KR102488134B1 - 입자 표면이 개질된 커큐민 나노 입자 복합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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장기현
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Abstract

본 발명은 입자 표면이 개질된 커큐민 나노 입자 복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

입자 표면이 개질된 커큐민 나노 입자 복합체 및 이의 제조 방법{A Nano Particle Complex With A Modified Particle Surface And A Method For Preparing The Same}
본 발명은 입자 표면이 개질된 커큐민 나노 입자 복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 COVID-19의 영향으로 항바이러스와 항염기능을 하는 면역 증진에 대한 관심이 급증하고 있다. 이에 따라서 건강기능식품에 대한 관심이 매우 커지면서 다양한 효능 효과를 가지고 특히 항염증, 항바이러스, 항균, 항암효과가 뛰어난 커큐민에 대한 관심이 매우 대두되고 있다. 커큐민(curcumin)은 인도산 울금(강황)에 포함되어 있는 폴리페놀로서 매일 성인 기준 8 g을 먹어도 부작용이 발생하지 않는 안전한 식품 원료이다. 이러한 커큐민은 in vitro 실험에서 뛰어난 효능 효과를 보이고 있고 그 기전 연구도 많이 이루어져왔으나 인체에 적용되었을 때 생체 이용률이 매우 낮아서 실질적인 효능 효과를 기대하기가 어렵다. 그 이유는 커큐민의 낮은 수용해도와 수용액상에서의 불안정성, 체내에서의 빠른 대사 때문이다.
이를 극복하기 위해 생체 이용률을 높이는 많은 연구가 이루어져왔다( Gyrnkiewicz G, Slifirski P, Acta Biochim Pol 2012;59(2):201-12). 커큐민의 생체 이용률을 높이기 위해서 피페린(piperine)이라는 흑후추 성분을 포함하면 커큐민의 간대사를 방해해 혈중의 커큐민 농도가 높아지는 결과를 나타낸다. 또한 수용해도와 흡수율을 높이기 위해 나노 리포좀(liposome), 마이셀(micelle), 나노 고형 지질 입자(solid lipid nanoparticle)등으로 제형화하여 커큐민의 생체 이용률을 높힌 연구 결과들도 많이 있다. 이를 바탕으로 상업적으로 상용화한 원료들로는 메리바(Meriva), 롱비다(LongVida), 커큐펜(CurQfen), 노바솔(NovalSol), 테라큐민(Theracumin)등이 있다. 이는 커큐민의 흡수율을 높혀 수배에서 수백 배의 혈중농도를 높힌 결과를 보여주고 있다(Rohitash. J., Journal of Intergrative Medicine, 12(2018), 367-374).
특히 메리바는 피토좀(phytosome)이라는 인지질 커큐민 복합체로 이루어져 있는데 에탄올에 녹인 커큐민에 인지질을 혼합시켜 커큐민의 에놀릭 하이드록시 그룹(enolic hydroxyl group)과 인지질의 극성부분이 수소결합(hydrogen bond)을 형성하여 복합체를 이루고 에탄올을 증발시켜 건조시킴으로써 커큐민-인지질 복합체를 개발한 것을 WO 2007/101551에 공개되어 있다. 그러나 커큐민-인지질 복합체를 단순히 용매를 증발시킴으로써 건조했기 때문에 어떤 균일한 나노 입자를 형성할 수는 없다. 입자의 균일도와 나노 입자의 크기는 혈중 농도 개선에 큰 영향을 끼치기 때문에 나노 입자를 균일하게 형성시킬 수 있고 대량생산이 가능한 기술은 아직도 전 세계적으로 미흡한 실정이다.
인지질은 비극성의 포화지방산과 극성의 인산기를 포함하는 대표적인 계면활성제이다. 이 인지질은 포스포리피드(phospholipid)라고도 하며, 80% 이하 포함하면 레시틴(lecithin)이라 명명한다. 포스포리피드(phospholipid) 즉, 인지질에는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinocitol) 등을 포함한다. 인지질에 특정 인지질 즉, 포스파티딜콜린이라면 이 특정 인지질이 90%이상 포함되면 포스파티딜콜린이라 명명할 수 있다. 인지질은 섭취량에 제한이 없을 정도로 매우 안전하고 난황, 대두, 해바라기 씨 등 천연에서 추출하기 때문에 남녀노소 누구나 섭취가 가능하고 동맥경화를 예방하는 등 그 자체로도 효능을 가지는 물질이다.
인지질은 세포막과 유사한 성분으로 수성매질에서 이중막을 형성하여 내부에 수용성의 물질, 인지질의 이중막 사이에는 지용성의 물질을 봉입시킬 수 있다. 이러한 제형을 리포좀이라 하고 인지질의 계면활성제를 이용한 대표적인 제형이라 할 수 있다.
커큐민은 리포좀 형태로 봉입하기에는 수용해도가 매우 낮아 인지질 내부에 봉입하여 콜로이드(colloid)상으로 존재하기에는 불가능하다. 따라서 대부분 커큐민은 스테아린산과 같은 고형지질 나노 입자 형태나 마이셀 형태로 개발되거나 또는 커큐민을 용매에 녹여 다시 재석출시키는 과정으로 커큐민 나노 입자 형태로 제조하여 이용되고 있다(Dutta AK, et.al, J Bioequiv Availab 2013, 6:1-9, Yallapu MM, et al Drug Discov Today 17:71-80, Donsi et al, J Agric Food Chem 2010 58:2848-2853).
상업화하기 위해서 고형지질 나노 입자나 마이셀 형태는 분말화 과정이 어렵다. 그 이유는 고형지질 나노 입자나 마이셀 형태에는 계면활성제가 매우 다량 첨가되어야 하는데 예를 들어 상업화된 커큐민의 하나인 노바솔 같은 경우 93%의 tween80이 포함되어 있다. 이러한 제형을 분말형태를 가공하기는 불가능하여 액상 형태로 제품이 되는데 이는 응용 분야부터 유통기한까지 제한적인 경우가 많다.
또한 소장 내의 흡수를 높이기 위해서는 우선 소장 내에 흡착되어야 한다. 소장 내 점막은 음이온성 바이카보네이트(bicarbonate, HCO3-)가 있어 위산을 중화시키는데 소장 내 점막의 음이온성 성질 때문에 양이온성 전하를 가진 입자가 좀더 소장 내 상피세포로 흡수될 가능성이 높아진다. 따라서 양이온성 전하를 가진 입자로 개발하는 것이 필요하다.
커큐민을 천연 계면활성제인 인지질을 이용하여 균일한 나노 입자로 결정화시켜 수분산이 매우 용이하고, 장 내에서 흡착되기 위해 양전하로 표면을 개질시키고, 일정한 형태의 미세입자로 분말화하여 생산의 재현성을 높이는 기술 개발이 필요하다.
