KR102500163B1 - 핵산분리용 피펫 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 압력 변화에 따라 액상 물질을 배출 또는 흡수할 수 있는 피펫으로서, 상기 피펫의 내부 영역을 정의하는 하우징; 상기 하우징의 내벽을 따라 형성되고, 상기 내부 영역을 상부 영역과 하부 영역으로 구획하는 분리판; 상기 분리판으로부터 수직한 방향으로 연장되고, 상기 상부영역을 복수의 공간으로 구획하는 상부격벽; 상기 하부영역으로부터 연장되어 관로를 형성하는 피펫관; 상기 피펫관의 내부에 형성되어 상기 분리판까지 연결되는 내부관; 상기 내부관의 외벽에 형성되며 상기 피펫관과 상기 하부영역을 개폐하고, 탄성부재를 포함하는 피펫관 개폐부; 및 상기 하부 영역에 배치된 필터막을 포함하는 핵산분리용 피펫을 제공한다.

Description

핵산분리용 피펫 및 이를 이용한 핵산의 분리방법{PIPET FOR SEPARATION OF NUCLEIC ACID AND METHOD OF SEPARATING NUCLEIC ACID BY USING THE SAME}

본 기술은 바이오 장비 분야의 기술로서, 특히 각종 바이오 시료 용액의 처리 공정에서 활용될 수 있는 바이오물질의 분리 기술에 관한 것이다.

중합효소 반응(polymerase chain reaction, PCR) 기술은 지속적으로 발전을 거듭하고 있으며, 단일한 PCR 장비에 의하여 열사이클링 공정 및 형광 검출 등 일련의 공정을 간편하게 처리할 수 있는 장비 등, PCR의 요소 기술들의 집약화가 가속화되고 있다. 나아가, 대량의 시료에 대한 연속 공정 및 자동화 공정이 가능한 다양한 바이오 진단 기술들이 개발되고 있다.

최근에는 실시간 PCR, 디지털 PCR(d-PCR)을 뛰어 어넘는 차세대 PCR 방식인 dd-PCR(digital droplet PCR) 이 차세대 PCR 기술로 대두되고 있다. dd-PCR은 20㎕의 PCR 반응을 2만개의 미세방울(droplet)로 쪼개어 증폭시키는 시스템이다.

이렇듯 첨단화되는 PCR의 발전 방향에 비추어 PCR 공정 자체나 장치 기술뿐만 아니라, 이에 발맞춘 PCR 대상 시료의 전처리 공정, 즉 환자의 검체로부터 PCR 대상 시료를 분리 또는 추출해 내는 공정의 첨단화 필요성이 커지고 있다. PCR 대상 시료(PCR 용액)의 준비 과정까지 검체로부터 핵산 등을 분리하는 과정은 전체 PCR 공정의 자동화 및 연속 공정을 저해하는 요소로 작용할 수 있기 때문이다.

종래의 원심분리 방식에 의한 분리 공정은 이러한 자동화 및 연속공정의 트랜드에 부합하지 못하는 측면이 있고, 대량화된 샘플의 처리에 적합하지 않은 측면이 있다. 따라서, 기존의 원심분리 방식에 의하여 바이오 물질을 분리해내는 기술을 대체할 다양한 신규의 용액처리기술들의 개발이 절실한 시점이다.
선행기술문헌: 국내공개특허 10-2020-0019594호

본 발명은 이러한 PCR 기술의 발전과 더불어 PCR 대상 물질의 사전 처리 기술의 긴급성을 고려하여 도출된 발명으로서, 대량 처리 및 자동화 처리에 유리한 신규의 핵산 분리용 피펫을 제공하고 나아가 이를 이용한 핵산의 분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 다른 핵산분리용 피펫은 압력 변화에 따라 액상 물질을 배출 또는 흡수할 수 있는 피펫으로서, 상기 피펫의 내부 영역을 정의하는 하우징; 상기 하우징의 내벽을 따라 형성되고, 상기 내부 영역을 상부 영역과 하부 영역으로 구획하는 분리판; 상기 분리판으로부터 수직한 방향으로 연장되고, 상기 상부영역을 복수의 공간으로 구획하는 상부격벽; 상기 하부영역으로부터 연장되어 관로를 형성하는 피펫관; 상기 피펫관의 내부에 형성되어 상기 분리판까지 연결되는 내부관; 상기 내부관의 외벽에 형성되며 상기 피펫관과 상기 하부영역을 개폐하고, 탄성부재를 포함하는 피펫관 개폐부; 및 상기 하부 영역에 배치된 필터막을 포함한다.

