KR102465434B1 - Composition for inhibition of toxicity of nanoparticles and environmentally-derived microparticles - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나노입자 및 환경에서 발생되는 미세입자에 대한 독성을 저해하는 조성물에 관한 것으로, 나노입자 또는 환경 유래 미세 입자로 유발된 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포의 활성화가 본 발명에 따른 조성물에 의해 저해되는 것이 확인됨에 따라, 상기 조성물은 나노입자 및 미세입자의 독성에 대한 저감 물질로 유용하게 사용될 수 있는 가능성이 있다.The present invention relates to a composition that inhibits the toxicity of nanoparticles and microparticles generated in the environment, and includes reduction of intracellular ATP caused by nanoparticles or microparticles derived from the environment, reduction of cell viability, inflammatory morphological changes in cells, and As it is confirmed that cell activation is inhibited by the composition according to the present invention, there is a possibility that the composition can be usefully used as a material for reducing the toxicity of nanoparticles and microparticles.

Description

나노입자 및 환경 유래 미세입자의 독성 저해 조성물{Composition for inhibition of toxicity of nanoparticles and environmentally-derived microparticles}Composition for inhibition of toxicity of nanoparticles and environmentally-derived microparticles

본 발명은 나노입자 및 환경에서 발생 되는 미세입자에 대한 독성을 저해하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition that inhibits the toxicity of nanoparticles and microparticles generated in the environment.

최근 나노입자에 대한 기술은 급격한 성장을 거두어 공업, 의료, 식품, 화장품 등 여러 산업분야에 응용되고 있다. 또한, 환경에서 연소, 물리적 분해를 통하여 블랙카본, 미세먼지, 미세플라스틱과 같은 미세입자들이 생성되어 공기, 물에 존재할 수 있다. 하지만, 나노입자의 응용 범위가 넓어지고, 환경 유래 미세입자의 생성이 증가할수록 인체에 대한 나노입자 및 미세입자의 노출 경로는 다양해지고, 빈도 또한 잦아질 수 있다(Angew. Chem. Int Ed Engi, 2011, Arch Toxicol, 2017). Recently, technology for nanoparticles has grown rapidly and is applied to various industrial fields such as industry, medicine, food, and cosmetics. In addition, through combustion and physical decomposition in the environment, fine particles such as black carbon, fine dust, and fine plastic are generated and may exist in air and water. However, as the range of application of nanoparticles widens and the production of microparticles derived from the environment increases, the routes of exposure of nanoparticles and microparticles to the human body become more diverse and the frequency may also increase (Angew. Chem. Int Ed Engi, 2011, Arch Toxicol, 2017).

이에 따라, 세계적으로 나노입자 및 미세입자에 대한 독성 저감 물질이 필요한 실정이다.Accordingly, there is a worldwide need for materials that reduce the toxicity of nanoparticles and microparticles.

일반적으로 나노입자는 일반적으로 평균 지름이 1-100 nm의 범위에 속하는 입자를 뜻하며, 이는 큰 입자의 소재보다 부피당 비표면적이 매우 넓다. 이에 따라 표면에서 일어나는 반응성이 상당히 높으며, 고유한 물리, 화학적 특성을 지닌다. 이러한 고유 특성들은 산업적으로 유용하지만, 안전성 측면에서는 잠재적으로 독성을 나타낼 수 있다.In general, nanoparticles generally mean particles with an average diameter in the range of 1-100 nm, which have a very large specific surface area per volume compared to large particle materials. Accordingly, the reactivity occurring on the surface is quite high, and it has unique physical and chemical properties. These unique properties are industrially useful, but from a safety point of view they can be potentially toxic.

또한, 나노입자의 크기가 작을수록 더욱 유해하고 활성산소 생성으로 인한 세포의 사멸 및 염증과 같은 반응을 유발한다고 보고되었다(J. Control Release, 2013). 게다가, 나노입자를 구성하는 물질에 따라서도 독성의 정도가 다르게 나타나고, 심지어 동일 물질, 동일 크기라 하더라도 구조와 형태 및 존재 환경에 따라 독성이 달라질 수 있다(Environ Health Perspect, 2006). In addition, it has been reported that the smaller the size of the nanoparticles, the more harmful they are and cause reactions such as cell death and inflammation due to the production of active oxygen (J. Control Release, 2013). In addition, the degree of toxicity appears differently depending on the material constituting the nanoparticles, and even the same material and the same size may have different toxicity depending on the structure, shape and environment of existence (Environ Health Perspect, 2006).

나노입자의 유입 경로는 흡입, 섭취, 피부가 주된 경로로 알려져 있으며, 인체에 유입된 나노입자는 모든 장기에 분포하게 되고 각각의 장기에 대한 질환의 원인이 될 수 있다(Biointerphases, 2007). Inhalation, ingestion, and skin are known as the main routes of entry of nanoparticles, and nanoparticles introduced into the human body are distributed in all organs and can cause diseases in each organ (Biointerphases, 2007).

그러나 상기 나노입자 및 미세입자의 독성을 탁월하게 저감하는 조성물은 개발되어 있지 않다.However, a composition that excellently reduces the toxicity of the nanoparticles and microparticles has not been developed.

따라서 나노입자 및 환경에서 발생 되는 미세입자에 대해 독성을 저해시킬 수 있는 조성물에 대한 연구가 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for research on a composition capable of inhibiting the toxicity of nanoparticles and microparticles generated in the environment.

1. 대한민국 공개특허 제10-2012-0043352호(2012.05.04. 공개)1. Republic of Korea Patent Publication No. 10-2012-0043352 (published on May 4, 2012)

본 발명의 목적은 나노입자 및 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 ATP 감소 및 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성의 형태학적 변화 및 세포 활성을 완화 시킬 수 있는 나노 독성 저해 조성물을 제공하는 데에 있다.An object of the present invention is to provide a nano-toxicity inhibitor composition capable of mitigating intracellular ATP reduction and cell viability reduction, inflammatory morphological changes and cellular activity induced by nanoparticles and environmental microparticles .

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펩타이드(peptide)계 화합물 및 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 일종 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a nano-toxicity inhibitory composition comprising one or a mixture thereof selected from the group consisting of peptide (peptide) compounds and organic acids as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, pharmaceutical composition or health food composition for preventing or treating cytotoxicity induced by nano or microscopic substances containing the nano-toxicity inhibitory composition as an active ingredient.

