KR102498180B1

KR102498180B1 - 두릅나무 추출물을 함유하는 안구건조증 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102498180B1
Application number: KR1020200115293A
Authority: KR
Inventors: 홍은경; 최완성; 김성재; 최미영
Original assignee: (주) 메드빌
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2023-02-10
Also published as: KR20210031402A; WO2021049864A1

Abstract

본 발명은 두릅나무 추출물을 함유하는 안구건조증 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없어 보다 안전하게 안구건조증을 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.

Description

두릅나무 추출물을 함유하는 안구건조증 개선용 조성물{Composition for Improving Dry Eye Syndrome Comprising Extract of Aralia}

본 발명은 두릅나무 추출물을 함유하는 안구건조증 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 두릅나무 추출물을 함유하여 안전하고 효과적으로 안구건조증을 예방 또는 개선할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

안구건조증은 눈부심, 눈의 자극감, 침침함, 이물감, 작열감, 국소소양감 등의 증상을 나타내는 증상으로서 눈의 눈물 분비량이 감소하거나 성분의 변화로 인해 나타나는 증상이다.

안구건조증의 가장 흔한 원인은 노화로서 정상적인 노화 현상에 의해 눈물 분비량이 감소하거나 눈물의 상태가 변화함으로 나타난다. 그 외에도 류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 공피증, 당뇨병, 비타민 A 결핍증 등의 질병이 있으면 눈물 분비가 감소하여 안구건조 증상이 나타나기도 한다. 또한, 안구건조증은 만성결막염, 갑상선 질환, 갱년기 여성호르몬 감소, 약물복용 등에 의해 나타날 수도 있다.

눈물 분비량에 영향을 미치는 약물은 항생제, 항히스타민제, 이뇨제, 지사제, 스코포라민과 같은 부교감 신경차단제, 고혈압 치료를 위한 베타차단제, 수면제, 피임약, 일부 여드름 치료제, 일부 항우울제, 일부 마취제 등으로 이런 약물을 복용하는 동안 일시적인 눈물 감소가 나타날 수 있다.

그 외에 환경적인 요인으로서 주위 환경이 건조하거나, 연기, 먼지 자극, 햇빛, 바람 등으로 눈이 자극되거나, 독서나 컴퓨터를 하면서 무의식 중에 눈을 깜박이는 횟수가 줄어들면 안구 건조증이 생기기 쉽다.

안구건조증의 가장 보편적인 대처는 인공누액을 이용하여 모자라는 눈물 성분을 공급해 주는 것으로, 용액, 연고, 묽은 젤리 형태 등 다양한 종류가 있다. 그러나, 인공누액을 이용하는 방법은 안구건조증의 증상을 일시적으로 개선하는 효능이 있을 뿐, 안구건조증의 진행을 억제하여 증상을 근원적으로 완화하기에는 역부족하다.

대한민국 등록특허 제10-1507504호에는 설파살라진 또는 친수화 설파살라진; 및 히알루론산을 포함하며, 상기 설파살라진 또는 친수화 설파살라진과 히알루론산의 혼합 중량비가 0.01:1 내지 50:1인 안구건조증 또는 이와 관련된 안과 질환 또는 안과 증상의 예방 또는 치료용 점안제 조성물이 개시된 바 있다. 그러나, 상기 점안제 조성물은 히알루론산을 포함하여 충혈, 눈 자극감, 눈꺼풀 가려움 등의 부작용이 있는 문제점이 있었다.

또한, 복약순응도의 개선을 위해 경구투여 제형 등으로 다양한 제형화가 가능한 안구건조증 치료제의 개발이 필요하다.

대한민국 등록특허 제10-1507504호

본 발명의 목적은 안전하고 효과적으로 안구건조증을 예방 또는 치료할 수 있으며 다양한 제형화가 가능한 안구건조증 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 두릅나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

두릅나무(Aralia elata)는 아랄리아 속(Aralia sp.)에 속하는 식물로 갈잎떨기나무이다. 두릅나무는 동아시아, 주로 만주, 사할린 등지에 분포하며 한국에서는 전국의 숲 가장자리에서 자란다. 두릅나무의 수피, 목재, 가지 등은 건조해 예로부터 한방 약재로 사용되어 왔으며 동의보감에서는 나무와 뿌리의 껍질을 말려 총목피라고 하였다.