Gyrnkiewicz G, Slifirski P, Acta Biochim Pol 2012;59(2):201-12 Rohitash. J. , Journal of Intergrative Medicine, 12(2018), 367-374 Dutta AK, et.al, J Bioequiv Availab 2013, 6:1-9, Yallapu MM, et al Drug Discov Today 17:71-80, Donsi et al, J Agric Food Chem 2010 58:2848-2853
본 발명은 커큐민 및 인지질(예컨대 레시틴)을 포함하는, 1000 nm 미만의 입자 크기를 갖는 커큐민 나노 입자 복합체로서, 양이온성 물질(예컨대 키토산)을 포함하는 1차 코팅층 및/또는 음이온성 물질(예컨대 알긴산 나트륨)을 포함하는 2차 코팅층을 추가로 포함할 수 있는, 커큐민 나노 입자 복합체를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 커큐민 나노 입자 복합체를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 커큐민 및 인지질을 포함하는, 1000 nm 미만의 입자 크기를 갖는 커큐민 나노 입자 복합체로서, 양이온성 물질을 포함하는 1차 코팅층 및/또는 음이온성 물질을 포함하는 2차 코팅층을 추가로 포함할 수 있는, 커큐민 나노 입자 복합체를 제공한다.
일 실시태양에서, 본 발명은
커큐민; 및
커큐민 1 중량부에 대해 약 6 중량부 이상, 예컨대 약 8 중량부 이상, 구체적으로는 약 8 내지 20 중량부의 인지질, 예컨대 레시틴;
을 포함하고,
커큐민 1 중량부에 대해 약 0 내지 0.3 중량부, 구체적으로는 약 0 초과 0.2 이하 중량부, 보다 구체적으로는, 약 0.03 내지 0.2 중량부의 양이온성 물질, 예컨대 키토산을 포함하는 1차 코팅층; 및/또는
커큐민 1 중량부에 대해 약 0 내지 0.025 중량부, 구체적으로는 약 0 초과 0.02 이하 중량부, 보다 구체적으로는 약 0.0001 내지 0.02 중량부 또는 약 0.0002 내지 0.02 중량부, 가장 구체적으로는 약 0.0003 내지 0.02 중량부의 음이온성 물질, 예컨대 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅층
을 추가로 포함할 수 있으며,
2차 코팅층은 1차 코팅층을 포함하는 경우에만 포함될 수 있는 것인,
커큐민 나노 입자 복합체를 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는 1차 코팅층을 포함한다. 이 경우 상기 1차 코팅층은 0 초과 중량부로 포함된다.
이에 따라 본 발명은
커큐민;
커큐민 1 중량부에 대해 약 6 중량부 이상, 예컨대 약 8 중량부 이상, 구체적으로는 약 8 내지 20 중량부의 인지질, 예컨대 레시틴; 및
커큐민 1 중량부에 대해 약 0 초과 0.2 이하 중량부, 구체적으로는, 약 0.03 내지 0.2 중량부의 양이온성 물질, 예컨대 키토산을 포함하는 1차 코팅층
을 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는 약 0 초과 0.02 이하 중량부, 보다 구체적으로는 약 0.0001 내지 0.02 중량부 또는 약 0.0002 내지 0.02 중량부, 가장 구체적으로는 약 0.0003 내지 0.02 중량부의 음이온성 물질, 예컨대 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅층을 추가로 포함한다.
일 구체적 실시태양에서, 본 발명은
커큐민; 및
커큐민 1 중량부에 대해 약 8 내지 20 중량부, 예컨대 약 8 또는 20 중량부의 레시틴
를 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체를 제공한다.
또다른 구체적 실시태양에서, 본 발명은
커큐민;
커큐민 1 중량부에 대해 8 중량부의 레시틴; 및
커큐민 1 중량부에 대해 0.03 중량부의 키토산을 포함하는 1차 코팅층
을 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체를 제공한다.
또다른 구체적 실시태양에서, 본 발명은
커큐민;
커큐민 1 중량부에 대해 8 중량부의 레시틴;
커큐민 1 중량부에 대해 0.03 중량부의 키토산을 포함하는 1차 코팅층; 및
커큐민 1 중량부에 대해 0.0003 중량부의 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅층
을 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체를 제공한다.
일 구체예에서, 인지질, 예컨대 레시틴의 함량이 상기 수치 미만일 경우, 커큐민을 봉입한 충분한 레시틴의 양이 부족하여 커큐민이 침전되어 커큐민의 봉입 효율이 낮아질 수 있으며, 상기 수치 초과인 경우, 커큐민을 충분히 봉입할 수 있었지만 미반응된 레시틴으로 인해 입자의 균일도가 저하될 수 있다.
또다른 구체예에서, 양이온성 또는 음이온성 물질의 함량이 상기 수치 초과일 경우, 침전 및 층분리가 발생되어, 안정성이 감소될 수 있다.
단, 상기 수치 범위를 벗어나는 경우라 하더라도, “나노 입자 복합체”를 형성하면서 그 안정성이 유지되는 경우라면 본원의 범위에 포함될 수 있으며, 이는 당업계에 통용되는 방법을 통해 통상의 기술자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “나노 입자”는 커큐민을 인지질을 이용하여 균일한 나노 입자로 결정화한 것을 지칭하는 것으로 그 크기가 nm 단위인 것을 의미하며, 즉, 그 크기가 1000 nm 미만으로서, “나노 결정화”라고 표현되기도 한다.
일 구체예에 있어서, 상기 나노 입자 복합체는 크기가 1000 nm 미만, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 구체적으로, 50 내지 900 nm, 100 내지 700 nm, 200 내지 600 nm, 300 내지 400 nm인 것일 수 있다.
상기 나노 입자 복합체의 크기가 상기 수치 미만일 경우 약물이 제대로 봉입되지 못하는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 수치 초과일 경우 용액 상에서 분산되지 않아 침전이 발생되고, 입자의 안정성이 저하되는 문제가 생길 수 있으며, 나노 입자 정의에 맞지 않는 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어“인지질”은 자연발생, 반합성 또는 합성 제조된 생성물을 포함하며, 이들은 단독으로 또는 혼합물로서 이용될 수 있다.
자연발생 인지질의 예들은 천연 레시틴(포스파티딜콜린(PC) 유도체), 예컨대 대두, 해바라기 또는 다른 식물 또는 동물 공급원, 바람직하게는 식물 공급원으로부터 수득 가능한 레시틴이다.
반합성 인지질의 예들은 자연발생 레시틴의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유도체이다. 예컨대, 상기 인지질은 포스파티딜콜린, 에틸포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 또는 스핑고미엘린의 지방산 디에스테르를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "1차 코팅층"은 커큐민과 인지질 복합체의 표면에 형성된 첫 번째 코팅층으로, 양이온성 물질을 포함하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 “양이온성 물질”은 커큐민 나노 입자 복합체에 양이온성 전하를 부여하기에 충분한 양의 양이온성 물질로 하전된 물질을 의미한다. 일 예에서, 양이온성으로 하전된 물질이 천연-유래 또는 합성 양이온성 중합체를 포함할 수 있다.
