KR102461927B1

KR102461927B1 - 이식용 줄기세포 및 이를 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 이식용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102461927B1
Application number: KR1020160018280A
Authority: KR
Inventors: 박근홍; 김재환; 박지선; 이세원
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2016-02-17
Publication date: 2022-10-31
Also published as: KR20170096713A

Abstract

본 발명은 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체에 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 로딩하고, 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자로 코팅하여 얻어진 나노입자로 줄기세포를 형질전환시켜 얻어진 이식용 줄기세포; 및 이를 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학 조성물을 제공한다.

Description

이식용 줄기세포 및 이를 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 이식용 약학 조성물{Stem cells for transplantation and pharmaceutical composition for inducing or facilitating angiogenesis comprising the same}

본 발명은 이식용 줄기세포 및 이를 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체에 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 로딩하고, 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자로 코팅하여 얻어진 나노입자로 줄기세포를 형질전환시켜 얻어진 이식용 줄기세포; 및 이를 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

특이적인 인자들이 혈관의 구성을 위하여 중요하다. 혈관은 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells, EPCs)의 순환에 의해 형성된다. 순환 과정에서, 이들 세포는 손상된 혈관으로 이동하며, 미세 환경 조건에 의하여 유도되는 망(network)을 형성하여, 내피세포(endothelial cells, ECs)로 발달된다. 따라서, 많은 연구자들이 허혈성 질환에 있어서 신혈관신생(neoangiogenesis)을 위한 EPC 이식에 촛점을 맞추고 있다. 단리된 EPCs의 이식은 국소분비(paracrine) 방식으로 숙주 세포를 자극하고, 다리 허혈(limb ischemia) 실험 모델에서 혈관신생을 촉진한다. 그러나, 이식된 EPCs의 분화를 유도하는데 있어서의 어려움을 포함한, 다양한 장애가 손상 부위에서 혈관신생(angiogenesis) 또는 혈관형성(vascularization)을 촉진하기 위한 EPCs의 사용을 방해한다. 특정 유전자의 조절은 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 특이적인 세포 미세환경를 유도하기 위하여, 비히클 내에 캡슐화될 경우 유전자 또는 약물이 세포에 직접 또는 간접적으로 도입될 수 있다. 다양한 형태의 물질들이 세포 분화에 관련된 유전자의 안전한 수송을 확보하기 위한 담체로서 사용되고 있다. 생분해성 고분자는 몇몇의 소수성 또는 친수성 약물을 캡슐화할 수 있으며, 이들의 표면 전하는 특정 유전자 또는 약물과의 결합을 촉진하도록 변형시킬 수 있다.

수많은 인자들이 혈관신생에 관여한다. 이들 중, 혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관투과성의 조절을 통하여 순환하고 있는 성숙한 ECs가 손상 부위로 들어가는 것을 증진시킴으로써 혈관 형성에 관여한다. 혈관에서 발견된 VEGF 동형체(isoforms) 중 하나인 글라이코실화된(glycosylated) VEGF₁₆₅는 임상적으로 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 유용한 효과를 가진다.

아펠린(apelin)의 단백질 및 펩타이드 형태는 VEGF를 보조하여 혈관 망(즉, 신혈관형성)을 형성하며, 심혈관 및 말초 혈관 형성을 자극한다. 아펠린 유전자의 77개 아미노산 프레프로단백질(preproprotein)은 쉽게 절단되어 짧은 활성 펩타이드를 형성한다(J. Boucher, et al., Apelin, a newly identified adipokine up-regulated by insulin and obesity, Endocrinology 146 (2005) 1764-1771). 결과적으로, 아펠린-19, 아펠린-17, 아펠린-16, 및 아펠린-12를 포함하는 합성 C-말단 절편에서 발견되는 아펠린-36은 아펠린 수용체(APJR)의 발현을 유도할 수 있다(D.K. Lee, et al., Modification of the terminal residue of apelin-13 antagonizes its hypotensive action, Endocrinology 146 (2005) 231-236; I. Szokodi, et al., Apelin, the novel endogenous ligand oforphan receptor APJ, regulates cardiac contractility, Circ . Res. 91 (2002) 434-440). 이러한 캐스케이드(cascade)는 손상 부위에서의 혈관 형성에 있어서 더욱 우수한 혈관신생을 야기하게 된다.

중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 다중-분화 가능성(multi-differentiation potential)을 가지고 있기 때문에, 세포치료 및 조직공학을 위한 잠재적인 세포원(potential cell source)으로서 알려져 있다. MSCs는 골격근 조직 연구 분야에서(예를 들어, 연골세포 및 조골세포의 생성을 위하여) 널리 사용되고 있지만, 내배엽 계통을 생성하기 위해서는 사용된 바 없다. 그러나, MSCs를 포함하는 임상적인 접근은 혈관신생을 비롯한 여러 분야에서 사용되고 있다.

고분자 담체와의 복합체 형성에 있어서, 양이온성 중합체는 음이온성의 플라스미드 DNA(pDNA)와 결합될 수 있다. 전형적인 양이온성 중합체인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 체세포 및 줄기세포로 유전자를 형질감염시키기 위하여 사용되어 왔다. PEI의 사용과 관련된 세포 독성은 나노입자(nanoparticles, NPs)의 형성에 의하여 해결될 수 있다(J.S. Park, et al., Multi-lineage differentiation of hMSCs encapsulated in thermo-reversible hydrogel using a coculture system with differentiated cells, Biomaterials 31 (28) (2010) 7275-7287; J.H. Kim, et al., The Use of Biodegradable PLGA Nanoparticles to Mediate SOX9 Gene Delivery in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Induce Chondrogenesis, Biomaterials 32 (2011) 268-278; S.Y. Jeon, et al., Co-delivery of Cbfa-1-targeting siRNA and SOX9 protein using PLGA nanoparticles to induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells, Biomaterials 35 (28) (2014) 8236-8248). PEI-코팅된 NPs는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 쉽게 유전자를 세포내로 전달할 수 있다(S.Y. Jeon, et al., Co-delivery of Cbfa-1-targeting siRNA and SOX9 protein using PLGA nanoparticles to induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells, Biomaterials 35 (28) (2014) 8236-8248).