본 발명에 따른 나노 독성 저해 조성물은 나노입자 또는 환경 유래 미세 입자로 유발된 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포 활성을 완화 시킬 수 있다.The nanotoxicity inhibitory composition according to the present invention can alleviate intracellular ATP reduction, cell viability reduction, inflammatory morphological changes and cellular activity induced by nanoparticles or environmental microparticles.

또한, 상기 조성물을 유효 성분으로 포함하여 나노입자 또는 환경 유래 미세 입자로 유발된 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공할 수 있다.In addition, a cosmetic composition, pharmaceutical composition, or health food composition for preventing or treating cytotoxicity caused by nanoparticles or environment-derived microparticles may be provided by including the composition as an active ingredient.

도 1은 0.01 μg/μl 혹은 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)가 24시간동안 처리된 미세아교세포 내 ATP의 양을 분석한 결과이며, 막대 그래프 위의 검은 이미지는 실제로 관찰된 발광을 포집하여 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 2는 입자가 처리되지 않은 미세아교세포에 24시간 동안 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(붉은색은 MNPs@SiO2(RITC)의 RITC 형광을 나타낸 것이다.).
도 4는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 7은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다(초록색은 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)의 자체 형광을 나타낸 것이다.).
도 8은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 9는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 10은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 11은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 12는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 13은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 14는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm) 와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 15는 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 16은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 17은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 18은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 19는 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).1 is a result of analyzing the amount of ATP in microglia treated with 0.01 μg/μl or 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm) for 24 hours, black on the bar graph The image is a graph showing the captured luminescence actually observed (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC)).
FIG. 2 is a diagram showing the results of cell morphological analysis by light microscopy after treatment of glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours to microglia not treated with particles.
Figure 3 shows the results of microglial cells treated with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid together with 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) for 24 hours, followed by cell morphological analysis by fluorescence and optical microscopy. (Red color represents RITC fluorescence of MNPs@SiO 2 (RITC).).
Figure 4 shows that microglia were treated with 0.1 μg/μl of silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter of 50 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, followed by cell morphological analysis under an optical microscope. This is a diagram showing the results.
Figure 5 shows that microglia were treated with 0.1 μg/μl of silver nanoparticles (Ag, average diameter of 20 nm) with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours, and cell morphological analysis was performed under an optical microscope. This is a diagram showing the result.
6 is a view showing cell morphological analysis by light microscopy after treating microglia with 0.1 μg/μl of gold nanoparticles (Au, average diameter of 10 nm) with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours. to be.
7 shows microglia treated with 0.1 μg/μl of quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter of 10 nm) with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours, followed by cell morphological analysis by fluorescence and optical microscopy. It is a drawing (green color shows self-fluorescence of quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm)).
8 is a view showing cell morphological analysis by light microscopy after treatment of glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid together with 0.1 μg/μl of polystyrene microplastic (PS, average diameter of 2 μm) to microglia for 24 hours. .
9 is a view showing cell morphological analysis by light microscopy after treating microglia with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid together with 0.1 μg/μl of polystyrene microplastic (PS, average diameter of 100 nm) for 24 hours. to be.
Figure 10 shows microglia treated with 0.1 μg/μl of urban particulate matter (UPM, NIST 1648A) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, followed by cell morphological analysis by light microscopy. is the drawing shown.
11 is silica nanoparticles (SiO 2 , 0.1 μg/μl of silica nanoparticles (SiO 2 , 30 nm in average diameter) and cell morphological analysis by light microscopy after treatment with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid.
Figure 12 shows microglial cells treated with 0.1 μg/μl of silica titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter of 40 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, followed by cell morphological analysis with an optical microscope. is a drawing showing
13 shows cell morphological analysis with an optical microscope after microglia were treated with 0.1 μg/μl of silica carbon nanotubes (MWCNTs, average diameter of 25 nm) with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours. it is a drawing
14 shows microglial cells treated with 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm), and silver nanoparticles (Ag, average diameter) for 24 hours. 20 nm), gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm), quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm), polystyrene microplastic (PS, average diameter 2 μm and 100 nm), urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 30 nm), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter 40 nm), carbon nanotubes (MWCNT, average diameter 25 nm) together with glutathione, citric acid and A graph showing cell viability after treatment with a mixture of glutathione and citric acid (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC)).
15 is a mouse model injected intraperitoneally with a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC), glutathione, and citric acid, and measuring the distribution of MNPs@SiO 2 (RITC) and the degree of activation of microglia distributed in the hippocampus of the mouse brain. A diagram showing the results (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only MNPs@SiO 2 (RITC)).
16 is an intraperitoneal injection of a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC), glutathione, and citric acid into a mouse model to measure the distribution of MNPs@SiO 2 (RITC) and the degree of activation of microglia in the hypothalamic region of the mouse brain. A diagram showing the results (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only MNPs@SiO 2 (RITC)).
17 is a mouse model by intraperitoneally injecting a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC), glutathione, and citric acid, and measuring the distribution of MNPs@SiO 2 (RITC) and the degree of activation of microglia distributed in the cerebral cortex of the mouse. It is a figure showing one result (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only MNPs@SiO 2 (RITC)).
18 is a mouse model injected intraperitoneally with a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC), glutathione, and citric acid, and measuring the distribution of MNPs@SiO 2 (RITC) and the degree of activation of microglia in the brain striatum of the mouse. A diagram showing the results (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only MNPs@SiO 2 (RITC)).
19 is a mouse model injected intraperitoneally with a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC), glutathione and citric acid, and measuring the distribution of MNPs@SiO 2 (RITC) and the degree of activation of microglia distributed in the cerebellum of the mouse brain. A diagram showing the results (*P < 0.05, vs. control group, #P < 0.05, vs. group treated with only MNPs@SiO 2 (RITC)).

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 글루타치온(glutathione, GSH)과 시트르산(citric acid)을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물을 제조하였으며, 이는 나노입자 및 미세입자로 유도된 세포 내 ATP 감소 및 세포 생존율 감소, 염증 유발성의 형태학적 변화 및 세포 활성을 완화할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.The present inventors have prepared a nanotoxicity inhibitory composition containing glutathione (GSH) and citric acid as active ingredients, which reduces intracellular ATP and cell viability induced by nanoparticles and microparticles, and reduces inflammation-inducing effects. The present invention was completed by finding that morphological changes and cell activity can be alleviated.

