KR102435331B1 - Biomarker composition for diagnosis of asthma containing HOOK2 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천식 진단용 바이오마커 HOOK2(hook microtubule-tethering protein 2)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 천식 진단용 바이오마커 HOOK2는 흡연량, 기도 과민성 및 염증과 깊은 연관성이 있다. 이는 본 발명의 천식 진단용 바이오마커 HOOK2가 천식의 진단 및 병리학적 상태를 예측할 수 있음을 의미하는바, 천식의 진단 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.The present invention relates to a biomarker HOOK2 (hook microtubule-tethering protein 2) for diagnosing asthma. The biomarker HOOK2 for diagnosing asthma according to the present invention is closely related to the amount of smoking, airway hypersensitivity and inflammation. This means that the biomarker HOOK2 for diagnosing asthma of the present invention can predict the diagnosis and pathological state of asthma, and thus can be variously used in the field of diagnosis and treatment of asthma.

Description

HOOK2를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for diagnosis of asthma containing HOOK2}Biomarker composition for diagnosis of asthma containing HOOK2

본 발명은 천식 진단용 바이오마커 HOOK2(hook microtubule-tethering protein 2)에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker HOOK2 (hook microtubule-tethering protein 2) for diagnosing asthma.

천식은 여러 자극에 대한 기도의 과민반응에 의해 기침, 호흡곤란, 천명음의 주증상이 나타나며, 조절되지 못하는 경우는 응급진료와 입원을 요하게 되는 만성염증성 기도질환이다. 천식의 원인은 유전적 소인과 꽃가루, 집 먼지 진드기, 동물의 털, 호흡기 바이러스, 흡연, 대기오염, 식품 등의 환경적 요인 그리고 심리상태, 환경변화, 운동, 약물 등으로 알려져 있다. 천식은 세계 대부분의 지역에서 유병률이 5-10%에 달하고, 특히 우리나라는 정부가 천식질환에 대한 연구, 진료 및 관리에 중점적으로 지원함에도 불구하고 천식 유병률은 7.6%로 지속적으로 증가하고 있는 추세이다.Asthma is a chronic inflammatory airway disease characterized by coughing, shortness of breath, and wheezing due to hypersensitivity of the airways to various stimuli. The causes of asthma are known as genetic predisposition, environmental factors such as pollen, house dust mites, animal hair, respiratory viruses, smoking, air pollution, food, and psychological state, environmental change, exercise, and drugs. Asthma has a prevalence of 5-10% in most regions of the world, and in particular, in Korea, the prevalence of asthma continues to increase to 7.6% despite the government's intensive support for research, treatment and management of asthma disease. .

천식의 진단은 임상적 증상인 가역적인 기도 폐쇄(reversible airway obstruction); 병태생리학적인 증상인 기도 과민 반응(airway hyperresponsiveness); 및 조직병리학적 증상인 기도의 염증 소견(airway inflammation);을 관찰한다. 그러나 기도의 염증 소견을 증명하기 위해 모든 환자들을 대상으로 기관지경 검사를 시행하는 것은 어려운 실정이다. 이에, 임상에서는 가역적인 기도 폐쇄 및 기도 과민 반응의 증명만으로 확진을 내리고, 기도의 염증 소견을 간접적으로 증명하기 위해 여러 가지 혈액학적 검사들을 포함한 특수 검사들이 동원된다. 이에 보다 정확한 천식의 진단을 위한 검사 지표 등의 개발이 필요한 실정이다.Diagnosis of asthma includes clinical symptoms of reversible airway obstruction; airway hyperresponsiveness, a pathophysiological symptom; and histopathological symptom, airway inflammation. However, it is difficult to perform bronchoscopy in all patients to prove the inflammatory findings of the airways. Therefore, in clinical practice, the diagnosis is confirmed only by proof of reversible airway obstruction and airway hyperresponsiveness, and special tests including various hematological tests are mobilized to indirectly prove the airway inflammation. Accordingly, there is a need to develop test indicators for more accurate asthma diagnosis.

이에 본 발명자들은 천식의 진단을 위한 검사 지표에 대한 연구를 수행한 결과, 천식 환자에서 과발현되는 바이오마커 HOOK2를 발굴함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors completed the present invention by discovering the biomarker HOOK2 overexpressed in asthmatic patients as a result of conducting a study on the test index for the diagnosis of asthma.

