배추 유묘의 상태를 비교하여 살유충 활성(larvicidal activity)을 측정하였다.Adults were inoculated using a transparent box of 30Х25Х30 (width Х length Х height) to investigate the effect of inhibiting spawning and controlling larvae of Chinese cabbage moth. First, spray 50mL of KR0006 culture supernatant on cabbage seedlings (40 individuals/tray) grown for 10 days under horticultural soil and greenhouse conditions (day/night = 30/25 ± 5℃, light/dark = 14/10 h) After air drying, it was placed in a glass cabinet and inoculated with 50 adult moths per tray. The spawning inhibition effect of the treatment group at 6 DAT was investigated by checking the number of larvae generated through spawning and eating traces of leaves by feeding. In addition, after 6 days of inoculation, the secondary culture filtrate was treated, and larvicidal activity was measured by comparing the conditions of the untreated control group and
4. 통계 분석4. Statistical analysis
One-Way ANOVA 통계 분석은 OriginPro 8.1(OriginLab, 2021)을 사용하여 수행되었다. 평균값을 비교하기 위해 Fisher 검정을 사용하였으며, 평균값 > 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.One-Way ANOVA statistical analysis was performed using OriginPro 8.1 (OriginLab, 2021). The Fisher test was used to compare mean values, and mean values > 0.05 were considered statistically significant.
5. 균주의 분류학적 특성5. Taxonomic characteristics of strains
KR0006 균주의 분류학적 특성 분석을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열 및 PCR 증폭이 수행되었다. PCR 산물은 유전자 서열분석을 수행하기 위해 Macrogen Co., Ltd.(대전, 한국)에 의뢰되었다. 확보한 16S rRNA 유전자에서 얻어진 염기서열은 NCBI의 BLASTn 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 분석하였고, CLUSTAL W 프로그램(MEGA 6.0.)을 이용하여 유사한 염기서열을 정렬하였다. 이 균주의 계통수(phylogenetic tree)는 MEGA 6 프로그램으로 Neighbor-joining 방법을 사용하여 생성되었다. 부트스트랩(bootstrap) 분석은 구성된 계통수의 안정성을 평가하기 위해 1000번의 복제로 구현되었다.For taxonomic characterization of strain KR0006, 16S rRNA gene sequencing and PCR amplification were performed. PCR products were commissioned to Macrogen Co., Ltd. (Daejeon, Korea) to perform genetic sequencing. The base sequence obtained from the secured 16S rRNA gene was analyzed through NCBI's BLASTn program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), and similar base sequences were aligned using the CLUSTAL W program (MEGA 6.0.) did A phylogenetic tree of this strain was generated using the Neighbor-joining method with the
6. 활성 화합물의 정제 및 구조적 식별6. Purification and structural identification of active compounds
균주 KR0006에 의해 생성된 활성 물질을 분리하기 위해 먼저 배양 여과액을 에틸 아세테이트(EtOAc)를 사용하여 추출하였다. 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 시스템 및 세파덱스(Sepadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 EtOAc 분획을 순차적으로 정제하고 활성 분획을 성공적으로 분리했다. 얻어진 각 분획의 살충 활성은 잎 디스크 급이 분석을 수행하여 평가하였다(3. 살충 분석 참조). 그 후, 살충 활성을 나타내는 활성 분획을 분취용(preparative) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 추가 정제하였다. HPLC 분석은 JASCO HPLC(PU890, MD910, Tokyo, Japan)에서 수행되었으며 70% 아세토니트릴(230 nm, 0.8 ml/min, 물 T3 컬럼)이 분석의 전개 용매로 사용되었다.To isolate the active substance produced by strain KR0006, the culture filtrate was first extracted using ethyl acetate (EtOAc). Using a medium pressure liquid chromatography (MPLC) system and Sephadex LH-20 column chromatography, the EtOAc fraction was sequentially purified and the active fraction was successfully separated. The insecticidal activity of each fraction obtained was evaluated by performing a leaf disc feeding assay (see 3. Insecticidal assay). Thereafter, active fractions exhibiting insecticidal activity were further purified by preparative high-performance liquid chromatography (HPLC). HPLC analysis was performed on a JASCO HPLC (PU890, MD910, Tokyo, Japan) and 70% acetonitrile (230 nm, 0.8 ml/min, water T3 column) was used as the developing solvent for the analysis.