본 발명자들은 특정 담체, 즉 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체에 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 로딩하고, 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자로 코팅된 나노입자로 줄기세포를 형질전환하여 얻어진 이식용 줄기세포가 혈관신생의 유도 및 촉진에 유용하게 사용될 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 이식용 줄기세포, 및 이를 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체에 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 캡슐화하여 얻어진 캡슐화된-나노입자 상에 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자가 코팅된 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자로 줄기세포를 형질전환시켜 얻어진 이식용 줄기세포가 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 이식용 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 이식용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명에 따라 제작된 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통하여 줄기세포로 내재화됨으로써 줄기세포를 형질전환시킨다. 상기 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자는 세포막을 투과하여 엔도좀(endosomes)으로부터 탈출하고, 캡슐화된 아펠린 단백질 또는 펩타이드가 세포기질 속으로 방출된다. 방출된 아펠린 단백질 또는 펩타이드는 아펠린 수용체의 발현을 유도하고, PI3K, p-AKT, ERK1/2, p-p70s6K 등을 자극한다. 또한, VEGF 유전자 코팅은 혈관신생-관련 단백질의 발현에 영향을 미치지 않으며, VEGF 유전자는 아펠린을 쉽게 방출시키고 아펠린 수용체의 발현을 유도한다. 특히, 본 발명에 따른 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자로 형질전환된 줄기세포를 허혈성 동물모델에 이식하였을 때 효과적으로 혈관신생을 유도하여 혈관을 형성한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 따라서, 본 발명에 따른 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자로 형질전환된 줄기세포는 혈관신생을 유도 또는 촉진하기 위한 약학 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 pVEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자의 모식도(도 1A) 및 상기 나노입자의 줄기세포내에서의 작용 메커니즘(도 1B)을 나타낸다.
도 2는 비-코팅된, PEI-코팅된, 및 PEI-pDNA(GFP)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 크기를 DLS 및 SEM에 의하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 PEI로 코딩되고, pDNA(GFP)와 복합체를 형성하는 것을 확인하기 위하여 겔 지연분석을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 비-코팅된, PEI-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs에 pDNA(GFP) 결합 후 ζ-전위를 측정하여 PLGA NPs의 표면 전하를 평가한 결과를 나타낸다.
도 4의 A는 pDNA(GFP)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 hMSCs에 처리한 다음, 유전자 및 단백질 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 각각 평가한 결과를 나타낸다. 도 4의 B는 유리 아펠린 펩타이드와 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 hMSCs에 처리한 다음, 6 시간 후에 hMSCs 의 세포막 단백질인 APJ와의 유리 아펠린 펩타이드와 아펠린-로딩된 PLGA NPs간의 상호작용 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 평가한 결과를 나타낸다. 도 4의 C는 넌센스 펩타이드-로딩된 PLGA NPs와 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 hMSCs에 처리한 다음, 6 시간 후에 hMSCs 의 세포막 단백질인 APJ와의 유리 아펠린 펩타이드와 아펠린-로딩된 PLGA NPs간의 상호작용 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 PEI-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 hMSCs로의 내재화 작용, 나노입자에 로딩된 아펠린과 세포막 단백질 APJR (아펠린 수용체)와의 상호작용을 PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 PEI-pDNA(pGFP 및 pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs을 이용하여 hMSCs를 pGFP 및 pVEGF로 형질감염시키는 효율을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 PEI-pDNA(pGFP 및 pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs을 이용하여 혈관신생-관련 인자인 ANG-1, VCAM-1, 및 bFGF가 아펠린 및 pVEGF 발현에 따른 효율을 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 8은 중간엽줄기세포의 기본배양 배지에서, PEI-pDNA(pGFP 및 pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs에 의한 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 내피세포의 특성을 나타내는 마커인 VE-cadherin (CD144), CD34, 및 Mel-CAM(CD133)의 발현 증가를 정량적 수치로 나타낸 결과이다.
도 9는 내피세포의 배양 배지(성장인자, 보충교재 및 5% 태아소혈청을 포함)인 EGM-2MV에서, PEI-pDNA(pGFP 및 pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs에 의한 중간엽 줄기세포 (hMSCs)의 내피세포의 특성을 나타내는 마커인 VE-cadherin (CD144), CD34, 및 Mel-CAM(CD133)의 발현 증가를 유세포분석기를 이용하여 정량적 수치로 나타낸 결과이다.
도 10은 아펠린 및 pVEGF에 의한, 중간엽줄기세포의 내피세포로의 분화 유도 특성을 특이적 항체를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 11의 A는 GFP-pVEGF-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질전환된 hMSCs를 매트리겔에서 24시간 동안 배양하여 혈관 형성을 평가한 결과를 나타낸다. 도 11의 B 및 C는 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs에 의한 중간엽 줄기세포 (hMSCs)로의 전달에 따른 혈관신생-관련 인자인 ANG-1, VCAM-1, 및 bFGF의 시간별 발현 추이를 PCR, 웨스턴블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 현재 유전자 전달에 많이 쓰이고 있는 비바이러스 벡터인 폴리머 (PEI-pDNA(pVEGF)), 리포펙타민-pDNA(pVEGF)(Lipid), 나노입자 (DNP-pDNA(pVEGF))와 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs과의 유전자 발현 효율을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 13은 현재 유전자 전달에 많이 쓰이고 있는 비바이러스 벡터인 폴리머 (PEI-pDNA(pVEGF)), 리포펙타민-pDNA(pVEGF)(Lipid), 나노입자 (DNP-pDNA(pVEGF))와 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs과의 유전자 발현 효율을 유세포분석 및 공초점 레이저 현미경으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 쥐의 하지에 허혈성 병변을 만든 뒤, 폴리머 (PEI), 리포펙타민 (Lipid), 나노입자 (DNP)와 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 이용하여 pVEGF를 줄기세포내로 전달하여 7주동안 도플러 관류 영상 검사를 이용하여 하지에서의 혈류량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 허혈성 하지 마우스 모델에서 신혈관형성을 도플러 관류 영상 검사로 평가한 결과를 나타낸다.
도 16 및 도 17은 현재 유전자 전달에 많이 쓰이고 있는 비바이러스 벡터인 폴리머 (PEI-pDNA(pVEGF)), 리포펙타민-pDNA(pVEGF)(Lipid), 나노입자 (DNP-pDNA(pVEGF))와 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 이용하여 pVEGF의 발현에 따른 쥐의 허혈성 사지의 비교 치료결과를 나타낸다.
도 18은 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs를 주사한 허혈성 뒷다리 모델 마우스에서의 신혈관 형성을 조직학적으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 19는 유전자 전달에 많이 쓰이고 있는 비바이러스 벡터인 폴리머 (PEI-pDNA(pVEGF)), 리포펙타민-pDNA(pVEGF)(Lipid), 나노입자 (DNP-pDNA(pVEGF))와 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 이용하여 중간엽줄기세포 내에서 발현된 pVEGF의 발현양에 따른 쥐의 허혈성 사지 모델에서의 형성을 조직학적으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 20은 pDNA(pGFP 및 pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 내재화된 중간엽줄기세포를 쥐의 허혈성 하지 병변에 주사한 후 신혈관 형성을 확인하기 위하여, 내피세포 특이 단백질을 면역형광 분석에 의하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 21은 유전자 전달에 많이 쓰이고 있는 비바이러스 벡터인 폴리머 (PEI-pDNA(pVEGF), 리포펙타민-pDNA(pVEGF)(Lipid), 나노입자 (DNP-pDNA(pVEGF))와 PEI-pDNA(pVEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 중간엽줄기세포 내재화 시킨 뒤 쥐의 허혈성 하지 병변에 주사한 후 신혈관 형성을 확인하기 위하여, 내피세포 특이 단백질을 면역형광 분석에 의하여 평가한 결과를 나타낸다.

본 명세서에서 "나노입자(nanoparticles)"라 함은 500 nm 이하의 직경을 갖는 입자를 말하며, 바람직하게는 50 nm ∼ 200 nm의 직경을 갖는 입자를 말한다. 또한, "캡슐화된-나노입자(encapsulated nanoparticles)" 라 함은 상기 나노입자(예를 들어, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체로 구성된 나노입자)에 본 발명에 따라 아펠린 단백질 또는 펩타이드가 캡슐화되어 형성된 나노입자를 말한다. 또한, "VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자(VEGF-coated apelin-loaded nanoparticles)"라 함은 본 발명에 따라 상기 캡슐화된-나노입자 상에 폴리에틸렌이민 및 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자가 순차적으로 코팅된 나노입자를 말한다.

본 발명은 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체에 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 캡슐화하여 얻어진 캡슐화된-나노입자 상에 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자가 코팅된 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자로 줄기세포를 형질전환시켜 얻어진 이식용 줄기세포를 제공한다.

본 발명에 따라 제작된 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통하여 줄기세포로 내재화(internalization)됨으로써 줄기세포를 형질전환시킨다. 또한, VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 세포막을 투과하여 엔도좀(endosomes)으로부터 탈출하고, 캡슐화된 아펠린 단백질 또는 펩타이드가 세포기질 속으로 방출된다. 방출된 아펠린 단백질 또는 펩타이드는 아펠린 수용체의 발현을 유도하고, PI3K, p-AKT, ERK1/2, p-p70s6K 등을 자극한다. 또한, VEGF 유전자는 아펠린을 쉽게 방출시키고 아펠린 수용체의 발현을 유도한다. 도 1은 본 발명에 따른 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자의 모식도(도 1A) 및 상기 나노입자의 줄기세포내에서의 작용 메커니즘(도 1B)을 나타낸다.

