KR102442670B1 - 조발성 알츠하이머의 치료제 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법 - Google Patents
조발성 알츠하이머의 치료제 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
조발성 알츠하이머의 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용하여 알츠하이머 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 조방설 알츠하이머 증상에 대하여 재현성이 뛰어난 환자 유래 유도만능줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포가 알츠하이머 치료제에 대하여 높은 특이도 및 민감도를 가지는 바, 알츠하이머 치료제 개발에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
조발성 알츠하이머의 치료제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용하여 알츠하이머 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
조발성 알츠하이머의 경우, 기존 동물모델에서는 알츠하이머와 직접 관련된 병태생리학적 증상을 재현하기 어렵다는 본질적인 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 조발성 알츠하이머 환자가 가지는 것과 동일한 유전자 돌연변이를 가지는 마우스 모델임에도 인간에게서 나타나는 증상이 나타나지 않는 경우가 대부분이다. 따라서, 구축된 동물 모델을 이용한 치료제나 치료법 개발이 제한적인 문제점이 있다.
한편, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSC)는 역분화 과정을 재현한 것으로 재생 의학의 기반이 되고 있다. 또한, iPSC 기반 질병 모델링은 각 iPSC 라인이 환자마다 다르고 약물 치료 반응을 사람 치료 전에 정확하게 모니터링 할 수 있기 때문에 개인화 된 치료에 큰 잠재력을 가지고 있다. 따라서, 기존 동물 모델의 문제점을 해결하고, 조발성 알츠하이머의 병리학적 특징, 높은 생체 유사성 및 신약 스크리닝에 이용될 수 있는 iPSC 기반 치료제 스크리닝 모델을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포를 포함하는 조발성 알츠하이머 치료제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포를 이용하여 조발성 알츠하이머 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(early-onset Alzheimer’s disease patient-derived iPSC)를 포함하는 조발성 알츠하이머 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "조발성 알츠하이머(early-onset Alzheimer's disease)"는 65세 이하의 사람에게 나타나는 알츠하이머 병으로, 주로 30대, 40대 또는 50대의 나이에 알츠하이머병 증상이 나타나는 경향을 보이며, 심각한 인지장애 및 운동장애를 나타내고 모계 쪽으로 강한 가족력을 나타낸다. 또한, 상기 조발성 알츠하이머는 인간의 14번 염색체에 있는 프레세닐린-1(presenilin-1, PS-1) 유전자의 정상 유전자와 1개 이상의 염기가 치환된 것인 임의의 돌연변이 유전자일 수 있고, 2개 이상의 염기가 연속적 또는 비연속적으로 치환, 결실 또는 부가된 것인 돌연변이 유전자를 갖는 것일 수 있다. 일 실시예에서는 30대에 알츠하이머병 진단을 받은 환자의 임상적, 유전적 특성을 확인한 결과, 시공간 기능, 언어 기억 및 시각 기억 검사에서 심각한 손상을 나타내었으며 모계 쪽으로 가족력 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 환자의 유전자형을 확인한 결과, PS-1 말단으로부터 170번째 아미노산이 세린(serine, S)에서 페닐알라닌(phenylalanine, F)으로 치환(c.509C>T)된 돌연변이를 가지고 있으며, 아포지단백 E(apolipoprotein E, APOE) 유전자형이 ε3/ε3인 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 환자로부터 유래된 유도만능줄기세포에서 아밀로이드 베타(A
) 및 p-Tau을 높은 수준으로 발현함으로써 미토콘드리아의 수송에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 일 양상에 따른 조발성 알츠하이머는 PS1-S170F로 표시될 수 있으며, 미토콘드리아의 기능 장애에 의해 발생된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSC)"는 체세포 또는 이미 분화된 세포를 처리하여 만능분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 상기 유노만능줄기세포는 뇌, 심장, 관절, 골, 혈관, 위, 간, 피부, 신장, 연골, 장 신경, 췌장 또는 신경 세포 등으로 분화될 수 있다. 일 양상에 따른 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(PS1-S170F iPSC)는 조발성 알츠하이머를 가지고 있는 개체 또는 유전적으로 조발성 알츠하이머를 가지고 있을 것으로 추정되는 개체로부터 추출한 세포를 역분화시켜 제작한 유도만능줄기세포를 의미한다. 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 상기 유도만능줄기세포(PS1-S170F iPSC)로부터 분화된 신경 세포를 포함하는 것일 수 있다. 일 실시예에서는 조발성 알츠하이머 환자로부터 유래된 유도만능줄기세포를 미분화 단계 또는 신경세포로 분화시킬 경우, 조발성 알츠하이머의 아밀로이드베타(Amyloid beta, A
), p-Tau 등과 같은 바이오마커가 발현되는 것을 확인하였다. 일 구체예에 따른 유도만능줄기세포는 환자 유래 유도만능줄기세포를 포함하고 있으므로 알츠하이머 환자의 병리학적 특성을 잘 나타내어 높은 재현성을 가질 뿐만 아니라, 치료 전에 약물 치료 반응을 정확히 모니터링 할 수 있기 때문에 개인화된 의약품의 제조에 이용될 수 있다.
