KR102451565B1 - Prehydrated-type acellular skin substitute and method of making the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수화형태의 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 무세포화 공정을 통해 무세포 진피를 수득하며, 황화나트륨 용액에의 처리 및 생체유래 고분자 용액에의 침지를 통해 부드러운 특성이 부여된 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.The present invention relates to a cell-free skin substitute in a hydrated form and a method for manufacturing the same.
In the present invention, a cell-free dermis is obtained through a cell-free process excluding the use of surfactants and enzymes, and a cell-free skin substitute with soft properties is prepared through treatment with sodium sulfide solution and immersion in a bio-derived polymer solution can do.

Description

수화형태 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법{PREHYDRATED-TYPE ACELLULAR SKIN SUBSTITUTE AND METHOD OF MAKING THE SAME}Hydration-type cell-free skin substitute and manufacturing method thereof

본 발명은 수화형태의 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a cell-free skin substitute in a hydrated form and a method for manufacturing the same.

무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)란, 사람 내지 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질로서, 순수한 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM) 형태의 생체유래 피부대체재를 의미한다. 이러한 생체유래 피부대체재는 이식용 장기와는 달리 면역거부반응이 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있다. 사람유래 피부대체재와 동물유래 피부대체재의 이식 시 면역거부반응 정도의 차이가 있기도 하나, 일반적으로 사람유래 피부대체재가 생물학적 성능 및 안전성에 대해서 동물유래 피부대체재 보다 우수한 것으로 보고되어 있다. 다만, 사람유래 피부대체재는 사후 기증자로부터 피부조직을 기증받아야 하므로, 원료수급 면에서는 제한이 있을 수 있다. Acellular Dermal Matrix (ADM) is a dermal matrix obtained through acellularization technology from human or animal skin, and is a bio-derived skin substitute in the form of an Extracellular Matrix (ECM) composed of pure collagen and elastin. means These bio-derived skin substitutes are known to have a relatively low immune rejection response, unlike transplant organs. Although there is a difference in the degree of immune rejection during transplantation of human-derived skin substitutes and animal-derived skin substitutes, it is generally reported that human-derived skin substitutes are superior to animal-derived skin substitutes in terms of biological performance and safety. However, human-derived skin substitutes may have limitations in terms of the supply and demand of raw materials, as skin tissue must be donated from a donor after death.

반면, 수술을 요하는 대부분의 의료분과에서 사람 유래인 인체조직의 수요가 날로 증가하는 추세이고, 특히 피부에 관한 수요가 가파르게 상승 중이며, 원재료 및 인체조직 완제품의 수입의존도가 91.5%에 이르는 것으로 보고되었다. 건강보험심사평가원 자료에 따르면, 2016년 human ADM 국내시장(보험급여 기준, 비급여 제외) 규모는 단일품목으로 약 100~200 억원 정도로 추산되고 있다. 이러한 추세에 따라, 인공피부 또는 창상피복재 등의 의료기기 개발이 활발하게 이루어지고는 있으나, 실제 human ADM의 생물학적 성능을 뛰어넘을 만한 피부대체재는 아직까지 보고된 바 없다. 이러한 의료기기 피부대체재의 세계시장규모는 2016년 18억 달러 규모로 평가되고 있다.On the other hand, in most medical departments requiring surgery, the demand for human-derived human tissues is increasing day by day, and the demand for skin in particular is rising sharply. became According to data from the Health Insurance Review and Assessment Service, the size of the human ADM domestic market (insurance benefit standards, excluding non-benefits) in 2016 is estimated to be about 10-20 billion won as a single item. According to this trend, medical devices such as artificial skin or wound dressings are being actively developed, but no skin substitutes that can exceed the biological performance of actual human ADM have been reported yet. The size of the global market for skin substitutes for medical devices is estimated at $1.8 billion in 2016.

무세포 진피를 얻는 과정은 크게 2 단계로 알려져 있다. 1 단계는 준비된 피부 조직으로부터 표피층을 제거하는 단계로서, 표피층과 진피층을 분리한다. 피부의 표피층은 단백질 분해 효소를 이용하여 진피층과 분리시켜 제거할 수 있는데, 통상적으로 진피층과 표피층을 분리하는데 다양한 단백질 분해효소를 사용한다. 효소를 사용하는 경우, 사용 농도가 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으키게 된다. 또 다른 방법으로는 용액의 이온강도를 변화시켜 조직의 두 층을 분리하기도 하는데, 이 방법도 역시 이온강도와 처리시간, 처리온도 등의 조건에 따라 효율이 달라진다. 예를 들어, 1몰 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.The process of obtaining acellular dermis is known as two major steps. Step 1 is a step of removing the epidermal layer from the prepared skin tissue, and the epidermal layer and the dermal layer are separated. The epidermal layer of the skin can be removed by separating it from the dermal layer by using a proteolytic enzyme. In general, various proteolytic enzymes are used to separate the dermal layer and the epidermal layer. In the case of using an enzyme, if the concentration used is low or the treatment time is too short, the separation is not performed well, and if the concentration is high or the treatment time is too long, damage to cells or tissues occurs. Another method is to separate the two layers of tissue by changing the ionic strength of the solution. This method also has different efficiency depending on conditions such as ionic strength, treatment time, and treatment temperature. For example, the dermal layer and the epidermal layer can be separated by treatment with a sodium chloride solution of 1 mol or more at 37° C. for 14 to 32 hours.

2 단계는 1 단계의 표피층 분리 후, 진피층의 세포를 제거하는 단계이다. 면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막단백질에 의해 야기되는데, 세포를 제거하면 면역반응을 최소화할 수 있다. 상기 단계는 세포와 세포외기질과의 물리화학적 특성 차이를 이용하여 조직의 손상없이 세포만 선별적으로 제거하는 방법을 이용한다. 세포막의 주성분은 인지질로 여러 가지 계면활성제를 이용하면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 일반적으로 계면활성제로 소듐도데실설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤엑스-100, 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80, 노니데트피-10(NP-10), 노니데트피-40(NP-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다.Step 2 is a step of removing the cells of the dermal layer after the epidermal layer separation of step 1. The immune response is mainly caused by membrane proteins present in the cell membrane, and removal of the cells can minimize the immune response. The above step uses a method of selectively removing only cells without tissue damage by using the difference in physicochemical properties between the cells and the extracellular matrix. The main component of the cell membrane is phospholipids, and if various surfactants are used, cells can be removed without damage to the tissue. Generally, surfactants are ionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS), or Triton X-100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Nonidet P-10 (NP-10), Nonidet Nonionic surfactants such as P-40 (NP-40) and the like are used.

그러나, 무세포 진피를 얻기 위한 제조방법 중, 단백질 분해효소를 사용하는 방법은 진피층 자체를 손상시킬 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우, 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으켜 이식이 거부될 수도 있다. 또한, 일반적으로 사용되는 계면활성제를 이용한 무세포화 방법은 계면활성제의 잔류를 최소화 시키기 위해, 막대한 양의 세척 시간 및 비용 등을 투입해야 하는 단점이 있다. 뿐만 아니라, 계면활성제의 잔류 역시 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있다.However, among the manufacturing methods for obtaining acellular dermis, the method using a proteolytic enzyme may damage the dermal layer itself, and if the enzyme remains and is transplanted into the body, it may damage the original tissue of the patient and in severe cases It may cause an immune response, which may result in rejection of the transplant. In addition, the cell-free method using a commonly used surfactant has a disadvantage in that an enormous amount of washing time and cost must be input in order to minimize the residue of the surfactant. In addition, the residual surfactant can also cause cellular and tissue toxicity in the body.

