KR102494775B1 - Primer sets and TaqMan probes for detecting hantavirus, and analysis method for hantavirus using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 한타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브, 이를 이용한 한타바이러스의 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브, 상기 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 사용하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응으로 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스를 분석하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a primer set and TaqMan probe for detecting hantavirus, and a method for analyzing hantavirus using the same, and more particularly, to a primer set and TaqMan probe for detecting Hantavirus, Seoul virus, and pumalavirus, and the primer set and a method for analyzing Hantaan virus, Seoul virus, and Pumala virus by TaqMan real-time polymerase chain reaction using a TaqMan probe.
한타바이러스는 한타바이러스과(Hantaviridae), 한타바이러스속(Hantavirus)에 속하는 단일가닥 음성 RNA 바이러스(single stranded negative sense RNA virus)로 현재까지 350종 이상의 종(species)으로 구성되어 있다. 한타바이러스의 형태는 직경 80-120nm의 구형으로, 유전자는 S 분절(Small segment, 또는 S segment), M 분절(Medium segment, 또는 M segment) 및 L 분절(Large segment, 또는 L segment)과 같이 3개 분절로 이루어져 있으며, 각각의 분절은 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 암호화하는 것으로 평균 크기가 1.6 kb정도인 S 분절(S segment), 당단백질(Glycoprotein)인 G1과 G2를 암호화하는 것으로 평균 크기가 3.6kb인 M 분절(M segment) 그리고, RNA 의존 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)를 암호화하는 것으로 평균 크기가 6.5 kb인 L 분절(L segment)이다.Hantavirus is a single-stranded negative sense RNA virus belonging to the family Hantaviridae and the genus Hantavirus, and consists of more than 350 species. The shape of hantavirus is spherical with a diameter of 80-120 nm. It consists of 2 segments, each segment encoding a nucleocapsid protein, an S segment with an average size of about 1.6 kb, and encoding G1 and G2, which are glycoproteins, on average. The M segment is 3.6 kb in size, and the L segment is 6.5 kb in average size, encoding RNA dependent RNA polymerase (RdRp).
한국을 포함하여 아시아 및 유라시아 지역에서 발생하는 신증후군출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome; HFRS)의 원인 병원체인 한타바이러스 감염으로 매년 세계에서 수 만명 이상의 환자가 발생하고 있으며 사망자 보고도 증가하는 추세이다. 대표적으로 알려진 신증후군출혈열 원인바이러스는 아시아 지역에서는 주로 한탄바이러스(Hantaan virus)에 의한 감염이 가장 많고, 유라시아 지역에서는 푸말라바이러스(Puumala virus)에 의한 감염이 가장 많이 보고되고 있다. 서울바이러스(Seoul virus)는 전 세계적으로 감염 발생 가능성이 있는 중요한 원인병원체로 알려져 있다. Hantavirus infection, a causative agent of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) occurring in Asia and Eurasia including Korea, causes more than tens of thousands of patients around the world every year, and reports of deaths are also increasing. As for the representatively known cause of hemorrhagic fever with renal syndrome, infection by Hantaan virus is the most common in Asia, and infection by Puumala virus is most frequently reported in Eurasia. Seoul virus is known as an important causative agent that can cause infection worldwide.
신증후군출혈열은 고열을 동반한 독감 증상과 유사한 임상적 특징을 나타내기 때문에 한타바이러스 감염에 의한 열성 질환이라는 것을 정확히 진단하기는 쉽지 않다. 의심 환자에 대한 초기 진단 방법으로는 바이러스에 대한 특이 항체를 검출하는 혈청학적 방법 및 유전자를 검출하는 방법으로 일반적인 중합효소연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR), 실시간 중합효소연쇄반응법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 혈청학적 방법은 항체가 생성되기 전 초기 감염자의 경우에는 진단을 하기가 쉽지 않으며, 유사 바이러스 간 교차 반응 가능성이 있어 어떤 바이러스에 감염되었는지에 대한 정확한 분석이 어렵다는 단점이 있다. 또한, 최근 많이 사용되고 있는 실시간 중합효소연쇄반응법(real-time PCR)은 한 가지 바이러스에 대한 검출 능력은 뛰어나지만 여러 원인 바이러스를 동시에 진단할 수는 없는 한계가 있다. 따라서 여러 원인 바이러스를 동시에 정확하게 확인할 수 있는 다중 실시간 중합효소연쇄반응법 개발이 요구된다.Because hemorrhagic fever with renal syndrome exhibits clinical features similar to flu symptoms accompanied by high fever, it is not easy to accurately diagnose a febrile illness caused by hantavirus infection. As an initial diagnosis method for suspected patients, the serological method for detecting specific antibodies to the virus and the gene detection method are the most common polymerase chain reaction (PCR) and real-time polymerase chain reaction methods. It is being used. However, the serological method has disadvantages in that it is not easy to diagnose in the case of an initial infection before antibodies are produced, and it is difficult to accurately analyze which virus was infected due to the possibility of cross-reaction between similar viruses. In addition, real-time PCR, which is widely used recently, has an excellent ability to detect one virus, but has a limitation in that it cannot simultaneously diagnose several causative viruses. Therefore, it is required to develop multiple real-time polymerase chain reaction methods that can accurately identify multiple causative viruses at the same time.
본 발명의 목적은, 한타바이러스과 한탄바이러스속에 속하는 한탄바이러스, 서울바이러스 또는 푸말라바이러스를 신속하고 정확하게 검출하고, 한번에 3종의 한타바이러스를 특이적으로 구분하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a primer set and a TaqMan probe capable of rapidly and accurately detecting Hantavirus, Seoul virus, or Pumala virus belonging to the Hantavirus family Hantavirus genus, and specifically distinguishing and detecting three types of Hantavirus at once. is in providing
본 발명의 다른 목적은, 상기 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 이용하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응으로 한탄바이러스, 서울바이러스 또는 푸말라바이러스를 신속하고 정확하게 검출하고, 한번에 3종의 한타바이러스를 특이적으로 구분하여 분석하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to rapidly and accurately detect Hantaan virus, Seoul virus, or Pumala virus by TaqMan real-time polymerase chain reaction using the primer set and TaqMan probe for detecting Hantaan virus, Seoul virus, and Pumala virus, It is an object of the present invention to provide a method for specifically distinguishing and analyzing three types of hantaviruses at once.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem (s), and another problem (s) not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer); 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer); 를 포함하는, 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, according to one aspect of the present invention, the present invention forward primer (forward primer) comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1; and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2; It provides a primer set for detecting Hantaan virus, including a.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하며, 상기 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지된, 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 제공한다.In addition, the present invention includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the 5' end of the nucleotide sequence is labeled with a fluorescent reporter dye and the 3' end is labeled with a quencher. TaqMan probes for detection are provided.
상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The fluorescent colorant is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy- It may be any one selected from the group consisting of 4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine).
상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA ( 5-Carboxytetramethylrhodamine), deep dark quencher 1 (DDQ1), and deep dark quencher 2 (DDQ2).