두릅나무의 껍질에는 사포닌을 포함한 여러 종류의 트리테르페노이드(triterpenoids)가 있고, 혈당강하 효과가 있는 엘라토시드(elatoside) E를 포함해 엘라토시드 F와 올레놀산 글리코시드 등 몇 가지의 글리코시드가 함유되어 있으며, 에탄올 흡수를 저해하는 엘라토시드 A와 B도 포함되어 있다. 민간이나 한방에서는 두릅나무의 수피 등을 해수, 위암, 당뇨병 및 위장장애 등에 이용하고 있다.

상기 두릅나무 추출물은 두릅나무를 물, 유기용매, 및 물과 유기용매의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매(1차 추출용매)로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 제조할 수 있다.

상기 유기용매는 C₁-C₄의 알콜, 에틸 아세테이트 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 C₁-C₄의 알콜은 탄소수 1 내지 4개의 직쇄형 또는 분지형 알콜을 의미하며, 예를 들어 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 알콜로는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 추출공정은 두릅나무의 무게에 대하여 약 1 내지 20배의 1차 추출용매, 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합용매로 추출함으로써 수행할 수 있다. 상기 혼합용매로는 약 70% 에탄올 수용액을 사용할 수 있다.

추출은 공지된 추출방법, 예컨대 냉침, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 추출 온도는 당업자가 추출방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으며, 예를 들어 0 내지 120℃에서 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 추출 시간은 추출방법에 따라 상이하며, 당업자가 적절한 추출 시간을 채택할 수 있다. 예를 들어, 추출 시간은 온도에 따라 달라질 수 있으며, 이에 국한되지 않으나 약 1 시간 내지 10 일의 범위에서 단회 또는 복수회로 수행될 수 있다. 추출시간은 압력을 가하는 경우 1 내지 3시간 정도로 줄일 수 있다. 상기 압력은 보통 1.2 내지 1.5kg/㎠일 수 있으며, 이 때 온도는 110 내지 120℃에 도달한다. 바람직하게는 상기 추출은 실온에서 약 48 내지 71시간 동안 상기한 1차 추출용매로 추출함으로써 수행될 수 있다.

상기 1차 추출용매로 추출을 수행하여 얻어진 추출물은 통상의 방법에 따라 여과하거나 원심분리하여 불순물을 제거한 액상 형태로 얻거나, 얻어진 액상 형태의 추출물을 통상의 방법에 따라 감압농축 및/또는 건조하여 분말 형태로 얻을 수 있다.

또한, 상기 추출공정은 필요에 따라 유효성분의 함량이 높은 분획물을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 상기 1차 추출용매로 추출하여 얻어진 추출물을 물에 분산시킨 후, 적절한 2차 추출용매, 예컨대 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출용매로 추출하여 분획물을 수득함으로써, 생성되는 추출물 중의 유효성분 함량을 더욱 높일 수 있다. 특히, 2차 추출용매 중 부탄올 추출물, 즉 부탄올 분획물 중의 유효성분 함량이 가장 높다.

본 발명의 일 실시형태는 상기 두릅나무 추출물로부터 분리된 클로로겐산을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 클로로겐산은 상기 두릅나무 추출물을 컬럼 크로마토그래피하여 수득할 수 있다.

본 발명의 두릅나무 추출물 및 이로부터 분리된 클로로겐산은 안구건조증 세포 모델로서 고삼투압성 스트레스 모델 및 산화 스트레스 모델에서 세포손상 억제 효과가 우수한 것으로 나타나 안구건조증을 예방 또는 개선할 수 있는 것으로 확인되었다(실험예 2 및 4).

본 발명에서는 신경전사인자인 NFAT5라고도 알려진 TonEBP와, NF-kB(p65)가 NaCl(sodium chloride)이나 H₂O₂를 처리하여 스트레스를 준 안구건조증 세포 모델에서 증가되었고, 이를 두릅나무 추출물 및 클로로겐산(CGA)이 감소시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 3 및 5).

또한, 본 발명의 두릅나무 추출물은 인체 적용시 부작용 없이 1개월 내에 안구건조증 개선 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(실험예 6).

