KR102505687B1 - 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법 - Google Patents

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Abstract

세포 계수 방법에 있어, 수동 방식과 자동 방식의 장점을 취합한 반자동 세포 계수 방법이 개시된다. 본 발명은 (a) 눈금 격자가 있는 혈구계산기(hemocytometer) 챔버에 세포 배양액을 넣고 유리 커버로 덮은 후 현미경 이미지를 취하는 단계; (b) 상기 이미지로부터 사각형의 계수 대상 영역을 추출하는 단계; (c) 상기 계수 대상 영역 내의 세포를 검출하는 단계; 및 (d) 상기 계수 대상 영역 내 세포 수로부터 상기 세포 배양액 내 전체 세포 수를 계수하는 단계;를 포함하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법을 제공한다.

Description

혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법{Semi-automatic cell counting method using a hemocytometer}
본 발명은 세포 계수 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈구계산기를 이용한 세포 계수 방법에 관한 것이다.
세포 계수(cell counting)는 생명과학 분야에서 세포의 개수를 정량화하는 것으로, 이는 세포계산법(cytometry)의 한 종류로서 임상과 연구에 모두 적용된다. 일반적으로 액체 배지에서의 세포 계수는 단위 부피 당 세포의 개수로 표현되고, 이것은 농도로 나타낼 수 있다.
이러한 세포를 계수하는 방법은 수동 방식과 자동 방식으로 분류할 수 있다. 자동 방식은 일반적으로 세포를 염색해서 나타나는 색상들을 분석해서 계수한다. 다양한 세포에 대해서 각기 다른 염색 반응으로 인해 그 분석 방법이 신뢰도를 갖기 위해서 많은 연구들이 이루어지고 있고, 이는 기술 개발에 비용 상승으로 이어지고, 결국 자동 계수 장비의 비용 상승을 야기시킨다.
그래서 간단하게는 혈구계산기(hemocytometer) 등을 이용해서 연구자가 직접 수동으로 세포를 계수하는 방법을 이용하지만, 단순 반복 작업으로 연구자의 피로도를 야기시키고, 연구자의 주관적 판단에 영향을 받는 등의 단점이 있다.
[선행특허문헌]
- 한국 공개특허 제10-2017-0024515호(2017.03.07.)
- 한국 등록특허 제10-1700887호(2017.01.23.)
본 발명은 세포 계수 방법에 있어, 수동 방식과 자동 방식의 장점을 취합한 반자동 세포 계수 방법과, 이를 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램 및 이를 기록한 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체를 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 제1 양태로서 본 발명은, (a) 눈금 격자가 있는 혈구계산기(hemocytometer) 챔버에 세포 배양액을 넣고 유리 커버로 덮은 후 현미경 이미지를 취하는 단계; (b) 상기 이미지로부터 사각형의 계수 대상 영역을 추출하는 단계; (c) 상기 계수 대상 영역 내의 세포를 검출하는 단계; 및 (d) 상기 계수 대상 영역 내 세포 수로부터 상기 세포 배양액 내 전체 세포 수를 계수하는 단계;를 포함하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법을 제공한다.
또한 상기 (b) 단계는, (b1) 상기 이미지에 대하여 색상을 기준으로 이분할하는 단계; (b2) 상기 이분할된 이미지를 입력받아 윤곽을 추출하는 단계; (b3) 상기 추출된 윤곽을 다각형으로 근사화하는 단계; (b4) 상기 근사화된 다각형 중 사각형을 추출하는 단계; 및 (b5) 상기 사각형 중 미리 지정된 크기 범위 내의 사각형을 상기 계수 대상 영역으로서 필터링하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법을 제공한다.
또한 상기 (b3) 단계는 Ramer-Douglas-Peucker 알고리즘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법을 제공한다.
또한 상기 (c) 단계는 딥러닝 기반의 Mask R-CNN 프레임워크를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법을 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 제2 양태로서 본 발명은, 상기 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 제3 양태로서 본 발명은, 상기 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 세포 계수 방법에 있어 혈구계산기를 이용하여 현미경 이미지를 취하는 단계는 기존 수동 방식으로 진행하고, 이후 계수 대상 영역의 추출, 세포 검출 및 세포 계수 단계는 자동 방식으로 진행함으로써, 수동 방식과 자동 방식의 장점을 취합하여 사용자가 직접 세포 수를 계수하는 데에 따른 피로감 없이 경제적인 방법으로 세포를 계수할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법의 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법이 구현되는 구성도이다.