NMR 분석을 통해 분리된 화합물의 구조를 확인하였다. 분리된 화합물을 CDCl3 또는 DMSO에 녹이고 800MHz 핵자기공명장치(Brucker, 독일)에서 1H-NMR, 13C-NMR, 및 2D-NMR을 수행하여 추론하였다. 화학적 이동이 있는 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼은 CDCl3 용매 신호(1H-NMR에서 7.26ppm 및 13C-NMR에서 77.2ppm)를 참조하여 백만분율(ppm)로 표시되었다. 분자량은 고해상도 전자분무 이온화 질량분석기(ESI-MS)(YL9100S, Young Lin 장치)를 통해 측정하였다. The structure of the separated compound was confirmed through NMR analysis. The isolated compound was dissolved in CDCl 3 or DMSO and deduced by performing 1 H-NMR, 13 C-NMR, and 2 D-NMR in an 800 MHz nuclear magnetic resonance apparatus (Brucker, Germany). 1 H- and 13 C-NMR spectra with chemical shifts are expressed in parts per million (ppm) with reference to CDCl 3 solvent signals (7.26 ppm in 1 H-NMR and 77.2 ppm in 13 C-NMR). Molecular weight was determined by high-resolution electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) (YL9100S, Young Lin Instruments).
7. UV 돌연변이를 통한 균주 활성 증가7. Increased strain activity through UV mutation
선택된 배양액로부터 포자 현탁액을 연속 희석 방법으로 제조하였다. 10-2 희석액(약 104-105 포자 ml-1)의 100 μL 배양 샘플을 멸균 조건에서 베넷 한천 배지에 적용하고 27℃에서 60분 동안 배양했다. 각 페트리 플레이트에 UV 조사(254 nm, 높이 17 cm)를 4℃에서 30초 내지 90초간 처리하고, 27℃에서 72시간 동안 배양하였다. 생존 및 치사율은 UV 노출 후 평가되었고 생존 돌연변이 콜로니는 전술한 M3 액체 배지에서 배양되었다. 돌연변이 배양 상층액이 수확되면 전술한 잎 디스크 섭식 분석(3. 살충 분석 참조)을 수행하여 배추좀나방 유충에서 각 돌연변이의 활성을 스크리닝하였다.A spore suspension was prepared from the selected culture by serial dilution. A 100 μL culture sample of a 10 −2 dilution (about 10 4 -10 5 spores ml −1 ) was applied to Bennett's agar medium under sterile conditions and incubated at 27° C. for 60 minutes. Each Petri plate was treated with UV irradiation (254 nm, height 17 cm) at 4°C for 30 seconds to 90 seconds, and incubated at 27°C for 72 hours. Survival and lethality were assessed after UV exposure and surviving mutant colonies were cultured in M3 liquid medium as described above. Once the mutant culture supernatant was harvested, the leaf disc feeding assay described above (see 3. Insecticidal assay) was performed to screen the activity of each mutant in diamondback moth larvae.
가장 높은 살충 활성을 나타내는 돌연변이 균주를 선택하고 1차 돌연변이에서 얻은 균주의 활성을 증가시키기 위해 2차 돌연변이를 시켰다. 2차 돌연변이는 1차 돌연변이에서 수행된 돌연변이 및 스크리닝 절차와 동일하게 수행되었다.A mutant strain showing the highest insecticidal activity was selected and a secondary mutation was performed to increase the activity of the strain obtained from the primary mutation. Secondary mutagenesis was performed identical to the mutagenesis and screening procedures performed for primary mutagenesis.