따라서, 본 발명의 두릅나무 추출물 및 이로부터 분리된 클로로겐산은 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 상기 두릅나무 추출물 이외에, 또 다른 안구건조증 치료제를 함께 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로(예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로(예를 들면, 주사, 경피흡수, 직장투여, 점안) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사일 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 파인 서브틸래(fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 유탁액제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽제, 안과용제(점안액), 주사제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제(disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 상기 두릅나무 추출물 또는 클로로겐산을 약 0.01 내지 95 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 구체적인 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 체중, 성별, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 다를 수 있다. 바람직하게는, 경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg 당 활성성분 10 내지 200 mg, 비경구투여의 경우에는 하루에 체중 1kg당 활성성분 0.01 내지 10 mg이 투여된다. 상기 총 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 두릅나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 상기 두릅나무 추출물로부터 분리된 클로로겐산을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명에 따른 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽제 등의 경구형 제제 형태이거나, 캔디, 과자, 껌, 아이스크림, 면류, 빵, 음료 등 일반적인 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 형태에 따라 통상적인 방법으로 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 감미제, 방향제, 보존제, 계면활성제, 윤활제, 부형제 등을 적절히 사용하여 제조될 수 있다.

상기 건강기능식품의 제조에 있어서 두릅나무 추출물 또는 클로로겐산의 함량은 건강기능식품의 형태에 따라 다르지만, 약 0.01 내지 95 중량%이다.

본 발명의 건강기능식품은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 두릅나무 추출물 및 이로부터 분리된 클로로겐산은 안구건조증 세포 모델에서 세포손상 억제 효과가 우수하고, 인체 적용시 부작용 없이 안구건조증 개선 효과를 나타낼 수 있는 것으로 나타나 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 건강기능식품에 효과적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 두릅나무 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없어 보다 안전하게 안구건조증을 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 수준의 고삼투압성 스트레스를 대상으로 세포 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 고삼투압성 스트레스 세포 모델에 두릅나무 추출물을 농도별로 처리하여 두릅나무 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포에 두릅나무 추출물(AE)과 두릅나무 추출물의 주요 성분으로 분석된 클로로겐산(CGA)을 농도별로 전처리하고, 고삼투압성 스트레스를 500 mOsm으로 주었을 때 세포 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 세포에 두릅나무 추출물(AE) 5 ㎍과 클로로겐산(CGA) 300 μM을 전처리하고, 고삼투압성 스트레스를 450 mOsm과 500 mOsm으로 각각 달리 주었을 때 세포 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 두릅나무 추출물(AE)과 클로로겐산(CGA)을 각각 전처리한 후, 고삼투압성 스트레스를 주었을 때 TonEBP와 p-NF-kB (p65)의 발현을 웨스턴 블럿팅으로 분석한 결과이다.
도 6은 산화 스트레스 모델에서 H₂O₂의 적정농도를 선택하기 위해서 H₂O₂를 농도별로 처리하여 세포 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 두릅나무 추출물(AE)과 클로로겐산(CGA)을 산화 스트레스와 함께 동시에 처리한 그룹과 전처리한 그룹에서, 세포 생존율의 변화를 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 두릅나무 추출물(AE)과 클로로겐산(CGA)을 각각 전처리한 후, H₂O₂로 산화 스트레스를 주었을 때 TonEBP와 p-NF-kB (p65)의 발현을 웨스턴 블럿팅으로 분석한 결과이다.
도 9는 두릅나무 추출물을 1개월 이상 복용한 사람들을 대상으로 효능과 부작용을 모니터링한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실시예 1: 두릅나무 열수 추출물의 제조

두릅나무 2018년산을 구입하여 가지를 분쇄해 200g을 취하고, 여기에 증류수 1,600ml를 가하여 100℃에서 8시간 동안 열수 추출한 후, 여과 및 농축한 다음 건조하여 열수 추출물을 수득하였다.

실시예 2: 두릅나무 에탄올 추출물 및 클로로겐산의 제조

두릅나무 2018년산을 구입하여 가지를 분쇄해 200g을 취하고 70% 에탄올 1.2ℓ를 넣어 실온에서 때때로 교반하면서 48 내지 72시간 동안 용출하였다. 용출액은 경사법으로 따라내고, 남은 잔사에 다시 70% 에탄올 1.2ℓ를 가하고, 위와 같은 방법을 반복하여 재용출하였다.