도 3은 혈구계산기를 이용한 세포 배양액 현미경 관찰 이미지를 예시적으로을 챔나타낸 사진이다.
도 4는 혈구계산기의 눈금 격자를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 계수 대상 영역을 추출하는 구체적인 방법을 나타낸 순서도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 계수 대상 영역을 추출하는 추출부를 나타낸 구성도이다.
도 7은 사각형의 계수 대상 영역이 최종 필터링된 모습을 예시적으로 나타낸 사진이다.
도 8은 Mask R-CNN 프레임워크를 통해 계수 대상 영역 내에서 세포를 검출한 결과를 예시적으로 나타낸 사진이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참고하여 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여 설명과 관계없는 부분은 생략하였고, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 부여하였다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
도 1은 본 발명에 따른 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법의 순서도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법이 구현되는 구성도이다.
도 1 및 2를 참조하면, 본 발명에 따른 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법은 (a) 눈금 격자가 있는 혈구계산기(hemocytometer) 챔버에 세포 배양액을 넣고 유리 커버로 덮은 후 현미경 이미지를 취하는 단계(S100); (b) 상기 이미지로부터 사각형의 계수 대상 영역을 추출하는 단계(S200); (c) 상기 계수 대상 영역 내의 세포를 검출하는 단계(S300); 및 (d) 상기 계수 대상 영역 내 세포 수로부터 상기 세포 배양액 내 전체 세포 수를 계수하는 단계(S400);를 포함하며, 이러한 세포 계수는 추출부(110), 검출부(120) 및 계수부(130)를 포함하는 세포 계수 시스템(100)에 의해 수행된다.
상기 혈구계산기는 세포 계수를 위해 고안된 눈금 격자가 있는 현미경 슬라이드로 세포 배양액을 챔버 가운데 떨어뜨리고 유리 커버로 덮은 뒤 현미경으로 관찰하게 되면 예컨대, 도 3에 나타낸 바와 같은 이미지를 얻을 수 있으며, 도 4는 도 3에서의 혈구계산기의 눈금 격자를 모식적으로 나타내고 있다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 혈구계산기의 눈금 격자는 크게 가로 및 세로 1 mm의 정사각형 9개로 구성되는데, 가운데 중앙의 정사각형은 4개의 라인으로 분할되어 25칸이고, 대각선 방향의 4개의 정사각형은 각각 3개의 라인으로 분할되어 16칸이다. 일반적으로 대각선 방향의 네 칸에서 각각 세포 수를 계수한 다음 평균을 구하는 방식으로 수행된다. 예컨대, 혈구계산기의 1 ㎟ 한 칸의 부피는 0.0001 ㎖(0.1 cm × 0.1 cm × 0.01 cm = 0.0001 ㎤ = 0.0001 ㎖)이므로, 계수된 세포 수의 계산은 샘플 1 ㎖ 당 1 ㎟ 한 칸에 든 평균 세포 수에 104을 곱한 수 만큼 세포가 있다고 간주할 수 있다. 즉, 계수된 세포의 수가 105인 경우 샘플 1 ㎖ 안에는 105 × 104 = 1.05 × 106 개 만큼의 세포가 있다고 계산할 수 있다.
본 발명에서 상기 (a) 단계(S100)는 혈구계산기(hemocytometer) 챔버에 세포 배양액을 넣고 유리 커버로 덮은 후 현미경 이미지를 취하는 단계로서, 기존의 혈구계산기를 이용한 수동 방식과 유사하며, 다만, 세포 배양액을 넣고 유리 커버로 덮은 후 기존에는 사용자가 카운팅기를 이용하여 세포 수를 세면서 카운팅을 수행하였으나, 본 발명에서는 이러한 수작업을 진행하지 않고, 현미경 이미지만을 취하게 되고, 예컨대, 도 3과 같은 이미지를 얻을 수 있다.
상기 (b) 단계(S200)는 상기 추출부에서 상기 이미지로부터 사각형의 계수 대상 영역을 추출하는 단계로서, 예컨대, 상기 눈금 격자 중 대각선 방향의 네 칸의 사각형을 계수 대상 영역으로 할 경우 해당 크기의 사각형 영역을 추출하는 단계이다. 도 5에서는 본 발명의 일실시예에서 계수 대상 영역을 추출하는 구체적인 방법을 나타낸 순서도이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에서 계수 대상 영역을 추출하는 추출부를 나타낸 구성도이다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 이미지에 대하여 색상을 기준으로 이분할하는 단계(S210); (b2) 상기 이분할된 이미지를 입력받아 윤곽을 추출하는 단계(S220); (b3) 상기 추출된 윤곽을 다각형으로 근사화하는 단계(S230); (b4) 상기 근사화된 다각형 중 사각형을 추출하는 단계(S240); 및 (b5) 상기 사각형 중 미리 지정된 크기 범위 내의 사각형을 상기 계수 대상 영역으로서 필터링하는 단계(S250);를 포함할 수 있고, 이러한 과정을 진행하기 위해 상기 추출부(110)는 색상 분할부(111), 윤곽 추출부(112), 다각형 근사부(113), 사각형 추출부(114) 및 필터링부(115)를 포함할 수 있다.