상기 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 상기 서열번호 3의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 FAM(carboxyfluorescein)이 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지되는 것 일 수 있다.The Hantaan virus detection TaqMan probe is labeled with FAM (carboxyfluorescein), a fluorescent dye, at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and at the 3'-end, a quencher, NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding) ) may be labeled.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer); 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer); 를 포함하는, 서울바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4; and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; It provides a primer set for detecting Seoul virus, including a.
또한, 본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열를 포함하며, 상기 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 제공한다.In addition, the present invention includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, for detecting Seoul virus labeled with a fluorescent reporter dye at the 5' end of the nucleotide sequence and labeled with a quencher at the 3' end. TaqMan probes are provided.
상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The fluorescent colorant is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy- It may be any one selected from the group consisting of 4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine).
상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA ( 5-Carboxytetramethylrhodamine), deep dark quencher 1 (DDQ1), and deep dark quencher 2 (DDQ2).
상기 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 상기 서열번호 6의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)가 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지된 것 일 수 있다.The TaqMan probe for detecting the Seoul virus is labeled with Rox (6-Carboxy-X-rhodamine), a fluorescent dye, at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and at the 3'-end, a quencher, NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding) may be labeled.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 염기서열를 포함하는 전방향 프라이머(forward primer); 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열를 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer); 를 포함하는, 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7; and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8; It provides a primer set for detecting fumala virus comprising a.
또한, 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 염기서열를 포함하며, 상기 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지된, 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 제공한다. In addition, the present invention includes a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, and a fluorescent reporter dye is labeled at the 5' end of the nucleotide sequence and a quencher is labeled at the 3' end. TaqMan probes for detection are provided.
상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The fluorescent colorant is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy- It may be any one selected from the group consisting of 4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine).
상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA ( 5-Carboxytetramethylrhodamine), deep dark quencher 1 (DDQ1), and deep dark quencher 2 (DDQ2).
상기 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 상기 서열번호 9의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지될 수 있다.The TaqMan probe for detecting the pumalavirus is labeled with a fluorescent dye, Cy5 (indocarbocyanine-5), at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and a quencher, NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor -groove binding) can be labeled.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 및 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 이용하는, 한타바이러스의 분석방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a primer set for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a TaqMan probe for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; Seoul virus detection primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, and Seoul virus detection TaqMan probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; and a primer set for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a TaqMan probe for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; It provides a method for analyzing hantavirus using one or two or more selected from the group consisting of.
상기 한타바이러스의 분석방법은 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 및 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 를 이용하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응(TaqMan multiplex real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.The Hantavirus analysis method includes a primer set for detecting Hantavirus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a TaqMan probe for detecting Hantavirus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; Seoul virus detection primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, and Seoul virus detection TaqMan probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; and a primer set for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a TaqMan probe for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; It may include performing TaqMan multiplex real-time PCR using.
상기 한타바이러스의 분석방법은 (a) 시료부터 전장 RNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (c) 합성된 cDNA에 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브, 서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브, 또는 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열로 구성된 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 이용하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)을 수행하는 단계; 및 (d) 한탄바이러스, 서울바이러스 또는 푸말라바이러스를 검출 및 정량하는 단계; 를 포함할 수 있다. The method for analyzing the hantavirus may include (a) isolating full-length RNA from a sample; (b) synthesizing cDNA from the isolated full-length RNA; (c) a primer set for detecting Hantavirus consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the synthesized cDNA, a TaqMan probe for detecting Hantavirus consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 A Seoul virus detection primer set consisting of the nucleotide sequence and a TaqMan probe for Seoul virus detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, or a primer set and sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for detecting Pumala virus Performing TaqMan real-time PCR using a TaqMan probe for detecting pumala virus composed of the nucleotide sequence of No. 9; and (d) detecting and quantifying Hantaan virus, Seoul virus or Pumala virus; can include
본 발명에 따른 한타바이러스 검출용 프라이머 세트(primer set) 및 TaqMan 프로브(TaqMan probe)는 각 바이러스에 특이적으로 작용하여, 혈청학적 방법으로는 항체가 생성되기 전 초기 진단이 어렵고 교차 반응 가능성으로 인해 원인 병원체 확인이 쉽지 않은 한타 바이러스를 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 효과가 있다.The primer set for detecting hantavirus and the TaqMan probe according to the present invention act specifically on each virus, and it is difficult to diagnose in the early stage before antibodies are produced by serological methods due to the possibility of cross-reaction. It has the effect of quickly and accurately identifying the Hantavirus, which is difficult to identify the causative pathogen.
또한, 본 발명에 따른 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트(primer set) 및 TaqMan 프로브(TaqMan probe)를 혼합하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응으로 분석하면, 실시간 중합효소연쇄반응법으로는 확인이 쉽지 않은 한타 바이러스 3종에 의한 신증후군출혈열을 한번에 특이적으로 구분하여 확인할 수 있는 효과가 있다.In addition, when a primer set for detecting Hantaan virus, Seoul virus, and Pumala virus according to the present invention and a TaqMan probe are mixed and analyzed by TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction, real-time polymerase chain reaction It is effective to specifically identify and confirm hemorrhagic fever with nephrotic syndrome caused by three types of hantaviruses, which are not easy to identify with a single test.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effects of the present invention are not limited to the above effects, and should be understood to include all effects that can be inferred from the detailed description of the present invention or the configuration of the invention described in the claims.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 한탄바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 서울바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 푸말라바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 한탄바이러스 및 서울바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 한탄바이러스 및 푸말라바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 서울바이러스 및 푸말라바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 한타바이러스 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스가 포함된 시료에 대해 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응를 실시한 결과를 나타낸 것이다.1 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on a sample containing Hantavirus using a Hantavirus primer set and a probe according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on a sample containing Seoul virus using a hantavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on a sample containing pumalavirus using a hantavirus primer set and a probe according to an embodiment of the present invention.
4 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on a sample containing Hantavirus and Seoul virus using the Hantavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention.
5 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on samples containing Hantavirus and Pumalavirus using the Hantavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention.
6 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on samples containing Seoul virus and Pumala virus using the hantavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention.
7 shows the results of performing TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction on samples containing Hantavirus, Seoul virus, and Pumala virus using the Hantavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, preferred embodiments according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.The advantages and features of the present invention, and how to achieve them, will become clear with reference to the detailed description of the following embodiments in conjunction with the accompanying drawings.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.However, the present invention is not limited by the embodiments disclosed below, but will be implemented in a variety of different forms, only the present embodiments make the disclosure of the present invention complete, and common knowledge in the art to which the present invention pertains. It is provided to completely inform the person who has the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.In addition, in the description of the present invention, if it is determined that related known technologies may obscure the gist of the present invention, a detailed description thereof will be omitted.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
한타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브Primer sets and TaqMan probes for detecting hantavirus
본 발명은 신증후군출혈열을 일으키는 원인 바이러스로 알려진 한타바이러스에 대한 감염을 정확하게 진단하고 정량하기 위한 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응(TaqMan real-time PCR) 분석에 사용될 수 있는 최적화된 프라이머 세트(Primer set) 및 TaqMan 프로브(Probe)를 제공한다.The present invention is an optimized primer set that can be used for TaqMan real-time PCR analysis to accurately diagnose and quantify infection with Hantavirus, known as the cause of hemorrhagic fever with renal syndrome. and TaqMan probes.