상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체는 '폴리-(DL)-락틱-코-글리콜산(poly-(DL)-lactic-coglycolic acid) 또는 PLGA'로 지칭되는 공중합체이다. PLGA의 구성성분인 폴리락트산과 폴리글리콜산의 몰비는 크게 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 폴리락트산과 폴리글리콜산이 1 : 0.3 ∼ 1 의 몰비, 바람직하게는 약 1 : 1 의 몰비로 공중합된 공중합체일 수 있다. 상기 PLGA의 중량평균분자량은 10,000 Da ∼ 70,000 Da의 범위, 바람직하게는 30,000 Da ∼ 35,000 Da의 범위, 더욱 바람직하게는 약 33,000 Da일 수 있다.

본 발명의 이식용 줄기세포에 있어서, 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드는 77개 아미노산을 포함하는 천연의 아펠린 단백질(서열번호 1) 및 이의 C-말단 단편으로서 아펠린 수용체의 발현을 유도하는 아펠린 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 상기 아펠린 펩타이드는 공지의 아펠린-19(서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드), 아펠린-17(서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드), 아펠린-16(서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드), 아펠린-12(서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 다양한 아펠린 펩타이드가 상기 캡슐화된-나노입자에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일 구현예에서, 상기 아펠린 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드(즉, 아펠린-17)일 수 있다.

상기 캡슐화는 수중유중수(water-in-oil-in water) 용매증발법에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 캡슐화는 (a) 상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체를 수-비혼화성 유기용매에 용해시켜 얻어진 용액과 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 수-혼화성 유기용매에 용해시켜 얻어진 용액을 혼합하여 에멀젼을 형성시키는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 에멀젼을 폴리(비닐알코올) 수용액과 혼합하여 혼합액을 얻는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 혼합액을 교반 및 증발시켜 상기 수-비혼화성 유기용매를 제거하는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 현탁액을 투석막을 사용하여 투석하여 비-캡슐화된 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

단계(a)에 있어서, 상기 수-비혼화성 유기용매는 디클로로메탄(DCM) 등일 수 있으며, PLGA 100 mg에 대하여 5 ∼ 20 ml의 비율, 바람직하게는 약 10 ml의 비율로 사용될 수 있다. 상기 수-혼화성 유기용매는 예를 들어 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 메탄올 등일 수 있으며, 아펠린 단백질 또는 펩타이드 1 mg에 대하여 0.1 ∼ 1.0 ml의 비율, 바람직하게는 약 0.1 ml의 비율로 사용될 수 있다. 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드의 사용 비율은 얻어지는 캡슐화된-나노입자 1 mg에 대하여 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 5 ∼ 50 ㎍의 범위로, 바람직하게는 약 50 ㎍이 로딩되기에 충분한 양으로 사용될 수 있으며, 이는 전체적인 제조 수율을 고려하여 PLGA와 아펠린 단백질 또는 펩타이드의 사용량을 조절함으로써 정해질 수 있다. 상기 에멀젼 형성은 통상의 방법, 예를 들어 초음파 처리 등에 따라 수행될 수 있다.

단계(b)에 있어서, 상기 폴리(비닐알코올) 수용액은 0.2 ∼ 5 %(w/v) 농도, 예를 들어 약 2 %(w/v)의 농도를 가질 수 있고, 그 사용량은 단계(a)에서 사용된 수-비혼화성 유기용매의 총 사용량에 대하여 0.5 ∼ 2 배의 비율, 바람직하게는 약 1 배의 비율로 사용될 수 있다. 얻어진 혼합액은 필요에 따라 초음파 처리 등을 수행하여 에멀젼을 형성시킬 수 있다.

단계(c)에 있어서, 상기 교반은 예를 들어 약 1시간 동안 600 rpm으로 기계적으로 교반함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 증발은 단계(a)에서 사용된 수-비혼화성 유기용매(예를 들어, 디클로로메탄)를 제거하기에 충분한 시간 동안 수행될 수 있으며, 통상의 방법(예를 들어, 진공 증발)에 따라 수행될 수 있다.

단계(d)에 있어서, 상기 투석막은 비-캡슐화된 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 제거할 수 있는 투석막이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 12,000 ∼ 14,000 의 분자량 컷-오프를 갖는 투석막을 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 투석을 수행하기 전에 단계(c)에서 얻어진 현탁액을 HEPES/NaOH 등을 사용한 원심분리를 수행함으로써 세척 과정을 수행할 수도 있다.

상기 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자는 전 서열(full sequence)의 VEGF를 코딩하는 유전자(즉, 서열번호 6의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드) 혹은 이의 동형체(isoforms)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 상기 VEGF를 코딩하는 유전자는 VEGF 동형체인 VEGF-121을 코딩하는 유전자(서열번호 7의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드), VEGF-145을 코딩하는 유전자(서열번호 8의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드), VEGF-165을 코딩하는 유전자(서열번호 9의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드), VEGF-189을 코딩하는 유전자(서열번호 10의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 다양한 VEGF 동형체를 코딩하는 유전자가 본 발명에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일 구현예에서, 상기 VEGF를 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 VEGF, VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-189 등을 코딩하는 유전자 서열은 상업적으로 구입가능한 플라스미드(예를 들어, abfrontier사 등)로부터 얻어질 수 있다.

상기 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자의 코팅은 (i) 상기 캡슐화된-나노입자 상에 폴리에틸렌이민을 가하여 1차 코팅하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 생성물에 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자를 가하여 2차 코팅하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 폴리에틸렌이민의 코팅은 캡슐화된-나노입자의 표면 전하를 양전하로 변환함으로써 VEGF를 코딩하는 유전자의 코팅을 돕는다. 상기 1차 코팅은 상기 캡슐화된-나노입자 1 mg 에 대하여 폴리에틸렌이민을 0.5 ∼ 10 ㎍의 범위로 가함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 2차 코팅은 혈관내피성장인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 상업적으로 구입가능한 플라스미드를 적절한 제한효소(예를 들어, HindIII, XhoI, 등)와 라이게이즈를 사용하여 통상의 발현벡터에 삽입시켜 얻어진 형태, 즉 발현 플라스미드를 가함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 이식용 줄기세포를 제조하기 위한 줄기세포는 혈관으로서 분화될 포텐셜(potential)을 갖는 것으로 알려져 있는 모든 종류의 줄기세포를 포함한다. 즉, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 포함한 모든 형태의 줄기세포일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 이는 통상의 방법에 따라 다양한 기원으로부터 얻어지거나 혹은 상업적으로 구입할 수 있다.