8. 돌연변이 균주에 대한 배양 최적화8. Optimization of culture for mutant strains
a) 온도 최적화: 2차 돌연변이 균주는 4L 작업 부피의 M3 액체 배지에서 300rpm의 교반 속도, 초기 pH 7.1에서 7일 동안 온도 25, 27, 30 및 35℃에서 배양되었다.a) Temperature optimization: Secondary mutant strains were cultured at temperatures of 25, 27, 30 and 35° C. for 7 days at an initial pH of 7.1 at an agitation rate of 300 rpm in a 4 L working volume of M3 liquid medium.
b) 교반 속도 최적화: 2차 돌연변이 균주는 4L 작업 부피의 M3 액체 배지에서 30℃, 초기 pH 7.1에서 7일 동안 교반 속도 200, 250, 300 및 350 rpm에서 배양되었다.b) Optimization of agitation rate: secondary mutant strains were cultured in a 4L working volume of M3 liquid medium at 30° C., initial pH 7.1, for 7 days at agitation rates of 200, 250, 300 and 350 rpm.
c) 배양 배지 최적화: 2차 돌연변이 균주는 4L 작업 부피의 M3(가용성 전분 2%, 포도당 1%, 소이톤 1%, CaCO3 0.3%, FeSO4 0.02%) 및 GS33(포도당 3%, 대두가루 3%)의 액체 배지에서 30℃, 초기 pH 7.1에서 6일 동안 300rpm의 교반 속도에서 배양되었다. 모든 실험에서 각 돌연변이체의 살충 활성은 전술한 잎 디스크 섭식 분석(3. 살충 분석 참조)을 수행하여 배추좀나방의 유충에 대해 결정되었다. 그러나 돌연변이 배양 배지는 적용 전 5배(x1/5) 희석하였다.c) Optimization of the culture medium: the secondary mutant strains were M3 (2% soluble starch, 1% glucose, 1% soytone, 0.3% CaCO 3 , 0.02% FeSO 4 ) and GS33 (3% glucose, soybean meal) in a 4 L working volume. 3%) in a liquid medium at 30° C., an initial pH of 7.1, for 6 days at a stirring speed of 300 rpm. The insecticidal activity of each mutant in all experiments was determined against diamondback moth larvae by performing the leaf disc feeding assay described above (see 3. Insecticidal assay). However, the mutant culture medium was diluted 5-fold (x1/5) before application.
<결과><result>
1. 스트렙토마이세스 분리균주의 살충 활성1. Insecticidal activity of Streptomyces isolates
850개 박테리아 균주 모두는 잎 디스크 섭식 분석을 사용하여 배추좀나방의 살유충 활성에 대해 스크리닝되었다. 실험에서 유충 치사율이 80% 이상인 6개 균주 중 KR0006이 가장 높은 살유충 활성을 보였고 처리 3일 후 유충이 완전히(100%) 사멸되는 것을 확인하였다(도 1).All 850 bacterial strains were screened for larvalicidal activity of diamondback moth using a leaf disc feeding assay. In the experiment, it was confirmed that KR0006 showed the highest larval killing activity among 6 strains having a larval mortality rate of 80% or more, and the larvae were completely (100%) killed after 3 days of treatment (FIG. 1).
가장 높은 살충 활성을 나타낸 KR0006이 선택되었고 전체 식물 섭식 분석에 적용되었다. 선택된 균주의 살유충 활성은 5 DAT에 따라 용량 의존적이었고, 나방 유충을 배양 용액의 최대 5배 희석액으로 처리했을 때 90% 이상의 유충 치사율이 관찰된 반면, 10배 이상의 희석액 배양에서 처리된 경우 30% 미만의 치사율을 얻었다(도 2). 또한, 2배 희석배지를 적용한 결과, 처리 5일 후 유충 치사율은 100% 이었다. 다만, 처리 초기에는 유충 활동으로 인해 약간의 섭식자국이 보였다(도 3).KR0006, which showed the highest insecticidal activity, was selected and subjected to whole plant feeding assays. The larvalicidal activity of the selected strains was dose-dependent according to 5 DAT, and >90% larval mortality was observed when moth larvae were treated with up to 5-fold dilutions of the culture solution, whereas 30% when treated with 10-fold or more dilution cultures. mortality was obtained (FIG. 2). In addition, as a result of applying the 2-fold diluted medium, the larval mortality rate after 5 days of treatment was 100%. However, at the beginning of the treatment, some eating marks were seen due to larval activity (FIG. 3).