본 발명에 따른 한타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브는 한타바이러스과 한타바이러스속에 속하는 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스 각각에 대해 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 S 분절(S segment) 염기서열들을 비교 분석하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응에 사용할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 염기서열을 디자인하여 수득한 것이다. 특히, TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법에 사용할 수 있도록 프라이머 세트 및 프로브 서열의 검출 특이성을 높이기 위해 해당되는 타겟 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 인지할 수 있는 염기서열로만 디자인 하였다.The primer set and TaqMan probe for detecting hantavirus according to the present invention compare and analyze S segment sequences encoding nucleocapsid proteins for Hantavirus, Seoulvirus, and Pumalavirus belonging to the genus Hantavirus and Hantavirus, respectively. and obtained by designing base sequences for primer sets and probes that can be used in TaqMan real-time polymerase chain reaction. In particular, in order to increase the detection specificity of primer sets and probe sequences so that they can be used in TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction, only base sequences capable of recognizing the nucleocapsid protein of the corresponding target virus were designed.
이하, 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스 각각의 검출용 프라이머 세트 및 TagMan 프로브에 대해 설명한다.Hereinafter, primer sets and TagMan probes for detecting each of Hantaan virus, Seoul virus, and Pumala virus will be described.
한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브Primer sets and TaqMan probes for detection of Hantaan virus
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. The present invention provides a primer set for detecting Hantaan virus comprising a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 do.
본 발명이 일 실시예에 따르면, 상기 한탄바이러스의 프라이머 세트는 한탄바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 염기서열로서, 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열은 한탄바이러스 S 분절의 833번째부터 849번째까지의 염기서열이고, 상기 서열번호 2로 기재되는 염기서열은 한탄바이러스 S 분절의 877번째에서 899번째까지의 염기서열이다.According to one embodiment of the present invention, the Hantavirus primer set is a gene nucleotide sequence capable of specifically binding to the Hantavirus, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is from position 833 to 849 of the Hantavirus S segment. It is the nucleotide sequence up to the nucleotide sequence, and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence from the 877th to the 899th of the Hantaan virus S segment.
본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하며, 상기 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 제공한다.The present invention includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and TaqMan for detecting Hantaan virus labeled with a fluorescent reporter dye at the 5' end of the nucleotide sequence and with a quencher at the 3' end. Probes are provided.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 한탄바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 염기서열로서, 상기 서열번호 3으로 기재되는 염기서열은 한탄바이러스 S 분절의 851번째부터 871번째까지의 염기서열이다. According to an embodiment of the present invention, the TaqMan probe for detecting Hantavirus is a genetic base sequence capable of specifically binding to Hantavirus, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is from position 851 of the Hantavirus S segment. This is the nucleotide sequence up to the 871st.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the fluorescent coloring agent is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2', 4', 5', Any one selected from the group consisting of 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine) can
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1 (deep dark Quencher 1), and DDQ2 (deep dark Quencher 2).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 상기 서열번호 3의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 FAM(carboxyfluorescein)이 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지된 것이 바람직하다.According to an embodiment of the present invention, the TaqMan probe for detecting Hantaan virus is labeled with FAM (carboxyfluorescein), a fluorescent dye, at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and NFQ (nonfluorescent, quencher) at the 3'-end. quencher) or MGB (minor-groove binding) is preferably labeled.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 최종 증폭 산물의 크기가 프로브를 포함하여 최소한의 염기서열만을 가지도록 디자인되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따른 한탄바이러스 프라이머 세트 및 프로브는, NCBI GenBank에 등록된 216개의 한탄바이러스 S 분절 전장유전체 서열을 비교 분석하여 포괄도(inclusivity)를 고려하였다. 한탄바이러스 S 분절 염기 서열에 대한 포괄도는 전방향 프라이머는 88.89%, 역방향 프라이머는 86.87%, TaqMan 프로브는 92.59%로 높은 특이도를 가지도록 디자인 되었다.Preferably, the primer set and the probe are designed such that the size of the final amplification product includes the minimum nucleotide sequence including the probe. In the Hantavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention, inclusivity was considered by comparative analysis of 216 Hantavirus S segment genome sequences registered in NCBI GenBank. The coverage of the Hantaan virus S segment sequence was 88.89% for the forward primer, 86.87% for the reverse primer, and 92.59% for the TaqMan probe, which was designed to have high specificity.
서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브Primer set and TaqMan probe for Seoul virus detection
본 발명은 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. The present invention provides a primer set for detecting Seoul virus, including a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 do.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서울바이러스의 프라이머 세트는 서울바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 염기서열로서, 상기 서열번호 4로 기재되는 염기서열은 서울바이러스 S 분절의 235번째부터 256번째까지의 염기서열이고, 상기 서열번호 5로 기재되는 염기서열은 서울바이러스 S 분절의 286번째에서 305번째까지의 염기서열이다.According to one embodiment of the present invention, the Seoul virus primer set is a gene sequence capable of specifically binding to the Seoul virus, and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4 is from 235th to 256th of the Seoulvirus S segment. nucleotide sequence, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the nucleotide sequence from the 286th to the 305th nucleotide sequence of the S segment of the Seoul virus.
본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 포함하며, 상기 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 제공한다.The present invention includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the 5' end of the nucleotide sequence is labeled with a fluorescent reporter dye and the 3' end is labeled with a quencher. TaqMan for detecting Seoul virus Probes are provided.
본 발명이 일 실시예에 따르면, 상기 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 서울바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 염기서열로서, 상기 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 서울바이러스 S 분절의 265번째부터 284번째까지의 염기서열이다. According to an embodiment of the present invention, the TaqMan probe for detecting the Seoul virus is a gene sequence capable of specifically binding to the Seoul virus, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 is from the 265th position of the S segment of the Seoul virus. It is the nucleotide sequence up to the 284th.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the fluorescent coloring agent is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2', 4', 5', Any one selected from the group consisting of 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine) can
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1 (deep dark Quencher 1), and DDQ2 (deep dark Quencher 2).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 상기 서열번호 6의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)가 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지된 것이 바람직하다.According to an embodiment of the present invention, the TaqMan probe for detecting Seoul virus is labeled with a fluorescent dye, Rox (6-Carboxy-X-rhodamine) at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and at the 3'-end It is preferable that the quencher NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding) is labeled.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 최종 증폭 산물의 크기가 프로브를 포함하여 최소한의 염기서열만을 가지도록 디자인되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따른 서울바이러스 프라이머 세트 및 프로브는, NCBI GenBank에 등록된 81개의 서울바이러스 S 분절 전장유전체 서열을 비교 분석하여 포괄도(inclusivity)를 고려하였다. 서울바이러스 S 분절 염기 서열에 대한 포괄도는 전방향 프라이머는 98.77%, 역방향 프라이머는 100%, TaqMan 프로브는 100%로 높은 특이도를 가지도록 디자인 되었다.Preferably, the primer set and the probe are designed such that the size of the final amplification product includes the minimum nucleotide sequence including the probe. Seoul virus primer sets and probes according to an embodiment of the present invention were compared and analyzed 81 Seoul virus S segment genome sequences registered in NCBI GenBank to consider inclusivity. The coverage of Seoul virus S segment sequence was 98.77% for the forward primer, 100% for the reverse primer, and 100% for the TaqMan probe, which was designed to have high specificity.
푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브Primer sets and TaqMan probes for detection of pumalavirus
본 발명은 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. The present invention provides a primer set for detecting pumalavirus, including a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 to provide.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 푸말라바이러스의 프라이머 세트는 푸말라바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 염기서열로서, 상기 서열번호 7로 기재되는 염기서열은 푸말라바이러스 S 분절의 144번째부터 166번째까지의 염기서열이고, 상기 서열번호 8로 기재되는 염기서열은 푸말라바이러스 S 분절의 237번째에서 256번째까지의 염기서열이다.According to one embodiment of the present invention, the primer set of the pumala virus is a gene sequence capable of specifically binding to the pumala virus, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 is 144 of the pumala virus S segment. It is a nucleotide sequence from th to 166th, and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 is a nucleotide sequence from 237th to 256th of the S segment of the pumala virus.
본 발명은 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 포함하며, 상기 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 제공한다.The present invention includes a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, for detecting a pumalavirus labeled with a fluorescent reporter dye at the 5' end of the nucleotide sequence and with a quencher at the 3' end. TaqMan probes are provided.
본 발명이 일 실시예에 따르면, 상기 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 푸말라바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 염기서열로서, 상기 서열번호 9로 기재되는 염기서열은 푸말라바이러스 S 분절의 184번째부터 201번째까지의 염기서열이다. According to an embodiment of the present invention, the TaqMan probe for detecting the pumala virus is a gene base sequence capable of specifically binding to the pumala virus, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 is the S segment of the pumala virus. It is the nucleotide sequence from the 184th to the 201st.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the fluorescent coloring agent is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2', 4', 5', Any one selected from the group consisting of 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine) can
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1 (deep dark Quencher 1), and DDQ2 (deep dark Quencher 2).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브는 상기 서열번호 9의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지된 것이 바람직하다.According to an embodiment of the present invention, the TaqMan probe for detecting Seoul virus is labeled with a fluorescent dye, Cy5 (indocarbocyanine-5), at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and NFQ, a quencher, at the 3'-end. (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding) is preferably labeled.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 최종 증폭 산물의 크기가 프로브를 포함하여 최소한의 염기서열만을 가지도록 디자인되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따른 푸말라바이러스 프라이머 세트 및 프로브는, NCBI GenBank에 등록된 71개의 푸말라바이러스 S 분절 전장유전체 서열을 비교 분석하여 포괄도(inclusivity)를 고려하였다. 푸말라바이러스 S 분절 염기 서열에 대한 포괄도는 전방향 프라이머는 94.37%, 역방향 프라이머는 94.37%, TaqMan 프로브는 100%로 높은 특이도를 가지도록 디자인 되었다.Preferably, the primer set and the probe are designed such that the size of the final amplification product includes the minimum nucleotide sequence including the probe. In the pumalavirus primer set and probe according to an embodiment of the present invention, inclusivity was considered by comparative analysis of 71 pumalavirus S segment genome sequences registered in NCBI GenBank. The coverage of the S segment sequence of the pumalavirus was 94.37% for the forward primer, 94.37% for the reverse primer, and 100% for the TaqMan probe, which were designed to have high specificity.
한타바이러스의 분석방법Hantavirus analysis method
본 발명에 따른 한타바이러스의 분석방법은 전술한 한탄바이러스, 서울바이러스, 및/또는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 이용하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)으로 측정 대상 시료(sample)에 존재하는 한탄바이러스, 서울바이러스, 및/또는 푸말라바이러스의 유무를 확인 및 정량적 검출하는 분석방법에 관한 것이다.The Hantavirus analysis method according to the present invention is measured by TaqMan real-time PCR using the above-described Hantavirus, Seoulvirus, and/or Pumalavirus detection primer set and TaqMan probe. It relates to an analysis method for confirming and quantitatively detecting the presence or absence of Hantaan virus, Seoul virus, and/or Pumala virus present in a target sample.
본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 및 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 이용하는 한타바이러스의 분석방법을 제공한다. The present invention includes a primer set for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a TaqMan probe for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; Seoul virus detection primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, and Seoul virus detection TaqMan probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; and a primer set for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a TaqMan probe for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; Provided is a method for analyzing hantavirus using one or two or more selected from the group consisting of
또한, 본 발명의 바람직한 실시예로서, 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 및 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 를 이용하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응(TaqMan multiplex real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 한타바이러스의 분석방법을 제공한다.In addition, as a preferred embodiment of the present invention, a primer set for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a TaqMan probe for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; Seoul virus detection primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, and Seoul virus detection TaqMan probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; and a primer set for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a TaqMan probe for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; Provided is a method for analyzing hantavirus, including the step of performing TaqMan multiplex real-time PCR using
또한, 좀 더 구체적으로 본 발명의 일 실시예로서, (a) 시료부터 전장 RNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (c) 합성된 cDNA에 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브, 서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브, 및/또는 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열로 구성된 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 이용하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan multiplex real-time PCR)을 수행하는 단계; 및 (d) 한탄바이러스, 서울바이러스 또는 푸말라바이러스를 검출 및 정량하는 단계; 를 포함하는, 한타바이러스의 분석방법을 제공한다.In addition, more specifically, as an embodiment of the present invention, (a) isolating full-length RNA from a sample; (b) synthesizing cDNA from the isolated full-length RNA; (c) a primer set for detecting Hantavirus consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the synthesized cDNA, a TaqMan probe for detecting Hantavirus consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 Seoul virus detection primer set consisting of the nucleotide sequence and Seoul virus detection TaqMan probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and/or primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for detecting Pumala virus and performing TaqMan multiplex real-time PCR using a TaqMan probe for detecting pumala virus composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; and (d) detecting and quantifying Hantaan virus, Seoul virus or Pumala virus; Including, it provides a method for analyzing hantavirus.
상기 한타바이러스의 분석방법에는 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)이 사용될 수 있고, 바람직하게는 복수 개의 표적물질을 동시에 검출하기 위하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan multiplex real-time PCR)이 사용될 수 있다.TaqMan real-time polymerase chain reaction (TaqMan real-time PCR) can be used for the analysis method of the hantavirus, and preferably, TaqMan multiplex real-time PCR (TaqMan multiplex real-time PCR) is used to simultaneously detect a plurality of target substances. -time PCR) can be used.