상기 색상 분할부(111)는 상기 이미지의 색상을 통해 특정 부분을 분할하기 위한 것으로, 혈구계산기 내 격자를 보면 그 색상이 일정 범위에 있는것을 확인할 수 있는데, 여기서, 일정 범위의 색상에 대해서는 '1'로, 그 이외의 색상에 대해서는 '0'으로 이분할함으로써 격자 부분만의 이미지로 분할되도록 한다.
상기 윤곽 추출부(112)는 상기 분할된 이미지를 입력으로 받아 윤곽을 추출하기 위한 것으로, 윤곽을 추출하기 위한 알고리즘을 이용하고, 예컨대, Satoshi Suzuki 등의 방법(Satoshi Suzuki and others. Topological structural analysis of digitized binary images by border following. Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 30(1):32-46, 1985.)이 이용될 수 있다.
상기 다각형 근사부(113)는 상기 윤곽 추출부(112)에서 추출된 윤곽이 일정하지 않기 때문에 이를 다각형으로 근사화하기 위한 것으로, 이러한 근사화를 위한 알고리즘을 이용할 수 있고, 예컨대, Ramer-Douglas-Peucker 알고리즘이 이용될 수 있다.
상기 사각형 추출부(114)에서는 상기 근사화된 다각형을 입력받아 이 중 사각형인 경우에 한해서만 추출하게 된다.
상기 필터링부(115)는 추출된 사각형 중에서도 그 크기가 다양할 수 있는데, 미리 지정된 크기 범위 내의 사각형만이 최종 필터링되도록 하여, 예컨대, 도 4에서 우측 하단 귀퉁이의 0.25 mm × 0.25 mm 크기의 격자(도 4 참조)만을 계수 대상 영역으로 추출할 수 있게 되며, 도 7에서는 최종 필터링되어 계수 대상 영역으로 추출된 사각형 이미지를 예시적으로 나타내고 있다.
상기 (c) 단계(S300)는 상기 계수 대상 영역 내의 세포를 검출하는 단계로서, 상기 검출부(120)에서 상기 (b) 단계(S200)에서 추출된 사각형의 계수 대상 영역의 이미지를 입력받아 세포 검출을 수행한다.
본 발명에서 상기 세포 검출은 딥러닝 기반의 Mask R-CNN(Convolutional Neural Network) 프레임워크를 이용하여 수행될 수 있다. 즉, 상기 검출부(120)는 Mask R-CNN 프레임워크를 이용하여 세포 배양액을 촬영한 다수의 이미지 상에서 세포 형태를 파악 및 세분화한 데이터를 학습할 수 있다. 예컨대, 세포 배양액 현미경 사진을 무작위로 촬영한 수 많은 이미지들 각각을 Mask R-CNN 프레임워크를 통해 세포 별로 서로 상이한 색상으로 마스킹한 후, 마스킹된 영역을 기초로 세포의 크기, 형태, 종류 등을 학습하게 된다. 이때, Mask R-CNN 프레임워크를 통해 파악되는 세포는 종류 별로 적어도 수 만개 이상의 샘플 이미지를 통해 기 학습된 세포를 토대로 마스킹이 이루어지므로, 학습된 세포 외의 다른 형태에 대해서는 검출되지 않도록 하게 된다. 도 8에서는 Mask R-CNN 프레임워크를 통해 계수 대상 영역 내에서 세포를 검출한 결과를 예시적으로 나타내고 있으며, 다양한 색상으로 마스킹된 세포 이미지를 확인할 수 있다.
상기 (d) 단계(S400)는 상기 (c) 단계(S300)에서 검출된 세포를 계수하는 단계로서, 상기 계수부(130)는 상기 검출부(120)에서 검출된, 예컨대, Mask R-CNN 프레임워크를 통해 마스킹된 부분을 계수하여, 최종 세포 계수가 마무리된다.
이상 설명된 본 발명의 일 실시예에 따른 반자동 세포 계수 방법은 다양한 컴퓨터 구성요소를 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령어의 형태로 구현되어 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 기록될 수 있다. 상기 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체는 프로그램 명령어, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 기록되는 프로그램 명령어는 본 발명을 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이나 컴퓨터 소프트웨어 분야의 당 업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다. 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체의 예에는, 하드 디스크, 플로피 디스크, 및 자기 테이프와 같은 자기 매체, CD-ROM, DVD와 같은 광기록 매체, 플롭티컬 디스크(floptical disk)와 같은 자기-광 매체(magneto-optical media), 및 ROM, RAM, 플래시 메모리 등과 같은 프로그램 명령어를 저장하고 수행하도록 특별히 구성된 하드웨어 장치가 포함된다. 프로그램 명령어의 예에는, 컴파일러에 의해 만들어지는 것과 같은 기계어 코드뿐만 아니라 인터프리터 등을 사용해서 컴퓨터에 의해서 실행될 수 있는 고급 언어 코드도 포함된다. 상기 하드웨어 장치는 본 발명에 따른 처리를 수행하기 위해 하나 이상의 소프트웨어 모듈로서 작동하도록 구성될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참고하여 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
100 : 세포 계수 시스템 110 : 추출부
111 : 색상 분할부 112 : 윤곽 추출부
113 : 다각형 근사부 114 : 사각형 추출부
115 : 필터링부 120 : 검출부
130 : 계수부