상기 천연-유래 양이온성 중합체는 구아 검, 셀룰로스, 단백질, 폴리펩티드, 키토산, 라놀린 및 전분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 양이온성으로 전하-변형된 유도체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 합성 양이온성 중합체는 폴리쿼터늄-4, 폴리쿼터늄-5, 폴리쿼터늄-6, 폴리쿼터늄-10, 폴리쿼터늄-39, 폴리쿼터늄-44, 폴리쿼터늄-46, 디스테아릴디모늄 클로라이드, 신나미도프로필트리모늄 클로라이드, 세트리모늄 클로라이드 및 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 양이온성으로 전하-변형된 유도체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
이에 따라 본 발명의 “양이온성 물질”은 구아 검, 셀룰로스, 단백질, 폴리펩티드, 키토산, 라놀린 및 전분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연-유래 양이온성 중합체; 또는 폴리쿼터늄-4, 폴리쿼터늄-5, 폴리쿼터늄-6, 폴리쿼터늄-10, 폴리쿼터늄-39, 폴리쿼터늄-44, 폴리쿼터늄-46, 디스테아릴디모늄 클로라이드, 신나미도프로필트리모늄 클로라이드, 세트리모늄 클로라이드 및 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 합성 양이온성 중합체일 수 있다. 상기 중합체는 물 또는 유기 용매에 용해 또는 분산시켜 사용될 수 있다.
구체적 일 실시태양에서, 본 발명의 양이온성 물질은 키토산이다.
본원에서 사용된 용어 "2차 코팅층"은 상기 1차 코팅층 위에 형성된 두 번째 코팅층으로, 음이온성 물질을 포함하는 것일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체는 1차 코팅층만을 포함하거나, 또는 1차 코팅층 및 2차 코팅층을 동시에 포함하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 “음이온성 물질”은 음이온성 하이드로겔일 수 있으며, 음이온성 히드로겔의 단량체의 예로는 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 비닐포스폰산, 말레산(이의 무수물을 포함함), 푸마르산, 이타콘산, 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산, 알긴산, 2-아크릴아미도-2-메틸프로판포스폰산과 같은 중합성 산 및, 이의 염, 예를 들면 나트륨 염, 칼륨 염 또는 암모늄 염, 이의 아미드, 히드록시알킬 에스테르, 및 아미노 또는 암모늄 작용성 에스테르 및 아미드를 포함한다.
구체적 일 실시태양에서, 본 발명의 음이온성 물질은 알긴산 나트륨, 또는 알긴산 하이드로겔일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 커큐민 나노 입자 복합체로부터 분말화된 마이크로 미세 분말을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은
상기 커큐민 나노 입자 복합체; 및
말토덱스트린, 덱스트린, 및 전분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수용성 고분자
를 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체로부터 분말화된 마이크로 미세 분말을 제공한다. 본 발명의 나노 입자는 용액 상태에서는 nm 단위, 예컨대 1000 nm 미만의 단위 크기로 존재하나, 수용성 고분자 존재 하에 분말 건조 등의 건조 단계를 거치게 되면, 나노 입자는 상기 고분자와 융합하여 그 크기는 마이크로미터 이상으로 커지게 된다.
상기 수용성 고분자는 커큐민 1 중량부에 대해 약 20 내지 30 중량부, 예컨대 약 26.67 중량부로 포함될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 커큐민 나노 입자 복합체 또는 상기 분말화된 마이크로 미세 분말을 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에서 “조성물”은 인간에게 의약품으로 사용하기 위한 약학 조성물, 동물에게 의약품으로 사용하기 위한 수의학 조성물, 또는 사람 또는 동물용 식이 제품 또는 식품(예를 들어, 기능성 식품 조성물, 즉 식품, 음료, 사료 또는 반려동물 식품, 또는 식품, 음료, 사료 또는 반려동물 식품 보충제) 등을 모두 포함한다. 이에 따라 본원에서의 “조성물”은 “약학 조성물”, “수의학 조성물”, “동물용 사료 조성물”, 또는 “식품 조성물”을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
이에 따라 본 발명의 조성물은 상기 커큐민 나노 입자 복합체 또는 상기 분말화된 마이크로 미세 분말; 및 그 용도에 맞게 약학상 허용되는 부형제, 수의학상 허용되는 부형제, 또는 식품상 허용되는 부형제를 포함한다.
본원에 사용된 어구 "약학상 허용되는", “수의학상 허용되는", 또는 “식품상 허용되는”은 합리적인 이익/위험 비와 어울리는, 건전한 의학적 또는 식품상 판단의 범주 내에서, 과독한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 담체, 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "약학상 허용되는 부형제", “수의학상 허용되는 부형제” 또는 “식품상 허용되는 부형제”는 일반적으로 안전하고, 비-독성이며, 생물학적으로도 다른 방식으로도 바람직하지 않은 약학 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 의미하며, 인간 약학 용도 또는 동물 수의학 용도, 나아가 식품 용도를 위해 허용되는 부형제를 포함한다. 명세서 및 청구범위에 사용된 "약학상 허용되는 부형제", “수의학상 허용되는 부형제”, 또는 “식품상 허용되는 성분”는 1종 이상의 이러한 부형제 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 제제에 사용되는 약학상, 수의학상, 식품상 허용되는 부형제는 희석제 또는 불활성 담체, 윤활제, 결합제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 제제에 사용되는 부형제는 충전제, 항-미생물제, 항산화제, 케이킹 방지제, 코팅제, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 그 외 약학상, 수의학상, 또는 식품성 허용되는 부형제라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 다양한 방법으로 인체에 투여될 수 있고, 다른 포유류에도 투여될 수 있다. 여기서, 다른 포유류로는 개, 고양이, 토끼, 돼지, 양, 염소, 젖소, 말, 소 등의 가축, 애완 동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
조성물이 약학 조성물인 경우, 약학 조성물은 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로 주사용 제형이 있고, 이때 조성물의 형태는 등장성 수용액 또는 현탁액인 것이 바람직할 수 있다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제, 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 할 수 있다. 경구용 제형으로는 분말, 과립, 정제, 환약, 캡슐 등이 있을 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
실시예에 따른 조성물은 약물 전달체를 이용하여 다양한 제제로 제조될 수 있다. 약물 전달 시스템은 리포좀, 에토좀, 탄성 에토좀, 타겟팅 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 나노 입자, 나노캡슐, 나노 파이버 등일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
조성물이 식품용 조성물인 경우, 예컨대 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품, 음료 등으로 활용될 수 있다. 식품용 조성물은, 예를 들어, 건강기능식품, 비타민 복합제, 껌, 음료, 각종 식품류, 차, 각종 식육가공품, 어육제품 두부류, 묵류, 면류, 빵류, 건강보조식품, 조미식품, 소스류, 과자류, 캔디류, 유가공품, 기타 가공식품, 발효 식품, 천연조미료 등으로 활용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 방법을 제공한다.