다른 양상은 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포를 이용하여 조발성 알츠하이머 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(early-onset Alzheimer’s disease patient-derived iPSC)를 배양하는 단계; 상기 배양된 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포에 피검 물질을 투여하는 단계; 상기 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포와 피검 화합물 또는 조성물을 미처리한 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포로부터 조발성 알츠하이머의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및 상기 바이오마커의 수준이 변화된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(early-onset Alzheimer’s disease patient-derived iPSC)를 배양하여 신경 세포로 분화시키는 단계; 상기 분화된 조발성 알츠하이머 환자 유래 신경 세포에 피검 물질을 투여하는 단계; 상기 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포와 피검 화합물 또는 조성물을 미처리한 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포로부터 조발성 알츠하이머의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및 상기 바이오마커의 수준이 변화된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 피검 물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 항체, 앱타머, 천연 추출물, 합성 화합물 등인 것일 수 있다. 상기 피검 물질은 BACE1 억제제(beta-site APP cleaving enzyme 1; BACE1) 계열의 치료제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, MK8931, AZD-3293, JNJ-54861911, E2609, CNP520 또는 LY288672 등인 것일 수 있다.
상기 바이오마커는 아밀로이드 베타(Amyloid beta, Aβ), p-Tau, Mfn1 (membrane proteins mitofusin 1), Mfn2 (membrane proteins mitofusin 2), DRP1 (dynamin-related protein 1), p62 (SQSTM1, sequestosome 1; cargo protein marker), Beclin1 (autophagosome membrane formation-related protein), LC3b (light chain 3; autophagosome formation marker) 등인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 Aβ, p-Tau, DRP1, p62, Beclin1 또는 LC3b의 발현이 피검 물질을 미처리한 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포에 비해 감소한 경우, 피검 물질을 알츠하이머 치료제로 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 Mfn1, 또는 Mfn2의 발현이 피검 물질을 미처리한 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포에 비해 증가한 경우, 피검 물질을 알츠하이머 치료제로 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 바이오마커 수준의 측정은 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블롯(western blot), 노던 블롯(northern blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis) 등의 방법으로 수행되는 것일 수 있다. 상기 선별된 피검 물질은 조발성 알츠하이머 바이오마커의 수준을 변화시킴으로써 알츠하이머의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
일 실시예에서는 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포를 신경 세포로 분화시킨 후, 상기 세포에 도네페질, 메만틴, 유데나필, 미르타자핀, 및 LY-2886721를 처리하여 LY-2886721을 처리할 경우, 조발성 알츠하이머의 바이오마커인 A
, 및 p-Tau의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 방법은 유도만능줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경 세포를 이용함으로써 조발성 알츠하이머 바이오마커의 발현을 변화시키는 피검 물질을 선별할 수 있는바, 조발성 알츠하이머 치료제를 스크리닝 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 조방설 알츠하이머 증상에 대하여 재현성이 뛰어난 환자 유래 유도만능줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경 세포를 이용한 것으로, 알츠하이머 치료제에 대하여 높은 특이도 및 민감도를 가지는 바, 알츠하이머 치료제 개발에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1a는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 가계도를 나타낸다.