본 발명의 다른 목적은 HOOK2 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing asthma comprising an agent for measuring the expression of HOOK2 or a gene encoding the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit comprising the composition for diagnosing asthma.

본 발명의 또 다른 목적은 천식 진단에 대한 정보 제공 방법 및 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information on asthma diagnosis and a screening method for a therapeutic agent for asthma.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HOOK2를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing asthma comprising HOOK2.

또한 본 발명은 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is HOOK2; Or a gene encoding it; provides a composition for diagnosing asthma comprising an agent for measuring the expression.

또한 본 발명은 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing asthma comprising the composition for diagnosing asthma.

또한 본 발명은 생물학적 시료에서 HOOK2 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 천식 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for providing information on asthma diagnosis, comprising measuring the expression of HOOK2 or a gene encoding the same in a biological sample.

또한 본 발명은 (a) 실험군으로서 생물학적 시료에 스크리닝하고자 하는 대상 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 실험군과 대상 물질을 처리하지 않은 대조군에서 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하여 비교하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계 비교 결과, 대조군과 비교하여 실험군에서 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 억제시키는 대상 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) treating a target material to be screened in a biological sample as an experimental group; (b) HOOK2 in the experimental group of step (a) and the control group not treated with the target substance; or a gene encoding it; measuring and comparing the expression of the; and (c) HOOK2 in the experimental group as compared to the control group as a result of step (b) comparison; Or a gene encoding it; selecting a target substance that inhibits the expression; provides a screening method for an asthma treatment comprising a.

본 발명에 따른 천식 진단용 바이오마커 HOOK2는 흡연량, 기도 과민성 및 염증과 깊은 연관성이 있다. 이는 본 발명의 천식 진단용 바이오마커 HOOK2가 천식의 진단 및 병리학적 상태를 예측할 수 있음을 의미하는바, 천식의 진단 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.The biomarker HOOK2 for diagnosing asthma according to the present invention is closely related to the amount of smoking, airway hypersensitivity and inflammation. This means that the biomarker HOOK2 for diagnosing asthma of the present invention can predict the diagnosis and pathological state of asthma, and thus can be variously used in the field of diagnosis and treatment of asthma.

도 1은 ELISA를 통해 발굴된 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 단백질 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 천식 진단용 바이오마커 HOOK2 및 흡연량의 연관성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3A는 급성 천식 마우스 모델의 제작 과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 3B는 급성 천식 마우스 모델의 기도 과민성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 3C는 기관지폐포세척액 내 세포 분석을 통해 급성 천식 마우스 모델의 염증 정도를 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 웨스턴 블롯팅을 통해 급성 천식 마우스 모델에서 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 단백질 발현량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 만성 천식 마우스 모델의 제작 과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 5B는 만성 천식 마우스 모델의 기도 과민성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5C는 기관지폐포세척액 내 세포 분석을 통해 만성 천식 마우스 모델의 염증 정도를 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 웨스턴 블롯팅을 통해 만성 천식 마우스 모델에서 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 단백질 발현량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of analyzing the protein expression of the asthma diagnostic biomarker HOOK2 discovered through ELISA.
2 is a diagram showing the results of analyzing the association between the asthma diagnosis biomarker HOOK2 and the amount of smoking according to the present invention.
3A is a diagram schematically illustrating the manufacturing process of an acute asthma mouse model.
3B is a diagram showing the results of evaluating airway hypersensitivity in an acute asthma mouse model.
Figure 3C is a diagram showing the results of evaluating the degree of inflammation in the acute asthma mouse model through the analysis of cells in the bronchoalveolar lavage fluid.
4 is a diagram showing the results of measuring the protein expression level of the asthma diagnostic biomarker HOOK2 in a mouse model of acute asthma through western blotting.
5A is a diagram schematically illustrating the manufacturing process of a chronic asthma mouse model.
5B is a diagram showing the results of evaluating airway hypersensitivity in a mouse model of chronic asthma.
5C is a diagram showing the results of evaluating the degree of inflammation in a mouse model of chronic asthma through analysis of cells in bronchoalveolar lavage fluid.
6 is a diagram showing the results of measuring the protein expression level of the asthma diagnostic biomarker HOOK2 in a mouse model of chronic asthma through western blotting.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 HOOK2를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing asthma comprising HOOK2.