재용출액을 경사법으로 따라서 첫 번째 용출액과 합하여, 환류냉각장치에서 에탄올은 회수하고, 남은 용출액을 원심분리하여 침전물은 제거하고, 남은 상층액은 여과하였다. 여액에 헥산(hexane)과 클로로포름(chloroform)을 가하여 수지와 단백질, 섬유질 등을 제거하고 남은 액체를 동결건조하여 분말화하였다.

상기에서 수득한 두릅나무 70% 에탄올 추출물을 사용하여 용매 추출법에 의해 4가지 분획물, 즉 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 분획하였다. 구체적으로, 상기 두릅나무 70% 에탄올 추출물을 물에 녹인 후 페트롤리엄 에테르(petroleum ether)를 사용하여 클로로필과 그 밖의 불순물을 제거하고, 나머지 액체를 순차적으로 클로로포름(CHCl₃), 에틸아세테이트, 부탄올(BuOH) 및 물 층으로 나누어 각각 분말화하였다.

상기 부탄올 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)하였다. 이때, 컬럼은 μbondapak C₁₈ (3.9×300mm)을 사용하였고, 용출용매로는 2% 아세트산 : 메탄올을 구배 모드(10 : 0 → 2 : 8)로 사용하였다. 1 ㎖/min의 유속으로 40℃ 온도 하에서 30분 동안 HPLC를 실시하여 소분획을 용출시켰다. 얻어진 소분획에 대하여 LC-MS를 이용하여 동정한 결과, 가장 함량이 높은 소분획이 클로로겐산임을 확인하였다.

실험예 1: 본 발명의 두릅나무 추출물의 성분 분석

시험물질 표준용액을 이용하여 시험물질의 머무름 시간대에 간섭물질이 없는 LC-MS 기기조건을 하기 표 1과 같이 확립하였다.

상기 표 1의 분석 조건에 따라 실시예 2에서 제조한 두릅나무 추출물의 성분 분석을 수행한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험물질	지표성분	함량(%)	함량(g/kg)
두릅나무 추출물	카페익산(caffeic acid)	0.0322	0.322
	클로로겐산(chlorogenic acid)	0.464	4.64
	3,4-디히드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)	0.394	3.94

상기 표 2를 통해, 실시예 2에서 제조한 두릅나무 추출물 내 페놀성 물질들의 함량이 높은 수준임을 알 수 있었다. 특히, 두릅나무 추출물 내에 클로로겐산(chlorogenic acid, CGA)이 가장 높은 수준으로 함유되어 있음을 확인하였다.

실험예 2: 고삼투압성 스트레스 모델 실험

안구건조증에 대한 효능 실험은 세포 모델로서 HCEC (human corneal epithelial cell)를 대상으로 수행하였다. 안구건조증 모델로서 고삼투압성 스트레스(hyperosmolar stress) 모델을 사용하였다.

고삼투압성 스트레스 모델은 세포에 NaCl(sodium chloride)을 처리하여 유도하였다.

(1) 고삼투압성 스트레스 수준 결정

고삼투압성 스트레스는 각막이나 수정체 상피 세포의 사멸을 유도하여 세포의 손상을 일으킨다. 본 실험에서는 세포실험 모델에서 사용될 고삼투압성 스트레스의 수준을 결정하기 위하여 다양한 수준의 고삼투압성 스트레스를 대상으로 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하였다.

세포 생존율을 확인하기 위하여는 MTT 분석(MTT assay)을 이용하였다.

MTT 분석은 다음과 같이 수행하였다.

세포 현탁액을 헤마사이토미터(haemacytometer)를 사용하여 카운팅(counting)한 다음, 1×10⁵ cells/ml 농도로 500㎕씩 24웰 플레이트의 각 웰에 넣고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, NaCl의 농도를 조절하여 다양한 수준의 고삼투압성 스트레스를 유발한 후 농도별로 시료를 처리하고 24시간 동안 더 인큐베이션시켰다. 시료를 제거한 후, 각 웰에 MTT 용액을 200㎕씩 첨가하고 빛을 차단하였다. 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, MTT 희석액을 조심스럽게 제거하였다. 각 웰에 200㎕의 DMSO를 첨가하고 빛을 차단한 상태에서 15 내지 20분간 플레이트 쉐이커(plate shaker)로 흔들어주었다. ELISA 판독기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 96웰에 100 ㎕씩 2개의 웰에 나누어 담아 ELISA 판독기를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해 환원된 양을 나타내며 각 웰에 존재하는 생존 세포수와 비례한다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 통해, 고삼투압성 스트레스가 500 mOsm일 때 세포 생존율이 저하되고, 550 mOsm일 때 세포 생존율이 50% 수준까지 낮아지는 것을 알 수 있다.