본 발명은 펩타이드(peptide)계 화합물 및 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 일종 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물을 제공한다.The present invention provides a nano-toxicity inhibitory composition comprising one or a mixture thereof selected from the group consisting of peptide (peptide) compounds and organic acids as an active ingredient.

이때, 상기 펩타이드(peptide)계 화합물은 글루타치온(glutathione; GSH)이며, 상기 유기산은 시트르산(citric acid)인 것을 특징으로 하며, 상기 조성물은 펩타이드(peptide)계 화합물과 유기산을 (0.05 내지 10) : 1 의 농도비로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, the peptide-based compound is glutathione (GSH), the organic acid is characterized in that citric acid, and the composition comprises a peptide-based compound and an organic acid (0.05 to 10): It may be included in a concentration ratio of 1, but is not limited thereto.

또한, 상기 나노 독성 저해 조성물은 나노입자 또는 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 독성을 저해하는 것으로, 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포 활성을 완화 시킬 수 있다.In addition, the nanotoxicity inhibitory composition inhibits intracellular toxicity induced by nanoparticles or environmental microparticles, and can alleviate intracellular ATP reduction, cell viability reduction, inflammatory morphological changes and cellular activity of cells. .

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노입자에 의한 세포 내 ATP 감소는 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.According to one embodiment of the present invention, the reduction of intracellular ATP by the nanoparticles has an effect that can be mitigated by glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid.

일반적으로 상기 나노입자는 평균 지름이 1-100 nm의 범위에 속하는 입자를 뜻하며, 미세입자(Particulate matter, PM)는 평균 지름이 10 μm (PM10) 인 입자와 평균 지름이 2.5 μm (PM2.5)인 초미세입자로 분류되며, 상기 나노입자 또는 환경 유래 미세입자는 자성 나노입자, 무기 나노입자, 금속 나노입자, 양자점 나노입자, 탄소나노튜브, 미세 플라스틱, 도시 미세입자로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.In general, the nanoparticles mean particles with an average diameter in the range of 1-100 nm, and fine particles (PM) include particles with an average diameter of 10 μm (PM 10 ) and average diameters of 2.5 μm (PM 2.5 ), and the nanoparticles or environment-derived microparticles may be selected from the group consisting of magnetic nanoparticles, inorganic nanoparticles, metal nanoparticles, quantum dot nanoparticles, carbon nanotubes, microplastics, and urban microparticles. have.

구체적으로, 화학적으로 결합된 로다민B 이소시아네이트를 포함하는 실리카-코팅된 자성 나노입자[MNPs@SiO2(RITC)], 실리카 나노입자, 은 나노입자, 금 나노입자, CdSe 양자점 나노입자, 폴리스티렌 미세 플라스틱, 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 티타늄옥사이드 나노입자, 탄소나노튜브일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 나노입자 또는 미세입자라면 모두 가능하다.Specifically, silica-coated magnetic nanoparticles containing chemically bound rhodamine B isocyanate [MNPs@SiO 2 (RITC)], silica nanoparticles, silver nanoparticles, gold nanoparticles, CdSe quantum dot nanoparticles, polystyrene microparticles It may be plastic, urban particulate matter (UPM, NIST 1648A), titanium oxide nanoparticles, or carbon nanotubes, but is not limited thereto, and nanoparticles or microparticles are all possible.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)에 의한 미세아교세포의 염증 유발성의 형태학적 변화가 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.According to an embodiment of the present invention, the MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm), silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm), gold Nanoparticles (Au, average diameter 10 nm), quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm), polystyrene microplastic (PS, average diameter 2 μm and 100 nm), Urban particulate matter (UPM, NIST 1648A) , Morphology of microglia induction of inflammation by silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 30 nm), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter 40 nm), and carbon nanotubes (MWCNT, average diameter 25 nm) There are effects in which changes can be mitigated by glutathione, citric acid and a mixture of glutathione and citric acid.

또한, 상기 MNPs@SiO2(RITC)(평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)에 의한 미세아교세포의 세포 생존율 감소가 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.In addition, the MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm), silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm), gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm), quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm), polystyrene microplastic (PS, average diameter 2 μm and 100 nm), urban particulate matter (UPM, NIST 1648A), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 30 nm), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter 40 nm), and carbon nanotubes (MWCNT, average diameter 25 nm) reduced the cell viability of microglia by glutathione, citric acid, and glutathione and citric acid mixtures. There is an effect that can be mitigated by

게다가, 상기 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)에 의한 미세아교세포의 filament 길이 감소 및 세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b) 발현양의 증가가 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.In addition, the MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm), silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm), gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm), quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm), polystyrene microplastic (PS, average diameter 2 μm and 100 nm), urban particulate matter (UPM, NIST 1648A), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 30 nm), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter 40 nm), carbon nanotubes (MWCNT, average diameter 25 nm) decrease the filament length of microglial cells and increase protein according to cell activation (Iba1, CD40, CD11b) There is an effect that the increase in the expression level can be mitigated by glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid.

또한, 상기 세포는 미세아교세포, 신경세포, 별 아교세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the cells are characterized in that they are selected from the group consisting of microglia, neurons, astrocytes and oligodendrocytes, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition for preventing or treating cytotoxicity induced by nano or microscopic substances containing the nano-toxicity inhibitory composition as an active ingredient.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 상기 화장료 조성물은 유효성분인 글루타치온(glutathione, GSH) 또는 시트르산(citric acid) 또는 이의 혼합물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.When the composition of the present invention is a cosmetic composition, the cosmetic composition contains conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors in addition to active ingredients such as glutathione (GSH) or citric acid or mixtures thereof, And it may contain a carrier.

상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The formulation of the cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, hair tonic, hair conditioner, hair essence, hair lotion, hair nutrition lotion, hair shampoo, hair rinse, hair treatment Hair treatment, hair cream, hair nutrition cream, hair moisture cream, hair massage cream, hair wax, hair aerosol, hair pack, hair nutrition pack, hair soap, hair cleansing foam, hair oil, hair drying agent, hair preservative, hair dye, hair wave It may be formulated into hair bleach, hair gel, hair glaze, hair dresser, hair lacquer, hair moisturizer, hair mousse and hair spray, but is not limited thereto.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as a carrier component. .

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propane/butane or a propellant such as dimethyl ether.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation is a solution or emulsion, a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3 -Butyl glycol oil, fatty acid esters of glycerol, polyethylene glycol or sorbitan.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation is a suspension, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose as a carrier component , aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth, and the like can be used.