산란 억제 활성 결정 실험 결과, 배추좀나방의 산란 억제로 인한 활성 유충의 발생은 무처리 대조군에 비해 현저히 적었다. 1차 처리 시 유충 발생에 의한 섭식흔이 거의 관찰되지 않았으며 2차 처리 후 유충의 생육이 확인되지 않아 100%의 살충활성을 확인하였다(도 4). 따라서, KR0006이 10 DAT에 나방과 유충을 100% 폐사시켰으며, 이는 나방 산란과 유충 성장 및 발달에 대한 완전한 억제 효과가 있음을 의미한다. KR0006의 높은 수준의 살충 및 살유충 활성을 고려하여 분자 식별, 화학 분석 및 UV 돌연변이 유발과 같은 추가 조사를 하였다.As a result of the experiment to determine the spawning inhibition activity, the occurrence of active larvae due to the spawning inhibition of diamondback moth was significantly less than that of the untreated control group. During the first treatment, almost no feeding marks due to the occurrence of larvae were observed, and after the second treatment, the growth of the larvae was not confirmed, confirming 100% insecticidal activity (FIG. 4). Therefore, KR0006 killed 100% of moths and larvae at 10 DAT, which means that there is a complete inhibitory effect on moth spawning and larval growth and development. Considering the high level of insecticidal and larvicidal activity of KR0006, further investigations such as molecular identification, chemical analysis and UV mutagenesis were conducted.
2. 균주 KR0006의 분류학적 구분2. Taxonomic classification of strain KR0006
KR0006 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 얻기 위해 범용 프라이머를 이용한 PCR 기법을 수행하였다. 얻어진 염기서열을 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLASTn 프로그램을 통해 다른 스트렙토마이세스 균주의 염기서열과 비교하였다. 16S rRNA 염기서열분석을 통해 유사균주와 비교분석한 결과 스트렙토마이세스 시네레오루버(Streptomyces cinereoruber) NBRC 12756 균주와 99% 일치하는 경향을 보였다(도 5). 따라서 균주 KR0006은 스트렙토마이세스 시네레오루버의 아속으로 분류될 수 있다.To obtain the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of the KR0006 strain, a PCR technique using a universal primer was performed. The obtained nucleotide sequence was compared with the nucleotide sequence of other Streptomyces strains through the BLASTn program of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). As a result of comparative analysis with similar strains through 16S rRNA sequencing, Streptomyces cinereoruber ( Streptomyces cinereoruber )
3. 활성 화합물의 정제 및 구조적 측정3. Purification and structural determination of active compounds
스트렙토마이세스 균주 KR0006의 배양액을 에틸아세테이트를 사용하여 분배하고 분류 및 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 및 세파덱스 LH20 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하였다(도 6). 배추좀나방 유충에 활성을 갖는 분획을 0.02% 트리플루오르아세테이트산을 함유하는 70% 아세토니트릴을 전개용매로 HPLC(230 nm, 0.8 ml/min, Water, atlantis T3 컬럼) 분석을 실시한 결과 5개 피크(316-HP1~HP5)가 확인되었으며 각 피크는 고압 액체크로마토그래피(HPLC) 시스템을 이용하여 정제되었다(도 7).Cultures of Streptomyces strain KR0006 were partitioned using ethyl acetate and separated by fractionation and medium pressure liquid chromatography (MPLC) and Sephadex LH20 column chromatography (FIG. 6). The fraction active against diamondback moth larvae was analyzed by HPLC (230 nm, 0.8 ml/min, Water, atlantis T3 column) using 70% acetonitrile containing 0.02% trifluoroacetate as a developing solvent. (316-HP1 to HP5) were identified and each peak was purified using a high-pressure liquid chromatography (HPLC) system (FIG. 7).