상기 분리판에는 적어도 하나의 제1 개구부를 포함하고, 상기 제1 개구부를 개폐할 수 있는 제1 개폐부를 포함한다.

상기 내부관에 연결된 상기 분리판에는 상기 내부관에 대응한 제2 개구부를 포함하고, 상기 제2 개구부를 개폐할 수 있는 제2 개폐부를 포함한다.

상기 상부격벽에 의하여 구획된 복수의 공간에 대응한 분리판에는 각각 제1 개구부 및 제1 개폐부를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 분리방법은 전술한 핵산분리용 피펫을 이용하여 핵산을 포함하는 시료 용액으로부터 핵산을 분리하는 방법으로서, 상기 피펫을 감압하여, 상기 상기 제2 개폐부를 열고 상기 린싱용액을 상기 내부관을 통하여 상기 상부 영역으로 흡수하여, 상기 상부격벽에 의하여 분리된 제1 공간에 저장하는 단계; 상기 피펫관을 통하여 상기 시료용액을 흡수하고 상기 필터막을 경유한 용액을 상기 어느 하나의 공간과 다른 제2 공간에 저장하기 위하여 상기 피펫을 감압하고 상기 제2 공간에 대응한 상기 제1 개폐부를 개방하는 단계; 상기 피펫을 가압하고, 상기 제1 공간에 대응한 제1 개폐부를 개방하여 린싱용액을 하부영역으로 밀어내어 상기 필터막을 세척하도록 하는 단계; 및 세척된 용액을 상기 피펫관 개폐부를 개방하여 상기 피펫관을 통하여 외부 용기로 배출하는 단계를 포함한다.

상기 린싱용액에 의하여 세척된 용액에는 필터막에 포획된 핵산이 상기 필터막으로부터 분리되어 포함된다.

본 발명의 핵산분리용 피펫은 피펫의 가압 또는 감압만으로 검체 용액으로부터 분리대상 물질을 효율적으로 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 분리된 물질을 다음 공정에 사용하기 위하여, 피펫으로부터 원하는 용기 등에 배출하여 보관하기 용이하다.

본 발명의 피펫은 복수의 피펫을 어레이 형태로 배치하여 대량의 검체에 대한 분리작업에 사용됨으로써 대량의 검체에 대한 동시 검출 및 진단이 가능하게 할 수 있다.

나아가, 공지된 다양한 연속공정 시스템을 도입함으로써 연속공정에 적용할 수 있도록 다양한 변형 설계가 가능하여, 궁극적으로 대량의 검체에 대한 동시 용액처리 공정을 가능하게 하고 연속적인 PCR 공정에 적용할 경우 대량 및 신속 진단 시스템 구축이 가능할 것으로 기대하고 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산분리용 피펫을 설명하기 위하여 개념적으로 도시한 단면도이다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 분리방법을 설명하기 위하여 각 단 계별로 도 1의 피펫의 상태를 개념적으로 도시한 단면도들이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산분리용 피펫을 설명하기 위하여 개념적으로 도시한 단면도이다.
도 6 내지 도 9는 도 4에서 분리된 제1 처리용액에 대하여 2차적으로 핵산을 분리하기 위하여 각 단계별도 도 5의 피펫의 상태를 개념적으로 도시한 단면도들이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산분리용 피펫 및 이를 이용한 핵산의 분리방법을 자세하게 설명하도록 한다. 그러나 하기 설명들은 본 발명의 기술사상을 구체화하여 설명하기 위한 예시적인 설명들이며, 본 발명은 아래 설명들로부터 유추될 수 있는 다양한 변형실시예들을 포함할 수 있음은 자명하다. 아울러, 본 발명의 기술사상은 오직 후술하는 청구범위에 의하여 해석되고 제한될 수 있을 뿐, 하기 설명들에 의하여 본 발명의 기술사상이 제한되는 것은 아니다.

핵산의 분리는 도 1의 제1 피펫(100)과 도 5의 제2 피펫(200)을 이용하여 크게는 2가지 종류의 공정에 의하여 이루어진다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산분리용 피펫을 설명하기 위하여 개념적으로 도시한 단면도이다.