도 1b는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 유전자형을 분석한 결과를 나타낸다.
도 1c는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 뇌 MRI 결과를 나타낸 사진이다.
도 1d는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 뇌의 FDG-PET 결과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC에서 발현하는 줄기세포 마커를 확인한 확인한 결과이다.
도 2b는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 일반 신경전구세포, 신경 마커 및 피질 신경 세포 마커를 확인한 확인한 결과이다.
도 2c 및 2d는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 기능적 특성을 확인한 결과이다.
도 3a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 분비하는 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 그래프이다.
도 3b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 Aβ 침전물의 발현을 나타낸다.
도 3c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 세포 내 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 그래프이다.
도 4a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 AT8을 면역세포 화학으로 분석한 결과를 나타난다.
도 4b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 AT8을 정량화한 그래프이다.
도 5a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 움직임을 Kymograph로 나타낸 결과이다.
도 5b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 전방 및 후방 속도의 평균을 나타낸 그래프이다.
도 5c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 미토콘드리아 융합 및 분열 관련 단백질을 확인한 결과이다.
도 6a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 LC3b, Tuj1 및 DAPI 발현을 나타낸 결과이다.
도 6b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 자가포식-관련 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 7a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용하여 알츠하이머 치료제를 스크리닝하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 7b는 LY2886721를 처리한 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 Aβ40, Aβ42 의 수준 및 Aβ42/ Aβ40의 비율을 측정한 그래프이다.
도 7c는 LY2886721를 처리한 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 p-Tau의 발현 수준 및 AT8/p-Tau 비율을 나타낸 결과이다.
도 8a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용한 알츠하이머 치료제의 민감도를 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 8b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 후, Aβ40 및 Aβ42 의 수준을 측정한 그래프이다.
도 8c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 후, p-Tau의 수준을 확인한 결과이다.
도 1b는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 유전자형을 분석한 결과를 나타낸다.
도 1c는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 뇌 MRI 결과를 나타낸 사진이다.
도 1d는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 뇌의 FDG-PET 결과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC에서 발현하는 줄기세포 마커를 확인한 확인한 결과이다.
도 2b는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 일반 신경전구세포, 신경 마커 및 피질 신경 세포 마커를 확인한 확인한 결과이다.
도 2c 및 2d는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 기능적 특성을 확인한 결과이다.
도 3a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 분비하는 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 그래프이다.
도 3b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 Aβ 침전물의 발현을 나타낸다.
도 3c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 세포 내 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 그래프이다.
도 4a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 AT8을 면역세포 화학으로 분석한 결과를 나타난다.
도 4b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 AT8을 정량화한 그래프이다.
도 5a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 움직임을 Kymograph로 나타낸 결과이다.
도 5b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 전방 및 후방 속도의 평균을 나타낸 그래프이다.
도 5c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 미토콘드리아 융합 및 분열 관련 단백질을 확인한 결과이다.
도 6a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 LC3b, Tuj1 및 DAPI 발현을 나타낸 결과이다.
도 6b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 자가포식-관련 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 7a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용하여 알츠하이머 치료제를 스크리닝하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 7b는 LY2886721를 처리한 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 Aβ40, Aβ42 의 수준 및 Aβ42/ Aβ40의 비율을 측정한 그래프이다.
도 7c는 LY2886721를 처리한 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 p-Tau의 발현 수준 및 AT8/p-Tau 비율을 나타낸 결과이다.
도 8a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용한 알츠하이머 치료제의 민감도를 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 8b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 후, Aβ40 및 Aβ42 의 수준을 측정한 그래프이다.