5개의 화합물 중 살충활성이 강한 활성 화합물 316-HP2, HP3, HP5의 구조를 결정하기 위해 NMR 분석을 수행하였다. 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR 실험과 고해상도 전자분무 이온화 질량분석법을 통해 316-HP2, 316-HP3, 316-HP5 화합물은 각각 antimycin A3a, antimycin A8a, antimycin A1a로 확인되었다(표 1). NMR analysis was performed to determine the structures of the active compounds 316-HP2, HP3, and HP5 with strong insecticidal activity among the five compounds. Through 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR experiments and high-resolution electrospray ionization mass spectrometry, compounds 316-HP2, 316-HP3, and 316-HP5 were identified as antimycin A3a, antimycin A8a, and antimycin A1a, respectively (Table 1). .
활성 물질 316-HP3(안티마이신 A8a)은 고분해능 질량분석기([M+H]+, m/z 535.26) 결과 C5H11의 알킬기를 지닌 화학식 C27H38N2O9의 물질로 확인되었다. 또한 COSY NMR 분석 시 2.53ppm(7-H)에서 메틴으로부터 1.65 및 1.36ppm(Hα)에서 메틸렌 수소로, 1.06ppm(Hβ)에서 Ha에서 메틸렌으로, 1.45ppm(Hγ)에서 Hα에서 메탄으로, 0.83ppm(Hα 및 Hβ)에서 Hγ에서 6개의 수소 메틸 이중선으로의 변환은 알킬 측쇄가 이소펜틸(3-메틸 부틸)임을 나타낸다. HMBC 분석 시 Hδ 및 Hε에서 Cγ 및 Cβ로의 연결은 측쇄 구조를 확인하였다.The active substance 316-HP3 (antimycin A8a) was identified as a substance of the formula C 27 H 38 N 2 O 9 with an alkyl group of C 5 H 11 as a result of high-resolution mass spectrometry ([M+H]+, m/z 535.26). . In addition, COZY NMR analysis showed that from methine at 2.53 ppm (7-H) to methylene hydrogen at 1.65 and 1.36 ppm (Hα), from Ha to methylene at 1.06 ppm (Hβ), from Hα to methane at 1.45 ppm (Hγ), and from Hα to methane at 0.83 ppm (Hγ). The conversion of Hγ to a six hydrogen methyl doublet in ppm (Hα and Hβ) indicates that the alkyl side chain is isopentyl (3-methyl butyl). In HMBC analysis, the side chain structure was confirmed by linking Hδ and Hε to Cγ and Cβ.
또한 화학식 C26H36N2O9([M+H]+, m/z 520.24)를 갖는 활성 물질 316-HP2의 경우, 화합물 316-HP3과 상당히 유사함을 확인하였다. 측쇄에 선형 알킬로 보이므로 분지된 CH 피크가 없었고 화학식 C28H40N2O9([M+H]+, m/z 549.28)를 갖는 316-HP5도 316-HP3의 호변이성질체로 확인되었다.In addition, in the case of the active material 316-HP2 having the chemical formula C 26 H 36 N 2 O 9 ([M+H]+, m/z 520.24), it was confirmed that the compound 316-HP3 was quite similar. 316-HP5 with the chemical formula C 28 H 4 0N 2 O 9 ([M+H]+, m/z 549.28) was also identified as a tautomer of 316-HP3, as there was no branched CH peak as it appeared to be a linear alkyl in the side chain. .
4. UV 돌연변이를 통한 균주 활성 향상4. Improvement of strain activity through UV mutation
선택된 균주 KR0006의 살충 활성은 도 8과 같이 UV 처리를 통한 돌연변이 분석을 수행하여 향상되었다. 돌연변이 콜로니의 수는 UV 노출 시간이 증가함에 따라 감소했으며 UV 노출로부터 획득된 살아남은 돌연변이는 원래의 뉴클레오티드 서열과 표현형을 복원하지 않고도 여러 세대 동안 안정적으로 유지될 수 있었다. 각 돌연변이체(다른 UV 처리 시간)의 살충 활성은 배추좀나방의 유충에 대해 스크리닝되었다. The insecticidal activity of the selected strain KR0006 was improved by performing mutation analysis through UV treatment as shown in FIG. 8 . The number of mutant colonies decreased with increasing UV exposure time, and surviving mutants acquired from UV exposure could be stably maintained for several generations without restoring the original nucleotide sequence and phenotype. The insecticidal activity of each mutant (different UV treatment time) was screened against diamondback moth larvae.