상기 (a) 단계 및 (b) 단계는 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)을 수행하기 전에 측정 대상 시료의 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계이다. 한탄바이러스 및 서울바이러스는 RNA를 게놈(genome)으로 하는 바, 이를 검출하기 위한 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법을 수행하기 위해 필요한 주형 DNA를 수득하기 위해, 바이러스의 게놈 RNA로부터 역전사를 수행하고, 이로부터 cDNA를 합성한다.Steps (a) and (b) are steps of synthesizing cDNA from RNA of a sample to be measured before performing TaqMan real-time PCR. Since Hantaan virus and Seoul virus have RNA as their genome, reverse transcription is performed from the genomic RNA of the virus to obtain template DNA necessary for performing the TaqMan real-time polymerase chain reaction method to detect it. synthesize cDNA from
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 합성된 cDNA에 특이적으로 결합하는 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)을 수행할 수 있다.In the step (c), TaqMan real-time PCR can be performed using the primer set and the probe that specifically bind to the cDNA synthesized in the step (b).
상기 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)의 반응 조건은 변성(denatureation), 결합과 연장 (annealing and extension), 형광 배열 (fluorescein arrangement)의 온도 처리 후 형광량을 측정하고 이를 반복함으로써, 합성된 cDNA에서 특정 유전자의 서열을 증폭하고 형광 신호를 실시간 측정한다. 구체적으로 본 발명의 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)의 반응 조건은 95℃에서 10분간 변성 및 프로브(Probe) 활성화를 시킨 후, 95℃에서 5초, 60℃에서 30초씩 40회 반복하는 방법으로 반응시킬 수 있으며, 전체 반응액 20ul 기준으로 프라이머의 최종 농도는 900nM, TaqMan 프로브의 최종 농도는 250 내지 500nM 이 되도록 반응시킬 수 있다.The reaction conditions of the TaqMan real-time PCR are denaturation, annealing and extension, and fluorescence arrangement after temperature treatment, then measuring the amount of fluorescence and repeating it. By doing so, the sequence of a specific gene is amplified from the synthesized cDNA and the fluorescence signal is measured in real time. Specifically, the reaction conditions of the TaqMan real-time PCR of the present invention are denaturation and probe activation at 95 ° C for 10 minutes, followed by 5 seconds at 95 ° C and 30 seconds at 60 ° C. The reaction may be repeated 40 times, and the final concentration of the primer may be 900nM and the final concentration of the TaqMan probe may be 250 to 500nM based on 20ul of the total reaction solution.
상기 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR) 또는TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan multiplex real-time PCR)은 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. The TaqMan real-time polymerase chain reaction (TaqMan real-time PCR) or TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction (TaqMan multiplex real-time PCR) can be performed by a method commonly used in the art, and is particularly limited. It doesn't work.
실시예Example
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to aid understanding of the present invention, but the following examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and Methods
이하 실시예에서 한탄바이러스 종은 HTNV 76-118(GenBank accession no. NC_005218), 서울바이러스 종은 SEOV 80-39(GenBank accession no. AY273791), 푸말라바이러스 종은 PUUV sotkamo(GenBank accession no. NC_005224)을 사용하였다.In the following examples, the Hantan virus species is HTNV 76-118 (GenBank accession no. NC_005218), the Seoul virus species is SEOV 80-39 (GenBank accession no. AY273791), and the Pumala virus species is PUUV sotkamo (GenBank accession no. NC_005224). was used.
TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법은 농도를 알고 있는 각 바이러스에 대한 viral RNA를 주형으로 하는 One step TaqMan real-time PCR 방법을 사용했으며 반응 조건은 50℃에서 30분간 역전사 반응을 시킨 후, 95℃에서 10분간 변성 및 Probe 활성화를 시키고, 95℃ 에서 5초, 60℃ 에서 30초씩 40회 반복하는 방법으로 반응시켰으며, 전체 반응액 20 ul 기준으로 프라이머의 최종 농도는 900 nM, 프로브 최종 농도는 250 nM 이 되도록 반응시켰다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법은 QuantStudia 6 Flex (Applied Biosystems, USA) 모델을 사용하였다. The TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method uses a one-step TaqMan real-time PCR method in which viral RNA for each virus of known concentration is used as a template. denaturation and probe activation for 10 minutes, and the reaction was repeated 40 times at 95 ° C for 5 seconds and 60 ° C for 30 seconds, and the final concentration of the primer was 900 nM based on 20 ul of the total reaction solution It was reacted so as to become 250 nM. The TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method used the QuantStudia 6 Flex (Applied Biosystems, USA) model.
제조예manufacturing example
한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스 각각에 대하여 암호화하는S 분절 전장유전체 염기서열을 확보하여 ClustalW 프로그램을 이용하여 서열 정렬(sequence alignment)하고, Primer Express® 소프트웨어 버전 3.0(Applied Biosystems)이라는 프로그램을 이용하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법에 사용 가능한 프라이머 및 프로브 염기서열을 디자인하였다.S segment genome sequences encoding each of Hantaan virus, Seoul virus, and Pumala virus were obtained, sequence alignment was performed using the ClustalW program, and Primer Express® software version 3.0 (Applied Biosystems) was used. to design primer and probe sequences usable for TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction.
한탄바이러스의 전방향 프라이머(forward primer)는 서열번호 1로 기재되는 한탄바이러스 뉴클레오캡시드에 관한 공통의 S분절 염기서열에서 833번째부터 849번째까지의 염기서열로 구성하였으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 서열번호 2로 기재되는 877번째부터 899번째까지의 염기서열로 구성하였다. 그리고 한탄바이러스의 프로브 경우는 서열번호 3으로 기재되는 851번째부터 871번째까지의 염기서열로 구성하였고, 5' 말단 부분에 형광발색체 FAM을 표지하고, 3' 말단 부분에는 소광체 NFQ를 표지하였고, 또한 3'-부분에 형광물질이 없는 소광체인 MGB를 표지하였다. 최종 증폭 산물의 크기가 프로브를 포함하여 최소한의 염기서열 만을 가지도록 디자인하였고, NCBI GenBank에 등록된 216개의 한탄바이러스 S 분절 전장유전체 서열을 비교 분석하여 포괄도(inclusivity)를 고려하였다. 한탄바이러스 S 분절 염기 서열에 대한 포괄도는 전방향 프라이머는 88.89%, 역방향 프라이머는 86.57%, 프로브는 92.59%로 특이도가 높게 디자인하였다.The forward primer of the Hantaan virus was composed of the nucleotide sequence from the 833rd to the 849th in the common S segment nucleotide sequence related to the Hantaan virus nucleocapsid described in SEQ ID NO: 1, and the reverse primer was composed of the nucleotide sequence from the 877th to the 899th described in SEQ ID NO: 2. In addition, the Hantaan virus probe was composed of the 851st to 871st nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 3, the fluorochrome FAM was labeled at the 5' end, and the quencher NFQ was labeled at the 3' end. , and also labeled MGB, a quencher without a fluorescent substance at the 3'-part. The size of the final amplification product was designed to have only the minimum nucleotide sequence including the probe, and inclusivity was considered by comparing and analyzing 216 Hantaan virus S segment genome sequences registered in NCBI GenBank. The coverage of the Hantaan virus S segment sequence was 88.89% for the forward primer, 86.57% for the reverse primer, and 92.59% for the probe, which was designed with high specificity.