도 8c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 후, p-Tau의 수준을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 알츠하이머 환자의 특성 확인
국립 노화 연구소 알츠하이머 협회(National Institute on Aging-Alzheimer's Association)의 기준에 따라 알츠하이머로 진단 받은 한국인 남성(33세)을 대상으로 신경심리검사, 뇌 MRI 촬영 및 fluorodeoxyglucose (FDG)-PET를 수행하여 알츠하이머 환자의 특성을 확인하였다. 또한, 상기 남성의 혈액을 수득하여 프레세닐린-1(presenilin-1, PS-1)을 스크리닝한 후, 아포지단백 E(apolipoprotein E, APOE) 유전자형을 분석하였다. 이때, 건강한 72세 한국인 남성을 대조군으로 설정하였다.
신경검사 결과, 상기 환자는 좌측 운동완만증(bradykinesia)과 떨림 증상을 나타내었다. 또한, 신경심리검사 결과, 상기 환자는 간이정신상태 검사(Mini-mental state examination)에서 25점을 받았으며, 시공간 기능, 언어 기억 및 시각 기억 검사에서 심각한 손상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
도 1a는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 가계도를 나타낸다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자는 외가쪽으로 가족력 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 상기 환자의 어머니는 20세에 치매 진단을 받은 후, 29세에 사망하였고(Ⅱ-2) 이모는 30세에 치매 진단을 받았으며(Ⅱ-3), 외조부는 40세에 치매에 걸려 종종 기억을 잃은 것으로 확인되었다(Ⅰ-1).
도 1b는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 유전자형을 분석한 결과를 나타낸다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자는 PS1 유전자의 말단으로부터 170번째 아미노산이 세린(serine, S)에서 페닐알라닌(phenylalanine, F)으로 치환(c.509C>T)된 이형접합 돌연변이를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군의 APOE 유전자형이 ε3/ε4인 것과 비교하여, 알츠하이머 환자의 APOE 유전자형은 ε3/ε3인 것을 확인할 수 있었다.
도 1c는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 뇌 MRI 결과를 나타낸 사진이고, 도 1d는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 뇌의 FDG-PET 결과를 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 대조군의 뇌 MRI에서 유의한 위축이 나타나지 않는 것과 비교하여 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 뇌는 양측 정수리 부위에서 위축된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 대조군의 FDG-PET에서 뇌에 아밀로이드 침적이 나타나지 않는 것과 비교하여, 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자의 뇌에서는 양측 측두 정수리 부위에서 포도당의 저대사(hypometabolism)를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기 도 1a 내지 도 1d의 결과에 의할 때, 일 구체예에 따른 알츠하이머는 가족력이 강하게 나타나며, PS1-S170F 돌연변이를 가지는 조발성 알츠하이머인 것을 알 수 있다.
실시예 2. 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F 줄기세포 및 뉴런의 제조, 및 특성 확인
2-1. 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F 줄기세포 및 뉴런의 제조
상기 실시예 1의 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC)를 제조한 후, 12주 동안 추가로 배양하여 대뇌 피질 뉴런(cortical neuron)으로 분화시켰다. 구체적으로, Ficoll-PaqueTM PLUS 방법 (GE Healthcare)을 이용하여 상기 실시예 1의 조발성 알츠하이머 환자의 말초 혈액에서 단핵 세포(Mononuclear cell, MNC)를 분리하였다. 이후, 분리된 말초 혈액 유래 단핵세포(peripheral-derived MNC, PBMC)를 단핵구 배양액을 포함하는 배지에서 4일 동안 부유 배양한 후, 4개의 재프로그래밍 인자(OCT3/4, SOX2, cMYC, KLF4)를 발현하는 센다이 바이러스 벡터(Sendai virus vector, SeVdp) 302L로 형질감염 시켰다. iPSC를 생성하기 위하여, 상기 역분화된 세포의 개별 클론을 3개 이상 선별한 후, 그 중에서 가장 잘 성장하는 클론을 선택하였다. 이때, 대조군으로 건강한 72세 한국인 남성의 iPSC를 제조한 후, 동일한 실험을 수행하였다.