따라서, 본 발명에서는 무세포 진피를 수득하는 새로운 방법으로써, 세척이 매우 용이한 염기성 수용액을 이용하여 무세포화 과정을 수행하는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명에서는 무세포화가 완료된 진피 조직에 물리적으로 부드러운 특성을 부여할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.Therefore, in the present invention, as a new method for obtaining acellular dermis, it is intended to provide a method of performing the cell-free process using a basic aqueous solution that is very easy to wash. In addition, in the present invention, it is an object of the present invention to provide a method capable of imparting physically soft properties to acellularized dermal tissue.

1. 한국등록특허 제10-0791502호1. Korean Patent No. 10-0791502

본 발명은 수화형태의 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a cell-free skin substitute in a hydrated form and a method for manufacturing the same.

더욱 상세하게는, 본 발명은 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 표피층/진피층 분리 및 무세포화 공정을 통해 얻어지는 무세포 진피를 제공하는 것을 목적으로 한다.More specifically, an object of the present invention is to provide a cell-free dermis obtained through epidermal/dermal layer separation and acellularization processes excluding the use of surfactants and enzymes.

또한, 본 발명은 무세포 진피의 체내 면역반응을 최소화하는 한편, 황화나트륨 용액의 처리 및 생체유래 고분자 용액에의 침지를 통해 물리적으로 부드러운 특성이 부여된 무세포화 피부대체재를 제공하는 것을 목적으로 한다. In addition, an object of the present invention is to provide a cell-free skin substitute with physically soft properties through treatment with sodium sulfide solution and immersion in a bio-derived polymer solution while minimizing the in vivo immune response of the cell-free dermis. .

본 발명은 a) 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계;The present invention comprises the steps of: a) removing a lipid component from a skin tissue;

b) 상기 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계;b) removing cells from the skin tissue from which the lipid component has been removed;

c) 상기 세포가 제거된 피부 조직을 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계; c) treating the skin tissue from which the cells have been removed with sodium sulfide solution;

d) 상기 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직을 환원하는 단계; 및 d) reducing the skin tissue treated with the sodium sulfide solution; and

e) 상기 환원된 피부 조직을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계를 포함하는 무세포화 피부대체재의 제조 방법을 제공한다. e) provides a method for producing a cell-free skin substitute comprising the step of immersing the reduced skin tissue in a bio-derived polymer solution to hydrate.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 무세포화 피부대체재를 제공한다. In addition, the present invention provides a cell-free skin substitute prepared by the above-described manufacturing method.

본 발명에서는 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 무세포화 공정을 통해 무세포 진피를 수득하며, 황화나트륨 용액의 처리 및 생체유래 고분자 용액에의 침지 공정을 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다. In the present invention, cell-free dermis is obtained through a cell-free process excluding the use of surfactants and enzymes, and a cell-free skin substitute can be prepared through treatment with sodium sulfide solution and immersion in a bio-derived polymer solution.

이러한 공정을 통해 제조되는 무세포화 피부대체재는 체내 면역반응을 최소화하는 한편, 상기 피부대체재에 물리적으로 부드러운 특성을 부여할 수 있다.The cell-free skin substitute manufactured through this process can minimize the immune response in the body, while providing the skin substitute with a physically soft property.

본 발명에 따른 무세포화 피부대체재는 체내 이식 후 지지체(scaffold)로 작용하여 이식자의 세포들이 이동하여 생장할 수 있는 생리적 공간으로 작용할 수 있다. 또한, 무세포화 피부대체재는 신혈관형성(angiogenesis)으로 시간이 흐름에 따라 이식자의 조직이 되므로, 손상된 조직의 수복 및 성형 용도의 피부대체재로 활용이 가능하다.The cell-free skin substitute according to the present invention can act as a scaffold after implantation in the body, and act as a physiological space in which the cells of the transplantee can move and grow. In addition, since the cell-free skin substitute becomes a transplant recipient's tissue over time due to angiogenesis, it can be used as a skin substitute for repair and cosmetic use of damaged tissue.

도 1은 탈지질 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 손상여부를 확인하기 위해 SEM으로 촬영한 결과를 나타낸다.
도 2는 탈세포 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 변형이나 손상을 확인하기 위해 SEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 모근 제거를 위해 황화나트륨(Na2S) 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 변형이나 손상이 없음을 TEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 탈지질 용액 처리 후 피부 조직에서 지방이 제거된 것을 Oil Red O 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 표피 및 세포가 제거된 것을 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색한 후 광학현미경 및 형광현미경에서 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 7은 황화나트륨 용액을 처리한 무세포 진피에서 털 및 모근이 제거된 것을 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 황화나트륨 용액 처리에 따른 무세포 진피의 유연성 증가를 압점 시험을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피의 유연성을 확인하기 위해, 본 발명의 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피와 타사 제품(생체유래 고분자 용액을 사용하지 않음)의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 황화나트륨 용액과 생체유래 고분자 용액의 사용에 따른 피부의 유연성을 확인하기 위해, 각 피부의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다.1 shows the results taken by SEM to check whether collagen fibers are damaged after treatment with a delipidation solution.
Figure 2 shows the results confirmed by SEM to confirm the deformation or damage of the collagen fibers after treatment with the decellularization solution.
3 shows the result of confirming by TEM that there is no deformation or damage to the collagen fibers after treatment with a sodium sulfide (Na 2 S) solution for hair root removal.
4 shows the results of confirming that fat was removed from the skin tissue after treatment with a delipidation solution through Oil Red O staining.
5 shows the results observed under an optical microscope and a fluorescence microscope after immunohistochemical staining and DAPI staining of the epidermis and cell nuclei, respectively, in order to confirm that the epidermis and cells are removed from the skin tissue after the decellularization solution treatment.
6 shows the results of DNA extraction and quantification from skin tissue after decellularization solution treatment.
7 shows the results of confirming that hair and hair roots are removed from the acellular dermis treated with sodium sulfide solution through H&E staining.
8 shows the results of confirming the increase in flexibility of the cell-free dermis according to the sodium sulfide solution treatment through a pressure point test.
Figure 9 is to confirm the flexibility of the cell-free dermis immersed in the bio-derived polymer solution, the tensile strength of the cell-free dermis immersed in the bio-derived polymer solution of the present invention and a third-party product (not using a bio-derived polymer solution) The measurement result is shown.
10 shows the results of measuring the tensile strength of each skin in order to confirm the flexibility of the skin according to the use of the sodium sulfide solution and the bio-derived polymer solution.