따라서, 실험을 위한 고삼투압성 스트레스 수준은 500 mOsm으로 결정하였다.

(2) 두릅나무 추출물의 농도 결정

세포에 고삼투압성 스트레스를 500 mOsm으로 가하고, 이때 실시예 1에서 제조한 건조 분말상의 두릅나무 추출물을 농도별로 함께 처리하여 두릅나무 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하였다.

세포 생존율을 확인하기 위하여는 MTT 분석을 이용하였다.

MTT 분석은 상기 고삼투압성 스트레스 수준 결정시와 동일하게 수행하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 통해, 두릅나무 추출물을 5 ㎍로 처리할 때 가장 좋은 효능이 나타나는 것을 확인하였다.

(3) 두릅나무 추출물(AE)과 클로로겐산(CGA)의 농도별 효능 평가

세포에 실시예 1에서 제조한 건조 분말상의 두릅나무 추출물(AE)과, 실시예 2에서 제조한 두릅나무 추출물의 주요 성분으로 분석된 클로로겐산(chlorogenic acid, CGA)을 농도별로 전처리하고, 고삼투압성 스트레스를 500 mOsm으로 주었을 때 두릅나무 추출물과 CGA가 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하였다.

세포 생존율을 확인하기 위하여는 MTT 분석을 이용하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 통해, 두릅나무 추출물(AE) 5 ㎍과 CGA 300 μM에서 세포손상 억제 효과가 가장 우수한 것을 알 수 있다.

(4) 두릅나무 추출물(AE)과 클로로겐산(CGA)의 고삼투압성 스트레스 조건에 따른 효능 평가

세포에 실시예 1에서 제조한 건조 분말상의 두릅나무 추출물(AE) 5 ㎍과 CGA 300 μM을 전처리하고, 고삼투압성 스트레스를 450 mOsm과 500 mOsm으로 각각 달리 주었을 때 두릅나무 추출물과 CGA가 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하였다.

세포 생존율을 확인하기 위하여는 MTT 분석을 이용하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 통해, 두 가지 고삼투압성 스트레스 조건 하에서 두릅나무 추출물(AE)과 CGA의 세포손상 억제 효과가 모두 확인되었다.

실험예 3: 고삼투압성 스트레스 모델에서의 작용기전 실험

TonEBP(Tonicity response element binding protein)는 세포가 삼투성 스트레스로부터 자신을 보호하는 메커니즘에서 광범위하게 발현되는 가장 중요한 전사인자로 알려져 있다. TonEBP는 세포 밖의 등장성(tonicity)에 의해 조절되며, 고등장성 조건(Hypertonic condition) 하에서는 TonEBP 수준(level)과 활성(activity)이 세포핵 내에서 상승한다. 또한, TonEBP는 알도즈 환원효소(aldose reductase, AR)와 NF-kB(nuclear factor-kappa B)를 포함하는 선별된 신호전달 분자(signaling molecule)와 효소의 과발현과 활성화에 관여한다.

본 실험예에서는 고삼투압성 스트레스 모델에서의 작용기전을 확인하기 위하여, 두릅나무 추출물(AE) 5㎍(A5)과 10㎍(A10), CGA 100 μM(C100)과 300 μM(C300)을 각각 24 시간 동안 전처리한 후, 고삼투압성 스트레스를 주었을 때 TonEBP와 p-NF-kB (p65)의 발현을 조사하였다. SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 분석하였다.

SDS-PAGE를 통한 단백질 분리는 다음과 같이 수행하였다.