2-2. PS1-S170F iPSC 및 iPSC-유래 뉴런의 특성 확인
상기 실시예 2-1에서 제조한 iPSC 및 iPCS-유래 뉴런의 신경 분화 특성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 제조한 제조한 iPSC의 미분화 줄기세포 마커를 확인하기 위하여 면역세포화학 분석을 수행하였다. 또한, iPCS-유래 뉴런의 일반신경전구세포, 신경 마커 및 피질 신경 세포 마커의 발현 여부를 확인하기 위하여, 면역세포화학 분석을 수행하였다. 또한, iPSC-유래 뉴런의 패치 클램프(whole-cell patch clamp) 분석을 이용하여 기능적 특성을 확인하였다.
도 2a는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC에서 발현하는 줄기세포 마커를 확인한 확인한 결과이다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC는 대조군과 유사하게 OCT4, SOX2, SSEA4 및 TRA-81과 같은 미분화 유도만능줄기세포 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
도 2b는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 일반 신경전구세포, 신경 마커 및 피질 신경 세포 마커를 확인한 확인한 결과이다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 유사하게 Nestin, SOX2 및 Musashi와 같은 일반 신경전구세포, Tuj, 및 Map2와 같은 신경 마커를 발현하며, TBR1 및 CTIP2와 같은 피질 신경세포 마커를 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
도 2c 및 2d는 일 구체예에 따른 알츠하이머 환자 유래 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 기능적 특성을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 모든 분화된 뉴런은 분화 후 10~12주에 전류 클램프 모드의 자발적 반복 활동 전위(action potential, AP)를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 활동 전위, 나트륨 및 칼륨 전류의 진폭에 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 분화 경향성의 유의한 차이가 없으며, 분화된 뉴런이 뉴런 신호 반응을 생성하고 기능적 뉴런으로 성숙되었음을 알 수 있다.
실시예 3. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 아밀로이드 베타 수준 확인
3-1. 세포 외 아밀로이드 베타 수준 확인
일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 세포 외 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ) 수준을 확인하기 위하여 뉴런에서 분비된 배지 내의 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-2의 뉴런 세포 1 x 105개를 분화시키고, 4주, 6주, 8 주 및 10주 차에 최종 배지로 교환하여 48 시간 동안 배양한 후, 조건 배지를 수득하였다. 이후, Aβ40 및 Aβ42 수준을 ELISA를 이용하여 확인하였다.
도 3a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 분비하는 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 그래프이다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 실험 기간 동안 대조군 및 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 Aβ40 수준의 유의적인 차이가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Aβ42 수준의 경우, 대조군과 비교하여 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었으며, 특히 분화 후 4주 차에 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, Aβ42/Aβ40의 비율 역시 대조군과 비교하여 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 현저하게 높은 것(2배 이상)을 확인할 수 있었다.
3-2. 아밀로이드 베타 침전 수준 확인
일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 세포 외 아밀로이드 베타 침전 수준을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 분화시켰다. 이후, 분화 10주 차에 항-Aβ42 항체, Tuj1 및 DAPI로 공동염색하여, 면역세포화학 분석을 통하여 아밀로이드 베타를 검출하였다.
도 3b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 Aβ 침전물의 발현을 나타낸다.
그 결과, 3b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 세포외 Aβ 침전물이 상당한 것을 확인할 수 있었다.
3-3. 세포 내 아밀로이드 베타 수준 확인
일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 세포 내 아밀로이드 베타 수준을 확인하기 위하여 TBS-불용성/SDS-수용성 분획을 추출하여 불용성 Aβ 수준을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-2의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 상기 실시예 301과 동일한 방법으로 분화시킨 후, 분화 10주 차에 TBS-불용성/SDS-수용성 분획을 추출하였다. 이후, TBS-불용성/SDS-수용성 세포 내 Aβ40 및 Aβ42 수준을 ELISA를 이용하여 총 1 ㎍ 단백질을 측정하였다.