본 발명은 a) 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계;The present invention comprises the steps of: a) removing a lipid component from a skin tissue;

b) 상기 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계;b) removing cells from the skin tissue from which the lipid component has been removed;

c) 상기 세포가 제거된 피부 조직을 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계; c) treating the skin tissue from which the cells have been removed with sodium sulfide solution;

d) 상기 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직을 환원하는 단계; 및 d) reducing the skin tissue treated with the sodium sulfide solution; and

e) 상기 환원된 피부 조직을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계를 포함하는 무세포화 피부대체재의 제조 방법에 관한 것이다. e) relates to a method for producing a cell-free skin substitute comprising the step of immersing the reduced skin tissue in a bio-derived polymer solution to hydrate.

본 발명의 실시예에서는 피부 조직의 지방 제거 과정과 세포 제거 과정 중에 사용되는 시약에 의한 피부 조직의 변형 및 손상 정도를 확인하였으며, 무세포화 결과를 나타내었다. 또한, 황화나트륨(Na2S) 용액과 생체유래 고분자 용액을 이용하여 피부에 유연성을 제공한 결과를 확인하였다.In the embodiment of the present invention, the degree of deformation and damage of the skin tissue by the reagent used during the fat removal process and the cell removal process of the skin tissue was confirmed, and the result of cell-freezing was shown. In addition, the results of providing flexibility to the skin using a sodium sulfide (Na 2 S) solution and a bio-derived polymer solution were confirmed.

이하, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, a method for producing a cell-free skin substitute according to the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 무세포화 피부대체재는, 본 발명에 따른 제조 방법에 따라 피부 조직을 처리하여 제조된 생성물을 의미한다. 상기 무세포화 피부대체재는 무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)와 동일한 분야에서 사용될 수 있다. In the present invention, the cell-free skin substitute means a product prepared by treating skin tissue according to the manufacturing method according to the present invention. The cell-free skin substitute may be used in the same field as the acellular dermal matrix (ADM).

본 발명에서는 본 발명의 각 단계를 용이하게 구별하기 위하여, 단계 b)까지 수행한 후의 피부 조직을 무세포 진피로 표현하였으며, 단계 e)까지 수행한 후의 피부 조직을 무세포화 피부대체재로 표현하였다. In the present invention, in order to easily distinguish each step of the present invention, the skin tissue after performing up to step b) was expressed as acellular dermis, and the skin tissue after performing up to step e) was expressed as a cell-free skin substitute.

본 발명에서 피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류를 의미할 수 있다.In the present invention, the skin tissue may be allogeneic or heterogeneous skin tissue. The homogeneous refers to a human, and the heterogeneous refers to an animal other than a human, that is, a mammal such as a pig, a cow, or a horse.

즉, 본 발명에서는 동종 또는 이종 유래의 피부 조직을 사용하여 본 발명의 제조 방법에 따라 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.That is, in the present invention, a cell-free skin substitute can be manufactured according to the manufacturing method of the present invention using a skin tissue derived from allogeneic or heterogeneous skin.

본 발명에서는 단계 a)를 수행하기 전에 피부 조직을 전처리하는 단계(이하, 전처리 단계)를 추가로 수행할 수 있다. In the present invention, before performing step a), a step of pre-treating the skin tissue (hereinafter, pre-treatment step) may be additionally performed.

상기 전처리 단계는 피부 조직을 세척하는 단계; 스크래퍼(scrapper)를 사용하여 진피에 붙어있는 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질을 제거하는 단계; 및 가위와 핀셋을 사용하여 남아 있는 불필요한 조직을 제거하는 단계; 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. The pretreatment step may include washing the skin tissue; using a scraper to remove fascia tissue, adipose tissue and other foreign substances attached to the dermis; and removing the remaining unnecessary tissue using scissors and tweezers; It may include one or more steps of

일 구체예에서, 전처리 단계는 피부 조직에서 진피 부분이 보일 때까지 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질 등을 제거할 수 있다. In one embodiment, the pretreatment step may remove fascia tissue, adipose tissue, and other foreign substances from the skin tissue until the dermal portion is visible.

본 발명에서 단계 a)는 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계로, 피부 조직을 탈지방화할 수 있다. 상기 탈지방화(delipidation)는 피부 조직으로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.In the present invention, step a) is a step of removing the lipid component from the skin tissue, and the skin tissue may be de-fat. The delipidation means removing the lipid component from the skin tissue.

일 구체예에서, 탈지방화는 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 알코올로는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 또한, 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올(IPA) 및 헥산(Hexane)의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 20:80 내지 80:20일 수 있다. In one embodiment, delipidation may be performed using a delipidation solution. The delipidation solution may include a polar solvent, a non-polar solvent, or a mixed solvent thereof. Water, alcohol, or a mixed solution thereof may be used as the polar solvent, and methanol, ethanol or isopropyl alcohol may be used as the alcohol. In addition, as the non-polar solvent, hexane, heptane, octane, or a mixed solution thereof may be used. Specifically, in the present invention, a mixed solution of isopropyl alcohol (IPA) and hexane (Hexane) may be used as the delipidation solution. At this time, the mixing ratio of isopropyl alcohol and hexane may be 20:80 to 80:20.

상기 탈지질 용액의 처리 시간은 1 내지 8 시간일 수 있다. The treatment time of the delipidation solution may be 1 to 8 hours.

본 발명에서 단계 b)는 단계 a)에 의해 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계로, 피부 조직을 탈세포화할 수 있다. 탈세포화(decellularization)는 피부 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 헥산 등을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 탈지방화 및 탈지질화를 거친 피부 조직을 무세포 진피로 표현할 수 있다. In the present invention, step b) is a step of removing cells from the skin tissue from which the lipid component has been removed by step a), and the skin tissue can be decellularized. Decellularization refers to the removal of other cellular components other than the extracellular matrix from the skin tissue, for example, the nucleus, cell membrane, hexane, and the like. In the present invention, the skin tissue that has undergone delipidation and delipidation can be expressed as acellular dermis.

일 구체예에서, 탈세포화는 탈세포 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈세포 용액으로 염기성 용액을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 탈세포 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다. 종래에는 계면활성제 또는 효소를 사용하여 탈세포화를 수행하였다. 그러나, 효소를 사용하는 경우 진피층 자체에 손상을 줄 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으키는 문제가 있었다. 또한, 계면활성제를 사용하는 경우 상기 계면활성제의 잔류를 최소화시키기 위해 세척 작업이 필요하며, 계면활성제의 잔류는 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 탈세포화시 탈세포 용액을 사용하여 전술한 문제점을 해결할 수 있으며, 또한, 세포 독성이 없다는 장점을 가진다. In one embodiment, decellularization can be performed using a decellularization solution. A basic solution may be used as the decellularization solution, and specifically, at least one selected from the group consisting of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium carbonate, magnesium hydroxide, calcium hydroxide and ammonia may be used. In the present invention, sodium hydroxide (NaOH) may be used as the decellularization solution. Conventionally, decellularization was performed using a surfactant or enzyme. However, if the enzyme is used, it may damage the dermal layer itself, and if the enzyme remains and is transplanted into the body, it may damage the original tissue of the patient, and in severe cases, there is a problem of causing an immune response. In addition, when a surfactant is used, a washing operation is required to minimize the residue of the surfactant, and the residue of the surfactant may cause cell and tissue toxicity in the body. Therefore, in the present invention, the above-described problem can be solved by using a decellularization solution during decellularization, and also has the advantage that there is no cytotoxicity.