또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cytotoxicity induced by nano- or microscopic substances containing the nano-toxicity inhibitory composition as an active ingredient.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등으로 제형화 될 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.When the composition of the present invention is a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition may be formulated into creams, gels, patches, sprays, ointments, warning agents, lotions, liniment agents, pasta agents, cataplasmas agents, and the like. On the other hand, the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient, and such a pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in pharmaceutical preparations, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, Mannitol, Starch, Gum Acacia, Calcium Phosphate, Alginate, Gelatin, Calcium Silicate, Microcrystalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidone, Cellulose, Water, Syrup, Methyl Cellulose, Methylhydroxybenzoate, Propylhydroxybenzoate, It may include talc, magnesium stearate, mineral oil, etc., but is not limited thereto. In addition, the pharmaceutical composition may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like as additives.

상기 약제학적 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.The method of administration of the pharmaceutical composition is determined according to the degree of symptoms, and a topical administration method is usually preferred. In addition, the dosage of the active ingredient in the pharmaceutical composition may vary depending on the route of administration, the severity of the disease, the age, sex, weight, etc. of the patient, and may be administered once or several times a day.

또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 건강식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food composition for preventing or treating cytotoxicity induced by nano or microscopic substances containing the nano-toxicity inhibitory composition as an active ingredient.

상기 건강식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품 조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 글루타치온(glutathione, GSH) 또는 시트르산(citric acid) 또는 이의 혼합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.The health food composition may be provided in the form of powder, granule, tablet, capsule, syrup or beverage, and the health food composition may contain glutathione (GSH) or citric acid or its active ingredient according to the present invention. In addition to the mixture, it is used together with other foods or food additives, and may be appropriately used according to conventional methods. The mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use thereof, for example, prevention, health or therapeutic treatment.

상기 건강식품 조성물에 함유된 글루타치온(glutathione, GSH) 또는 시트르산(citric acid) 또는 이의 혼합물의 유효 용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.The effective dose of glutathione (GSH) or citric acid or mixtures thereof contained in the health food composition may be used according to the effective dose of the pharmaceutical composition, but for health and hygiene purposes or for health control In the case of intended long-term intake, it may be below the above range, and since the active ingredient has no problem in terms of safety, it is certain that it can be used in an amount above the above range.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.There is no particular limitation on the type of health food, and examples include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, Drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, and the like are exemplified.

나노입자 및 미세입자의 주된 독성은 활성산소의 증가 및 미토콘드리아 손상으로 인한 에너지 대사의 저하에 의해 나타나는데, 글루타치온의 항산화 효과와 시트르산의 에너지 대사 촉진 및 금속이온 킬레이트 작용의 동반 상승 효과로 인해 본 발명에서 효율적으로 독성을 저해하는 조성물을 개발하였다.The main toxicity of nanoparticles and microparticles is caused by an increase in reactive oxygen species and a decrease in energy metabolism due to mitochondrial damage. Due to the antioxidant effect of glutathione, the promotion of energy metabolism of citric acid, and the accompanying synergistic effect of metal ion chelating action, in the present invention A composition that effectively inhibits toxicity was developed.

본 발명에 따르면, 상기 나노입자 및 미세입자가 처리된 백서 뇌 조직 유래 미세아교세포 (rat primary microglia)에서 ATP의 감소와 세포사멸 및 세포 형태의 변화 및 세포 활성이 관찰되었으며, 이는 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 세포 내 ATP가 증가되고, 세포 생존율이 증가하며, 세포의 활성화가 저감되는 것이 확인됨에 따라, 상기 나노입자 및 미세입자의 독성에 대한 저감물질로 사용될 수 있음을 확인하였다.According to the present invention, a decrease in ATP, apoptosis, change in cell morphology, and cell activity were observed in rat primary microglia treated with the nanoparticles and microparticles, which showed that glutathione, citric acid and As it was confirmed that intracellular ATP was increased, cell viability was increased, and cell activation was reduced by the mixture of glutathione and citric acid, it was confirmed that the nanoparticles and microparticles could be used as a material for reducing toxicity.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to aid understanding of the present invention. However, the following examples are merely illustrative of the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

<참고예> 실험재료<Reference example> Test materials

화학적으로 결합된 로다민B 이소시아네이트를 포함하는 실리카-코팅된 자성 나노입자[Silica-coated magnetic nanoparticles contanining chemically bound rhodamine B isothiocyanate; MNPs@SiO2(RITC)] (평균 지름 50 nm)는 BITERIALS(Korea)에서, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)는 Seo H, Kim S-W (2007) In Situ Synthesis of CdTe/CdSe Core-Shell Quantum Dots. Chemistry of Materials 19: 2715-2717; Kim J, Lee JE, Lee J, Jang Y, Kim S-W, An K, Yu JH, Hyeon T (2006a) Generalized Fabrication of Multifunctional Nanoparticle Assemblies on Silica Spheres. Angew Chem 45: 4789-4793 에서, 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)는 Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007 에서, 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)는 Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007에서, 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)는 Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007에서, 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm)은 Sigma-Aldrich(USA) 에서, 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)는 Sigma-Aldrich(USA)에서, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)는 US Research Nanomaterials(USA)에서, 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)는 US Research Nanomaterials(USA)에서, 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)는 US Research Nanomaterials(USA)에서 수득하였다.Silica-coated magnetic nanoparticles containing chemically bound rhodamine B isocyanate [Silica-coated magnetic nanoparticles contanining chemically bound rhodamine B isothiocyanate; MNPs@SiO 2 (RITC)] (average diameter 50 nm) from BITERIALS (Korea), and silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm) from Seo H, Kim SW (2007) In Situ Synthesis of CdTe/CdSe Core -Shell Quantum Dots. Chemistry of Materials 19: 2715-2717; Kim J, Lee JE, Lee J, Jang Y, Kim SW, An K, Yu JH, Hyeon T (2006a) Generalized Fabrication of Multifunctional Nanoparticle Assemblies on Silica Spheres. In Angew Chem 45: 4789-4793, silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm) were prepared by Kim et al, 2006a; In Seo & Kim, 2007, gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm) were prepared by Kim et al, 2006a; In Seo & Kim, 2007, quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm) are described in Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007, polystyrene microplastics (PS, average diameter 2 μm and 100 nm) from Sigma-Aldrich (USA) and urban particulate matter (UPM, NIST 1648A) from Sigma-Aldrich (USA) , silica nanoparticles (SiO 2 , average Diameter 30 nm) from US Research Nanomaterials (USA), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average Diameter 40 nm) was obtained from US Research Nanomaterials (USA), and carbon nanotubes (MWCNT, average diameter 25 nm) were obtained from US Research Nanomaterials (USA).