구체적 실시태양에서, 본 발명은
(a) 커큐민을 유기 용매에 용해시켜 커큐민 용액을 제조하는 단계;
(b) 인지질, 예컨대 레시틴을 유기 용매 또는 물 또는 그 둘의 혼합 용매에서 용해시켜 레시틴 용액 또는 분산액을 제조하는 단계;
(c) 단계 (a)의 상기 커큐민 용액과 단계 (b)의 상기 레시틴 용액 또는 분산액을 혼합하여 커큐민-레시틴 혼합액을 제조하는 단계;
(d) 상기 커큐민-레시틴 혼합액을 물과 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및
(e) 상기 에멀젼을 고압균질화하여 커큐민 나노 입자 복합체를 제조하는 단계
를 포함하며, 선택적으로
(f) 양이온성 물질, 예컨대 키토산을 포함하는 1차 코팅제로 상기 커큐민 나노 입자 복합체를 1차 코팅하는 단계; 및/또는
(g) 음이온성 물질, 예컨대 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅제로 상기 1차 코팅된 커큐민 나노 입자 복합체를 2차 코팅하는 단계
를 포함하는, 상기 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 방법을 제공한다. 이 때 사용되는 각 성분의 함량은 상기 언급한 바와 같다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 커큐민 나노 입자 복합체로부터 분말화된 마이크로 미세 분말의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은
상기 방법을 통해 커큐민 나노 입자 복합체를 제조하는 단계;
(h) 말토덱스트린, 덱스트린, 및 전분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수용성 고분자를 첨가하는 단계; 및
(i) 분무건조 또는 동결건조를 통해 분말화하는 단계
를 추가로 포함하는, 마이크로 미세 분말의 제조 방법을 제공한다. 이 때 사용되는 각 성분의 함량은 상기 언급한 바와 같다.
일 구체예에서, 단계 (f)에서 상기 양이온성 물질을 포함하는 1차 코팅제는 1.5 %(w/w) 이상의 농도를 갖는 키토산 수용액일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 단계 (f)에서 상기 음이온성 물질을 포함하는 2차 코팅제는 0.015 %(w/w) 이상의 농도를 갖는 알긴산 나트륨 수용액일 수 있다.
본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체는 균일한 나노 결정체를 가지고 이를 둘러싼 리포좀이 양이온성 물질 및/도는 음이온성 물질로 표면이 개질되어 소장의 점막으로의 흡수율이 높아진다.
또한 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체는 분말화를 통해 마이크로 크기의 복합체를 이룸으로써 서방성 방출 효과를 가져 혈중 농도를 높혀 생체이용율을 향상시킨다.
이에 따라 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체는 효과적인 항염증, 항바이러스, 항균 또는 항암 효과를 나타내어, 의약품, 식품 또는 동물 사료용으로 광범위하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 5의 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 직후의 제형 안정성을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2는 전계방사형 주사전자현미경(FE-SEM)을 통해 촬영된 비교예 1, 실시예 1 및 실시예 6의 사진을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체의 LPS에 의해 유도된 산화질소(NO) 억제능을 보여주는 그래프이다(실험예 4).
도 4는 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체의 TNF-α 발현량 감소를 보여주는 그래프이다(실험예 ５).
도 5는 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체의 T　세포 (MOLT-4) 증식능을 보여주는 그래프이다(실험예 6).
도 6은 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체의 인공위액과 인공장액 조건에서의 시간대별 in vitro 방출 실험 결과를 보여주는 그래프이다(실험예 ７).
도 7은 본 발명의 커큐민 나노 입자 복합체을 SD Rat에 경구투여 후 in vivo 동물 실험을 통한 시간대별 혈중 커큐민 농도를 보여주는 그래프이다(실험예 ８).
첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
이하에서는 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예에 한정되지 않는다.
실시예: 코팅된 커큐민 나노 입자 제조
표 1에 기재된 조성비에 따라 각각 성분의 첨가하여 코팅된 커큐민 나노 입자 제조하였다.
실시예 1
커큐민 추출 분말(Curcumin C3 Complex, Sabinsa사) 0.15 중량%를 에탄올에 첨가하여 70℃ 온도 조건으로 용해시켜 커큐민 용해액을 제조하였다(A). 별도로, 에탄올과 정제수가 혼합되어있는 용액에 분말 레시틴(Emulpur IP, Cargill사) 1.2 중량%를 첨가 후 70℃ 온도 조건에서 분산시켜 레시틴 분산액을 제조하였다(B).
상기 제조된 커큐민 용액을 레시틴 분산액에 첨가하여 70℃ 조건으로 10분간 균질화를 진행하였다. 1차 균질화가 완료된 커큐민-레시틴 혼합액을 정제수에 서서히 첨가하며 호모믹서로 균질화를 진행하여 입자화하여, 나노 입자를 생성하였다(C).
상기 나노 입자화된 커큐민 용액을 다시 마이크로플루다이져를 통해 1,000 bar 3회 통과로 고압균질화를 진행하여, 나노 결정화된 커큐민 복합체를 제조하였다.
나노 결정화된 커큐민 복합체 용액에 양이온성 하이드로겔인 1.5% 농도의 키토산(미래바이오텍사, MW ≥ 50,000 dalton) 수용액(D)을 0.3 중량% 첨가하여 1차 코팅을 통한 표면 개질을 진행하였다. 이어서 음이온성 하이드로겔인 0.015% 농도의 알긴산 나트륨(엠에스씨사, MW ≥ 100,000 dalton) 수용액(E)을 0.3 중량% 첨가하여 2차 코팅을 통한 표면 개질을 진행하였다. 이에 따라 최종 외부 표면이 키토산/알지네이트로 코팅된 커큐민 나노 입자를 제조하였다.
실시예 2
상기 실시예 1에서 음이온성 하이드로겔인 알긴산 나트륨 수용액(E)를 첨가하는 단계를 진행하지 않는 것을 제외하고는, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 3
상기 실시예 1에서 양이온성 하이드로겔인 키토산 수용액(D)과 음이온성 하이드로겔인 알긴산 나트륨 수용액(E)을 첨가하는 단계를 진행하지 않는 것을 제외하고는, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 4
상기 실시예 1에서 레시틴의 첨가량을 3.0 중량%로 증가시키고, 양이온성 하이드로겔인 키토산 수용액(D)과 음이온성 하이드로겔인 알긴산 나트륨 수용액(E)을 첨가하는 단계를 진행하지 않는 것을 제외하고 동일하게 제조하였다.