상기한 이식용 줄기세포, 즉 본 발명에 따른 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자로 형질전환된 줄기세포를 허혈성 동물모델에 이식하였을 때 효과적으로 혈관신생을 유도하여 혈관을 형성한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 상기한 이식용 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 이식용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 이식용 약학 조성물은 혈관신생을 필요로 하는 질환, 예를 들어 심근경색증, 뇌졸중, 저산소성 허혈성 뇌손상, 하지동맥경화성 질환 등의 허혈성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기한 이식용 줄기세포를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체, 즉 세포 치료제(cell therapy) 분야에서 통상적으로 사용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 제제학적 방법에 따라 세포이식을 위한 조직내-이식용 주사제, 정맥 주사제, 주사용 동결건조제제 등의 형태로 제제화될 수 있으며, 특히 바람직하게는 세포이식을 위한 조직내-이식용 주사제의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균된 수용액(예를 들어, 생리식염수 등), 비수성용제 등을 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 적절한 안정화제, 아주반트(예를 들어, 프로인트 완전 아주반트, 프로인트 불완전 아주반트 등), 등장화제, 보존제 등을 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학조성물에 유효성분으로서 함유되는 상기 이식용 줄기세포의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 이식용 줄기세포는 1회 이식량으로서 1.0 x 10⁴ ∼ 1.0 x 10¹⁰ cells/kg, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ ∼ 1.0 x 10⁹ cells/kg의 이식량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 약학 조성물 단위 제제당(per unit dosage form) 상기 이식용 줄기세포의 함량은 1.0 x 10⁴ ∼ 1.0 x 10¹⁰ cells/kg, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ ∼ 1.0 x 10⁹ cells/kg의 투여에 적합한 양일 수 있다. 물론, 상기 함량범위는 필요에 따라 적절히 변화시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 물질 및 시험방법

(1) 아펠린 - 로딩된 PLGA NPs의 제조

PLGA(50:50, 분자량: 33,000)는 베링거 인겔하임(Petersburg, 미국)으로부터 구입하였다. 아펠린-17 펩타이드는 펩트론(주)(롯트 번호 14-19101; 대전, 한국)에 의하여 합성하였다. 상기 아펠린-17 서열은 다음과 같다: "K-F-R-R-Q-R-P-R-L-S-H-K-G-P-M-P-F". 아펠린-17은 디메틸 설폭사이드에 용해하였다. 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 수중유중수(water-in-oil-in water) 용매증발법에 의해 제조하였다. 즉, 디메틸 설폭사이드(0.5 ml)에 용해시킨 아펠린-17 5 mg을 PLGA 100 mg 및 디클로로메탄 10 ml와 함께 30초 동안 초음파 처리하여(Bandelin electronic UW 70/HD 70; tip, MS 72/D, 베를린, 독일) 에멀젼화하였다. 2 %(w/v) 폴리(비닐알코올)(PVA) 수용액 10 ml를 첨가한 후, 상기 에멀젼을 다시 20초 동안 초음파처리하였다. 얻어진 에멀젼을 1시간 동안 600 rpm으로 교반하면서 유지하였다. 잔류 디클로로메탄을 진공증발시켰다. 이후, 나노스피어(nanosphere) 현탁액을 증류수를 사용하여 원심분리(7000 rpm, 10 min, 4 ℃)하여 2회 세척한 다음, 나노스피어 용액을 투석막으로 투석하여 비-캡슐화된 아펠린을 제거하였다. 얻어진 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 동결건조하여 보관하였다.

건조된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 5 mg/ml로 멸균 3차 증류수로 용해한 뒤, 5 - 50 ㎍ 범위의 아펠린-로딩된 PLGA NPs 1 mg에 폴리에틸렌이민 5 ㎍을 가하여 코팅하였다. 폴리에틸렌이민에 의해 양전하를 지닌 아펠린-로딩된 PLGA NPs 1 mg에 0.5 - 2 ㎍의 음전하를 띠는 pDNA(VEGF)를 전하-전하 상호작용에 의하여 결합시켰다. 상기 pDNA(VEGF)[즉, pEGFP-N3-hVEGF-A(165)]는 다음과 같이 제작하였다. Human VEGF-A(165) 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드인 pcDNA3.1-myc-His-hVEGF-A(165)(abfrontier사)로부터 프라이머 세트 즉, VEGF(V4)-5'-HindIII 프라이머: 5'-CACAAGCTTGCCACCATGAAC TTTCTGCTGTCTT-3' (서열번호 11) 및 hVEGF(V4)-3'-XhoI 프라이머: 5'-CATCTCGAGCCGCCTCGGCTTGTCACATC-3' (서열번호 12)를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 hVEGF-A(165) 부위를 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 제한효소 HindIII와 XhoI로 처리하고, 역시 같은 제한효소로 처리한 EGFP 유전자를 가지고 있는 pEGFP-N3(Clontech, USA)의 다중클로닝 부위(multiple cloning sites)에 재조합하여 pEGFP-N3-hVEGF-A(165)를 제작하였다.

유전자 코팅된 혹은 유전자 코팅되지 않은 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 크기를 측정하기 위하여, Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd., 영국)를 사용하여 동적광산란(dynamic light scattering, DLS)을 수행하였다. 이들 NPs의 ζ 전위(ζ-potential)은 Zetasizer Nano ZS를 사용하여 측정하였다. 이들 NPs의 형태는 주사전자현미경법(SEM, Hitachi S-3000N)으로 특정하였다. NPs에 의한 아펠린의 성공적인 캡슐화를 확인하기 위하여, FITC-아펠린-로딩된 PLGA NPs를 공초점 현미경으로 시각화하였다(LSM 510 META; Zeiss, 괴팅겐, 독일). pDNA 농축을 위한 상이한 전달체들의 성능은 Bio-Rad 화상 시스템(Bio-Rad Imaging System, Bio-Rad사제)을 사용하여 겔 이동 분석(gel retardation assay)를 수행하여 평가하였다. 즉, 상이한 NP:pDNA 중량비를 갖는 샘플을 겔상에 로딩하고, 트리스-아세테이트-EDTA(Tris-acetate-EDTA) 완충액에서 100V로 20분 동안 전기영동하였다. pDNA의 이동은 자외선 하에서 관찰하였다.

(2) hMSC 배양 및 아펠린 - 로딩된 PLGA NPs의 추적

hMSCs는 Lonza Walkersville Inc.로부터 구입하였다(catalogue #PT-2501; 미국). 해동 후, hMSCs를 37℃에서 5% CO₂ 및 95% 대기를 함유하는 습한(humidified) 인큐베이터 내에서 MSCGM 기본 배지(catalogue #PT-3001; Lonza Walkersville Inc.)에서 배양했다. 이들 조건에서 세포를 유지하였으며, 배양 배지는 2일 마다 교환하였다. 실험을 위하여, 계대 #5-7의 세포를, 37℃에서 5% CO₂를 함유하는 습한 인큐베이터 내에서 아펠린-로딩된 PLGA NPs와 함께 또는 아펠린-로딩된 PLGA NPs 없이 무혈청 배지(MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), catalogue # SH30265.01; Thermo Scientific HyClone)에서 배양하였다.

세포를 무혈청 배지에서 아펠린-로딩된 PLGA NPs와 함께 37℃에서 1, 3, 6, 9, 12, 및 24시간 동안 배양하였다. 세포를 인산완충생리식염수(PBS)로 세척하여, 유리 NPs를 제거하고, 트립신화한 후, 488nm 레이저가 장착된 Guava EasyCyte System(Guava Technologies, Hayward, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 5,000 세포의 평균 형광 시그날을 나타낸다.

hMSCs를 6-웰의 커버슬립(coverslips) 상에 2 × 10⁵ cells/well의 농도로 파종하였다. 세포를 6시간 동안 37℃에서 아펠린-로딩된 PLGA NPs와 함께 배양하고, 차가운 PBS로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 1시간 동안 4℃에서 고정시키고, PBS 1mL로 2회 세척하고, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 2분 동안 인큐베이션하여, 핵을 표지하였다. 커버슬립 상의 세포를 수성 마운팅 매질(aqueous mounting medium)(Biomeda, Foster City, CA, USA)에 올리고, 공초점 현미경(LSM 510 META)을 사용하여 관찰하였다.

(3) PLGA NPs에 로딩된 아펠린의 확인

hMSCs를 2 × 10⁵ cells/well의 농로로 6-웰에 파종하고, 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 및 72시간 동안 아펠린-로딩된 PLGA NPs와 함께 배양하였다. 처리된 세포를 RIPA 세포 용해 완충액(GenDEPOT, Barker, Texas, USA)(150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 및 0.005% 단백질분해효소 억제제)에서 용해시켰다. 로딩을 확인하기 위하여, 복합체에 해당하는 562nm에서의 흡광도를 측정하고, 바이신코닉산 분석(bicinchoninic acid assay)(Pierce, USA))을 사용하여 상등액의 펩타이드와 비교하였다.