일 구체예에서, 탈세포 용액의 농도는 0.05 내지 0.5 M일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다. In one embodiment, the concentration of the decellularization solution may be 0.05 to 0.5 M. It is easy to remove the cells in the above concentration range.

또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 30 분 내지 10 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.Also, in one embodiment, the decellularization step may be performed for 30 minutes to 10 hours. Removal of cells in this time range is easy.

본 발명에서 단계 c)는 단계 b)에 의해 세포가 제거된 피부 조직, 즉, 무세포 진피를 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계이다. 상기 단계를 통해, 무세포 진피 중의 모근을 제거할 수 있으며, 또한 무세포 진피 및 최종 제조되는 무세포화 피부대체재에 유연성을 제공할 수 있다.In the present invention, step c) is a step of treating the skin tissue from which cells have been removed by step b), that is, the acellular dermis with sodium sulfide solution. Through the above step, it is possible to remove the hair root in the acellular dermis, and it is also possible to provide flexibility to the acellular dermis and the finally manufactured acellularized skin substitute.

일 구체예에서, 황화나트륨(Na2S) 용액에서 황화나트륨의 농도는 1 내지 7 중량%일 수 있다. In one embodiment, the concentration of sodium sulfide in the sodium sulfide (Na 2 S) solution may be 1 to 7% by weight.

일 구체예에서, 황화나트륨 용액의 함량은 피부 조직이 황화나트륨 용액에 침지될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서는 황화나트륨 용액을 피부 조직 부피 대비 1 내지 7 배의 부피로 사용할 수 있다.In one embodiment, the content of the sodium sulfide solution is not particularly limited as long as the skin tissue can be immersed in the sodium sulfide solution. In the present invention, the sodium sulfide solution may be used in an amount of 1 to 7 times the volume of the skin tissue.

일 구체예에서, 단계 c)는 60 내지 480 분 동안 수행될 수 있다. In one embodiment, step c) may be carried out for 60 to 480 minutes.

본 발명에서 단계 d)는 단계 c)에 의해 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직(무세포 진피)을 환원하는 단계이다. 단계 c)에서 사용된 황화나트륨에 의해 피부 조직은 산화된다. 따라서, 본 발명에서는 상기 환원 단계를 통해 산화된 조직을 중화할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 중성 pH를 가지는 피부대체재를 제공할 수 있으며, 또한 본 단계를 통해 피부 조직의 표백 효과 및 박테리아 제거 효과를 나타낼 수 있다. In the present invention, step d) is a step of reducing the skin tissue (acellular dermis) treated with the sodium sulfide solution by step c). The skin tissue is oxidized by the sodium sulfide used in step c). Therefore, in the present invention, it is possible to neutralize the oxidized tissue through the reduction step. Accordingly, the present invention can provide a skin substitute having a neutral pH, and can also exhibit the effect of bleaching the skin tissue and removing bacteria through this step.

상기 단계는 피부환원 처리 용액을 사용하여 수행할 수 있다. The above step may be performed using a skin reduction treatment solution.

일 구체예에서, 피부환원 처리 용액으로 과산화수소를 사용할 수 있으며, 1 내지 10% 과산화수소를 사용할 수 있다. In one embodiment, hydrogen peroxide may be used as the skin reduction treatment solution, and 1 to 10% hydrogen peroxide may be used.

일 구체예에서, 단계 d)는 1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. In one embodiment, step d) may be carried out for 1 to 24 hours.

본 발명에서 단계 e)는 단계 d)에 의해 환원된 피부 조직(무세포 진피)을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계이다. 상기 단계를 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있으며, 상기 피부대체재에 유연성을 부여할 수 있다. In the present invention, step e) is a step for hydration by immersing the skin tissue (acellular dermis) reduced by step d) in a bio-derived polymer solution. Through the above steps, a cell-free skin substitute can be prepared, and flexibility can be imparted to the skin substitute.

일 구체예에서, 생체유래 고분자 용액에서 생체유래 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin) 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. In one embodiment, the bio-derived polymer in the bio-derived polymer solution is hyaluronic acid, chitosan, collagen, decellularized extracellular matrix, fibrin/fibrinogen ), gelatin (gelatin) and hydroxyapatite (hydroxyapatite) may include one or more selected from the group consisting of.

일 구체예에서, 생체유래 고분자로 히알루론산을 사용할 수 있다. In one embodiment, hyaluronic acid may be used as the bio-derived polymer.

일 구체예에서, 생체유래 고분자 용액에서 상기 생체유래 고분자는 0.01 내지 5 중량%로 포함될 수 있다. In one embodiment, the bio-derived polymer may be included in an amount of 0.01 to 5 wt% in the bio-derived polymer solution.

일 구체예에서, 생체유래 고분자 용액의 함량은 무세포 진피가 생체유래 고분자 용액에 침지될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서는 생체유래 고분자 용액의 함량이 무세포 진피 부피 대비 1 내지 14 배의 부피로 사용할 수 있다. In one embodiment, the content of the bio-derived polymer solution is not particularly limited as long as the cell-free dermis can be immersed in the bio-derived polymer solution. In the present invention, the content of the bio-derived polymer solution can be used in a volume of 1 to 14 times the volume of the cell-free dermis.

일 구체예에서, 단계 e)는 6 내지 20 시간 동안 수행될 수 있다. In one embodiment, step e) may be performed for 6 to 20 hours.

또한, 본 발명에서는 단계 e)를 수행한 후, 포장 및 멸균하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. In addition, in the present invention, after performing step e), the step of packaging and sterilizing may be additionally performed.

일 구체예에서, 포장은 포장재에 무세포화 피부대체재와 함께 단계 e)에서 사용된 생체유래 고분자 용액을 첨가하는 방식으로 수행할 수 있다.In one embodiment, the packaging may be performed by adding the bio-derived polymer solution used in step e) together with the cell-free skin substitute to the packaging material.

일 구체예에서, 멸균은 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지 30 kGy일 수 있다.In one embodiment, sterilization may be performed by irradiating radiation, and the irradiation range of radiation may be 10 to 30 kGy.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 무세포화 피부대체재에 관한 것이다. In addition, the present invention relates to a cell-free skin substitute prepared by the above-described manufacturing method.

본 발명에 따른 제조 방법에 의해 제조된 무세포화 피부대체재는 체내 면역반응을 최소화할 수 있으며, 부드러운 특성을 가질 수 있다.The cell-free skin substitute prepared by the manufacturing method according to the present invention can minimize the immune response in the body and can have soft properties.

이러한 무세포화 피부대체재는 체내 이식 후 지지체(scaffold)로 작용하여 이식자의 세포들이 이동하여 생장할 수 있는 생리적 공간으로 작용할 수 있다. 또한, 무세포화 피부대체재는 신혈관형성(angiogenesis)으로 시간이 흐름에 따라 이식자의 조직이 되므로, 손상된 조직의 수복 및 성형 용도의 피부대체재로 활용이 가능하다.This cell-free skin substitute may act as a scaffold after implantation in the body, and act as a physiological space in which the cells of the transplantee can migrate and grow. In addition, since the cell-free skin substitute becomes a transplant recipient's tissue over time due to angiogenesis, it can be used as a skin substitute for repair and cosmetic use of damaged tissue.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다. The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples, and it will be understood by those skilled in the art that various changes, modifications, or applications are possible within the scope without departing from the technical matters derived from the matters described in the appended claims. will be.