도 3c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 세포 내 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 그래프이다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 세포 내 Aβ40 및 Aβ42 수준이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, β42/Aβ40의 비율 역시 대조군과 비교하여 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 인산화-tau 수준 확인
성숙한 뉴런에서 tau 단백질을 일반적으로 축삭(exon)에서 수용성 형태로 존재한다. 그러나, 알츠하이머에서 tau 단백질은 과인산화 되어 인산화된 tau 단백질(phosphorylated tau, p-Tau)이 수상 돌기와 세포체에 비정상적으로 축적되어 있다. 이러한 결과를 바탕으로, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 p-Tau 단백질 수준을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 분화시켰다. 이후, 분화 10주 차에 AT8 (Ser202/Thr205가 인산화) 항체, MAP2 및 DAPI로 염색하여 면역세포 화학 분석을 수행하고, AT8 발현을 정량화 하였다. 또한, AT8 및 Tau5 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
도 4a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 AT8 발현의 면역세포 화학 분석 결과를 나타내고, 도 4b는 AT8 발현을 정량화한 그래프이다.
도 4c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 AT8 발현 및 AT8/Tau5의 비율을 분석한 결과를 나타낸다.
그 결과, 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 신경 돌기 및 신경세포체(soma)에서 AT8의 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 약 50 KDa에서 AT8의 밴드를 확인할 수 있으며, 대조군과 비교하여 AT8 발현량 및 AT8/Tau5의 비율이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 세포체에 인산화된 tau 단백질이 높은 수준으로 국한되어 있는 것을 알 수 있다.
실시예 5. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 미토콘드리아의 손상된 축삭 수송 및 미토콘드리아 융합 및 분열의 균형 확인
5-1. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 역동학 확인
최근 연구에 따른 높은 수준의 Aβ 및 p-Tau는 미토콘드리아의 축삭 수송을 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 이를 근거로, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 역동학을 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 분화시켰다. 이후, 분화 10주 차에 Mitotracker (Ds-Red)를 사용하여 살아있는 세포의 이미징을 수행하였다. 또한, 상기 미토콘드리아에 대한 Kymograph 분석을 KymographClear를 사용하여 수행하였으며, 미토콘드리아 속도의 정량화 분석은 KymographDirect를 사용하여 수행되었다.
그 결과, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 미토콘드리아의 움직임이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
도 5a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 움직임을 Kymograph로 나타낸 결과이다.
도 5b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 전방 및 후방 속도의 평균을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아는 대조군과 비교하여 전방 및 후방 속도 평균이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
5-2. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 미토콘드리아 융합 및 분열-관련 단백질의 균형 확인
미토콘드리아의 기능 장애는 알츠하이머의 주된 특성 중 하나이다. 한편, 미토콘드리아의 역동학은 지속적인 융합 및 분열 과정에 의해 결정되며, 이러한 과정은 융합 및 분열과 관련된 단백질의 균형에 의해 엄격하게 조절된다. 따라서, A
및 p-Tau 발현량의 변화가 미토콘드리아 기능에 끼치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 분화시켰다. 이후, 분화 10주 차에 미토콘드리아 융합 관련 단백질인 Mfn1 (membrane proteins mitofusin 1), Mfn2 (membrane proteins mitofusin 2)과 분열 관련 단백질인 DRP1 (dynamin-related protein 1) 및 Fis1 (mitochondrial fission 1 protein)의 발현 양상을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
도 5c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 미토콘드리아 융합 및 분열 관련 단백질을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 미토콘드리아 융합 관련 단백질인 Mfn1 및 Mfn2 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 미토콘드리아 분열 관련 단백질인 DRP1의 발현은 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 Aβ 및 p-Tau을 높은 수준으로 발현함으로써 미토콘드리아 융합 및 분열의 균형을 손상시키는 바, 미토콘드리아의 수송을 방해할 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 조발성 알츠하이머는 미토콘드리아의 기능 장애를 나타낼 수 있다.