(4) 아펠린 - 로딩된 유전자-코팅된 PLGA NPs를 사용한 hMSCs의 형질감염

hMSCs를 면역블로팅 결과를 기초로 최적화된 형질감염 조건을 사용하여 p-DNA-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염시켰다. 유전자 형질감염 및 발현 효율을 면역블로팅, RT-PCR, 유세포분석(Guava Technologies), 형광 공초점 현미경(LSM 510 META), 및 human VEGF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 분석했다.

hMSCs를 6-웰(2 × 10⁵ cells/well)에 파종하고, 37℃, 5% CO₂에서 배양하고, 차가운 PBS로 2회 세척하고, 20분 동안 전-배양하였다. 이후, 녹색형광단백질(GFP) 또는 VEGF를 코딩하는 pDNA로 코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 및 72시간 동안 세포를 처리하였다.

총 RNA를 제조사의 지시에 따라 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 hMSCs로부터 추출하였다. 지놈 DNA를 Dnase I(Roche, Basel, Switzerland)로 처리하여 제거하였다. 프라이머 염기서열은 다음과 같다 : APJR, 센스 5'-GAGTGCTGGGAAGGACTCTG-3'(서열번호 13) 및 안티센스 5'-ACTGGTTGTCTGCCCCATAG-3'(서열번호 14); VEGF, 센스 5'-ACAGACTGGAAATCCTCGGG-3'(서열번호 15) 및 안티센스 5'-GCAGAAGAAGGTCCCAAAGG-3'(서열번호 16); VEGF 수용체(VEGFR), 센스 5'-GTGACCAACATGGAGTCGTG-3'(서열번호 17) 및 안티센스 5'-TGCTTCACAGAAGACCATGC-3'(서열번호 18); basic fibroblast growth factor(bFGF), 센스 5'-CCATCCCCTGGATATGCTCT-3'(서열번호 19) 및 안티센스 5'-GTGGCACGATTATGGCTCAC-3'(서열번호 20); angiopoietin-1(ANG-1), 센스 5'-GGGCCCAGTTACTCCTTACG-3'(서열번호 21) 및 안티센스 5'-CACGGTCAAGAACCTTGGTG-3'(서열번호 22); vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), 센스 5'-GGCTATGAATCCCCATCTTT-3'(서열번호 23) 및 안티센스 5'-AAGGGGGTACACGCTAGGAA-3'(서열번호 24); 및 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 센스 5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3'(서열번호 25) 및 안티센스 5'-ATGATGTTCTGGAGAGCCCC-3'(서열번호 26). 역전사는 500 ng의 총 RNA를 사용하여 42℃에서 60분 동안 수행하였다. 인간 APJR 및 GAPDH에 대한 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 20초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 45초 동안 연장의 32 사이클 수행 후, 70℃에서 7분 동안 최종 연장.

VEGF는 ELISA Quantikine Kit를 사용하여 정량하였다. 웰을 마우스 단일클론항체 항-VEGF로 2시간 동안 실온에서 전-코팅하였다. 완충액으로 3회 세척한 후, 항-마우스 서양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이티드 다클론항체(anti-mouse horseradish peroxidase-conjugated polyclonal antibody) 100 ㎕를 각 웰에 2시간 동안 실온에서 가하였다. 추가로 세척한 후, 1:1 비율로 과산화수소 및 TMB 크로모젠(chromogen)을 함유하는 용액 100 ㎕를 각 웰에 20분 동안 가하였다. 이후, 정지액(Stop solution) 50 μL를 각 웰에 가하고, 450nm에서의 흡광도를 30분 내에 측정하고, 파장 보정은 540 또는 570 nm 로 맞추었다.

(5) 혈관 형성 분석

24-웰을 액화 매트리겔(BD Biosciences, Billerica, USA)로 코팅하고, 37℃에서 최소 30분 동안 중합시켰다. VEGF를 코딩하는 pDNA(pVEGF)로 코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 함유하는 배지를 각 웰에 가하였다. hMSCs를 37℃에서 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 및 72시간 동안 배양하고, 내피 혈관(endothelial tubes)을 칼세인 AM(Calcein AM)으로 염색하고, 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 각 웰 당 세 곳을 무작위로 선택한 영역을 이미지화하였다. 각 실험은 적어도 3회 수행하였다.

(6) 마우스 다리(limb) 허혈

암컷 BALB/c 마우스(6주령)을 실라진 및 케타민의 조합(1:5)으로 마취시킨 후, 대퇴동맥 및 그의 가지(branches)를 피부절개를 통하여 5-0 실크(Ethicon, Somerville, NJ, USA)로 결찰하였다. 이후, 외장골 동맥(external iliac artery) 및 전술한 동맥을 결찰하였다. 외장골 동맥, 말단의 가지로서 근위 기원으로부터, 복재동맥 및 슬와동맥(saphenous and popliteal arteries)으로의 분지부까지 대퇴동맥을 절개하였다. 모든 동물 실험은 차의과학대학교의 동물윤리위원회에 의하여 승인을 받았다.

(7) 다리 허혈의 처리

동맥 절개 후 1일 후, 뒷다리 허혈을 갖는 마우스를 비-처리하거나(n=10) 또는 PBS(n=10), pDNA(GFP)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs(n=10) 또는 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs(n=10)를 근육주사하였다.

(8) 레이저 도플러 관류 영상(Laser doppler perfusion imaging, LDPI ) 분석

LDPI 분석을 문헌에 기술된 바에 따라 수행하였다(H.N. Yang, et al., Differentiation of endothelial progenitor cells into endothelial cells by heparin-modified supramolecular pluronic nanogels encapsulating bFGF and complexed with VEGF165 genes, Biomaterials 35 (16) (2014) 4716-4728). 신혈관 형성(neovascularization)의 연속적인 비침습적 생리학적 평가, 즉 주사 후 0, 7, 21, 35, 및 49일째에 뒷다리에서의 표면 혈류의 연속 스캐닝을 위하여 레이저 도플러 관류 영상장치(Moor Instruments, Devon, UK)를 사용하였다. 디지털 컬러-코딩된 이미지를 분석하여, 무릎 관절부터 발가락 부위까지의 혈류를 정량하고, 관류의 평균값을 계산하였다.

(9) 면역형광법

신혈관 형성을 평가하기 위하여, hMSCs를 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 주사 부위를 완전히 절개하고, 조직학적 분석을 위해 처리하였다. 즉, 모든 샘플을 최적 컷팅 온도 화합물(TISSUE-TEKs 4583, Sakura Finetek Inc., USA)에 포매하고 냉동시켰다. 이후, 표본을 -20℃에서 14mm 두께 절편으로 자르고, 마손 트리크롬(Masson's trichrome)으로 염색하였다. 인간 핵(Chemicon, Temecula, CA, USA), ANG-1(Abcam, Cambridge, UK), VEGF165b, Tie-2 (R&D Systems), Flk-1, 혈소판 내피세포 부착 분자-1(platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1), 및 bFGF(Santa Cruz Biotechnology Inc., Delaware Avenue, CA, USA)를 동정하기 위하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 샘플을 습한 조건에서 일차 항체(1:200 희석)와 함께 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, FITC- 및 RITC-결합 이차항체(Molecular Probes)와 함께 인큐베이션하고, PBS로 3회 세척하고, 1분 동안 DAPI와 함께 인큐베이션하였다. 이미지는 공초점 현미경(LSM 510 META)에 의하여 얻었다.

(10) 통계 분석

스튜던트의 t-검정(Student's t-test)을 모든 통계 분석에 사용하였다. **P<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

2. 결과

(1) hMSCs에 의한 아펠린 - 로딩된 PLGA NPs의 내재화(internalization) 평가

아펠린-17 펩타이드를 캡슐화하고, PEI-pDNA로 코팅된 PLGA NPs를 제조하였다. 생분해성 PLGA 및 아펠린을 DCM에 용해시켜 PLGA NPs에 아펠린을 캡슐화하였다. 음전하의 pDNA와의 복합체 형성을 위하여 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 PEI의 양이온성 중합체로 코팅하였다.