실시예Example

실시예 1. 무세포화 피부대체재 제조 Example 1. Preparation of cell-free skin substitute

(1) 피부 전처리 과정(1) skin pretreatment process

피부 조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 준비하였다. Skin tissue (collected from a cadaver donated by a tissue bank for non-profit patient care) was prepared.

세척이 완료된 피부 조직을 멸균대에 올려 놓고 멸균된 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 진피에 붙어있는 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질 등을 진피 부분이 보일 때까지 제거하였다. 멸균된 스크래퍼를 이용하여 진피에 남아있는 지방을 최대한 제거하고 멸균된 가위와 핀셋을 이용하여 남아있는 불필요한 조직을 제거하였다. 멸균 증류수로 수회 세척하였다.The washed skin tissue was placed on a sterile table, and using a sterile scraper, the fascia tissue, adipose tissue, and other foreign substances attached to the dermis were removed until the dermis part was visible. Using a sterile scraper, the remaining fat in the dermis was removed as much as possible, and the remaining unnecessary tissue was removed using sterile scissors and tweezers. It was washed several times with sterile distilled water.

(2) 지방 제거 과정(2) fat removal process

IPA:Hexane의 혼합비가 2:8 내지 8:2가 되도록 혼합하여 탈지질 용액을 제조하였다. A delipidation solution was prepared by mixing IPA:Hexane in a mixing ratio of 2:8 to 8:2.

탈지질 용액 및 전처리된 피부 조직을 4L 광구병에 넣고, 상온에서 2시간, 150rpm 범위에서 교반하였다. 교반 진행 중 혹은 완료된 피부 조직은 꺼내어 스크래퍼로 지방을 물리적으로 제거하였다. 지방이 제거된 피부 조직을 증류수를 활용해 수회 세척한 후, 상온, 150rpm 범위에서 증류수를 사용해 2시간 동안 추가 교반 세척하여 잔여 탈지질 용액을 제거하였다.The delipidation solution and the pre-treated skin tissue were placed in a 4L wide-mouth bottle, and stirred at room temperature for 2 hours at 150 rpm. The skin tissue was removed during the stirring process or completed, and the fat was physically removed with a scraper. After washing the skin tissue from which fat has been removed using distilled water several times, the residual delipidation solution was removed by further stirring and washing for 2 hours using distilled water at room temperature and 150 rpm range.

(3) 세포 제거 과정(3) cell removal process

탈세포 용액으로 0.05 내지 0.5M NaOH 용액을 사용하였다. 0.05-0.5M NaOH solution was used as a decellularization solution.

탈세포 용액에 지방이 제거된 피부 조직을 넣고 상온에서 1 내지 6시간 동안 교반하였다. 교반이 완료된 피부 조직을 꺼내어 스크래퍼로 표피 및 잔해(debris) 등을 제거하였다. 표피 및 세포가 제거된 피부 조직은 증류수로 10회 세척하고, 증류수를 넣고 상온에서 150rpm 범위에서 1~6시간 교반 세척하였다(무세포 진피 제조). The skin tissue from which fat was removed was added to the decellularization solution and stirred at room temperature for 1 to 6 hours. The agitated skin tissue was taken out and the epidermis and debris were removed with a scraper. The skin tissue from which the epidermis and cells were removed was washed 10 times with distilled water, added distilled water, and washed with stirring at room temperature for 1 to 6 hours at 150 rpm (cell-free dermis preparation).

(4) 모근 제거 과정(4) hair root removal process

세포가 제거된 피부 재료, 즉, 무세포 진피를 1~7% Na2S 용액에 넣고 상온에서 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 교반이 완료된 후, 피부를 꺼내어 스크래퍼를 이용해 잔류 모근을 제거하였다. 증류수를 이용해 10회 이상 세척하고, 증류수를 넣고 상온에서 150rpm 범위에서 1~6시간 교반 세척하였다. The skin material from which cells were removed, that is, the cell-free dermis, was placed in a 1-7% Na 2 S solution and stirred at room temperature for 1 to 3 hours. After the agitation was completed, the skin was taken out and residual hair roots were removed using a scraper. It was washed more than 10 times with distilled water, and distilled water was added, and the mixture was stirred and washed at room temperature at 150 rpm for 1 to 6 hours.

(5) 피부 환원 과정(5) skin reduction process

피부환원 처리 용액으로 1~10% 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)를 사용하였다. 1-10% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was used as a skin reduction treatment solution.

모근이 제거된 무세포 진피를 피부환원 처리 용액에 넣고 상온에서 교반하며 환원시켰다. 환원이 완료된 무세포 진피를 증류수에 넣고 150 rpm 범위에서 교반하며 10회 이상 세척하였다.The cell-free dermis from which the hair root has been removed was placed in a skin reduction treatment solution and reduced with stirring at room temperature. The reduced cell-free dermis was placed in distilled water and washed at least 10 times while stirring at 150 rpm.

(6) 생체유래 고분자 용액 침지 과정 (6) Bio-derived polymer solution immersion process

생체유래 고분자 용액으로 히알루론산(HA)의 농도가 0.05 내지 0.5%가 되도록 조정한 생리식염수를 사용하였다. As a bio-derived polymer solution, physiological saline adjusted so that the concentration of hyaluronic acid (HA) was 0.05 to 0.5% was used.

생체유래 고분자 용액에 환원이 완료된 무세포 진피를 넣고 150 rpm 범위에서 12시간 이상 교반하며 HA가 무세포 진피에 침지되도록 하였다(무세포화 피부대체재 제조). The reduced cell-free dermis was added to the bio-derived polymer solution and stirred at 150 rpm for more than 12 hours so that HA was immersed in the cell-free dermis (manufactured as a cell-free skin substitute).

(7) 포장 및 멸균(7) Packaging and sterilization

세척이 완료된 무세포화 피부대체재에 생체유래 고분자 용액을 넣고 밀봉 포장하였다. 포장이 완료된 무세포화 피부대체재는 감마선 10 내지 30 kGy를 활용해 멸균을 진행하였다.A bio-derived polymer solution was added to the cell-free skin substitute that was washed and sealed and packaged. Cell-free skin substitutes that have been packaged were sterilized using gamma rays of 10 to 30 kGy.

실험예 1. 각 단계별 콜라겐 섬유의 손상 확인 Experimental Example 1. Confirmation of damage to collagen fibers at each stage

실시예 1의 각 단계 이후, 피부 조직의 콜라겐 섬유 손상을 확인하였다. After each step of Example 1, it was confirmed that the collagen fiber damage in the skin tissue.

(1) 지방 제거 과정 후의 콜라겐 섬유의 손상 확인(1) Confirmation of damage to collagen fibers after fat removal process

실시예 1의 (2) 지방 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직을 주사전자현미경(SEM)으로 촬영하였다. After the (2) fat removal process of Example 1 was performed, the skin tissue was photographed with a scanning electron microscope (SEM).