<< 실시예Example 1> MNPs@SiO 1> MNPs@SiO 22 (( RITCRITC )가 처리된 미세아교세포 내 ATP(Adenosine triphosphate) 측정) Measurement of ATP (Adenosine triphosphate) in microglia treated with

1. 세포배양1. Cell culture

생후 1일 된 백서의 뇌 조직을 적출하여, 적출된 뇌 조직으로부터 미세아교 세포만 분리하였다.The brain tissue of a 1-day-old white paper was extracted, and only microglia were isolated from the brain tissue.

상기 세포를 10% 태아소혈청 및 100 units/ml 페니실린, 100 ng/μl 스트렙토마이신이 포함된 MEM(Minimum Essential Medium Eagle)에 부유시켰다. 이후 5% CO2, 37 ℃ 인큐베이터에서 배양 하였다.The cells were suspended in MEM (Minimum Essential Medium Eagle) containing 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, and 100 ng/μl streptomycin. Afterwards, they were cultured in an incubator at 5% CO 2 and 37 °C.

2. 세포 내 ATP측정2. Intracellular ATP measurement

배양 중인 미세아교세포에 0.01 μg/μl 혹은 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)를 24시간 동안 처리하였다. 이때, 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물 그룹의 경우, 나노입자와 함께 처리하였다. 세포를 부유시킨 후 세포 수를 측정하여 동일세포 수로 맞추었다. 이 세포들은 루시퍼린 기반 ATP 발광 측정 키트 (Promega, USA)을 이용하여 ATP의 양에 따라 발광시켰고, 그 발광 정도를 luminometer (LMaxII384; Molecular Devices, USA)로 측정하였으며, ChemiDoc™ Touch Gel Imaging System (Bio-Rad)를 이용하여 이미지화 하였다. Cultured microglia were treated with 0.01 μg/μl or 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter: 50 nm) for 24 hours. At this time, in the case of the glutathione, citric acid, and glutathione and citric acid mixture groups, they were treated together with the nanoparticles. After the cells were suspended, the number of cells was measured and adjusted to the same number of cells. These cells were luminescent according to the amount of ATP using a luciferin-based ATP luminescence measurement kit (Promega, USA), and the degree of luminescence was measured with a luminometer (LMaxII384; Molecular Devices, USA), and ChemiDoc™ Touch Gel Imaging System ( It was imaged using Bio-Rad).

그 결과, 배양 중인 미세아교세포에 0.01 μg/μl 혹은 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)만을 처리한 그룹과 비교하여, 글루타치온 또는 시트르산을, 글루타치온과 시트르산 혼합물 함께 첨가했을 때, ATP 감소를 막아줌을 확인하였으며, 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)만을 처리한 그룹과 비교하여, 각각 30%, 30%, 45% 만큼 증가된 것을 확인하였다(도 1). As a result, compared to the group treated with only 0.01 μg/μl or 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter of 50 nm) in cultured microglia, glutathione or citric acid, along with a mixture of glutathione and citric acid When added, it was confirmed that ATP reduction was prevented, and compared to the group treated with only 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), increased by 30%, 30%, and 45%, respectively It was confirmed that it was done (Fig. 1).

상기 도 1의 막대 그래프 위의 검은 이미지는 실제로 관찰된 발광을 포집하여 생성된 것이며, 검은색에 가까울수록 ATP의 양이 높음을 의미하는 바, 막대 그래프 상의 결과와 잘 일치하여 글루타치온 또는 시트르산, 글루타치온과 시트르산 혼합물 함께 첨가했을 때 ATP 감소를 막아줌을 확인하였다.The black image on the bar graph of FIG. 1 was generated by collecting the actually observed luminescence, and the closer to black, the higher the amount of ATP. It was confirmed that ATP reduction was prevented when the mixture of citric acid and citric acid was added together.

<실시예 2> 나노입자 및 미세입자가 처리된 미세아교세포의 형태학적 분석<Example 2> Morphological analysis of microglia treated with nanoparticles and microparticles

1. 형태학적 분석1. Morphological analysis

상기 실시예 1의 세포배양 방법으로 배양한 미세아교세포에 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)를 24시간 처리한 후, 형광 및 광학현미경(Axio Vert 200M fluorescence microscopy, Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 촬영하였다. 형광을 띄는 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm) 및 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)는 형광도 함께 촬영하였다. 나노입자 및 미세입자가 처리된 미세아교세포의 수의 변화 및 정상적인 형태(세포 가지를 뻗은 상태)와 염증 유발성의 형태(동그란 모양의 상태), 비정상적인 형태(입자에 파묻힌 형태)를 관찰하였다.0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm), silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm), gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm), quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm), polystyrene microplastic (PS, average diameter 2 μm and 100 nm), urban particulate matter (UPM, NIST 1648A), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 30 nm), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , Average diameter 40 nm) and carbon nanotubes (MWCNT, average diameter 25 nm) were treated for 24 hours, and then photographed using fluorescence and an optical microscope (Axio Vert 200M fluorescence microscopy, Zeiss, Jena, Germany). Fluorescent MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm) and quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm) were also photographed with fluorescence. Changes in the number of microglia treated with nanoparticles and microparticles, normal morphology (cell branching state), pro-inflammatory morphology (round-shaped state), and abnormal morphology (embedded in particles) were observed.