실시예 6. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 자가포식 축적 확인
자가포식(autophagy)는 단백질과 세포 기관의 분해 경로에서 중요한 역할을 하기 때문에 신경세포 생존에 필수적이다. 알츠하이머에서는 자가포식 액포(autophagy vacuoles, AV)가 환자의 뇌 조직에 축적되기 때문에 자가포식의 결함이 나타나며, 이는 신경성 플라크(neuritic plaque) 및 섬유상(filamentous) tau의 존재와 관련이 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 자가포식의 비정상적인 축적을 통해 Aβ의 고발현 수준 및 p-Tau 생성과의 관계를 확인하였다. 구체적으로, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 분화시켰다. 이후, 분화 10주 차에 LC3b, Tuj1 및 DAPI 면역세포 화학 염색을 통해 자가포식의 축적을 확인하였다. 또한, Ub(Ubiquitin), p62 (SQSTM1, sequestosome 1; cargo protein marker), Beclin1 (autophagosome membrane formation-related protein), LC3b (light chain 3; autophagosome formation marker), LAMP1(lysosome-associated membrane protein1) 및 LAMP2을 포함한 자가포식-관련 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯 및 ELISA로 측정하였다.
도 6a는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런의 LC3b, Tuj1 및 DAPI 발현을 나타낸 결과이다.
도 6b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 발현하는 자가포식-관련 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 신경세포체 영역의 주위에서 LC3b의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 대조군과 비교하여 p62, Beclin1 및 LC3b의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나, LAMP1 및 LAMP2와 같은 리소좀 마커의 발현은 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 A LC3b-기반 자가포식 시스템이 활성화된 경우에도 Aβ42 및 p-Tau이 매우 높은 수준으로 발현하며, 이는 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런이 자가포식 관련 클리어런스(clearance) 시스템이 손상되었음을 의미한다.
실시예 7. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용한 알츠하이머 치료제 스크리닝
Aβ는 β-사이트 APP 절단 효소 1(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1) 및 γ-세크레타아제(secretase)의 순차적 절단에 의해 생성되므로, 상기 2가지 효소는 알츠하이머 치료제의 가장 중요한 표적으로 간주된다. 따라서, 상기 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런이 알츠하이머 치료제 스크리닝 모델로 적용 가능한지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 6주 동안 분화시킨 후, BACE1 억제제인 LY2886721 5μmol/L의 농도로 분화된 뉴런에 5일 동안 처리하였다(도 7a). 이후, 상기 약물이 처리된 뉴런에서 Aβ 및 p-Tau의 수준을 웨스턴 블롯 및 ELISA으로 확인하였다.
도 7b는 LY2886721를 처리한 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 Aβ40, Aβ42 의 수준 및 Aβ42/ Aβ40의 비율을 측정한 그래프이다.
도 7c는 LY2886721를 처리한 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에서 p-Tau의 발현 수준 및 AT8/p-Tau 비율을 나타낸 결과이다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 LY2886721의 처리 전과 비교하여 처리 후에 Aβ40, Aβ42 의 수준 및 Aβ42/ Aβ40의 비율이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 LY2886721의 처리 전과 비교하여 처리 후에 p-Tau의 수준이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 알츠하이머 치료제 스크리닝 모델로 이용할 수 있다.
실시예 8. PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용한 알츠하이머 치료제의 민감도 확인
일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런이 알츠하이머 치료제에 대한 민감도를 나타내는지 여부를 확인하였다. 도 8은 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 이용한 알츠하이머 치료제의 민감도를 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2-1의 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런을 6주 동안 분화시키고, 전체 치료(Full treatment) 그룹과 후기 치료 그룹(late treatment) 나누어 전체 치료 그룹에 대하여는 분화 기간 동안 하기 표 1의 치료제 후보 물질을 처리하였다. 또한, 후기 치료 그룹에 대하여는 분화 6주차 직후에, 동일한 방법으로 치료제 후보 물질을 처리하였다. 이후, 상기 약물이 처리된 각 그룹에 대하여 Aβ 및 p-Tau의 수준을 웨스턴 블롯 및 ELISA으로 확인하였다. 양성대조군으로는 아밀로이드 전구체 단백질의 돌연변이체인 APP-V715M 그룹을 사용하였다.
| 후보 물질 | 기능 | 농도 |
| 도네페질(Donepezil, Done) | 아세틸콜린에스터레이스 억제제 | 5μM |
| 메만틴(Memantine, Meman) | NMDA 수용제 작용제, NMDA 수용제 차단 | 5μM |
| 유데나필(Udenafil, Uden) | PDE5(phosphodiesterase type 5) 억제제 | 5μM |
| 미르타자핀(Mirtasapine, Mirt) | 피페라지노아제핀(Piperazinoazepine) 계열 약물의 항우울제 | 5μM |
| LY-2886721(LY) | BACE1 억제제 | 5μM |
도 8b는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 후, Aβ40 및 Aβ42 의 수준을 측정한 그래프이다.