표 2를 참조하면, 실험한 UV 돌연변이체 중에서 돌연변이체 U67에서 가장 높은 활성이 관찰되었다. 돌연변이 U67의 5배 희석에서 유충 사망률은 처리 24시간 후 70%, 처리 48시간 후 100%로 다른 돌연변이 및 야생형에 비해 살충력이 증가한 것을 확인하였다.Referring to Table 2, among the UV mutants tested, the highest activity was observed in mutant U67. In the 5-fold dilution of mutant U67, the mortality rate of larvae was 70% after 24 hours of treatment and 100% after 48 hours of treatment, confirming that the insecticidal activity was increased compared to other mutants and wild type.
상기와 같이 우수한 살충력을 나타낸 돌연변이 U67을 선택하고, 이에 2차 UV 돌연변이를 시켰다. 돌연변이 U67을 사용한 두 번째 UV 돌연변이 유발에서는 돌연변이 U67-46이 선택되었다. 잎 디스크 섭식 분석에 의한 돌연변이 U67-46의 유충 활성은 각각 20배 및 30배 희석액으로 처리했을 때 98% 및 65% 이었다. 2차 돌연변이 균주 U67은 배양여액을 10배 희석하여 처리했을 때 유충 치사율이 55%로 2차 돌연변이체 U67-46의 살충활성이 1차 돌연변이 균주 U67에 비해 2배, 야생형보다 5배 이상 증가한 것으로 나타났다. 또한, 2차 돌연변이 균주 U67-46은 20배 희석액에서 1차 돌연변이 균주 U67에 비해 살충 활성이 4배 정도를 나타내었다(표 3).Mutant U67, which exhibited excellent insecticidal activity as described above, was selected and subjected to secondary UV mutation. In the second UV mutagenesis with mutant U67, mutant U67-46 was selected. The larval activity of mutant U67-46 by leaf disc feeding assay was 98% and 65% when treated with 20-fold and 30-fold dilutions, respectively. The second mutant strain U67 showed a larval mortality of 55% when the culture filtrate was diluted 10 times, and the insecticidal activity of the second mutant U67-46 increased by 2 times compared to the 1st mutant strain U67 and by more than 5 times compared to the wild type. appear. In addition, the second mutant strain U67-46 exhibited about 4 times the insecticidal activity compared to the first mutant strain U67 in a 20-fold dilution (Table 3).
5. 2차 돌연변이 균주 U67-46에 대한 배양 최적화5. Optimization of culture for secondary mutant strain U67-46
2차 돌연변이 균주 U67-46은 온도 20-35℃, 교반 속도 200-350 rpm, 배양 배지 M3 또는 GS33에서 7일 동안 배양되었다. The secondary mutant strain U67-46 was cultured for 7 days at a temperature of 20-35°C, agitation speed of 200-350 rpm, and culture medium M3 or GS33.
표 4 내지 표 5, 도 8를 참조하면, 온도 30℃, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1, M3 배지에서 3-4일 동안 배양할 때 최대 살충 활성(100%)이 관찰되었다. 그러나 상기 조건에서 4일을 초과하여 배양하면 살충 특성이 감소하였다. 한편 온도 27℃ 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1에서 M3 배지에서 배양하는 경우, 최대 살충 활성(100%)을 나타내는데 배양 기간이 5일로 연장되었다. 30℃ 초과의 온도 및 300rpm 초과의 교반 속도는 살충 활성을 상대적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 도 9에 따르면, 전체 배양 일수(1 내지 6일)에서 M3 배지를 사용하는 경우 GS33 배지를 사용하는 경우보다 유충 방제 활성이 유의하게 높은 것으로 나타났다.Referring to Tables 4 to 5 and FIG. 8, the maximum insecticidal activity (100%) was observed when cultured for 3-4 days in M3 medium at a temperature of 30 ° C., a stirring speed of 300 rpm, an initial pH of 7.1. However, when cultured for more than 4 days under the above conditions, the insecticidal properties were reduced. On the other hand, when cultured in M3 medium at a temperature of 27 ° C., an agitation speed of 300 rpm, and an initial pH of 7.1, the maximum insecticidal activity (100%) was exhibited, and the incubation period was extended to 5 days. Temperatures above 30° C. and agitation rates above 300 rpm have been shown to relatively reduce insecticidal activity. According to Figure 9, it was found that the larval control activity was significantly higher than the case of using GS33 medium in the case of using M3 medium in the total culture days (1 to 6 days).