실시예 5
상기 실시예 1에서 첨가되는 양이온성 하이드로겔을 10% 농도의 키토산 수용액(D)을 0.3 중량% 첨가하고, 음이온성 하이드로겔인 1% 알긴산 나트륨 수용액(E)을 0.3 중량% 첨가하는 것을 제외하고는, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 6
상기 실시예 1에서 알긴산 나트륨 수용액(E) 첨가 후 전달체화 용액에 분말화를 위해 약 33.3% 농도의 말토덱스트린 수용액(F)을 12 중량% 첨가하여 혼합한 후 분무건조를 통해 분말화하는 과정을 추가하여, 분말화된 마이크로 미세 분말의 형태로 제조하는 것을 제외하고는, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실시예 1 내지 실시예 6의 조성 (단위 : 중량%)
원료 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6
A 커큐민 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
에탄올 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0
B 레시틴 1.2 1.2 1.2 3.0 1.2 1.2
에탄올 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
정제수 17.0 17.0 17.0 17.0 17.0 17.0
C 정제수 up to 100
(전체 총량이 100중량%가 되도록 하는 양)
D 키토산 0.0045 0.0045 - - 0.03 0.0045
정제수 0.2955 0.2955 - - 0.27 0.2955
E 알긴산나트륨 0.000045 - - - 0.003 0.000045
정제수 0.299955 - - - 0.297 0.299955
F 말토덱스트린 - - - - - 4.0
정제수 - - - - - 8.0
표 2는 표 1의 각 성분의 함량을 커큐민 1 중량부에 대한 값으로 환산한 것이다.
실시예 1 내지 실시예 6의 조성비 (단위 : 중량부)
원료 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6
A 커큐민 1 1 1 1 1 1
B 레시틴 8 8 8 20 8 8
D 키토산 0.03 0.03 - - 0.2 0.03
E 알긴산나트륨 0.0003 - - - 0.02 0.0003
F 말토덱스트린 - - - - - 26.67
비교예
표 3에 기재된 조성비에 따라 각각 성분의 첨가하여 코팅된 커큐민 나노 입자 제조하였다.
비교예 1
커큐민을 0.15 중량%로 정제수에 첨가하여 교반시킨 분산액으로 제조하였다.
비교예 2
상기 실시예 1에서 양이온성 하이드로겔인 키토산 수용액(D)와 음이온성 하이드로겔인 알긴산 나트륨 수용액(E)을 첨가하는 단계를 진행하지 않으며, 나아가 마이크로플루다이져 공정을 진행하지 않는 것을 제외하고는, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
비교예 3
상기 실시예 3에서 레시틴의 첨가량을 0.8 중량%로 변경하는 것을 제외하고, 나머지는 실시예 3과 동일하게 진행하였다.
비교예 4
상기 실시예 2에서 양이온성 하이드로겔인 키토산의 첨가량을 0.05 중량%로 증가시킨 것(즉, 키토산 수용액의 농도가 약 16.7%)을 제외하고는, 실시예 2와 동일하게 제조하였다.
비교예 5
상기 실시예 1에서 양이온성 하이드로겔인 키토산 수용액과 음이온성 하이드로겔인 알지네이트 수용액을 동일한 농도로 첨가되는 것을 제외하고는, 실시예1과 동일하게 제조하였다.
비교예 1 내지 비교예 5의 조성(단위 : 중량%)
원료 비교예1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
A 커큐민 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
에탄올 - 7.0 7.0 7.0 7.0
B 레시틴 - 1.2 0.8 1.2 1.2
에탄올 - 5.0 5.0 5.0 5.0
정제수 - 17.0 17.0 17.0 17.0
C 정제수 up to 100
(전체 총량이 100중량%가 되도록 하는 양)
D 키토산 - - - 0.05 0.0045
정제수 - - - 0.25 0.2955
E 알긴산나트륨 - - - - 0.0045
정제수 - - - - 0.2955
마이크로플루다이져 공정 유무 X X O O O
표 4는 표 3의 각 성분의 함량을 커큐민 1 중량부에 대한 값으로 환산한 것이다.
비교예 1 내지 비교예 5의 조성비 (단위 : 중량부)
원료 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
A 커큐민 1 1 1 1 1
B 레시틴 - 8 5.33 8 8
D 키토산 - - - 0.33 0.03
E 알긴산나트륨 - - - - 0.03
실험예 1 : 실시예 및 비교예 제형 안정성 비교
실시예 1 내지 실시예 6과 비교예 1 내지 비교예 5를 제조 직후 육안으로 제형 안정성을 관찰하였다. 최적 조성비로 전달체화한 실시예 1 내지 실시예 6에서는 제조 직후 불용성의 커큐민이 석출이나 침전 없이 분산된 형태의 용액으로 제조되었으며, 시간에 지남에도 침전이나 석출, 또는 층분리 없이 안정적인 형태를 유지하는 것을 확인하였다.
불용성의 커큐민을 정제수에 분산한 비교예 1에서는 제조직후부터 입자형태로 바로 침전되는 것을 확인하였다.
마이크로플루다이져 공정을 수행하지 않은 비교예 2는 4시간부터 석출이 관찰되었고, 24시간 이후부터 침전이 발생하였다.
레시틴 함량이 감소된 비교예 3에서는 커큐민을 봉입할 충분한 레시틴의 양이 부족하여 커큐민이 침전되었다.
양이온성 하이드로겔(키토산)과 음이온성 하이드로겔(알긴산 나트륨)의 농도가 증가된 비교예 4와 비교예 5에서는 석출 및 응집이 발생되어, 하이드로겔의 증가에 따라 용액상에서의 겔화로 인해 침전 및 층분리가 발생되었다.
실시예 1，비교예 1, 비교예 5의 커큐민 안정성을 사진으로 촬영한 결과를 도 1에 나타내었다.
시간 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
제조 직후 안정 안정 안정 안정 안정 침전 안정 침전 안정 응집
1 안정 안정 안정 안정 안정 침전 안정 침전 석출 응집
2 안정 안정 안정 안정 안정 침전 안정 침전 침전 응집
4 안정 안정 안정 안정 안정 침전 석출 침전 침전 층분리
24 안정 안정 안정 안정 안정 침전 침전 침전 침전 층분리
48 안정 안정 안정 안정 안정 침전 침전 침전 침전 층분리
실험예 2 : 커큐민 나노 입자 복합체의 입자 크기 및 입자 형성 측정
실험예 1을 통해 제형 안정성이 확보된 실시예 1 내지 실시예 5와, 비교예 1 및 비교예 2의 평균 입자크기를 측정하기 위해 나노 입자분석기(Zetasizer, Malvern사)를 통해 입자크기 측정을 진행하였고, 입자 형태를 확인하기 위해 FE-SEM(S-4200, Hitachi사)을 통해 이미지를 측정하였다.
평균 입자 크기 측정을 위해서 각 시료를 동일한 Count rate로 진행하기 위해 일정 비율로 희석하여 농도를 맞추어서 측정하였다.
키토산과 알지네이트로 코팅된 실시예 1은 368.2 ± 61.2 nm의 입자크기로 측정되었졌으며, 키토산 코팅된 실시예 2는 340.9 ± 47.88 nm, 코팅되지 않은 실시예 3은 321.5 ± 35.04 nm로 코팅에 따라 전달체의 크기가 커짐을 확인하였다.
제타전위도 실시예 1은 -47.07 ± 0.6255 mV로, 실시예 2는 -40.44 ± 1.1 mV, 실시예 3은 -69.27 ± 1.295 mV로 양이온성 하이드로겔과 음이온성 하이드로겔로 코팅될때마다 제타전위도 변화되는 것을 확인하였다.