도 1은 탈지질 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 손상여부를 확인하기 위해 SEM으로 촬영한 결과를 나타낸다.1 shows the results taken by SEM to check whether collagen fibers are damaged after treatment with a delipidation solution.

도 1에 나타난 바와 같이, 탈지질 용액을 사용하여 지방 제거 과정을 거친 피부(IPA/Hexane)는 피부 원재료(raw skin)와 같이 조직의 변형이나 콜라겐 섬유의 손상이 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 1 , it can be confirmed that in the skin (IPA/Hexane), which has undergone the fat removal process using a delipidation solution, tissue deformation or damage to collagen fibers is not observed as in raw skin.

(2) 세포 제거 과정 후의 콜라겐 섬유의 손상 확인(2) Confirmation of damage to collagen fibers after cell removal process

실시예 1의 (3) 세포 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직을 SEM으로 촬영하였다. After performing the cell removal process of Example 1 (3), the skin tissue was photographed by SEM.

도 2는 탈세포 용액에 피부를 처리한 후, 콜라겐 섬유의 변형이나 손상을 확인하기 위해 SEM으로 확인한 결과를 나타낸다. Figure 2 shows the results of SEM to confirm the deformation or damage of collagen fibers after the skin is treated in the decellularization solution.

도 2에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)와 마찬가지로 탈세포 용액을 처리한 후의 피부(NaOH)에서도 조직의 변형이나 손상은 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 2 , it can be seen that no tissue deformation or damage was observed in the skin (NaOH) after the decellularization solution was treated like the raw skin.

즉, 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에 손상이 가해지지 않는다는 점을 확인할 수 있다. That is, it can be confirmed that the skin tissue is not damaged after the decellularization solution treatment.

(3) 모근 제거 과정 후의 콜라겐 섬유의 손상 확인(3) Confirmation of damage to collagen fibers after hair root removal process

실시예 1의 (4) 모근 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직(무세포 진피)을 투과전자현미경(TEM)으로 촬영하였다. After performing the (4) hair root removal process of Example 1, the skin tissue (cell-free dermis) was photographed with a transmission electron microscope (TEM).

도 3은 모근 제거 및 피부 유연성을 제공하기 위해 황화나트륨(Na2S)을 처리한 후 무세포 진피에서 콜라겐 섬유의 변형이나 손상이 없음을 TEM을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 3 shows the results of confirming through TEM that there is no deformation or damage of collagen fibers in the acellular dermis after treatment with sodium sulfide (Na 2 S) to remove hair roots and provide skin flexibility.

도 3에 나타난 바와 같이, 황화나트륨 처리 후 피부(Na2S)의 조직의 변형이나 손상은 관찰되지 않음을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 3 , it can be confirmed that no deformation or damage to the tissue of the skin (Na 2 S) is observed after sodium sulfide treatment.

실험예 2. 지방 제거 과정 후의 지방 제거 유무 확인 Experimental Example 2. Confirmation of fat removal after fat removal process

실시예 1의 (2) 지방 제거 과정을 수행한 후, Oil Red O 염색을 수행하여 지방 제거 유무를 확인하였다. After performing the fat removal process of Example 1 (2), Oil Red O staining was performed to confirm the presence or absence of fat removal.

구체적으로, (2) 지방 제거 과정이 완료된 후, Oil Red O 염색을 위해 피부 조직을 10% 포르말린으로 고정하였다. 고정이 완료된 후, OCT 블록을 제작하고, 염색을 위해 OCT 블록을 10 um 두께로 슬라이드를 제작하였다. 제작한 슬라이드를 자연 건조하여 잔여 수분을 완전히 제거하고, absolute propylene glycol을 5 분 동안 처리하였다. 따뜻한 Oil Red O 용액을 처리하여 60℃에서 10 분 동안 염색한 후, 85% propylene glycol 용액을 이용하여 5 분 동안 발현시킨 후, 증류수로 씻어내고 커버글라스(cover glass)로 마운팅하고 현미경으로 관찰하였다.Specifically, (2) after the fat removal process was completed, the skin tissue was fixed with 10% formalin for Oil Red O staining. After fixation was completed, an OCT block was prepared, and a slide was prepared using the OCT block with a thickness of 10 um for staining. The prepared slides were dried naturally to completely remove residual moisture and treated with absolute propylene glycol for 5 minutes. After treatment with a warm Oil Red O solution and dyeing at 60° C. for 10 minutes, expression was performed using 85% propylene glycol solution for 5 minutes, washed with distilled water, mounted with a cover glass, and observed under a microscope. .

도 4는 탈지질 용액 처리 후 지방이 제거된 것을 Oil Red O 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.4 shows the results of confirming that fat was removed after treatment with a delipidation solution through Oil Red O staining.

도 4에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에서는 지방이 붉게 염색된 것과 대비하여, 탈지질 용액을 사용하여 지방 제거 과정을 거친 피부(IPA/Hexane)에서는 붉게 염색된 부분이 보이지 않은 것을 확인할 수 있다.As shown in Figure 4, in contrast to the red dyed fat in the raw skin, it was confirmed that the red dyed portion was not seen in the skin (IPA/Hexane) that was subjected to the fat removal process using a delipidation solution. can

실험예 3. 세포 제거 과정 후의 세포의 유무 확인 Experimental Example 3. Confirmation of the presence of cells after the cell removal process

실시예 1의 (3) 세포 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직 내의 세포의 유무를 확인하였고, 또한, DNA를 정량하였다. After performing the cell removal process of Example 1 (3), the presence or absence of cells in the skin tissue was checked, and DNA was also quantified.

먼저, 피부 조직 내의 세포의 유무를 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색하였다. First, in order to confirm the presence or absence of cells in the skin tissue, the epidermis and cell nucleus were stained with immunohistochemistry and DAPI, respectively.

구체적으로, 면역조직화학염색을 진행하기 위해, (3) 세포 제거 과정이 완료된 피부 조직을 파라핀 블록으로 제작하여 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드에서 파라핀을 제거한 후, antigen retrivel을 진행하여 순차적으로 1차 및 2차 항원을 붙인 후 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. Specifically, in order to proceed with immunohistochemical staining, (3) the skin tissue from which the cell removal process was completed was fabricated with a paraffin block to prepare a slide. After removing paraffin from the prepared slide, antigen retrivel was performed to sequentially attach primary and secondary antigens, and then confirmed using an optical microscope.

또한, 세포의 유무를 확인하기 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포의 핵을 염색하였다. In addition, to check the presence or absence of cells, the nucleus of the cells was stained using 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).

도 5는 탈세포 용액 처리 후 피부에서 표피 및 세포가 제거된 것을 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색한 후 광학현미경 및 형광현미경에서 관찰한 결과를 나타낸다.5 shows the results observed under an optical microscope and a fluorescence microscope after immunohistochemical staining and DAPI staining of the epidermis and cell nuclei, respectively, in order to confirm that the epidermis and cells are removed from the skin after the decellularization solution treatment.