도 1을 참조하면, 핵산분리용 제1 피펫(100)은 제1 하우징(110), 제1 분리판(120), 제1 내부관(130) 및 제1 필터막(140)을 포함한다. 한편, 상기 핵산분리용 제1 피펫(100)은 본 발명에서 '핵산분리용' 목적으로 사용되는 것으로 설명되나 제1 필터막(140)의 다양한 변형 설계, 구조 변경 등을 통하여 핵산 외에 다양한 바이오물질의 분리에 사용될 수 있을 것이다.

본 실시예에서, 상기 제1 하우징(110)은 기본적으로 원기둥 형상으로 이루어져 있고 내부영역을 구획한다. 상기 제1 분리판(120)은 상기 제1 하우징(110) 내벽을 따라 형성됨으로써 제1 하우징(110)에 의하여 구획되는 내부영역을, 제1 하부영역(102)과 제1 상부영역(104)로 구분한다. 상기 제1 하우징(110)은 제1 하부영역(102)에서 깔대기 형상으로 좁아지면서 관로 형상을 갖는 제1 피펫관(112)을 포함한다. 상기 제1 하우징(110)의 제1 상부영역(104)의 최 상부에는 제1 피펫(100) 내부의 압력을 감압하거나 가압하기 위한 제1 공기통로(114)가 형성되어 있다.

상기 제1 필터막(140)은 핵산을 여과할 수 있는 공지된 필터막이 사용될 수 있으며, 상기 제1 필터막(140)은 제1 하부영역(102)의 일 영역에 형성되며 제1 하우징(110)의 내벽을 따라 형성됨으로써 제1 하부영역(102)을 상부와 하부로 구획한다.

한편, 상기 제1 피펫관(112) 내부에는 제1 내부관(130)이 형성되어 있다. 상기 제1 내부관(130)은 상기 제1 피펫관(112)을 따라 삽입된 형상을 갖는 관으로서, 상기 제1 내부관(112)의 유로는 상기 제1 피펫(100)의 제1 하부영역(102)과 공간적으로 연결되지 않고 상기 제1 분리판(120)에 연결되어 있다.

상기 제1 분리판(120)에는 적어도 하나의 제1 개구부(121)가 형성되어 있다. 상기 제1 개구부(121)의 형상은 특별히 제한되지 않으며 제1 상부영역(104)의 유체가 제1 하부영역(102)로 원할하게 이동될 수 있을 정도의 형상이면 된다. 상기 제1 분리판(120)은 또한 상기 제1 개구부(121)를 개폐할 수 있는 제1 개폐부(125)를 포함한다.

상기 제1 분리판(120)은 또한 상기 제1 내부관(130)과 연결되는 부위에, 상기 제1 내부관(130)의 유로에 대응한 제2 개구부(122)를 포함하고, 상기 제2 개구부를(122)를 개폐할 수 있는 제2 개폐부(126)를 포함한다.

상기 제1 개폐부(125) 및 제2 개폐부(126)는 제1 피펫(100) 내부의 감압 또는 가압 압력에 의하여 작동될 수 있도록 탄성부재를 포함할 수도 있으며, 이와 다르게 다양한 개폐 수단이 채용될 수 있다.

도 2 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 분리방법을 설명하기 위하여 각 단 계별로 도 1의 피펫의 상태를 개념적으로 도시한 단면도들이다.

도 2 내지 도 4를 설명하면서, 제1 피펫(100)의 구조에 대한 중복된 설명은 생략하도록 한다.

도 2를 참조하면, 외부용기(300)에는 검체용액(30)이 준비되어 있다. 상기 검체용액은 환자로부터 채취한 검체 및 용해 완충액(lysis buffer)을 포함한다. 또한, 분리 효율성을 위하여 상기 검체용액(30)은 공지된 다양한 첨가제를 포함할 수도 있다.

외부용기(300)에 수용된 검체용액(300)에 피펫이 삽입되면, 1차적으로 제1 피펫(100)의 압력을 감압하여 상기 검체용액(300)을 흡수한다. 이때, 제1 분리판(120)의 제1 개폐부(125)는 닫힌 상태이며, 제2 개폐부(126)만을 개방함으로써, 검체용액(30)이 제1 내부관(130)을 통하여 제1 상부영역(104)로 이동된다.

도 3을 참조하면, 검체용액(30)이 모두 제1 상부영역(104)로 이동되면, 제1 개폐부(126)를 닫고, 상기 검체용액(30)을 제1 상부영역(104)에 저장하면서, 가능하면 외부용기(300)을 교체하고 다음 과정을 계속한다.