비-코팅된, PEI-코팅된, 및 PEI-pDNA-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 크기를 DLS 및 SEM에 의하여 측정하였다(도 2). 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 대략 직경 120 nm이었다. PEI 코팅은 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 직경을 200nm까지 크게 증가시켰다. PEI-pDNA 코팅은 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 직경을 250nm까지 더욱 증가시켰다. 따라서, 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 크기는 PEI로 코팅 및 pDNA와 복합체 형성에 의해 증가하였다. 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 PEI로 쉽게 코팅되었고, 양전하를 띠는 표면은 쉽게 pDNA와 복합체를 형성하였다. 따라서, PLGA NPs를 이용한 동시-전달 시스템(co-delivery system)은 펩타이드- 및 유전자-변형된 hMSCs를 구축하기에 유용한 것으로 보인다.

펩타이드-로딩된 PLGA NPs가 PEI로 코딩되고, pDNA와 복합체를 형성하는 것을 확인하기 위하여, ζ-전위를 계산하여 PLGA NPs의 표면 전하를 평가하였다. 그 결과, 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 음으로 하전되었으며, PEI로 코팅되었을 때 양으로 하전되었다(도 3의 a). 또한, 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 코팅하는 PEI의 함량은 농도-의존적으로 표면 전하를 증가시켰다(도 3의 b). 따라서, 높은 양전하를 띠는 PEI-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 pDNA와 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 겔 이동 분석에 의하여 확인되었다(도 3의 c 및 d). pDNA는 고함량의 PEI로 코팅된 PLGA NPs와 강하게 복합체를 형성한다(도 3의 d). 역으로, PEI의 함량이 증가하지 않을 경우, 고함량의 아펠린-로딩된 PLGA NPs 및 pDNA 사이의 커플링은 약해졌다(도 3의 a). 이는 PLGA NPs 및 pDNA 사이의 복합체 형성이 PEI 코팅의 수준에 크게 의존한다는 것을 나타낸다.

hMSCs내로 유전자를 전달하는 이들 NPs의 특성을 연구하기 위하여, 세포를 pDNA(GFP)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리한 다음, 유전자 및 단백질 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 각각 평가했다(도 4). hMSCs에서 GFP의 유전자 발현은 PEI 수준에 영향을 받지 않았다. 그러나, GFP의 단백질 발현은 PEI의 수준과 함께 증가하였다. 이는 고함량의 PEI로 코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 쉽게 hMSCs 내로 유전자를 전달할 수 있고, 이어서 단백질로 번역된다는 것을 나타낸다.

hMSCs에 의한 FITC-아펠린-로딩된 PLGA NPs의 내재화는 24시간에 걸쳐 형광-활성 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 및 6시간째에 공초점 레이저 현미경에 의하여 측정하였다(도 5A). FACS 분석 결과, hMSCs의 23.23%의 최고치는 6시간째에 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 내재화시켰으며, 이 백분율은 9시간까지 유지된 후, 이후 감소하였다(도 5A). 이는 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 엔도사이토시스(endocytosis)를 통하여 hMSCs로 들어간다는 것을 나타낸다. 공초점 레이저 현미경은 세포기질(cytosol)에서 형광을 검출하였으며, 이는 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 세포막을 투과하여 엔도좀(endosomes)으로부터 탈출하고, 또한 캡슐화한 단백질이 세포기질 속으로 방출된다는 것을 나타낸다.

96-웰 플레이트에 아펠린-로딩된 PLGA NPs(50 mg)를 hMSCs와 함께 넣고, 아펠린 방출을 측정하였다(도 5B). 아펠린은 시간-의존적으로 방출되었으며; 6시간째에 정점에 이른 후, 이후 감소하였다. 따라서, 아펠린은 hMSCs에 의한 내재화에 따라 PLGA NPs로부터 쉽게 방출되어, 혈관신생-관련 인자의 발현을 유도하였다.

방출된 아펠린에 의한 p-포스포이노시타이드 3-키나아제(p-phosphoinositide 3-kinase, PI3K), p-AKT, p-세포외 신호조절 키나아제(p-extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2, 및 p-p70s6K의 자극을 측정하였다. 아펠린이 전달되었을 때, 이들 단백질은 5-10분 이내에 발현되었고, 1시간 동안 유지되었다(도 5C). 따라서, 아펠린-로딩된 PLGA NPs은 hMSCs에 의하여 내재화되고 엔도좀으로부터 탈출된다. 그 후, 캡슐화된 아펠린이 방출되고, 전술한 단백질의 단기 발현을 자극한다.

hMSCs을 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리하였을 때, RT-PCR 및 웨스턴블롯 분석은 방출된 아펠린이 아펠린 수용체(APJR)의 발현을 유도한다는 것을 나타내었다(도 5D). 따라서, pVEGF로 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 코팅하면, 아펠린은 쉽게 방출되고 APJR의 발현이 유도된다.

RT-PCR 및 웨스턴블롯 분석은 또한 pGFP 또는 pVEGF로 코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 도입에 따른 APJR의 발현을 검출하였다(도 5E 및 F). 이는 아펠린-로딩된 PLGA NPs와 유전자와의 복합체 형성이 혈관신생-관련 단백질의 발현에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.

APJR의 발현은 hMSCs를 50 μg의 아펠린을 캡슐화한 PLGA NPs로 처리하였을 때 가장 높았고, 더 높은 함량에서는 감소하였다(도 5F). VEGF 발현은 유사한 양상을 나타내었다. 그러므로, 특정 함량의 아펠린으로의 처리는 세포 내에서 최대 효과를 유도해 내지만, 그보다 더 높은 함량은 APJR 또는 VEGF 발현을 효과적으로 자극시키지 않는다.

(2) GFP - pVEGF을 갖는 hMSCs의 형질감염 효율의 평가

PEI-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs을 이용하여 hMSCs를 pGFP 및 pVEGF로 형질감염시키는 효율을 평가하였다(도 6A). FACS 분석에 의해 hMSCs가 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 첨가 후 48시간까지 시간-의존적으로 GFP-pVEGF를 발현했음을 확인하였다(도 6A). GFP 형광은 세포기질에서 48시간째에 검출되며, 이는 GFP-pVEGF로 코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 hMSCs에 의하여 내재화되며, 엔도좀으로부터 탈출된다는 것을 나타낸다(도 6A). 이는 초기 엔도좀 염색에 의하여 확인되었다(도 7). 따라서, 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 세포막을 투과한 후, 엔도좀에 일시적으로 편재화된다.

RT-PCR 및 웨스턴블롯 분석은 VEGF의 mRNA 및 단백질 발현을 검출하였으며, 또한 1시간 후에 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 hMSCs 내 수용체를 검출하였다(도 6B). 혈관신생-관련 인자 ANG-1, VCAM-1, 및 bFGF가 또한 이들 PLGA NPs 처리에 따라 시간-의존적으로 hMSCs에서 발현되었다(도 8). 따라서, pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs는 혈관신생-관련 인자의 발현을 유도하였다. 이는 혈관신생을 유도하기 위하여 동물 모델로의 펩타이드- 및 유전자-변형된 hMSCs 이식을 위해 이상적이다.

아펠린-로딩된 PLGA NPs과 pVEGF의 복합체 형성은 hMSCs에서 VEGF 생성을 야기하였다(도 6D). VEGF 생성은, pGFP와 복합체를 형성한 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 hMSCs에서 및 대조 hMSCs에 비하여, pVEGF와 복합체를 형성한 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 hMSCs에서 100배 이상 더 높았다. 따라서, 내재화된 VEGF 유전자는 단백질로 번역되었다.