그 결과, 입자가 처리되지 않은 미세아교세포에 24시간 동안 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 세포 수의 변화나 형태학적 변화가 없는 것을 확인하였다(도 2).As a result, microglia without particle treatment were treated with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours, and then cell morphological analysis was performed under an optical microscope, showing no change in cell number or morphology. confirmed (FIG. 2).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, MNPs@SiO2(RITC)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 3).In addition, when microglia were treated with 0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and cell morphological analysis was performed by fluorescence and light microscopy, MNPs It was confirmed that the decrease in the number of cells caused by @SiO 2 (RITC) was alleviated by glutathione or citric acid, and the most alleviated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 3).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 4).In addition, microglia were treated with 0.1 μg/μl of silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter of 50 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, followed by cell morphological analysis under an optical microscope. In this case, it was confirmed that the reduction in the number of cells due to silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter of 50 nm) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigating effect was found in the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 4).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 비활성(정상) 상태가 됨을 확인하였다(도 5). In addition, microglial cells were treated with 0.1 μg/μl of silver nanoparticles (Ag, average diameter of 20 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and then cell morphological analysis was performed with an optical microscope. , The decrease in the number of cells caused by silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm) was alleviated by glutathione or citric acid, and the most alleviated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was confirmed that the mixture of glutathione and citric acid became inactive (normal) in the treated group (FIG. 5).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 비활성(정상) 상태가 됨을 확인하였다(도 6).In addition, microglial cells were treated with 0.1 μg/μl of gold nanoparticles (Au, average diameter of 10 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and then cell morphological analysis was performed with an optical microscope. , The decrease in the number of cells caused by gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was confirmed that the glutathione and citric acid mixture became inactive (normal) in the treated group (FIG. 6).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 비활성(정상) 상태가 됨을 확인하였다(도 7).In addition, microglia were treated with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid together with 0.1 μg/μl of quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter of 10 nm) for 24 hours, and cell morphological analysis was performed by fluorescence and optical microscopy. In one case, the decrease in the number of cells caused by quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter of 10 nm) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was confirmed that the glutathione and citric acid mixture became inactive (normal) in the treated group (FIG. 7).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 8).In addition, microglial cells were treated with 0.1 μg/μl of polystyrene microplastic (PS, average diameter of 2 μm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and then cell morphological analysis was performed with an optical microscope. The decrease in the number of cells caused by microplastics (PS, average diameter of 2 μm) was alleviated by glutathione or citric acid, and the most alleviated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was observed in the group treated with a mixture of glutathione and citric acid that it appeared in an inactive (normal) state (FIG. 8).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)으로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다(도 9). In addition, microglial cells were treated with 0.1 μg/μl of polystyrene microplastic (PS, average diameter of 100 nm) with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid for 24 hours, and cell morphological analysis was performed with an optical microscope. , The decrease in the number of cells caused by microplastics (PS, average diameter of 100 nm) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigated effect was shown in the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 9).

또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 미세 플라스틱도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다(도 10).In addition, microglia were treated with 0.1 μg/μl of urban particulate matter (UPM, NIST 1648A) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, followed by cell morphological analysis by light microscopy. In one case, the reduction in the number of cells caused by fine plastic urban particulate matter (UPM, NIST 1648A) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigating effect was found in the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 10).

미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 11).Microglia were treated with 0.1 μg/μl of silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter of 30 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and then cell morphological analysis was performed with an optical microscope. Silica nanoparticles (SiO 2 , average 30 nm in diameter) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was also observed in the group treated with a mixture of glutathione and citric acid that it appeared in an inactive (normal) state (FIG. 11).

미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 뚜렷하게 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 12).Microglia were treated with 0.1 μg/μl silica titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter 40 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and cell morphological analysis was performed with an optical microscope. In this case, the decrease in the number of cells caused by titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , average diameter of 40 nm) was alleviated by glutathione or citric acid, and the most alleviated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was also observed in the group treated with a mixture of glutathione and citric acid that it appeared in an inactive (normal) state (FIG. 12).

미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 13). Microglia were treated with 0.1 μg/μl of silica carbon nanotubes (MWCNTs, average diameter of 25 nm) for 24 hours with glutathione, citric acid, and a mixture of glutathione and citric acid, and then cell morphological analysis was performed with an optical microscope. The decrease in the number of cells caused by carbon nanotubes (MWCNTs, average diameter of 25 nm) was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigated effect was found in the mixture of glutathione and citric acid. Morphologically, it was observed in the group treated with a mixture of glutathione and citric acid that it appeared in an inactive (normal) state (FIG. 13).

<실시예 3> 나노입자 및 미세입자가 처리된 미세아교세포의 세포 생존율 측정<Example 3> Measurement of cell viability of microglia treated with nanoparticles and microparticles

1. 세포 생존율 분석1. Cell viability assay

상기 실시예 1의 세포배양 방법으로 배양한 미세아교세포에 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)를 24시간 처리한 후, succinic dehydrogenase의 활성을 기반으로 세포 생존율을 분석하는 키트(CellTilter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega Corporation, Madison, WI)를 혼합하여, 세포의 생존율에 따른 formazan 형성 정도를 490 nm 흡광도를 통해 측정하였다.0.1 μg/μl of MNPs@SiO 2 (RITC) (average diameter 50 nm), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 50 nm), silver nanoparticles (Ag, average diameter 20 nm), gold nanoparticles (Au, average diameter 10 nm), quantum dot nanoparticles (CdSe, average diameter 10 nm), polystyrene microplastic (PS, average diameter 2 μm and 100 nm), urban particulate matter (UPM, NIST 1648A), silica nanoparticles (SiO 2 , average diameter 30 nm), titanium oxide nanoparticles (TiO 2 , A kit (CellTilter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega Corporation, Madison, WI), and the degree of formazan formation according to cell viability was measured through absorbance at 490 nm.

그 결과, 나노입자 및 미세입자에 의한 세포 생존율의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 14).As a result, it was confirmed that the decrease in cell viability caused by nanoparticles and microparticles was mitigated by glutathione or citric acid, and the most mitigating effect was found in the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 14).

<실시예 4> 나노입자가 처리된 마우스의 뇌에서의 미세아교세포 활성화 측정 <Example 4> Measurement of microglia activation in the brain of nanoparticle-treated mice

마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스 뇌에서 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정하였다.A mixture of MNPs@SiO 2 (RITC), glutathione, and citric acid was intraperitoneally injected into the mouse model, and the distribution of MNPs@SiO 2 (RITC) and the degree of activation of microglia were measured in the mouse brain.

8주령의 ICR 마우스에 100 mg/kg의 MNPs@SiO2(RITC) 및 글루타치온(1000 mg/kg)과 시트르산(200 mg/kg) 혼합물을 복강 내에 주입한 뒤, 5일 후에 파라포름알데하이드로 관류한 뒤, 뇌를 적출하여 대뇌 피질(cortex), 선조체(striatum), 해마(hippocampus), 시상(thalamus), 소뇌(cerebellum)으로 분리하여 면역조직화학 (Immunohistochemistry, IHC) 및 면역 블롯(immunoblot)으로 분석하였다(도 15a). 8-week-old ICR mice were intraperitoneally injected with 100 mg/kg of MNPs@SiO 2 (RITC) and a mixture of glutathione (1000 mg/kg) and citric acid (200 mg/kg), followed by paraformaldehyde perfusion 5 days later. After that, the brain was removed and separated into the cortex, striatum, hippocampus, thalamus, and cerebellum, and subjected to immunohistochemistry (IHC) and immunoblot. analyzed (FIG. 15A).