* 상기 값은 피셔 검정(Fisher test)에서 3회 반복(n=3)의 평균이다(평균 ± 표준 오차).*The values are the average of triplicate (n=3) in the Fisher test (mean ± standard error).
* 상기 값은 피셔 검정(Fisher test)에서 3회 반복(n=3)의 평균이다(평균 ± 표준 오차).*The values are the average of triplicate (n=3) in the Fisher test (mean ± standard error).
지금까지 본 발명의 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 작물관리용 조성물 및 이를 이용한 해충방제 방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.So far, the composition for crop management containing the Streptomyces genus mutant U67-46 strain or its culture medium of the present invention and specific examples of pest control methods using the same have been described, but within the limits that do not deviate from the scope of the present invention It is obvious that various implementation variations are possible in
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be limited to the described embodiments and should not be defined, and should be defined by not only the claims to be described later, but also those equivalent to these claims.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.That is, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not restrictive, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and All changes or modified forms derived from the equivalent concept should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (12)
상기 조성물은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 배양액의 1 내지 20배 희석액을 포함하고,
상기 조성물은 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대한 살충 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
작물관리용 조성물.
Streptomyces genus ( Streptomyces sp. ) In the composition for crop management containing the mutant U67-46 strain (KCTC14896BP) culture medium as an active ingredient,
The composition comprises a 1 to 20-fold dilution of the culture medium of the Streptomyces sp. mutant U67-46 strain (KCTC14896BP),
Characterized in that the composition has insecticidal activity against Plutella xylostella,
A composition for crop management.
상기 살충 활성은 해충의 산란을 억제하거나 유충에 대한 살충 활성인 것을 특징으로 하는,
작물관리용 조성물.
According to claim 1,
Characterized in that the insecticidal activity inhibits spawning of pests or is insecticidal activity against larvae,
A composition for crop management.
배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대해 적용하는 것을 특징으로 하는,
작물관리용 조성물.
According to claim 1,
Characterized in that it is applied to one or more plants selected from the group consisting of cabbage, cabbage, red cabbage, radish, turnip, rapeseed, leaf mustard, broccoli, collard, kale, and horseradish,
A composition for crop management.
상기 조성물은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP) 또는 이의 배양액의 1 내지 20배 희석액을 포함하고,
상기 조성물은 배추좀나방(Plutella xylostella)에 대한 살충 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
해충방제 방법.
Genus Streptomyces ( Streptomyces sp. ) Mutant strain U67-46 strain (KCTC14896BP) or its culture solution as pests, pest larvae or pest eggs; or all or part of a plant, or a seed of a plant; Or in the pest control method comprising the step of contacting the habitat of the pest or plant,
The composition includes a 1 to 20-fold dilution of Streptomyces sp. ) mutant U67-46 strain (KCTC14896BP) or a culture medium thereof,
Characterized in that the composition has insecticidal activity against Plutella xylostella,
pest control methods.
상기 식물은
배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는,
해충방제 방법.
According to claim 10,
said plant
Characterized in that one or two or more selected from the group consisting of cabbage, cabbage, red cabbage, radish, turnip, rapeseed, mustard, broccoli, collard, kale, and horseradish,
pest control methods.
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|---|---|---|---|
| KR1020220055092A KR102509351B1 (en) | 2022-05-03 | 2022-05-03 | Composition for crop management comprising Streptomyces sp. mutant U67-46 or its culture medium, and method for controlling pests using the same |
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