ECs로 분화를 유도하기 위하여, hMSCs를 2개의 다른 유형의 배지에서 배양하였으며, 이들의 특성을 특이적 항체를 이용하여 검사하였다(도 9 및 10). pVEGF와 복합체를 형성하거나 또는 형성하지 않은 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 세포는 EC-관련 마커 Flk-1, CD34, CD133, VCAM-1, 혈관내피-카데린, CD146, 및 폰 빌란트 인자를 발현하였다. 중간엽 세포는 이들 인자를 발현하지 않았다.

(3) pDNA ( VEGF )-코팅된 아펠린 - 로딩된 PLGA NPs로 형질감염한 후 hMSCs에 의한 혈관 형성의 평가

pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 내재화에 따른 hMSCs에 의한 혈관 형성을 24시간에 걸쳐 공초점 레이저 현미경, RT-PCR, 및 웨스턴블롯 분석으로 모니터하였다(도 11). pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 내재화 및 매트리겔에서의 배양에 따라, hMSCs는 3시간째에 관상 구조(tubular structures)를 형성하기 시작했으며(도 11A, c), 9시간째에 단단한 관상 구조를 형성하기 시작하였다(도 11A, e). 이들 구조는 면역 조직학에 의한 혈관신생 인자에 대하여 명확하게 염색되었다. VEGF 단백질 발현은 매트리겔에서 1시간 동안 배양한 후 검출되었고, 24시간 동안 유지되었다(도 11A, h). 아펠린에 의하여 자극된 APJR은 또한 1시간째에 발현되었고, 24시간 동안 유지되었다(도 11A, h).

FACS 분석은 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 hMSCs에서 혈관신생-관련 인자 VEGF, VEGFR, APJR, PECAM-1, ANG-1, bFGF, Tie-2, 및 VCAM-1가 발현되었음을 보여주었다(도 10).

pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 hMSCs에서, VEGF, VEGFR, APJR, PECAM-1, ANG-1, bFGF, Tie-2, 및 VCAM-1를 포함한 혈관신생-관련 단백질이 또한 발현되며, 이는 매트리겔에서 관 형성(tubular formation) 형성을 야기하였다(도 11B & C).

pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 내재화한 hMSCs를 RT-PCR 및 웨스턴블롯 분석에 의하여 분석했다.

튜브 형성은 1시간째에 시작되었고, 24시간까지 계속되었다(도 11A). VEGF 및 VEGFR은 24시간째에 발현되었고(도 12), 또한 AJPR, PECAM-1, ANG-1, bFGF, Tie-2, 및 VCAM-1도 24시간째에 완전히 발현되었다(도 12). pVEGF를 지닌 PLGA NPs의 hMSCs에 의한 내재화를 FACS, 공초점 레이저 현미경, 및 웨스턴블롯 분석으로 조사하였다. PEI 또는 리포펙타민과 복합체를 형성한 pVEGF에 비하여, pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs가 hMSCs에 의하여 높게 내재화되었다(도 13, e). 공초점 레이저 현미경은 유사한 결과를 나타내었다(도 13, j). 웨스턴블롯 분석에서, VEGF 단백질 발현은, PEI 또는 리포펙타민과 복합체를 형성한 pVEGF로 처리된 세포에 비하여, pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 처리된 세포에서 더 높았다(도 12).

(4) 이식된 hMSCs의 검출 및 혈류의 증가

허혈성 뒷다리 마우스 모델(ischemic hind limb mouse model)의 손상부위에 형질감염된 hMSCs의 주사에 따라, 혈류 회복을 LDPI로 검출하였다(도 15A 및 B). pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 주사에 따라, 묶인 혈관에서의 혈류는 시간-의존적으로 증가되었다(도 15A, k-o). 대조적으로, PBS 또는 pDNA(GFP)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 주사한 마우스에서는, 주사 후 1 주간 손상 부위에서의 혈류는 개선되지 않았다. 또한, 허혈성 다리는 불충분한 혈류 때문에 떼어졌다(detached)(도 15A, c-e 및 h-j). pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs의 내재화에 따라, hMSCs는 허혈성 모델에서 혈관의 재구성을 도울 수 있었으며, 혈류를 증가시켜 다리 손실을 방지할 수 있었다(도 15B).

LPDI 분석은 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs의 이식에 따라, 허혈성 뒷다리 동물 모델에서 신혈관생성으로 인하여 증가된 혈류를 나타내었다(도 15C). 이식된 세포는 새로운 혈관을 생성시켜 혈류를 증가시켰으며, 이에 의해 다리 손실을 방지하였다. 새로운 혈관의 형성은 이들 세포의 주사 후 다리의 손실 없이 7주 동안 계속되었다(도 15C). 그러나, PBS 또는 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질전환된 hMSCs를 주사한 마우스에서는 주사 1 주째부터 허혈성 다리가 떼어졌다.

pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs의 주사는 주사 후 7주 동안 세포사멸 없이 새로운 혈관 형성을 증가시켰으며, 다리 구제(limb salvage)를 증가시켰다(도 15D). 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs의 주사가 다리 손실 및 발 세포사멸(foot apoptosis)를 감소시켰음에도 불구하고, 다리 구제는 관찰되지 않았다.

이식된 hMSCs에 의한 혈류의 회복을 LDPI에 의하여 검사하였다(도 15E). 대조 마우스에서, 상처 아래의 부위로 혈액은 흐르지 않았다(도 15E, a). 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs의 이식에 의하여 혈류가 증진되었음에도 불구하고, 혈액은 허혈성 다리로 흐르지 않았고, 결국 다리는 손실되었다(도 15E, b). pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs의 이식은 허혈 부위로의 혈류를 회복시켰다(도 15E, c).

혈관을 형성하는 VEGF의 능력을 확인하기 위하여, 다양한 형태의 pDNA(VEGF)-코팅된 벡터를 평가하였다. PEI와 복합체를 형성한 pVEGF의 주사는 빈약한 신혈관 형성을 유도했다(도 16 및 도 17). 리포펙타민과 복합체를 형성한 pVEGF의 주사는 낮은 수준의 ECs로의 hMSC 분화를 야기하였다(도 14 c, h, m, r, & w, 및 도 16 e & f). 그러나, 덱사메타손 또는 아펠린이 로딩된 pDNA(VEGF)-코팅된 PLGA NPs의 주사는 높은 수준의 ECs로의 hMSC 분화를 유도했다(도 14 d, i, n, s x, e, j, o, t, & y, 및 도 16 g, h & i, j 및 도 17).

(5) pDNA ( VEGF )-코팅된 아펠린 - 로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs를 주사한 허혈성 뒷다리 모델 마우스에서 신혈관 형성

정상 및 허혈성 뒷다리 모델 마우스를 조직학적으로 평가하였다(도 18). 정상 마우스와는 대조적으로, 허혈성 뒷다리 모델 마우스의 다리는 떼어졌다(도 18B 및 C). 통상, 마우스 다리의 길이는 15 mm이다(도 18A). 정상 마우스 조직에서, 콜라겐은 조밀하며, 인간 핵은 검출되지 않는다(도 18A, a-3). PBS를 주사한 마우스에서는 허혈성 다리는 떼어졌다(도 18B 및 C). 잔여 조직의 길이는 2 mm(도 18B) 및 5 mm (도 18C)이었고, 인간 핵은 관찰되지 않았다(도 18B 및 C, b-3, c-5, 및 c-6). 대조적으로, pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs를 주사한 허혈성 뒷다리 모델 마우스는 정상적인 외관을 가졌고(도 18D), 다리의 길이도 정상이었다. 콜라겐(도 18D d-1 및 d-2) 및 인간 핵(도 18D, d-5 및 d-6)이 손상의 상부 및 하부 부위에서 검출되었다.

pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs를 주사한 마우스의 다리는 정상적인 마우스와 거의 동일하였다(도 19). 그러나, PEI- 또는 리포펙타민-복합체형성된 pVEGF로 형질감염된 hMSCs의 주사에 의해서는 혈관 형성이 회복되지 않았다.