서울바이러스의 전방향 프라이머(forward primer)는 서열번호 4로 기재되는 서울바이러스 뉴클레오캡시드에 관한 공통의 S분절 염기서열에서 235번째부터 256번째까지의 염기서열로 구성하였으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 서열번호 5로 기재되는 286번째부터 305번째까지의 염기서열로 구성하였다. 그리고 서울바이러스의 프로브 경우는 서열번호 6으로 기재되는 265번째부터 284번째까지의 염기서열로 구성하였고, 5' 말단 부분에 형광발색체ROX를 표지하고, 3' 말단 부분에는 소광체 NFQ를 표지하였고, 또한 3'-부분에 형광물질이 없는 소광체인 MGB를 표지하였다. 최종 증폭 산물의 크기가 프로브를 포함하여 최소한의 염기서열 만을 가지도록 디자인하였고, NCBI GenBank에 등록된 81개의 서울바이러스 S 분절 전장유전체 서열을 비교 분석하여 포괄도(inclusivity)를 고려하였다. 서울바이러스 S 분절 염기 서열에 대한 포괄도는 전방향 프라이머는 98.77%, 역방향 프라이머는 100%, 프로브는 100%로 특이도가 높게 디자인하였다.The forward primer of the Seoul virus was composed of the nucleotide sequence from the 235th to the 256th in the common S segment nucleotide sequence related to the Seoul virus nucleocapsid described in SEQ ID NO: 4, and the reverse primer was composed of the nucleotide sequence from the 286th to the 305th described in SEQ ID NO: 5. In addition, the Seoul virus probe was composed of the 265th to 284th nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 6, and the fluorescent chromogen ROX was labeled at the 5' end, and the quencher NFQ was labeled at the 3' end. , and also labeled MGB, a quencher without a fluorescent substance at the 3'-part. The size of the final amplification product was designed to have only the minimum nucleotide sequence including the probe, and inclusivity was considered by comparing and analyzing the sequences of 81 Seoul virus S segment genomes registered in NCBI GenBank. The coverage of the Seoul virus S segment sequence was 98.77% for the forward primer, 100% for the reverse primer, and 100% for the probe, which was designed with high specificity.
푸말라바이러스의 전방향 프라이머(forward primer)는 서열번호 7로 기재되는 푸말라바이러스 뉴클레오캡시드에 관한 공통의 S분절 염기서열에서 144번째부터 166번째까지의 염기서열로 구성하였으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 서열번호 8로 기재되는 237번째부터 256번째까지의 염기서열로 구성하였다. 그리고 푸말라바이러스의 프로브 경우는 서열번호 9로 기재되는 184번째부터 201번째까지의 염기서열로 구성하였고, 5' 말단 부분에 형광발색체CY-5를 표지하고, 3' 말단 부분에는 소광체NFQ를 표지하였고, 또한 3'-부분에 형광물질이 없는 소광체인 MGB를 표지하였다. 최종 증폭 산물의 크기가 프로브를 포함하여 최소한의 염기서열 만을 가지도록 디자인하였고, NCBI GenBank에 등록된 71개의 푸말라바이러스 S 분절 전장유전체 서열을 비교 분석하여 포괄도(inclusivity)를 고려하였다. 푸말라바이러스 S 분절 염기 서열에 대한 포괄도는 전방향 프라이머는 94.37%, 역방향 프라이머는 94.37%, 프로브는 100%로 특이도가 높게 디자인하였다.The forward primer of the pumala virus was composed of the nucleotide sequence from the 144th to the 166th nucleotide sequence in the common S segment nucleotide sequence related to the pumala virus nucleocapsid represented by SEQ ID NO: 7, and the reverse primer (reverse primer) primer) was composed of the nucleotide sequence from the 237th to the 256th described in SEQ ID NO: 8. And, in the case of the pumala virus probe, it was composed of the nucleotide sequence from 184th to 201st base sequence described in SEQ ID NO: 9, and the fluorescent chromogen CY-5 was labeled at the 5' end, and the quencher NFQ at the 3' end. was labeled, and MGB, a quencher without a fluorescent substance at the 3'-part, was also labeled. The size of the final amplification product was designed to have only the minimum nucleotide sequence including the probe, and inclusivity was considered by comparing and analyzing 71 pumalavirus S segment genome sequences registered in NCBI GenBank. The coverage of the S segment sequence of the pumalavirus was 94.37% for the forward primer, 94.37% for the reverse primer, and 100% for the probe, which was designed with high specificity.
상기와 같이 제조된 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스의 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 표 1로 나타내었다.Table 1 shows primer sets and TaqMan probes for the Hantaan virus, Seoul virus, and Pumala virus prepared as described above.
* IUPAC nucleotide code: R(A or G), V(A or C or G), Y(C or T), H(A or C or T), M(A or C), K(G or T), D(A or G or T), S(G or C)* IUPAC nucleotide code: R(A or G), V(A or C or G), Y(C or T), H(A or C or T), M(A or C), K(G or T) , D (A or G or T), S (G or C)
실시예 1Example 1
상기 제조예에서 준비된 한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 3종에 대한 프라이머 세트(전방향 프라이머, 역방향 프라이머 각각 0.9 uM, 3종 바이러스 프라이머 세트 총 5.4 uM) 및 TaqMan 프로브(0.25 uM, 3종 바이러스 프로브 총 0.75 uM)를 혼합한 반응액 20ul를 사용하였다. 대상 시료로는 한탄바이러스 프로토타입(prototype)인 76-118 균주(HTNV 76-118)를 주형으로 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 1로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 한탄바이러스 Ct값은 17.601 이었다.Primer sets for the three types of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus prepared in the above Preparation Example (0.9 uM each for forward primer and reverse primer, 5.4 uM in total of 3 virus primer sets) and TaqMan probe (0.25 uM, 3 types of virus) A total of 0.75 uM of probes) was used as 20 ul of the reaction mixture. As a target sample, Hantan virus prototype 76-118 strain (HTNV 76-118) was used as a template, and the viral RNA concentration was 1 ng/ul. The analysis result of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method is shown in FIG. 1, and referring to this, the detected Hantaan virus Ct value was 17.601.
실시예 2Example 2
반응액은 실시예 1과 동일하게 준비하였고, 대상 시료로 서울바이러스 prototype인 80-39 균주(SEOV 80-39)를 주형으로 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 2로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 서울바이러스 Ct값은 27.479 이었다.The reaction solution was prepared in the same manner as in Example 1, and the Seoul virus prototype 80-39 strain (SEOV 80-39) was used as a template, and the viral RNA concentration was 1 ng/ul. The analysis result of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method is shown in FIG. 2, and referring to this, the detected Seoul virus Ct value was 27.479.