양이온성 하이드로겔과 음이온성 하이드로겔의 함량이 증가(즉, 각각의 수용액 농도 증가)한 실시예 5에서는 실시예 1 내지 실시예 3에 대비하여 입자크기가 증가하였고, 다분산지수도 높게 측정되어 상대적으로 입자의 균일도가 낮은 것으로 측정되었지만, 석출이나 침전의 현상이 발생되지 않아 전달체로 활용가능한 것으로 확인되었다.
커큐민을 정제수에 분산시킨 비교예 1에서는 입자크기가 1658.66 ± 54.90 nm로 마이크로크기로 확인되었으며, 실시에 3과 비교하여 마이크로플루다이져 공정을 진행하지 않은 비교예 2는 입자크기가 571.4 ± 107.2 nm로 500 nm 이상의 불균일한 입자크기로 측정되어졌다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 비교예 1 비교예 2
입자크기
(nm)		 368.2 ± 61.2 340.9 ± 47.88 321.5 ± 35.04 317.86 ± 37.19 817.7 ± 245.3 1658.66 ± 54.90 571.4 ± 107.2
다분산지수 0.1121 ± 0.05771 0.2211 ± 0.0276 0.2573 ± 0.0899 0.2698 ± 0.0605 0.8205 ± 0.1794 0.778 ± 0.059 0.6549 ± 0.451
제타전위
(mV)		 -47.07 ± 0.6255 -40.44 ± 1.1 -69.27 ± 1.295 -70.53 ±
1.324		 -23.93 ± 0.9369 -31.46 ± 1.847 -53.61 ± 0.5313
FE-SEM으로 촬영된 이미지를 도 2에 나타내었다. 비교예 1은 무정형의 입자성으로 관찰되어졌지만, 실시예 1은 균일한 입자 형태의 나노 복합체 형태로 관찰되어졌다. 분무건조된 실시예 6에서는 구형의 균일한 입자 형태의 마이크로 복합체 형태로 관찰되어졌다.
실험예 3 : 커큐민 나노 입자 복합체의 봉입효율
실험예 2를 통해 균일한 입자크기로 형성된 실시예 1 내지 실시예 3에 대한 약물 전달체에 봉입된 유효성분인 커큐민의 봉입효율을 확인하기 위해 고성능액체크로마토그래프 (High Performance Liquid Chromatography, Shimadzu사)로 측정하였다.
Curcumin 원료의 봉입효율을 측정하기 위한 농도점 별 표준용액은 Ethyl acetate를 이용하여 1 mg/mL의 농도로 제조하였다. 상기 제조한 농도별 용액을 Ethyl acetate로 희석하여 0.2~100μg/mL로 하여 검량선용 표준용액을 제조하였다. 작성된 검량선은 Ethyl acetate 표준용액은 농도 범위내 0.99999의 높은 직선성을 가지는 검량선으로 작성되었다.
실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 용액 1mL를 Glass test tube에 넣은 뒤 Ethyl acetate 20 mL를 첨가하고, Vortex Mixer로 1분간 분산 시킨 뒤 초음파진탕기로 1시간동안 진탕 시켜 Curcumin을 유기용매상으로 추출하였다. 유기용매상을 채취하여 원심분리기 11,000g 4℃ 20분간 분리한 뒤 상층액을 전체 농도 분석시료로 하였다.
실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 용액 1 mL를 채취하여 Amicon® Ultra-4 Contrifugal Filter에 투입한 뒤 원심분리기 7,500 g, 25℃에서 30분간 여과한 뒤 하단에 회수된 용액을 미봉입 농도 측정 샘플로 하여 측정한다.
본 실험에서 사용된 LC-UV/RFD는 UV-Vis 검출기로 Shimadzu사의 SPD-40, Fluorescence검출기로 RF-20A을 사용하여 분석조건을 수립하였다.
이동상 A는 ACN, 이동상 B는 0.1% Formic acid 수용액이다.
초기 이동상 A가 20%의 부피비로 총 1mL/min의 유속으로 흘려주었으며, 이동상의 농도구배는 20분에 이동상 A의 비율이 79.6%이 되도록 선형으로 구배를 주었으며, 이후 샘플 간 교차오염을 방지하기 위해 10분간 ACN, Methanol 50:50 부피비로 세척한 뒤, 10분간 초기 이동상 조건으로 안정화 한 뒤 시료를 측정하였다.
Column은 CAPCELL PAK C18 UG 120 (4.6x250mm) 5μm column을 사용하였으며, 온도는 35℃를 유지하였다.
UV-Vis검출기는 430 nm파장에서, Fluorescence검출기는 Em 420 nm, Ex 550 nm조건에서 분석하였다.
실시예 1 내지 실시예 3의 봉입효율
실시예 1 실시예 2 실시예 3
봉입효율
(%)		 99.911 99.893 99.811
실시예 3의 나노 결정화된 커큐민에서 3k dalton로 필터된 시료에서 전체 커큐민 농도 대비 약 99.811%의 봉입효율로 계산되어졌으며, 실시예 2는 99.893%, 실시예 1은 99.911%로 측정되었다.
실험예 4 : 커큐민 나노 입자 복합체의 LPS에 의해 유도된 산화질소(NO) 억제 효능
실시예 1 내지 실시예 2와 비교예 1을 사용하여 나노 결정화된 커큐민 복합체의 LPS에 의해 유도된 산화질소(NO)의 억제효능을 측정하였다.
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 대식세포주와 면역세포주인 RAW 264.7, MOLT-4 을 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 g/mL)을 첨가한 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.), RPMI-1640 에서 배양하였다. 이들 세포들은 37℃에서 5% CO2 조건에서 배양하였으며, 3일마다 계대배양 하였다.
RAW 264.7 세포를 96 well plate 에 1x106 cells/mL 로 분주하여 24시간 배양한 후 sample, LPS (1㎍/mL)를 처치하여 24시간 동안 염증반응을 유도시켰다. 그 후 세포 상등액과 동량의 Griess 시약(N-1-Naphthylenthylenediamine, Sulfanilamide)을 혼합하여 96 well plate 에 10분 동안 반응 시킨 후 spectrophotometer를 사용하여 흡광도 540nm에서 NO 생성량을 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. NO 생성능 측정 결과 Control군으로 사용한 LPS군에 비해 실시예 1 및 2에서 NO 생성능이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 5 : 커큐민 나노 입자 복합체의 TNF-α 발현량 측정(Western blot)
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×106 cells/㎖로 분주하여 24시간동안 배양 한 후 비교예 1, 실시예 1 및 2를 6 ㎍/㎖ 처치하고 염증 유도제인 LPS (1 ㎍/㎖) 를 처치하여 24시간 동안 염증을 유도하였다. 아무것도 처리하지 않은 것을 정상 대조군(None; N)으로, LPS를 처치하여 24시간 동안 염증을 유도하여 대조군(Control; C)으로 사용하였다.
24시간 후 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 RIPA buffer를 200 ㎕/well 씩 투여하여 세포를 균질화 하였다. 균질화된 세포는 4℃, 12,000 rpm, 10분간 원심 분리하여 상등액을 취해 소 혈청 알부민 (BSA)을 기준으로 단백질의 농도를 정량분석 하였다.