피부 원재료(Raw skin)에서 표피는 갈색으로 염색되며, 세포의 핵은 파란색으로 염색된다. 상기 도 5에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에는 파란색의 DAPI가 많이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 그와 반대로, 탈세포화 용액을 처리한 조직에서는 세포가 제거됨에 따라 파란색으로 발현되는 부분이 거의 나타나지 않은 것을 확인할 수 있다. 즉, 피부 원재료(Raw skin)에서 보이는 표피와 세포가 탈세포 용액 처리 이후(NaOH) 제거되었음을 확인할 수 있다. In raw skin, the epidermis is dyed brown, and the nucleus of the cell is dyed blue. As shown in FIG. 5 , it can be seen that a lot of blue DAPI is expressed in raw skin. On the contrary, it can be seen that, in the tissue treated with the decellularization solution, the part expressed in blue color is hardly displayed as the cells are removed. That is, it can be confirmed that the epidermis and cells seen in the raw skin are removed after the decellularization solution treatment (NaOH).

한편, DNA 정량하기 위해, (3) 세포 제거 과정이 완료된 피부 조직을 잘게 잘랐다. 상기 잘게 자른 피부 조직을 단백질 분해효소(protease K)로 처리하고 overnight 동안 56℃에서 가열하여 완전히 녹이고, 동량의 페놀(phenol)-클로로포름(chloroform)을 처리하였다. 4℃에서 원심분리한 후, 상층액을 수득하여 상층액의 1/10 부피의 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 100% 에탄올(ethanol)을 섞어 -20℃에서 30분 보관하였다. 이후, 원심분리를 이용하여 DNA 펠렛(pellet)을 제작하고 상층액을 버리고 70% 에탄올을 넣고 다시 원심분리하여 DNA pellet을 세척하여 순도 높은 DNA를 수득하였다. 에탄올을 모두 자연 건조한 후, 증류수에 녹이고 Nanodrop을 사용하여 DNA를 정량하였다.On the other hand, for DNA quantification, (3) the skin tissue after the cell removal process was completed was cut into small pieces. The chopped skin tissue was treated with protease K, and completely dissolved by heating at 56° C. overnight, and treated with the same amount of phenol-chloroform. After centrifugation at 4°C, a supernatant was obtained, mixed with 1/10 volume of sodium acetate and 100% ethanol of the supernatant, and stored at -20°C for 30 minutes. Thereafter, a DNA pellet was prepared using centrifugation, the supernatant was discarded, 70% ethanol was added, and the DNA pellet was washed again by centrifugation to obtain high-purity DNA. After all ethanol was dried naturally, it was dissolved in distilled water and DNA was quantified using Nanodrop.

도 6은 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타낸다. 6 shows the results of DNA extraction and quantification from skin tissue after decellularization solution treatment.

도 6에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에 비해 탈세포 용액을 처리한 후 피부에서 DNA의 양이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다. 즉, 탈세포 용액 처리 후 피부에서 세포가 제거된 것을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 6 , it can be seen that the amount of DNA in the skin is significantly reduced after treatment with the decellularization solution compared to raw skin. That is, it can be confirmed that the cells are removed from the skin after the decellularization solution treatment.

실험예 4. 모근 제거 과정 후의 모근 제거 유무 확인 Experimental Example 4. Confirmation of hair root removal after hair root removal process

실시예 1의 (4) 모근 제거 과정을 수행한 후, H&E 염색을 수행하여 모근 제거 유무를 확인하였다. After performing the (4) hair root removal process of Example 1, H&E staining was performed to confirm the presence or absence of hair root removal.

도 7은 황화나트륨 용액을 처리한 무세포 진피에서 털 및 모근이 제거된 것을 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.7 shows the results of confirming that hair and hair roots are removed from the acellular dermis treated with sodium sulfide solution through H&E staining.

도 7에 나타난 바와 같이, 황화나트륨 처리 후 모근이 제거되었음을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 7 , it can be confirmed that the hair roots are removed after sodium sulfide treatment.

실험예 5. 유연성 확인Experimental Example 5. Confirmation of flexibility

(1) 황화나트륨 용액의 처리에 따른 피부 조직의 유연성 확인(1) Confirmation of flexibility of skin tissue following treatment with sodium sulfide solution

황화나트륨 용액의 처리에 따른 무세포화 피부대체재의 유연성을 확인하기 위해 압점 시험을 진행하였다.A pressure point test was performed to confirm the flexibility of the cell-free skin substitute according to the treatment of sodium sulfide solution.

압전 시험은 황화나트륨 용액을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 피부 조직(피부대체재) 위에 동일한 무게의 추(50 g)를 올린 후, 눌린 정도 및 눌린 높이를 측정하는 방법으로 진행하였다. The piezoelectric test was conducted by placing a weight (50 g) of the same weight on the skin tissue (skin substitute) when sodium sulfide solution was used and when not using it, and then measuring the degree of pressure and the height of pressure.

이때, 황화나트륨 용액을 사용한 경우는 실시예 1의 (1) 피부 전처리 과정, (2) 지방 제거 과정, (3) 세포 제거 과정, (4) 모근 제거 과정 및 (5) 피부 환원 과정을 거친 피부 조직(피부대체재)를 의미하며, 황화나트륨 용액을 사용하지 않은 경우는 상기 과정 중 (4)를 수행하지 않은 것을 의미한다.At this time, when the sodium sulfide solution was used, the skin that had undergone (1) skin pretreatment process, (2) fat removal process, (3) cell removal process, (4) hair root removal process, and (5) skin reduction process of Example 1 It means tissue (skin substitute), and when sodium sulfide solution is not used, it means that (4) is not performed during the above process.

도 8은 황화나트륨 용액 처리에 따른 피부 조직의 유연성 증가를 압점 시험을 통해 확인한 결과를 나타낸다.8 shows the results of confirming the increase in the flexibility of the skin tissue according to the sodium sulfide solution treatment through a pressure point test.

도 8에 나타난 바와 같이, 황화나트륨 용액을 사용하지 않은 경우에 비해 사용한 경우 피부에서 단단한 정도가 확연히 감소하여 더 유연해지는 것을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 8 , when sodium sulfide solution is not used, it can be confirmed that the degree of firmness in the skin is significantly reduced and more flexible.

(2) 생체유래 고분자 용액에 침지 후의 피부 조직의 유연성 확인(2) Confirmation of flexibility of skin tissue after immersion in bio-derived polymer solution

실시예 1의 (6) 생체유래 고분자 용액 침지 과정을 수행한 후, 무세포 진피의 유연성을 확인하기 위해 인장강도를 측정하였다.After performing the (6) bio-derived polymer solution immersion process of Example 1, tensile strength was measured to confirm the flexibility of the cell-free dermis.

구체적으로, 인장강도는 직사각형으로 자른 피부 조직을 장비(Universal testing machine, UTM)의 지그(zig)로 조직의 양끝을 고정시킨 후, 지그 간의 거리를 늘리면서 피부 조직에 가해지는 힘을 측정하였다. 결과는 측정된 힘을 피부 조직의 단면적으로 나누어 정량화하였다.Specifically, the tensile strength measured the force applied to the skin tissue while increasing the distance between the jigs after fixing both ends of the tissue with a jig of a universal testing machine (UTM) for the skin tissue cut into a rectangle. The results were quantified by dividing the measured force by the cross-sectional area of the skin tissue.