세포 현탁액을 헤마사이토미터를 사용하여 카운팅한 다음, 1×10⁵ cells/ml 농도로 6웰 플레이트의 각 웰에 2 ml씩 넣고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 농도별로 시료를 처리하고 원하는 시간만큼 인큐베이션시켰다. 시료를 제거하고, PBS로 세척하였다. 세포 스크래퍼(cell scraper)로 세포를 긁어모아서 5 ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 모았다. 데스크 탑 원심분리기(desk top centrifuge)에서 3,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. PBS를 제거하고, 세포용해 버퍼(lysis buffer)를 1 튜브 당 20㎕씩 넣은 후, 피펫팅(pipetting)으로 세포를 용해시켰다. 상기 튜브를 20분 동안 얼음에 박아두었다. 그 다음, 샘플을 초음파분쇄기(sonicater)를 이용하여 초음파분쇄시켰다. 10 내지 30초간 초음파분쇄시킨 후, 1분간 얼음에 두는 과정을 3회 반복하였다. 이 후, 20 분 동안 얼음에 박아두었다. 4℃에서 12,000 g의 속도로 30분간 원심분리한 후 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 1:15로 정량하였다.

웨스턴 블럿팅은 다음과 같이 수행하였다.

상기 SDS-PAGE에서 정량한 값으로 계산하여 4배 샘플 버퍼를 이용하여 SDS-PAGE 샘플을 준비하였다. 항체(antibody)의 사이즈에 맞게 겔을 준비하였다. 샘플을 3분간 끓이고, 3분간 얼음물(ice water)에 넣어 식힌 후, 원심분리하였다. 상기 겔에 샘플을 로딩하여 스택킹 겔(stacking gel)에서는 6mA(1판당)로 진행시키다가 세퍼레이팅 겔(separating gel)에서는 9~10mA로 높여서 진행시켰다. 원하는 사이즈까지 진행되면, 멈추고 트랜스퍼(transfer)를 이용하여 겔의 단백질들을 NC 멤브레인으로 옮겼다. 그 다음, 3% BSA로 블록킹하고, 원하는 Ab를 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다. 다음날, 2차 Ab로 인큐베이션시킨 후, ECL 용액을 이용하여 밴드(band)를 확인하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 통해, TonEBP는 고삼투압성 스트레스를 주었을 때 단백질 발현이 증가하다가 본 발명의 두릅나무 추출물(AE)과 CGA를 전처리 한 그룹에서 모두 발현이 감소하는 것으로 확인되었고, p-NF-kB (p65)는 두릅나무 추출물 5㎍을 1시간 동안 전처리한 그룹과 CGA 100 μM을 전처리한 그룹에서 발현이 감소하여 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.

실험예 4: 산화 스트레스 모델 실험

본 실험에서는 또 다른 안구건조증 모델로서 산화 스트레스 모델을 사용하여 두릅나무 추출물의 안구건조증 치료 효능을 확인하였다.

안구건조증에 대한 효능 실험은 세포 모델로서 HLE-B3(human lens epithelial cell)를 대상으로 수행하였다.

산화 스트레스 모델은 세포에 H₂O₂를 처리하여 유도하였다.

(1) H ₂ O ₂ 의 적정농도 산출

H₂O₂의 적정농도를 선택하기 위해서 H₂O₂를 농도별로 처리하여 세포 생존율을 확인하였다. 세포 생존율을 확인하기 위하여는 MTT 분석을 사용하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 통해, 0.1 mM에서 약 50% 세포 생존율이 확인되었으므로 실험에 사용되는 농도는 0.1mM로 정하였다.

(2) 산화 스트레스 모델에서의 두릅나무 추출물과 클로로겐산(CGA)의 효과

실시예 1에서 제조한 건조 분말상의 두릅나무 추출물(AE)과 CGA를 산화 스트레스와 함께 동시에 처리한 그룹과 전처리한 그룹에서, 세포 생존율의 변화를 조사하였다. 세포 생존율을 확인하기 위하여는 MTT 분석을 사용하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 통해, 두릅나무 추출물(AE)과 CGA를 전처리한 그룹이 동시에 처리한 그룹에 비하여 효과가 더 높은 것으로 확인되었다.