정량분석된 단백질 샘플을 10% Spolyacrylamide gel로 전기 영동하고, polyvinylidene fluoride membranes에 transfer 하였다. 그 후 2% skimmilk를 사용하여 blocking buffer에서 1시간 동안 blocking 한 후 TBST(TBS + 0.1% Tween 20)를 사용하여 membrane을 세척한 다음 TNF-α 1차 primary antibody를 4℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후에 secondary antibody를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응한 후 ECL(Amersham)을 이용하여 암실에서 X-ray film 발광하여 현상하였다. TNF-α 생성량을 Western blot으로 정량화하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 실험에 따른 결과, 실시예 1 및 2에서 TNF-α의 생성에 대한 증가율이 감소하는 것을 알 수 있었다.
실험예 6 : 커큐민 나노 입자 복합체의 MOLT-4 세포 증식능
MOLT-4 세포를 6 well plate에 5x105 cells/mL로 분주하고 나노 결정화 커큐민 복합체인 실시예 1 및 2와 비교예 1을 농도별로 (5 내지 6㎍/㎖) 처치하여 24시간동안 배양하였다. 아무것도 처리하지 않은 것을 정상 대조군(None; N)으로 사용하였고, 양성 대조군(Control)으로는 T 세포를 증식시키는 Concanvalin A(1 ㎍/㎖)와 B 세포를 증식시키는 LPS(1 ㎍/㎖)를 첨가한 것을 사용하여, 37℃에서 5% CO2 조건에서 약 72시간동안 배양하여 T 세포 증식량을 측정하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. T 세포(즉, MOLT-4 cell) 증식량 측정 결과 정상 대조군의 T 세포 증식량을 100%로 함) Curcumin의 농도가 5㎍/㎖일 때 양성 대조군의 112.79%보다 높은 115.92%로 측정되었고, 나노 결정화된 커큐민 마이크로 입자 복합체인 실시예 1과 실시예 2에서는 각각 145.88%, 152.23%로 측정되었다. 나노 결정화 커큐민 마이크로 입자 복합체로 제조된 실시예 1 내지 실시예 2에서 비교예 1과 양의 대조군인 Concanvalin A보다 T 세포인 MOLT-4 세포 양이 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 7 : 나노 결정화된 커큐민 마이크로 입자 복합체의 in vitro 방출 실험
실시예 6과 비교예 1의 인공 위액과 인공 장액 조건에서의 커큐민 방출량을 확인하기 위해 pH 조건별 in vitro 방출실험을 진행하였다.
방출실험은 Dialysis bag (Thermo scientific, 3k dalton Molecular cut off)를 사용하여 진행하였으며, Dialysis bag 상부에는 실시예 6과 비교예 1 용액을 4mL씩 첨가하였으며, 하부에는 인공 위액과 인공 장액을 44mL 씩 첨가하여 진행하였다.
항온교반기를 통해 36.5℃로 200RPM으로 교반하였으며, 1, 2, 4, 8, 24, 48시간에 4mL씩 채취하고 동량의 인공위액 및 인공장액을 채워 넣어주었다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 인공위액 조건에서는 실시예 6과 비교예 1 모두 방출이 되지 않았지만(도 6 위 그림; 실시예 6과 비교예 1의 그래프가 거의 중첩됨), 인공장액 조건에서 4시간 이후부터 실시예 6이 비교예 1보다 월등히 많이 방출됨을 확인하였으며, 최대 4배 이상의 방출량이 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 8 : 나노 결정화된 커큐민 마이크로 입자 복합체의 in vivo 동물실험을 통한 장내 흡수율 평가
실시예 6과 비교예 1의 SD Rat을 통해 장내 흡수율 평가를 위한 in vivo 동물 실험을 진행하였다.
in vivo 동물실험을 위해 동물실험윤리위원회에 사전 승인을 득한 후 진행하였다.(심의번호 IACUC-UR-2022-01)
실험에 사용한 SD Rat은 수컷 8주령으로 경구 투여 12시간 전 단식시키고, 실시예 6과 비교예 1을 커큐민 기준 200 mg/kg로 경구투여하였다.
체혈은 안와체혈로 진행하였으며, 30분, 1, 2, 4, 8, 24시간 별로 체혈한 후 즉시 3000rpm, 5분간 원심분리하여 상층액인 혈장만 분리하여 측정전까지 -80℃에 보관하였다.
본 실험에서 사용된 표준시료는 Curcumin의 고순도 시약을 구매 및 사용하였다.
표준 시료는 ACN(Acetonitrile)을 이용하여 0.5mg/mL의 농도로 제조하여 -80℃에서 보관하였다.
혈중 Curcumin의 농도를 측정하기 위한 농도점 별 표준용액은 상기 제조된 표준시료 용액을 HPLC등급의 용매 ACN(Acetonitrile)으로 희석하여 제조하였다.
제조한 농도점은 5~500ng/mL로 하여 검량선용 표준용액으로 하였다.
작성된 검량선은 농도 범위내 0.9907의 높은 신뢰도를 가지는 검량선으로 작성되었다.
쥐로부터 채취한 혈액샘플은 각각 200μL을 채취하여 유리 시험관에 첨가하고, 2.8% Acetic acid 용액 25μL를 첨가한 뒤 Vortex mixer로 20초간 교반하였다.
교반된 용액에 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 1.2mL를 첨가 한 뒤 Vortex mixer 1분간 혼합하고, 10분간 초음파 처리 하였다.
혼합된 용액은 원심분리기 3000rpm 10min간 분리한 뒤 1차 유기상 1mL를 깨끗한 유리 시험관에 옮겨 담았다.
옮겨담은 유기용액은 질소농축기 40℃ 25분간 증발하여 유기용액을 완전히 휘발 시켰다.
유기용액이 완전히 휘발된 유리시험관에 ACN 100μL를 첨가하여 Vortex mixer 20초간 교반하여 완전히 녹여낸 뒤 측정샘플로 하였다.
본 실험에서 사용된 LC-MS/MS는 LCMS-8050을 사용하여 LC-MS/MS 조건을 수립하였다.
이동상 A는 ACN, 이동상 B는 2mM Ammonium acetate, 0.1% Formic acid 수용액이며, 이중펌프로 이동상 A가 95%의 부피비로 총 0.2mL/min의 유속으로 흘려주었으며, 이동상의 농도구배는 0.5분까지 이동상 A의 비율을 95%로 유지한 다음, 1.5분에 이동상 A 5%, 5분에 이동상 A 5%, 6분에 이동상 A 95%로 각각 선형으로 구배를 주었으며, 마지막 조성으로 10분까지 유지 하였다.
Column은 AtlantisTM T3 3μm(2.1x100mm) column을 사용하였으며, 온도는 30℃를 유지하였다.
LC-MS검출기의 다중 반응 검지법(Multiple Reaction Monitoring : MRM)으로 지정한 분자량은 DHA는 m/z 367.05>134.00으로 하여 분석하였다.