실시예 3Example 3
반응액은 실시예 1과 동일하게 준비하였고, 대상 시료로 푸말라바이러스 prototype인 sotkamo 균주(PUUV sotkamo)를 주형으로 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 3으로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 푸말라바이러스 Ct값은 22.105 이었다.The reaction solution was prepared in the same manner as in Example 1, and the pumala virus prototype sotkamo strain (PUUV sotkamo) was used as a template, and the viral RNA concentration was 1 ng/ul. The analysis result of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method is shown in FIG. 3, and referring to this, the detected fumala virus Ct value was 22.105.
실시예 4Example 4
반응액은 실험예 1과 동일하게 준비하였고, 대상 시료로 한탄바이러스 HTNV 76-118, 서울바이러스 SEOV 80-39가 혼합된 주형을 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 각각 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 4로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 Ct값은 한탄바이러스 17.691, 서울바이러스 21.198 이었다.The reaction solution was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and a template in which Hantan virus HTNV 76-118 and Seoul virus SEOV 80-39 were mixed was used as a target sample, and the viral RNA concentration was 1 ng/ul, respectively. The analysis results of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method are shown in FIG. 4, and referring to this, the detected Ct values were 17.691 for Hantaan virus and 21.198 for Seoul virus.
실시예 5Example 5
반응액은 실험예 1과 동일하게 준비하였고, 대상 시료로 한탄바이러스 HTNV 76-118, 푸말라바이러스 PUUV sotkamo가 혼합된 주형을 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 각각 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 5로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 Ct값은 한탄바이러스 17.526, 푸말라바이러스 22.017 이었다.The reaction solution was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and a template in which Hantaan virus HTNV 76-118 and Pumala virus PUUV sotkamo were mixed was used as a target sample, and the viral RNA concentration was 1 ng/ul, respectively. The analysis results of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method are shown in FIG. 5, and referring to this, the detected Ct values were 17.526 for Hantaan virus and 22.017 for Pumala virus.
실시예 6Example 6
반응액은 실험예 1과 동일하게 준비하였고, 대상 시료로 서울바이러스 SEOV80-39, 푸말라바이러스 PUUV sotkamo가 혼합된 주형을 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 각각 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 6으로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 Ct값은 서울바이러스 21.495, 푸말라바이러스 21.946 이었다.The reaction solution was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and a template in which Seoul virus SEOV80-39 and Pumala virus PUUV sotkamo were mixed was used as the target sample, and the viral RNA concentration was 1 ng/ul, respectively. The analysis results of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method are shown in FIG. 6, and referring to this, the detected Ct values were 21.495 for Seoul virus and 21.946 for Pumala virus.
실시예 7Example 7
반응액은 실험예 1과 동일하게 준비하였고, 대상 시료로 한탄바이러스 HTNV 76-118, 서울바이러스 SEOV 80-39, 푸말라바이러스 PUUV sotkamo가 혼합된 주형을 사용하였고, 바이러스 RNA 농도는 각각 1 ng/ul 로 하였다. TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응법의 분석 결과는 도 7로 나타내었으며, 이를 참조하면 검출된 Ct값은 한탄바이러스 17.903, 서울바이러스 21.642, 푸말라바이러스 21.846 이었다.The reaction solution was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and a mixture of Hantan virus HTNV 76-118, Seoul virus SEOV 80-39, and Pumala virus PUUV sotkamo was used as the target sample, and the viral RNA concentration was 1 ng/ ul. The analysis result of the TaqMan multiplex real-time polymerase chain reaction method is shown in FIG. 7, and referring to this, the detected Ct values were Hantaan virus 17.903, Seoul virus 21.642, and Pumala virus 21.846.
상기 실시예 1 내지 7의 결과로부터, 본 발명에 따른 한타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브, 이를 이용한 한타바이러스의 검출방법은 극미량의 시료에 대해 신속하고 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸말라바이러스를 특이적으로 구분하여 검출할 수 있음을 확인하였다. From the results of Examples 1 to 7, the primer set for detecting hantavirus, the TaqMan probe, and the method for detecting hantavirus using the same according to the present invention can quickly and accurately detect a very small amount of sample, as well as Hantavirus, Seoul It was confirmed that viruses and pumala viruses could be specifically classified and detected.
지금까지 한타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브, 이를 이용한 한타바이러스의 분석방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.So far, a primer set for detecting hantavirus and a TaqMan probe, and specific examples of a method for analyzing hantavirus using the same have been described, but it is apparent that various modifications are possible within the scope of the present invention.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be limited to the described embodiments and should not be defined, and should be defined by not only the claims to be described later, but also those equivalent to these claims.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지고, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.That is, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not restrictive, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and All changes or modified forms derived from the equivalent concept should be construed as being included in the scope of the present invention.
<서열목록의 설명><Description of sequence listing>
서열번호 1은 한탄바이러스 검출을 위한 전방향 프라이머 서열이다.SEQ ID NO: 1 is a forward primer sequence for detecting Hantaan virus.
서열번호 2는 한탄바이러스 검출을 위한 역방향 프라이머 서열이다.SEQ ID NO: 2 is a reverse primer sequence for detecting Hantaan virus.
서열번호 3은 한탄바이러스 검출을 위한 TaqMan 프로브 서열이다.SEQ ID NO: 3 is a TaqMan probe sequence for detecting Hantaan virus.
서열번호 4는 서울바이러스 검출을 위한 전방향 프라이머 서열이다.SEQ ID NO: 4 is a forward primer sequence for Seoul virus detection.
서열번호 5는 서울바이러스 검출을 위한 역방향 프라이머 서열이다.SEQ ID NO: 5 is a reverse primer sequence for Seoul virus detection.
서열번호 6은 서울바이러스 검출을 위한 TaqMan 프로브 서열이다.SEQ ID NO: 6 is a TaqMan probe sequence for detecting Seoul virus.
서열번호 7은 푸말라바이러스 검출을 위한 전방향 프라이머 서열이다.SEQ ID NO: 7 is a forward primer sequence for detecting pumalavirus.
서열번호 8은 푸말라바이러스 검출을 위한 역방향 프라이머 서열이다.SEQ ID NO: 8 is a reverse primer sequence for detecting pumalavirus.
서열번호 9는 푸말라바이러스 검출을 위한 TaqMan 프로브 서열이다.SEQ ID NO: 9 is a TaqMan probe sequence for detecting pumalavirus.
<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT
<120> Primer sets and TaqMan probes for detecting hantavirus, and
analysis method for hantavirus using the same
<130> PT20220051
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1 is a forward primer sequence for detecting Hantan
virus.
<400> 1
tacggcarcg vcargtg 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 2 is a reverse primer sequence for detecting Hantan
virus.