실험예 5: 산화 스트레스 모델에서의 작용기전 실험

산화 스트레스 모델에서의 작용기전을 확인하기 위하여, HLE-B3(human lens epithelial cell) 야생형(Wild Type, WT)과, NFAT5(=TonEBP) 녹아웃(knockout)(KO) 세포주에 H₂O₂로 산화 스트레스를 주었을 때, 본 발명의 두릅나무 추출물(AE) 5㎍(A5)과 두릅나무 추출물의 주요성분인 클로로겐산(CGA) 100 μM(C100)과 300 μM(C300)를 각각 처리한 후, TonEBP와 p-NF-kB (p65)의 발현을 조사하였다. SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 분석하였다.

SDS-PAGE와 웨스턴 블럿팅은 상기 실험예 3의 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 통해, 야생형(Wild Type, WT)에서는 본 발명의 두릅나무 추출물(AE)과 두릅나무 추출물의 주요성분인 클로로겐산(CGA)을 처리한 그룹에서 TonEBP와 p-NF-kB가 감소하는 경향을 나타내는 것을 알 수 있다.

또한, 도 8을 통해, KO 그룹에서는 TonEBP가 녹아웃된 모델이므로 TonEBP와 p-NF-kB가 나타나지 않았으나, TonEBP와 p-NF-kB가 없는데도 stress를 주었을 때 TonEBP와 p-NF-kB가 증가하다가 본 발명의 두릅나무 추출물(AE)과 두릅나무 추출물의 주요성분인 클로로겐산(CGA)을 처리하면 감소하는 것으로 나타났다.

상기 결과로부터 p-NF-kB가 TonEBP의 하위단계로 영향을 받지는 않는 것으로 보여지고, 본 발명의 두릅나무 추출물(AE)과 두릅나무 추출물의 주요성분인 클로로겐산(CGA) 처리가 TonEBP와 p-NF-kB의 발현에 각각 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 본 발명의 두릅나무 추출물의 인체에서의 안구건조개선 효능 평가

36명의 지원자들을 대상으로 본 발명의 두릅나무 추출물을 1 내지 3개월간 복용하게 하면서 효능이나 부작용을 모니터링하였다.

대상인원은 36명으로 남자 18명, 여자 18명이 복용하였다. 연령별 분포는 하기 표 3과 같았다.

나이	인원
10대(10∼19)	2
20대(20∼19)	3
30대(30∼39)	2
40대(40∼49)	6
50대(50∼59)	8
60대(60∼69)	10
70대(70∼79)	3
80대(80∼19)	2
합계	36

두릅나무 추출물의 안전성을 확인하기 위해, 실시예 1의 두릅나무 추출물을 대상으로 한 랫트에서의 28일 반복독성시험을 수행하였다. 그 결과, NOAEL 값이 2,000mg/kg 이상으로 매우 안전한 물질임을 확인하였다.

상기 안전성 시험 결과를 토대로, 두릅나무 추출물은 200mg/포로, 1회 복용량은 200mg × 2포 = 400mg, 1일 복용량은 400mg × 2회 = 800mg (성인 60kg 기준)으로 설정하였다.

두릅나무 추출물을 1개월 이상 복용한 사람들을 대상으로 효능과 부작용에 대한 질문에 대한 응답을 모니터링하였다. 모니터링 항목은 나이, 성별, 두릅나무 추출물 복용기간, 복용 중이나 후에 나타난 효능이나 부작용 등이었다.

그 결과를 하기 표 4 및 도 9에 나타내었다.

번호	이름	성별	나이	사용기간	사용후 자각된 효능
번호	이름	성별	나이	사용기간	눈의피로 감소	시력 개선	안구건조 개선	백내장등 개선
1	이OO	남	42	3개월		○
2	박OO	여	63	3개월	○	○	○
3	김OO	여	59	3개월	○		○
4	장OO	남	61	3개월		○
5	신OO	남	63	3개월	○			○
6	김OO	여	66	3개월		○		○
7	권OO	여	57	3개월	○	○	○
8	김OO	남	59	3개월	○	○
9	유OO	여	80	3개월		○		○
10	정OO	여	36	3개월		○	○
11	신OO	여	40	3개월	○
12	강OO	남	47	3개월	○		○
13	이OO	여	33	3개월		○
14	조OO	남	54	3개월		○	○
15	박OO	여	53	3개월		○	○
16	신OO	여	60	3개월		○	○
17	김OO	남	62	3개월		○
18	정OO	남	48	3개월			○	○
19	이OO	남	45	3개월		○
20	임OO	남	64	3개월		○
21	홍OO	여	55	3개월			○
22	박OO	남	62	3개월		○
23	이OO	여	18	3개월	○		○
24	임OO	여	25	3개월	○	○	○
25	백OO	남	52	3개월	○	○
26	엄OO	여	48	3개월	○		○
27	이OO	여	78	3개월	○	○		○
28	김OO	남	61	3개월		○
29	김OO	남	80	3개월		○	○	○
30	이OO	여	19	3개월	○		○
31	강OO	여	20	3개월	○
32	이OO	남	24	3개월			○
33	성OO	남	57	3개월			○	○
34	이OO	남	75	3개월	○		○
35	오OO	남	73	2개월			○
36	조OO	여	61	2개월	○		○