본 발명에 있어서, HOOK2(hook microtubule-tethering protein 2)는 cytosolic coiled-coil protein으로, 미세소관에 부착되는 N-말단 도메인; 및 세포 기관에 대한 결합을 매개하는 C-말단 도메인;을 포함한다.In the present invention, HOOK2 (hook microtubule-tethering protein 2) is a cytosolic coiled-coil protein, comprising: an N-terminal domain attached to a microtubule; and a C-terminal domain that mediates binding to organelles.

본 발명에 있어서, 천식(asthma)은 특정한 유발 원인 물질에 노출되었을 때 기관지의 염증에 의해 기관지가 심하게 좁아져 기침, 천명, 호흡곤란, 가슴 답답함이 반복적으로 발생하는 질환이다. 천식은 알레르기 특성의 발현 여부에 따라 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식으로 나눌 수 있다.In the present invention, asthma is a disease in which cough, wheezing, shortness of breath, and chest tightness repeatedly occur due to severe narrowing of the bronchi due to inflammation of the bronchi when exposed to a specific triggering substance. Asthma can be divided into allergic asthma or non-allergic asthma according to the manifestation of allergic characteristics.

본 발명의 구체예에서, 상기 천식은 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the asthma may be allergic asthma or non-allergic asthma, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 발병 여부뿐만 아니라 예후, 천식의 경과, 병기 등의 모니터링에 필요한 객관적인 기초정보를 제공할 수 있으며, 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다. 본 발명의 목적상, 진단은 천식의 발병, 예후, 경과, 병기 상태 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.In the present invention, diagnosis means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. The diagnosis can provide objective basic information necessary for monitoring not only the onset of the disease, but also the prognosis, the progress of asthma, the stage, and the like, and the clinical judgment or opinion of the doctor is excluded. For the purposes of the present invention, diagnosis means ascertaining the onset, prognosis, course, staging or characteristics of asthma.

본 발명에 있어서, 바이오마커는 진단용 마커로도 쓰일 수 있으며, 생물학적 시료에서 천식의 발생 여부를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 시료에 비하여 천식 환자에서 채취한 시료에서 발현 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.In the present invention, the biomarker can also be used as a diagnostic marker, is a substance that can be diagnosed by distinguishing whether or not asthma occurs in a biological sample, and shows an increase or decrease in expression in a sample collected from an asthmatic patient compared to a normal sample. organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), and the like.

본 발명의 구체예에서, 상기 HOOK2는 혈액에서 과발현되는 것이 바람직하다.In an embodiment of the present invention, the HOOK2 is preferably overexpressed in blood.

본 발명의 실시예에서, 혈액 시료에서 HOOK2가 과발현된 천식 환자는 기도 과민성이 높고, 염증 정도가 증가된 것을 확인한바, 천식의 진단을 위한 바이오마커로 유용하게 활용될 수 있다.In an embodiment of the present invention, it was confirmed that asthma patients in which HOOK2 is overexpressed in a blood sample have high airway hypersensitivity and an increased degree of inflammation, which can be usefully used as a biomarker for diagnosing asthma.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention is HOOK2; Or a gene encoding it; provides a composition for diagnosing asthma comprising an agent for measuring the expression.

본 발명에 있어서, 상기 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제는 상기와 같이 천식 환자의 생물학적 시료에서 발현이 증가하는 마커인 HOOK2의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하여, 이의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.In the present invention, the HOOK2; Or a gene encoding it; an agent for measuring the expression of a marker by specifically binding to a protein or mRNA encoding the HOOK2 protein, which is a marker whose expression is increased in a biological sample of an asthma patient, as described above, and checking the expression level thereof. molecules that can be used for the detection of

본 발명의 구체예에서, 상기 발현을 측정하는 제제는 상기 HOOK2에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression is an oligopeptide that specifically binds to the HOOK2, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a ligand, PNA (Peptide nucleic acid) Or it may be an aptamer.

본 발명에 있어서, 항체는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 HOOK2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.In the present invention, an antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as a term known in the art. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to HOOK2, a marker of the present invention, and the antibody is a protein encoded by the marker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. can be obtained and prepared by a conventional method from the obtained protein. This also includes partial peptides that can be made from the protein. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and as long as it has polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding property, a part thereof is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibody of the present invention includes a special antibody such as a humanized antibody.

본 발명의 천식 진단용 바이오마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.The antibody used for the detection of the biomarker for diagnosis of asthma of the present invention includes a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.