도 8c는 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런에 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 후, p-Tau의 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 8b 및 8c에 나타낸 바와 같이, 메만틴, 유데나필 및 미르타자핀 처리군의 경우, Aβ40, Aβ42 및 p-Tau의 감소 수준이 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 도네페질 및 LY-2886721 처리군은 치료제 후보물질의 투여 시기에 관계 없이 Aβ40, Aβ42 및 p-Tau의 수준이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 LY-2886721 처리군에서 현저한 감소효과를 나타내었다.
즉, 일 구체예에 따른 PS1-S170F iPSC-유래 뉴런은 알츠하이머 치료제의 특정 후보 물질에 대하여 민감도를 나타내는 바, 치료제 스크리닝 모델로 적용 가능하다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(early-onset Alzheimer’s disease patient-derived iPSC)로부터 분화된 신경세포를 포함하는 조발성 알츠하이머 치료제 스크리닝용 조성물로서, 상기 조발성 알츠하이머는 프레세닐린-1(presenilin-1, PS-1) 유전자의 말단으로부터 170번째 아미노산이 세린(serine, S)에서 페닐알라닌(phenylalanine, F)으로 치환(c.509C>T)된 것인 조성물.
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- 조발성 알츠하이머 환자 유래 유도만능줄기세포(early-onset Alzheimer’s disease patient-derived iPSC)를 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계로서, 상기 조발성 알츠하이머는 프레세닐린-1(presenilin-1, PS-1) 유전자의 말단으로부터 170번째 아미노산이 세린(serine, S)에서 페닐알라닌(phenylalanine, F)으로 치환(c.509C>T)된 것인 단계;
상기 분화된 신경세포에 피검 물질을 투여하는 단계;
상기 피검 물질이 처리된 신경세포와 피검 물질을 미처리한 신경세포로부터 조발성 알츠하이머의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및
상기 바이오마커의 수준이 변화된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 조발성 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법. - 청구항 4에 있어서, 상기 피검 물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 합성 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조발성 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 바이오마커는 아밀로이드베타(Amyloid beta, Aβ), p-Tau, Mfn1 (membrane proteins mitofusin 1), Mfn2 (membrane proteins mitofusin 2), DRP1 (dynamin-related protein 1), p62 (SQSTM1, sequestosome 1; cargo protein marker), Beclin1 (autophagosome membrane formation-related protein), LC3b (light chain 3; autophagosome formation marker)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조발성 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 바이오마커 수준의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블롯(western blot), 노던 블롯(northern blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것인 조발성 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법.
- 삭제
- 청구항 6에 있어서, 상기 Aβ, p-Tau, DRP1, p62, Beclin1 또는 LC3b의 발현이 피검 물질을 미처리한 신경세포에 비해 감소한 경우, 피검 물질을 알츠하이머 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조발성 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 Mfn1, 또는 Mfn2의 발현이 피검 물질을 미처리한 신경세포에 비해 증가한 경우, 피검 물질을 알츠하이머 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조발성 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116612833A (zh) * | 2023-06-19 | 2023-08-18 | 江西德上制药股份有限公司 | 一种智能筛选治疗阿尔茨海默病的中药活性成分的方法 |
| RU2821890C1 (ru) * | 2023-11-03 | 2024-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "А-БиоМаркер" | Способ диагностики или определения риска развития когнитивного нарушения |
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| RU2821893C1 (ru) * | 2023-11-03 | 2024-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "А-БиоМаркер" | Способ дифференциальной прижизненной диагностики болезни альцгеймера |
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