상기 표 4 및 도 9를 통해, 두릅나무 추출물 복용시 전반적인 효능으로 시력개선, 안구건조 개선, 눈의 피로 감소, 백내장 증상 개선 등을 나타내는 것을 알 수 있다.

두릅나무 추출물을 하루에 2회 아침저녁 식사 후에 복용했을 때 효능을 나타내기까지 걸리는 시간은 사람에 따라 다르지만 1주 내지 1개월이었다. 또한, 두릅나무 추출물의 섭취로 인한 부작용은 나타나지 않았다.

제제예:

실시예 1에서 제조한 두릅나무 추출물을 사용하여 아래와 같은 제형을 제조하였다. 그러나, 하기 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1: 정제의 제조

실시예 1에서 제조한 건조 분말상의 두릅나무 추출물 250 mg을 부형제 직타용 락토즈 260 mg과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 35 mg, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 15 mg, 결합제인 직타용 L-HPC(Low-hydroxypropylcellulose) 80 mg과 섞어 U형 혼합기에 넣고 20 분간 혼합하였다. 혼합완료 후 활택제인 마그네슘 스테아레이트 10 mg을 추가로 넣고 3분간 혼합하였다. 정량시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여, 1 정당 추출물 250 mg을 함유하는 정제를 제조하였다.

제제예 2: 시럽제의 제조

일정량의 물에 적당량의 백당을 용해시키고, 여기에 보존제로서 파라옥시메틸벤조에이트 80 ㎎ 및 파라옥시프로필벤조에이트 16 ㎎을 가하고, 실시예 1에서 제조된 건조 분말상의 두릅나무 추출물 4.5 g을 넣고, 60℃로 유지시키면서 완전히 용해시킨 후, 냉각시키고 증류수를 가해 150 ㎖로 만들어 시럽제를 제조하였다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 건조 분말상의 두릅나무 추출물 300 ㎎을, 담체로서 락토즈 200 ㎎과 혼합시켜 경질 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4: 음료의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 건조 분말상의 두릅나무 추출물 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 고과당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료를 제조하였다.

제제예 5: 주사제의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 건조 분말상의 두릅나무 추출물 200 mg을 1%의 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 mg에 가열 용해시켜 추출물을 0.1 중량%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

제제예 6: 점안액의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 건조 분말상의 두릅나무 추출물 200 mg을 생리 식염수에 가열 용해시켜 점안액을 제조하였다.

Claims

두릅나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 두릅나무 추출물은 두릅나무를 물, 및 물과 유기용매의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1차 추출용매로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 제조되는 것인 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 유기용매가 에탄올인 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 추출공정은 상기 1차 추출용매로 추출하여 얻어진 추출물을 물에 분산시킨 후, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 2차 추출용매로 추출하여 분획물을 얻는 단계를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽제, 안과용제 및 주사제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 약제학적 조성물.
삭제
두릅나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서, 상기 두릅나무 추출물은 두릅나무를 물, 및 물과 유기용매의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1차 추출용매로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 제조되는 것인 건강기능식품.
제8항에 있어서, 상기 유기용매가 에탄올인 건강기능식품.
제8항에 있어서, 상기 추출공정은 상기 1차 추출용매로 추출하여 얻어진 추출물을 물에 분산시킨 후, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 2차 추출용매로 추출하여 분획물을 얻는 단계를 추가로 포함하는 건강기능식품.
제7항에 있어서, 음료, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼 및 시럽제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 건강기능식품.
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