도 4를 참조하면, 제1 상부영역(104)에 저장되었던 검체용액(30)은 제1 분리판(120)의 제1 개폐부(125)를 개방하고 제1 피펫(100) 내부를 가압함으로써, 제1 개구부(121)를 통하여 제1 하부영역(102)으로 이동된다.

아울러, 제1 피펫(100) 내부의 가압상태가 유지되는 동안, 상기 검체용액(30)은 제1 필터막(140)을 경유하게 된다. 필터막(140)을 경유하면서 검체용액(30) 내부의 고분자량의 단백질은 제1 필터막(140)에 의하여 걸러지게 된다. 따라서 제1 필터막(140)을 경유한 검체용액(30)은 고분자량의 단백질을 제외한 핵산 및 일부 저분자량의 단백질을 포함한 제1 처리용액(50)으로 변화되어 제1 피펫관(112)을 통하여 외부용기(300)로 배출된다.

이상과 같은 1차 공정이 완료되면, 핵산분리용 제2 피펫(200)을 이용한 2차 공정이 이루어진다.

도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산분리용 피펫을 설명하기 위하여 개념적으로 도시한 단면도이다.

도 5의 제2 피펫(200)은 대부분의 구성요소가 제1 피펫(100)과 기능이 동일함으로 제2 피펫(200)의 구성요소 중 제1 피펫(100)과 동일한 구성요소에 대해서는 중복된 설명을 생략하도록 한다.

도 5를 참조하면, 핵산분리용 제2 피펫(200)은 제2 하우징(210), 제2 분리판(220), 제1 내부관(230) 및 제1 필터막(240)을 포함한다. 한편, 상기 핵산분리용 제1 피펫(200)은 전술한 바와 마찬가지로 본 발명에서 '핵산분리용' 목적으로 사용되는 것으로 설명되나 제2 필터막(240)의 다양한 변형 설계, 구조 변경 등을 통하여 핵산 외에 다양한 바이오물질의 분리에 사용될 수 있을 것이다.

상기 제2 내부관(230)의 외벽에는 제2 하부영역(202)의 제2 피펫관(212)의 유로를 개폐하기 위해서, 상기 제2 내부관(230) 중 제2 하부영역(202)에 대응한 영역에 피펫관 개폐부(260)가 형성되어 있다. 상기 피펫관 개폐부(260)는 개폐 플레이트(262) 및 탄성부재(264)를 포함한다. 제2 내부관(212) 외부로 돌출된 제2 피펫관(230)에 압력을 가하면 탄성부재(264)가 수축되면서 상기 개폐 플레이트(264)가 개방되어 상기 제2 내부관(212)의 유로가 개방되어 제2 하부영역(202)의 유체가 상기 제2 내부관(212)을 통하여 이동할 수 있다.

한편, 상기 제2 상부영역(204)에는 상기 제2 상부영역을 2개의 공간으로 구획하는 상부격벽(250)이 형성되어 있다. 상기 상부격벽(250)은 제2 분리판(220)으로부터 수직한 방향으로 연장되어 있으며, 상부격벽(250)의 상부는 하우징과 연결되지 않도록 설계됨으로써 공기통로(214)로부터 가압 또는 감압되는 압력이 상부격벽(250)으로 구획된 양 쪽의 공간 모두에 전달될 수 있도록 되어 있다. 상기 상부격벽(250)은 제2 분리판(220)으로 연장되나, 상기 상부격벽(250)에 의하여 나누어지는 공간 중 하나의 공간은 상기 제2 내부관(230)과 공간적으로 연결되도록 제2 내부관(230)과 오버랩되지 않도록 연장된다.

본 실시예에서, 상기 제2 필터막(240)은 제1 필터막(140)과 달리 저분자량의 단백질(미세 단백질)까지 걸러질 수 있도록 제1 필터막(140) 대비 상대적으로 공극이 작은 필터구조를 갖는다.

이하에서는, 상기 도 4에서 준비된 제1 처리용액(50)을 연속하여 처리하는 공정을 자세하게 설명하도록 한다.

도 6 내지 도 9는 도 4에서 분리된 제1 처리용액에 대하여 2차적으로 핵산을 분리하기 위하여 각 단계별도 도 5의 피펫의 상태를 개념적으로 도시한 단면도들이다.