1. 면역조직화학 분석1. Immunohistochemical analysis

적출된 뇌 조직을 동결절편하여 1% 소혈청알부민 및 10% 당나귀 혈청으로 blocking을 상온에서 2시간하였다. blocking된 조직에 항-Iba1 다클론성 염소 항체(1:100)를 4 ℃에서 16시간 결합시켰다. 조직을 0.4% Triton X-100이 포함된 인산완충식염수로 세척한 뒤, Alexa Fluor 488이 결합된 항-염소 IgG 항체(1:100)을 상온에서 2시간 결합시켰다. 조직을 0.4% Triton X-100이 포함된 인산완충식염수로 세척한 뒤, DAPI가 포함된 봉입제를 이용하여 커버글라스로 봉입하였다. 염색된 조직은 슬라이드 스캐너(Axio Scan Z1, Zeiss, Germany) 혹은 공초점 현미경(Nikon A1R HD25, Japan)을 이용하여 관찰 및 Z-stack 스캔하였다. 스캔된 이미지들을 Imaris 9.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland) 프로그램을 통하여 3D rendering 모델을 구축하였다. 구축된 모델에서 미세아교세포의 filament들의 길이를 정량하였다.The excised brain tissue was frozen sectioned and blocked with 1% bovine serum albumin and 10% donkey serum at room temperature for 2 hours. Anti-Iba1 polyclonal goat antibody (1:100) was bound to the blocked tissue at 4 °C for 16 hours. After washing the tissue with phosphate buffered saline containing 0.4% Triton X-100, Alexa Fluor 488-conjugated anti-goat IgG antibody (1:100) was bound at room temperature for 2 hours. After washing the tissue with phosphate buffered saline containing 0.4% Triton X-100, it was sealed with a cover glass using a sealing agent containing DAPI. Stained tissues were observed and Z-stack scanned using a slide scanner (Axio Scan Z1, Zeiss, Germany) or a confocal microscope (Nikon A1R HD25, Japan). A 3D rendering model was constructed from the scanned images through the Imaris 9.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland) program. In the constructed model, the length of microglial filaments was quantified.

도 15b는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. 미세아교세포는 단백질 마커인 Iba1으로 검출하였다. Iba1으로 염색된 미세아교세포의 형태는 Imaris 9.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland) 프로그램을 통하여 3D rendering 모델을 구축하였고, 이에 따른 filament 길이의 감소(미세아교세포 활성화)를 정량분석 하였다(도 15c). 15b is an immunohistochemical analysis of the morphology of MNPs@SiO 2 (RITC) and microglia distributed in the hippocampus of the brain of mice injected with a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC) and glutathione and citric acid (Co-administrated). This is the result. Microglia were detected with Iba1, a protein marker. For the morphology of Iba1-stained microglia, a 3D rendering model was constructed using the Imaris 9.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland) program, and the resulting reduction in filament length (microglia activation) was quantitatively analyzed (Fig. 15c).

대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다. Compared to the control group, the filament length of microglial cells distributed in the hippocampus of the brain of mice treated with only MNPs@SiO 2 (RITC) decreased statistically significantly, and this decrease was found in mice treated with a mixture of glutathione and citric acid. (Co-administrated).

도 16a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 16b). Figure 16a is an immunohistochemical analysis of the morphology of MNPs@SiO 2 (RITC) and microglia distributed in the brain sagittal region of mice injected with (Co-administrated) a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC) and glutathione and citric acid. This is the result. As MNPs@SiO 2 (RITC) was treated, the decrease in filament length was quantitatively analyzed (Fig. 16b).

대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다. Compared to the control group, the filament length of microglial cells distributed in the brain sagittal region of mice treated with only MNPs@SiO 2 (RITC) decreased statistically significantly, and this decrease was found in mice treated with a mixture of glutathione and citric acid. (Co-administrated).

도 17a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 17b). 17a is immunohistochemistry of MNPs@SiO 2 (RITC) and microglial cell morphology distributed in the cerebral cortex of mice injected with (Co-administrated) a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC) and glutathione and citric acid. is the result of the analysis. As MNPs@SiO 2 (RITC) was treated, the decrease in filament length was quantitatively analyzed (Fig. 17b).

대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.Compared to the control group, the filament length of microglia distributed in the cerebral cortex of the mouse treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) decreased statistically significantly. It was confirmed that it was alleviated in mice (Co-administrated).

도 18a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 18b). Figure 18a is an immunohistochemical analysis of the morphology of MNPs@SiO 2 (RITC) and microglia distributed in the brain striatum of mice injected with (Co-administrated) a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC) and glutathione and citric acid. This is the result. As MNPs@SiO 2 (RITC) was treated, the decrease in filament length was quantitatively analyzed (Fig. 18b).

대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.Compared to the control group, the filament length of microglial cells distributed in the brain striatum of mice treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) decreased statistically significantly, and this decrease was found in mice treated with a mixture of glutathione and citric acid. (Co-administrated).

도 19a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 19b). Figure 19a is an immunohistochemical analysis of the morphology of MNPs@SiO 2 (RITC) and microglial cells distributed in the cerebellum of the brain of mice injected with (Co-administrated) a mixture of MNPs@SiO 2 (RITC) and glutathione and citric acid. This is the result. As MNPs@SiO 2 (RITC) was treated, the decrease in filament length was quantitatively analyzed (Fig. 19b).

대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다. Compared to the control group, the filament length of microglial cells distributed in the cerebellar part of the brain of mice treated with only MNPs@SiO 2 (RITC) decreased statistically significantly, and this decrease was found in mice treated with a mixture of glutathione and citric acid. (Co-administrated).