(6) pDNA ( VEGF )-코팅된 아펠린 - 로딩된 PLGA NPs로 형질감염된 hMSCs를 주사한 마우스에서 혈관생성-관련 마커의 발현

pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 주사한 마우스에서 신혈관 형성을 확인하기 위하여, EC-관련 단백질 VEGF, VEGFR, PECAM-1, ANG-1, APJR, bFGF, Tie-2, 및 VCAM-1을 면역형광 분석에 의하여 평가하였다(도 20). 아펠린 및 VEGF 표지는 정상 조직에서보다 이들 PLGA NPs로 처리한 마우스의 조직에서 훨씬 강했다(도 20A 및 D). PECAM-1, ANG-1, APJR, bFGF, Tie-2, 및 VCAM-1은 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 주사한 손상 부위에서 높게 검출되었다(도 20H, L, 및 P). 상기한 단백질의 발현은 PEI 또는 리포펙타민과 복합체를 형성한 pVEGF를 주사한 마우스에서보다 pDNA(VEGF)-코팅된 아펠린-로딩된 PLGA NPs를 주사한 마우스에서 더 높았다(도 21).

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Stem cells for transplantation and pharmaceutical composition for inducing or facilitating angiogenesis comprising the same <130> PN0767 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Met Pro Leu Pro Asp Gly Asn 20 25 30 Gly Leu Glu Asp Gly Asn Val Arg His Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser 35 40 45 Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg 50 55 60 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 65 70 75 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apelin peptide <400> 2 Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro 1 5 10 15 Met Pro Phe <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apelin peptide <400> 3 Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro 1 5 10 15 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240 cttgaatcgg gccgacggct tggggagatt gctctacttc cccaaatcac tgtggatttt 300 ggaaaccagc agaaagagga aagaggtagc aagagctcca gagagaagtc gaggaagaga 360 gagacggggt cagagagagc gcgcgggcgt gcgagcagcg aaagcgacag gggcaaagtg 420 agtgacctgc ttttgggggt gaccgccgga gcgcggcgtg agccctcccc cttgggatcc 480 cgcagctgac cagtcgcgct gacggacaga cagacagaca ccgcccccag ccccagctac 540 cacctcctcc ccggccggcg gcggacagtg gacgcggcgg cgagccgcgg gcaggggccg 600 gagcccgcgc ccggaggcgg ggtggagggg gtcggggctc gcggcgtcgc actgaaactt 660 ttcgtccaac ttctgggctg ttctcgcttc ggaggagccg tggtccgcgc gggggaagcc 720 gagccgagcg gagccgcgag aagtgctagc tcgggccggg aggagccgca gccggaggag 780 ggggaggagg aagaagagaa ggaagaggag agggggccgc agtggcgact cggcgctcgg 840 aagccgggct catggacggg tgaggcggcg gtgtgcgcag acagtgctcc agccgcgcgc 900 gctccccagg ccctggcccg ggcctcgggc cggggaggaa gagtagctcg ccgaggcgcc 960 gaggagagcg ggccgcccca cagcccgagc cggagaggga gcgcgagccg cgccggcccc 1020 ggtcgggcct ccgaaaccat gaactttctg ctgtcttggg tgcattggag ccttgccttg 1080 ctgctctacc tccaccatgc caagtggtcc caggctgcac ccatggcaga aggaggaggg 1140 cagaatcatc acgaagtggt gaagttcatg gatgtctatc agcgcagcta ctgccatcca 1200 atcgagaccc tggtggacat cttccaggag taccctgatg agatcgagta catcttcaag 1260 ccatcctgtg tgcccctgat gcgatgcggg ggctgctgca atgacgaggg cctggagtgt 1320 gtgcccactg aggagtccaa catcaccatg cagattatgc ggatcaaacc tcaccaaggc 1380 cagcacatag gagagatgag cttcctacag cacaacaaat gtgaatgcag accaaagaaa 1440 gatagagcaa gacaagaaaa aaaatcagtt cgaggaaagg gaaaggggca aaaacgaaag 1500 cgcaagaaat cccggtataa gtcctggagc gtatgtgaca agccgaggcg gtgagccggg 1560 caggaggaag gagcctccct cagggtttcg g 1591 <210> 9 <211> 576 <212> DNA <213> human <400> 9 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300 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cagcacatag gagagatgag cttcctacag cacaacaaat gtgaatgcag accaaagaaa 1440 gatagagcaa gacaagaaaa aaaatcagtt cgaggaaagg gaaaggggca aaaacgaaag 1500 cgcaagaaat cccggtataa gtcctggagc gttccctgtg ggccttgctc agagcggaga 1560 aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg 1620 cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg 1680 cggtgagccg ggcaggagga aggagcctcc ctcagggttt cgg 1723 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIII primer <400> 11 cacaagcttg ccaccatgaa ctttctgctg tctt 34 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XhoI primer <400> 12 catctcgagc cgcctcggct tgtcacatc 29 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gagtgctggg aaggactctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 actggttgtc tgccccatag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 acagactgga aatcctcggg 20 <210> 16 <211> 20 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<220> <223> Primer <400> 25 cgctgagtac gtcgtggagt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 atgatgttct ggagagcccc 20

Claims

폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체에 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 캡슐화하여 얻어진 캡슐화된-나노입자 상에 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자가 코팅된 VEGF-코팅된 아펠린-로딩된 나노입자로 줄기세포를 형질전환시켜 얻어진 이식용 줄기세포로서,
상기 코팅이 (i) 상기 캡슐화된-나노입자 상에 폴리에틸렌이민을 가하여 1차 코팅하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 생성물에 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자를 가하여 2차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체가 폴리락트산과 폴리글리콜산이 1 : 0.3 ∼ 1 의 몰비로 공중합된 공중합체인 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제2항에 있어서, 상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체가 폴리락트산과 폴리글리콜산이 1 : 1 의 몰비로 공중합된 공중합체인 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체가 10,000 Da ∼ 70,000 Da의 중량평균분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제4항에 있어서, 상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체가 33,000 Da의 중량평균분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드가 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제6항에 있어서, 상기 아펠린 펩타이드가 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 캡슐화가
(a) 상기 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체를 수-비혼화성 유기용매에 용해시켜 얻어진 용액과 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 수-혼화성 유기용매에 용해시켜 얻어진 용액을 혼합하여 에멀젼을 형성시키는 단계;
(b) 단계(a)에서 얻어진 에멀젼을 폴리(비닐알코올) 수용액과 혼합하여 혼합액을 얻는 단계;
(c) 단계(b)에서 얻어진 혼합액을 교반 및 증발시켜 상기 수-비혼화성 유기용매를 제거하는 단계; 및
(d) 단계(c)에서 얻어진 현탁액을 투석막을 사용하여 투석하여 비-캡슐화된 아펠린 단백질 또는 펩타이드를 제거하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 캡슐화가 캡슐화된-나노입자 1 mg에 대하여 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드가 5 ∼ 50 ㎍의 범위로 로딩되도록 수행되는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제9항에 있어서, 상기 캡슐화가 캡슐화된-나노입자 1 mg에 대하여 상기 아펠린 단백질 또는 펩타이드가 50 ㎍이 로딩되도록 수행되는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자가 서열번호 6 내지 10의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제11항에 있어서, 상기 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자가 서열번호 9의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
삭제
제1항에 있어서, 상기 1차 코팅이 상기 캡슐화된-나노입자 1 mg 에 대하여 폴리에틸렌이민을 0.5 ∼ 10 ㎍ 의 범위로 가함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 2차 코팅이 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 가함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 이식용 줄기세포.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이식용 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 이식용 약학 조성물.