도 6을 참조하면, 우선 별도의 린싱(rinsing) 용액(70)을 제2 피펫(200)을 감압하여 흡수한다. 상기 린싱 용액(70)은 제2 개폐부(226)이 개방된 상태에서 제2 내부관(230)을 통하여, 상부격벽(250)에 의하여 나누어진 2 개의 공간 중 하나의 공간에 흡수되어 저장된다.

도 7을 참조하면, 도 4에서 준비된 제1 처리용액(50)은 제2 내부관(230)을 가압하여 피펫관 개폐부(260)이 탄성에 의하여 개방되도록 한 후, 상기 제2 피펫(200)을 감압하여 흡수된다. 흡수된 제1 처리용액(50)은 린싱용액(70)이 저장된 공간과 다른 공간에 저장된다. 상기 제1 처리용액(50)이 흡수되는 동안 린싱용액(70) 저장된 공간의 제3개폐부(225)는 닫힌 상태를 유지한다.

한편, 상기 제1 처리용액(50)이 흡수되는 과정에서 제2 필터막(240)을 경유한다. 제2 필터막(240)을 경유하면서, 상기 제2 필터막(240)에는 핵산과 저분자량의 단백질이 상기 제2 필터막(240)을 통과하지 못하고 잔류하게 된다.

따라서 제1 처리용액(50)은 핵산과 저분자량의 단백질을 제외한 액상성분으로 변화된 용액(52) 상태로 제2 상부영역(204)역에 저장된다.

도 8을 참조하면, 제2 상부영역(204)에는 상부격벽(250)을 경계로 하여 린싱용액(70)과 용액(52)이 저장된다. 상기 상부격벽(250)을 통하여 양 용액(52, 70)의 이동은 불가하다. 또한, 최종 분리 대상인 핵산은 제2 필터막(240)에 포획된 상태이다.

도 9를 참조하면, 린싱용액(70)을 제2 하부영역(202)에 가압하여 통과시키기 위하여 상기 린싱용액(70)이 저장된 공간의 제3개폐부(225)는 개방되고, 제4 개폐부(226)는 닫힌 상태를 유지시킨다. 또한, 이 때 제2 내부관(230)은 하부로 가압되어 피펫관 개폐부(260)는 수축되고 따라서 제1 피펫관(212)은 개방된다. 따라서 상기 린싱용액(70)은 제2 필터막(240)을 경유하면서 저분자량의 단백질은 잔류시키고 핵산만을 선택적으로 씻어 내어 제2 피펫관(212)을 통하여 외부 용기(400)로 배출한다. 결국, 배출된 용액(54)에는 핵산만이 분리된 용액이 남게된다.

전술한 바와 같이 서로 다른 2종의 피펫(100, 200)을 이용하여 최초 검체용액으로부터 핵산을 효율적으로 분리해낼 수 있다. 또한, 전술한 피펫(100, 200)들은 어레이를 이루어 동시에 복수의 검체용액을 대상으로 핵산 분리공정을 수행할 수도 있다.

Claims (6)

1. 압력 변화에 따라 액상 물질을 배출 또는 흡수할 수 있는 피펫으로서,
   상기 피펫의 내부 영역을 정의하는 하우징;
   상기 하우징의 내벽을 따라 형성되고, 상기 내부 영역을 상부 영역과 하부 영역으로 구획하는 분리판;
   상기 분리판으로부터 수직한 방향으로 연장되고, 상기 상부영역을 복수의 공간으로 구획하는 상부격벽;
   상기 하부영역으로부터 연장되어 관로를 형성하는 피펫관;
   상기 피펫관의 내부에 형성되어 상기 분리판까지 연결되는 내부관;
   상기 내부관의 외벽에 형성되며 상기 피펫관과 상기 하부영역을 개폐하고, 탄성부재를 포함하는 피펫관 개폐부; 및
   상기 하부 영역에 배치된 필터막을 포함하는 핵산분리용 피펫.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 분리판에는 적어도 하나의 제1 개구부를 포함하고, 상기 제1 개구부를 개폐할 수 있는 제1 개폐부를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분리용 피펫.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 상부격벽에 의하여 구획된 복수의 공간에 대응한 분리판에는 각각 제1 개구부 및 제1 개폐부를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분리용 피펫.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 내부관에 연결된 상기 분리판에는 상기 내부관에 대응한 제2 개구부를 포함하고, 상기 제2 개구부를 개폐할 수 있는 제2 개폐부를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분리용 피펫.
   
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