도 9는 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피의 유연성을 확인하기 위해, 상기 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피와 타사 제품(DermACELL)의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다(5회 측정). Figure 9 shows the results of measuring the tensile strength of the cell-free dermis immersed in the bio-derived polymer solution and a third-party product (DermACELL) in order to confirm the flexibility of the cell-free dermis immersed in the bio-derived polymer solution (measured 5 times) ).

도 9에 나타난 바와 같이, 타사 제품에 비해 생체유래 고분자 용액에 침지한 경우 인장강도가 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 9 , it can be confirmed that the tensile strength is significantly reduced when immersed in a bio-derived polymer solution compared to other products.

또한, 생체유래 고분자 용액의 침지 시간에 대해서는, 짧은 시간(10 시간)에 비해 긴 시간(20 시간) 침지하였을 경우 인장강도가 더 감소하였으나 유의한 차이는 없었다.In addition, with respect to the immersion time of the bio-derived polymer solution, the tensile strength was further decreased when immersed for a long time (20 hours) compared to a short time (10 hours), but there was no significant difference.

이에 따라, 황화나트륨 용액과 생체유래 고분자 용액의 사용에 따른 유연 효과를 확인하였다. Accordingly, the softening effect of the use of sodium sulfide solution and bioderived polymer solution was confirmed.

도 10은 황화나트륨 용액과 생체유래 고분자 용액의 사용에 따른 피부의 유연성을 확인하기 위해 각 피부의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다.10 shows the results of measuring the tensile strength of each skin in order to confirm the flexibility of the skin according to the use of sodium sulfide solution and bio-derived polymer solution.

도 10에서는 각 용액(황화나트륨 용액만 사용한 그룹(ADM+Na2S), 생체유래 고분자 용액만 사용한 그룹(ADM+HA) 및 황화나트륨 용액 및 생체유래 고분자 용액을 함께 사용한 그룹(ADM+Na2S+HA)) 사용 조건별 무세포 진피에서 인장강도를 측정하였다.In Figure 10, each solution (a group using only sodium sulfide solution (ADM+Na 2 S), a group using only a bio-derived polymer solution (ADM+HA), and a group using a sodium sulfide solution and a bio-derived polymer solution together (ADM+Na 2 ) S+HA)) tensile strength was measured in the cell-free dermis for each use condition.

이때, 황화나트륨 용액 및 생체유래 고분자 용액을 함께 사용한 그룹(ADM+Na2S+HA)은 실시예 1의 (1) 내지 (6)을 수행하여 제조된 피부대체재를 의미하고, 황화나트륨 용액만 사용한 그룹(ADM+Na2S)은 상기 과정 중 (6) 생체유래 고분자 용액 침지 과정을 수행하지 않고 제조된 피부대체재를 의미하며, 생체유래 고분자 용액만 사용한 그룹(ADM+HA)은 상기 과정 중 (4) 모근 제거 과정을 수행하지 않고 제조된 피부대체재를 의미한다. At this time, the group (ADM+Na 2 S+HA) using the sodium sulfide solution and the bio-derived polymer solution together means a skin substitute prepared by performing (1) to (6) of Example 1, and only the sodium sulfide solution The group used (ADM+Na 2 S) refers to a skin substitute manufactured without performing (6) the bio-derived polymer solution immersion process during the above process, and the group using only the bio-derived polymer solution (ADM+HA) during the process (4) It refers to a skin substitute manufactured without performing the hair root removal process.

ADM+Na2S, ADM+HA 및 ADM+Na2S+HA 그룹은 무처리 그룹(ADM)에 비해 인장강도가 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 그 중 두 가지 용액을 함께 사용한 그룹에서 가장 낮은 인장강도를 보임으로써, 두 용액을 각각 사용하였을 때 보다 더 우수한 유연 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.It can be seen that the tensile strength of the ADM+Na 2 S, ADM+HA and ADM+Na 2 S+HA groups was significantly reduced compared to the untreated group (ADM). Among them, the group in which the two solutions were used together showed the lowest tensile strength, so it can be confirmed that the softening effect was better than when the two solutions were used separately.

Claims (10)

a) 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계;
b) 상기 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계;
c) 상기 세포가 제거된 피부 조직을 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계;
d) 상기 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직을 환원하는 단계; 및
e) 상기 환원된 피부 조직을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계;를 포함하고,
단계 c)에서 황화나트륨 용액의 처리 시간은 1 내지 5 시간이고,
단계 e)에서 생체유래 고분자 용액에의 침지 시간은 10 내지 20 시간인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
a) removing the lipid component from the skin tissue;
b) removing cells from the skin tissue from which the lipid component has been removed;
c) treating the skin tissue from which the cells have been removed with sodium sulfide solution;
d) reducing the skin tissue treated with the sodium sulfide solution; and
e) immersing the reduced skin tissue in a bio-derived polymer solution to hydrate;
the treatment time of the sodium sulfide solution in step c) is 1 to 5 hours,
In step e), the immersion time in the bio-derived polymer solution is 10 to 20 hours.
 제 1 항에 있어서,
피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직인 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
A method for producing a cell-free skin substitute, wherein the skin tissue is an allogeneic or heterogeneous skin tissue.
 제 1 항에 있어서,
단계 a)는 탈지질 용액을 사용하여 수행하며,
상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
Step a) is carried out using a delipidation solution,
The delipidation solution is a method for producing a cell-free skin substitute comprising a polar solvent, a non-polar solvent, or a mixed solvent thereof.
 제 1 항에 있어서,
단계 b)는 탈세포 용액을 사용하여 수행하며,
탈세포 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
Step b) is performed using a decellularization solution,
The decellularization solution is a method for producing a cell-free skin substitute comprising at least one selected from the group consisting of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium carbonate, magnesium hydroxide, calcium hydroxide and ammonia.
 제 1 항에 있어서,
단계 c)에서 황화나트륨 용액에서 황화나트륨의 농도는 1 내지 7 중량%인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
In step c), the concentration of sodium sulfide in the sodium sulfide solution is 1 to 7% by weight.
 제 1 항에 있어서,
단계 d)는 피부환원 처리 용액을 사용하여 수행하며,
상기 피부환원 처리 용액은 과산화수소인 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
Step d) is performed using a skin reduction treatment solution,
The method for producing a cell-free skin substitute that the skin reduction treatment solution is hydrogen peroxide.
 제 1 항에 있어서,
단계 e)에서 생체유래 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin) 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
In step e), the bio-derived polymer is hyaluronic acid, chitosan, collagen, decellularized extracellular matrix, fibrin/fibrinogen, gelatin. And hydroxyapatite (hydroxyapatite) method for producing a cell-free skin substitute comprising at least one selected from the group consisting of.
 제 1 항에 있어서,
단계 e)에서 생체유래 고분자 용액에서 생체유래 고분자의 함량은 0.01 내지 5 중량%인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
In step e), the content of the bio-derived polymer in the bio-derived polymer solution is 0.01 to 5 wt %, the method for producing a cell-free skin substitute.
 제 1 항에 있어서,
단계 e)를 수행한 후, 포장 및 멸균하는 단계를 추가로 수행하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
The method of claim 1,
After performing step e), a method for producing a cell-free skin substitute that further performs the steps of packaging and sterilization.
 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 무세포화 피부대체재.
A cell-free skin substitute manufactured by the manufacturing method according to claim 1 .
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