LC-MS검출기의 기기조건으로 인터페이스는 ESI(Electrospray ioniztion)로 하였으며, 불활성기체는 아르곤으로 하였으며, 분무기체 유량(Nebulizing gas flow)은 3L/min, 건조기체유량(Drying gas flow)은 10L/min, 가열기체유량(Heating gas flow)은 10L/min, 인터페이스 온도(Interface Temperature)는 300℃, 주입구 온도(DL temperature)는 250℃, 가열부 온도(Heating block temperature)는 400℃ CID(Collision-induced dissociation) gas는 17kPa, 인터페이스 전압(Interface Vortage)는 2.24kV에서 운용하였다.
그 결과를 도 7 및 표 8에 나타내었다. 실시예 6은 비교예 1보다 높은 Cmax 값을 나타내며, 생체이용률의 지표인 혈장 농도 시간 곡선 하의 넓이 (AUC)값도 약 43배 높았다.
Cmax
(ng/mL)		 AUC 24hr
(ng*min /mL)
실시예 6 3471.36 ± 1852.00 30242.75
비교예 1 57.37 ± 38.64 690.85

Claims (17)

  1. 커큐민;
    커큐민 1 중량부에 대해 6 중량부 이상의 레시틴
    을 포함하는 커큐민 나노 입자 복합체로서,
    상기 커큐민 나노 입자 복합체는
    커큐민 1 중량부에 대해 0.03 내지 0.2 중량부의 키토산을 포함하는 1차 코팅층을 추가로 포함하며,
    커큐민 1 중량부에 대해 0 내지 0.025 중량부의 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅층을 추가로 포함할 수 있는 것인,
    커큐민 나노 입자 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는 커큐민 1 중량부에 대해 8 중량부 이상의 레시틴을 포함하는 것인, 커큐민 나노 입자 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는 커큐민 1 중량부에 대해 8 내지 20 중량부의 레시틴을 포함하는 것인, 커큐민 나노 입자 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2차 코팅층은 커큐민 1 중량부에 대해 0.0003 내지 0.02 중량부의 알긴산 나트륨을 포함하는 것인, 커큐민 나노 입자 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는
    커큐민; 및
    커큐민 1 중량부에 대해 8 중량부의 레시틴을 포함하며,
    커큐민 1 중량부에 대해 0.03 중량부의 키토산을 포함하는 1차 코팅층을 추가로 포함하는 것인,
    커큐민 나노 입자 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는
    커큐민; 및
    커큐민 1 중량부에 대해 8 중량부의 레시틴을 포함하며,
    커큐민 1 중량부에 대해 0.03 중량부의 키토산을 포함하는 1차 코팅층; 및
    커큐민 1 중량부에 대해 0.0003 중량부의 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅층
    을 추가로 포함하는 것인,
    커큐민 나노 입자 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는
    커큐민; 및
    커큐민 1 중량부에 대해 8 중량부의 레시틴을 포함하며,
    커큐민 1 중량부에 대해 0.2 중량부의 키토산을 포함하는 1차 코팅층; 및
    커큐민 1 중량부에 대해 0.02 중량부의 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅층
    을 추가로 포함하는 것인,
    커큐민 나노 입자 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 커큐민 나노 입자 복합체는 마이크로플루다이저로 고압균질화된 것인, 커큐민 나노 입자 복합체.
  9. 삭제
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 커큐민 나노 입자 복합체; 및
    말토덱스트린, 덱스트린, 및 전분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수용성 고분자
    를 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체로부터 분말화된 마이크로 미세 분말.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수용성 고분자는 커큐민 1 중량부에 대해 20 내지 30 중량부로 포함되는 것인,
    커큐민 나노 입자 복합체로부터 분말화된 마이크로 미세 분말.
  12. 제6항에 따른 커큐민 나노 입자 복합체; 및
    커큐민 1 중량부에 대해 20 내지 30 중량부의 말토덱스트린
    을 포함하는, 커큐민 나노 입자 복합체로부터 분말화된 마이크로 미세 분말.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 커큐민 나노 입자 복합체를 포함하는 조성물.
  14. (a) 커큐민을 유기 용매에 용해시켜 커큐민 용액을 제조하는 단계;
    (b) 레시틴을 유기 용매 또는 물 또는 그 둘의 혼합 용매에서 용해시켜 레시틴 용액 또는 분산액을 제조하는 단계;
    (c) 단계 (a)의 상기 커큐민 용액과 단계 (b)의 상기 레시틴 용액 또는 분산액을 혼합하여 커큐민-레시틴 혼합액을 제조하는 단계;
    (d) 상기 커큐민-레시틴 혼합액을 물과 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계;
    (e) 상기 에멀젼을 고압균질화하여 커큐민 나노 입자 복합체를 제조하는 단계; 및
    (f) 키토산을 포함하는 1차 코팅제로 상기 커큐민 나노 입자 복합체를 1차 코팅하는 단계
    를 포함하며, 선택적으로
    (g) 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅제로 상기 1차 코팅된 커큐민 나노 입자 복합체를 2차 코팅하는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (f)에서 상기 키토산을 포함하는 1차 코팅제는 1.5 %(w/w) 이상의 농도를 갖는 키토산 수용액인, 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서, 단계 (g)에서 상기 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅제는 0.015 %(w/w) 이상의 농도를 갖는 알긴산 나트륨 수용액인, 커큐민 나노 입자 복합체의 제조 방법.
  17. (a) 커큐민을 유기 용매에 용해시켜 커큐민 용액을 제조하는 단계;
    (b) 레시틴을 유기 용매 또는 물 또는 그 둘의 혼합 용매에서 용해시켜 레시틴 용액 또는 분산액을 제조하는 단계;
    (c) 단계 (a)의 상기 커큐민 용액과 단계 (b)의 상기 레시틴 용액 또는 분산액을 혼합하여 커큐민-레시틴 혼합액을 제조하는 단계;
    (d) 상기 커큐민-레시틴 혼합액을 물과 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계;
    (e) 상기 에멀젼을 고압균질화하여 커큐민 나노 입자 복합체를 제조하는 단계;
    (f) 키토산을 포함하는 1차 코팅제로 상기 커큐민 나노 입자 복합체를 1차 코팅하는 단계;
    (h) 말토덱스트린, 덱스트린, 및 전분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수용성 고분자를 첨가하는 단계; 및
    (i) 분무건조 또는 동결건조를 통해 분말화하는 단계
    를 포함하며,
    선택적으로 (f) 단계와 (h) 단계 사이에,
    (g) 알긴산 나트륨을 포함하는 2차 코팅제로 상기 1차 코팅된 커큐민 나노 입자 복합체를 2차 코팅하는 단계
    추가로 포함할 수 있는, 제10항에 따른 마이크로 미세 분말의 제조 방법.
KR1020220122917A 2021-09-28 2022-09-27 입자 표면이 개질된 커큐민 나노 입자 복합체 및 이의 제조 방법 KR102488134B1 (ko)

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