<400> 2
gcatgytgrc gtatrgcctt tga 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 3 is a TaqMan probe sequence for detecting Hantan
virus.
<400> 3
cattrggyaa tatggaraca a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 4 is a forward primer sequence for detecting Seoul
virus.
<400> 4
cttgcygaya ggattgcagc ag 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 5 is a reverse primer sequence for detecting Seoul
virus.
<400> 5
tcrcchggyt cyacycctgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 6 is a TaqMan probe sequence for detecting Seoul
virus.
<400> 6
atygggcaag acmgggatcc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 7 is a forward primer sequence for detecting Puumala
virus.
<400> 7
ggacccrgat gaygttaaya aaa 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 8 is a reverse primer sequence for detecting Puumala
virus.
<400> 8
tcckdgasac agcatctgcc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 9 is a TaqMan probe sequence for detecting Puumala
virus.
<400> 9
caacaracag tgtcagca 18
<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT
<120> Primer sets and TaqMan probes for detecting hantavirus, and
analysis method for hantavirus using the same
<130> PT20220051
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1 is a forward primer sequence for detecting Hantan
virus.
<400> 1
tacggcarcg vcargtg 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 2 is a reverse primer sequence for detecting Hantan
virus.
<400> 2
gcatgytgrc gtatrgcctt tga 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 3 is a TaqMan probe sequence for detecting Hantan
virus.
<400> 3
cattrggyaa tatggaraca a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 4 is a forward primer sequence for detecting Seoul
virus.
<400> 4
cttgcygaya ggattgcagc
Claims (18)
서열번호 4로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 이루어지는 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 및
서열번호 7로 기재되는 염기서열을 포함하는 전방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어지는 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 를 포함하고,
TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응(TaqMan multiplex real-time PCR)에 사용되는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
A primer set including a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 TaqMan probe for detecting Hantaan virus consisting of the sequence;
A primer set including a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 TaqMan probe for detecting Seoul virus consisting of the sequence; and
A primer set including a forward primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 TaqMan probe for detecting fumala virus consisting of the sequence; including,
Characterized in that it is used for TaqMan multiplex real-time PCR (TaqMan multiplex real-time PCR),
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
상기 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브, 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브 및 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브에서 염기서열의 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3' 말단에 소광제(quencher)가 표지되는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
According to claim 1,
In the TaqMan probe for detecting Hantaan virus, TaqMan probe for detecting Seoul virus, and TaqMan probe for detecting Pumala virus, a fluorescent reporter dye is labeled at the 5' end of the base sequence and a quencher is added at the 3' end. characterized in that it is labeled,
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
상기 형광발색제는 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), 및 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
According to claim 2,
The fluorescent colorant is FAM (carboxyfluorescein), JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), VIC, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy- Characterized in that any one selected from the group consisting of 4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (indocarbocyanine-3), Cy5 (indocarbocyanine-5), and Rox (6-Carboxy-X-rhodamine),
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
상기 소광제는 NFQ(nonfluorescent quencher), MGB(minor-groove binding), BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), 및 DDQ2(deep dark Quencher 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
According to claim 2,
The quencher is NFQ (nonfluorescent quencher), MGB (minor-groove binding), BHQ-1 (Black Hole Quencher 1), BHQ-2 (Black Hole Quencher 2), BHQ-3 (Black Hole Quencher 3), TAMRA ( Characterized in that it is any one selected from the group consisting of 5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1 (deep dark Quencher 1), and DDQ2 (deep dark Quencher 2),
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
상기 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브는
상기 서열번호 3의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 FAM(carboxyfluorescein)이 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지되는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
According to any one of claims 2 to 4,
The TaqMan probe for detecting the Hantaan virus
FAM (carboxyfluorescein), a fluorescent colorant, is labeled at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding), a quencher, is labeled at the 3'-end. ,
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
상기 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브는
상기 서열번호 6의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)가 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지되는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
According to any one of claims 2 to 4,
The TaqMan probe for detecting the Seoul virus
Rox (6-Carboxy-X-rhodamine), a fluorescent colorant, is labeled at the 5'-end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and a quencher, NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding) is labeled at the 3'-end characterized in that it is labeled,
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
상기 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브는
상기 서열번호 9의 염기서열의 5'-말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고 3'-말단에 소광제인 NFQ(nonfluorescent quencher) 또는 MGB(minor-groove binding)가 표지되는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스 검출용 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트.
According to any one of claims 2 to 4,
The TaqMan probe for detecting the pumalavirus is
Characterized in that the 5'-end of the base sequence of SEQ ID NO: 9 is labeled with a fluorescent dye, Cy5 (indocarbocyanine-5), and the quencher, NFQ (nonfluorescent quencher) or MGB (minor-groove binding) is labeled at the 3'-end to do,
Primer and TaqMan probe sets for detection of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 및
서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브; 를 이용하여 TaqMan 다중 실시간 중합효소연쇄반응(TaqMan multiplex real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스의 분석방법.
A primer set for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a TaqMan probe for detecting Hantaan virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
Seoul virus detection primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, and Seoul virus detection TaqMan probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; and
A primer set for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a TaqMan probe for detecting pumala virus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; Characterized in that it comprises the step of performing TaqMan multiplex real-time PCR (TaqMan multiplex real-time PCR) using
Analysis method of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
(a) 시료부터 전장 RNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(c) 합성된 cDNA에 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 한탄바이러스 검출용 TaqMan 프로브,
서열번호 4와 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 서울바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 서울바이러스 검출용 TaqMan 프로브, 및
서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 푸말라바이러스 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열로 구성된 푸말라바이러스 검출용 TaqMan 프로브를 이용하여 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응법(TaqMan real-time PCR)을 수행하는 단계; 및
(d) 한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스를 검출 및 정량하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는,
한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸말라바이러스의 분석방법.According to claim 16,
(a) isolating full-length RNA from the sample;
(b) synthesizing cDNA from the isolated full-length RNA;
(c) a primer set for detecting Hantavirus consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the synthesized cDNA and a TaqMan probe for detecting Hantavirus consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3;
A primer set for detecting Seoul virus consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a TaqMan probe for detecting Seoul virus consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6, and
The TaqMan real-time polymerase chain reaction (TaqMan real- performing time PCR); and
(d) detecting and quantifying Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus; Characterized in that it includes,
Analysis method of Hantaan virus, Seoul virus and Pumala virus.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220044442A KR102494775B1 (en) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | Primer sets and TaqMan probes for detecting hantavirus, and analysis method for hantavirus using the same |
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|---|---|---|---|---|
| WO2008008444A2 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Methods and reagents for detecting hantavirus |
| KR102207965B1 (en) | 2020-01-21 | 2021-01-26 | 대한민국 | Primers and probes for detection of Hantaan virus and Seoul virus and detecting method for Hantaan virus and Seoul virus using the same |
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2022
- 2022-04-11 KR KR1020220044442A patent/KR102494775B1/en active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| WO2008008444A2 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Methods and reagents for detecting hantavirus |
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