2. 면역 블롯 분석2. Immunoblot analysis

적출된 뇌 조직을 대뇌 피질, 선조체, 해마, 시상, 소뇌로 분리하여 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 및 1 μg/ml leupeptin의 용액으로 용해하였다. 용해된 조직의 단백질 농도를 BCA Kit (Thermo Fisher Scientific, USA)으로 정량하였다. 동일 농도로 맞추어진 시료들을 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 크기에 따라 분리한 뒤, 단백질들을 nitrocellulose 막에 흡착시켰다. 단백질이 포함된 막은 3% 탈지유가 포함된 트리스완충식염수로 blocking 하였다. blocking된 막은 각각 항 Iba1, 항 CD40, 항 CD11b, 항 beta-actin 의 1차 항체들을 결합시켰다. 막을 0.1% Tween-20이 포함된 트리스완충식염수로 세척한 뒤, 각 1차 항체에 맞는 Horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 항체를 결합시켰다. 1% Tween-20이 포함된 트리스완충식염수로 세척한 뒤, 화학 발광용액과 반응시켜 나타나는 발광을 X-ray firm에 인화하였다. 나타난 단백질 밴드의 크기를 Image J 프로그램(National Institutes of Health, USA)을 이용하여 정량하였다. The extracted brain tissue was separated into cerebral cortex, striatum, hippocampus, thalamus, and cerebellum, and 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, It was dissolved in a solution of 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, and 1 µg/ml leupeptin. The protein concentration of the lysed tissue was quantified with BCA Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Samples adjusted to the same concentration were separated according to size by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and then proteins were adsorbed onto a nitrocellulose membrane. The protein-containing membrane was blocked with Tris buffered saline containing 3% skim milk. The blocked membrane was bound with primary antibodies of anti-Iba1, anti-CD40, anti-CD11b, and anti-beta-actin, respectively. After washing the membrane with Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies were coupled to each primary antibody. After washing with Tris-buffered saline containing 1% Tween-20, the light emitted by reacting with a chemiluminescent solution was printed on an X-ray firm. The size of the protein bands appeared was quantified using the Image J program (National Institutes of Health, USA).

도 15d는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 해마 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 15e-g).15D shows the results of measuring the expression levels of proteins (Iba1, CD40, CD11b) that increase with activation of microglia in mouse brain tissue. It was confirmed that the statistically significant increase of the above three proteins in the hippocampus of the brain of mice treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) was inhibited by the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 15e-g).

도 16c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 시상 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 16d-f).16c shows the results of measuring the expression levels of proteins (Iba1, CD40, CD11b) that increase with activation of microglia in mouse brain tissue. It was confirmed that the statistically significant increase of the above three proteins in the brain sagittal region of mice treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) was inhibited by the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 16d-f).

도 17c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 17d-f).17c shows the results of measuring the expression levels of proteins (Iba1, CD40, CD11b) that increase with activation of microglia in mouse brain tissue. It was confirmed that the statistically significant increase of the above three proteins in the cerebral cortex of mice treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) was inhibited by the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 17d-f).

도 18c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 선조체 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 18d-f).18c shows the results of measuring the expression levels of proteins (Iba1, CD40, CD11b) that increase with activation of microglia in mouse brain tissue. It was confirmed that the statistically significant increase of the above three proteins in the brain striatum of mice treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) was inhibited by a mixture of glutathione and citric acid (FIG. 18d-f).

도 19c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 소뇌 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 19d-f).19c shows the results of measuring the expression levels of proteins (Iba1, CD40, CD11b) that increase with activation of microglia in mouse brain tissue. It was confirmed that the statistically significant increase of the above three proteins in the cerebellum of the brain of mice treated only with MNPs@SiO 2 (RITC) was inhibited by the mixture of glutathione and citric acid (FIG. 19d-f).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific parts of the present invention in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (11)

펩타이드(peptide)계 화합물 및 유기산으로 이루어진 혼합물을 유효성분으로 포함하고,
상기 펩타이드(peptide)계 화합물은 글루타치온(glutathione; GSH)이며,
상기 유기산은 시트르산(citric acid)이고,
조성물은 펩타이드(peptide)계 화합물을 0.1 내지 0.5 mM의 농도로, 유기산은 0.5 내지 2 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물.Contains a mixture consisting of a peptide-based compound and an organic acid as an active ingredient,
The peptide-based compound is glutathione (GSH),
The organic acid is citric acid,
The composition comprises a peptide (peptide) compound at a concentration of 0.1 to 0.5 mM, organic acid is a nano-toxicity inhibitory composition characterized in that it comprises a concentration of 0.5 to 2 mM. 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 펩타이드(peptide)계 화합물과 유기산은 (0.05 내지 10) : 1 의 농도비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물.According to claim 1,
The peptide (peptide) compound and organic acid (0.05 to 10): nano-toxicity inhibitory composition, characterized in that mixed in a concentration ratio of 1. 제 1항에 있어서,
상기 나노 독성 저해 조성물은,
나노입자 또는 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 독성을 저해하는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물.According to claim 1,
The nano-toxicity inhibitory composition,
A nanotoxicity inhibitory composition characterized in that it inhibits intracellular toxicity induced by nanoparticles or microparticles derived from the environment. 제 1항에 있어서,
상기 나노 독성 저해 조성물은,
나노입자 또는 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포 활성을 완화 시키는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물.According to claim 1,
The nano-toxicity inhibitory composition,
A nanotoxicity inhibitory composition characterized in that it alleviates intracellular ATP reduction, cell viability reduction, inflammatory morphological changes and cellular activity induced by nanoparticles or environmental microparticles. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
상기 나노입자 또는 환경 유래 미세입자는,
자성 나노입자, 무기 나노입자, 금속 나노입자, 양자점 나노입자, 탄소나노튜브, 미세 플라스틱, 도시 미세입자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물.According to claim 5 or 6,
The nanoparticles or environment-derived microparticles,
Magnetic nanoparticles, inorganic nanoparticles, metal nanoparticles, quantum dot nanoparticles, carbon nanotubes, microplastics, nano-toxicity inhibitory composition characterized in that selected from the group consisting of urban microparticles. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
상기 세포는,
미세아교세포, 신경세포, 별 아교세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물.According to claim 5 or 6,
the cell,
Nanotoxicity inhibitory composition, characterized in that selected from the group consisting of microglia, neurons, astrocytes and oligodendrocytes. 제 1항에 따른 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방용 화장료 조성물.A cosmetic composition for preventing cytotoxicity induced by nano or microscopic substances comprising the nano-toxicity inhibitory composition according to claim 1 as an active ingredient. 제 1항에 따른 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating cytotoxicity induced by nano or microscopic substances comprising the nano-toxicity inhibitory composition according to claim 1 as an active ingredient. 제 1항에 따른 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방용 건강식품 조성물.A health food composition for preventing cytotoxicity induced by nano or microscopic substances comprising the nano-toxicity inhibitory composition according to claim 1 as an active ingredient.
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