Claims (6)

  1. 혈구계산기와, 추출부, 검출부 및 계수부를 포함하는 세포 계수 시스템을 이용한 반자동 세포 계수 방법으로서,
    (a) 눈금 격자가 있는 혈구계산기(hemocytometer) 챔버에 세포 배양액을 넣고 유리 커버로 덮은 후 현미경 이미지를 취하는 단계;
    (b) 상기 추출부에서 상기 이미지로부터 사각형의 계수 대상 영역을 추출하는 단계;
    (c) 상기 검출부에서 상기 계수 대상 영역 내의 세포를 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 계수부에서 상기 계수 대상 영역 내 세포 수로부터 상기 세포 배양액 내 전체 세포 수를 계수하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 추출부는 색상 분할부, 윤곽 추출부, 다각형 근사부, 사각형 추출부 및 필터링부를 포함하여, 상기 (b) 단계는,
    (b1) 상기 색상 분할부에서 상기 이미지에 대하여 색상을 기준으로, 색상이 일정 범위에 있는 상기 격자 부분과, 상기 일정 범위 이외의 색상 부분으로 이분할하는 단계;
    (b2) 상기 윤곽 추출부에서 상기 이분할된 이미지를 입력받아 윤곽을 추출하는 단계;
    (b3) 상기 근사부에서 상기 추출된 윤곽을 다각형으로 근사화하는 단계;
    (b4) 상기 사각형 추출부에서 상기 근사화된 다각형 중 사각형을 추출하는 단계; 및
    (b5) 상기 필터링부에서 상기 사각형 중 미리 지정된 크기 범위 내의 사각형을 상기 계수 대상 영역으로서 필터링하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 반자동 세포 계수 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b3) 단계는 Ramer-Douglas-Peucker 알고리즘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 딥러닝 기반의 Mask R-CNN 프레임워크를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.
KR1020200163960A 2020-11-30 2020-11-30 혈구계산기를 이용한 반자동 세포 계수 방법 KR102505687B1 (ko)

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