본 발명의 구체예에서, 상기 발현을 측정하는 제제는 상기 HOOK2를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression may be an antisense oligonucleotide, a primer pair, or a probe that specifically binds to the gene encoding the HOOK2.

본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 구체적으로, HOOK2의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 천식을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, the primer is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group and can form a complementary template and base pair, and serves as a starting point for template strand copying. It means a short nucleic acid sequence that Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in appropriate buffers and temperatures. Specifically, by performing PCR amplification using the sense and antisense primers of the polynucleotide of HOOK2, asthma can be diagnosed based on whether a desired product is generated. PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.

본 발명에 있어서, 프로브는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, the probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to several bases to several hundred bases as long as possible to achieve specific binding to mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA. . The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution with one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoro amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for diagnosing asthma comprising the composition for diagnosing asthma.

본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit, but is not limited thereto.

상기 키트에는 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. The kit includes HOOK2; Or a gene encoding it; as well as an agent for measuring the expression, tools, reagents, etc. commonly used in the art used for immunological analysis may be included.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.Examples of the tool or reagent include, but are not limited to, a suitable carrier, a labeling material capable of generating a detectable signal, chromophores, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling material is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. The carrier includes a soluble carrier and an insoluble carrier, and an example of the soluble carrier is a physiologically acceptable buffer known in the art, for example, PBS, and an example of the insoluble carrier is polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, poly It may be acrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.

본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 앞서 설명한 천식 진단용 바이오마커 조성물을 더 포함할 수 있으며, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.In an embodiment of the present invention, the kit may further include the above-described biomarker composition for diagnosing asthma, and redundant descriptions thereof are omitted to avoid excessive complexity of the present specification.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료에서 HOOK2 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 천식 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for providing information on the diagnosis of asthma, comprising measuring the expression of HOOK2 or a gene encoding the same in a biological sample.

상기 진단에 대한 정보는 천식 환자에서 HOOK2의 발현에 대한 측정 정보이고, 본 발명의 목적상, HOOK2의 발현이 증가된 것으로 측정되는 경우 천식의 증상(즉, 폐기능 감소, 기도 과민성 증가, 염증 증가)이 있다는 것을 제시하며, 이를 기반으로 본 발명은 개체의 천식 발병 여부에 대한 정보를 제공한다.The diagnosis information is measurement information on the expression of HOOK2 in asthmatic patients, and for the purposes of the present invention, when the expression of HOOK2 is measured to be increased, symptoms of asthma (ie, decreased lung function, increased airway hypersensitivity, increased inflammation) ), and based on this, the present invention provides information on whether an individual has asthma.

본 발명에 있어서, HOOK2의 발현을 측정하는 것은 천식의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것이다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, measuring the expression of HOOK2 is a process of confirming the presence and level of expression of a protein expressed in a biological sample for the diagnosis of asthma. to check the quantity. Analysis methods for this include western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunoelectrolysis. Electrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS and protein chip, but are not limited thereto.

본 발명에 있어서, HOOK2를 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 것은 천식을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, measuring the expression of the gene encoding HOOK2 is a process of confirming the presence and expression level of mRNA of a biomarker gene for asthma diagnosis in a biological sample for diagnosing asthma, and can be determined by measuring the amount of mRNA. have. For this, analysis methods include RT-PCR, competitive RT-PCR (RT-PCR), real-time RT-PCR (RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting (Northern blotting). blotting) or a DNA chip, but is not limited thereto.

상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액 또는 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The biological sample may be blood, plasma, serum, urine, saliva or tissue, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 실험군으로서 생물학적 시료에 스크리닝하고자 하는 대상 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 실험군과 대상 물질을 처리하지 않은 대조군에서 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하여 비교하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계 비교 결과, 대조군과 비교하여 실험군에서 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 억제시키는 대상 물질을 선별하는 단계;를 포함한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a screening method for a therapeutic agent for asthma. The method comprises the steps of (a) treating a target material to be screened in a biological sample as an experimental group; (b) HOOK2 in the experimental group of step (a) and the control group not treated with the target substance; or a gene encoding it; measuring and comparing the expression of the; and (c) HOOK2 in the experimental group as compared to the control group as a result of step (b) comparison; or a gene encoding it; selecting a target substance that inhibits the expression.

상기 (c) 단계에서, 대상 물질이 실험군의 HOOK2; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 억제시키는 경우 이는 천식 치료제로서 선별될 수 있다.In step (c), the target substance is HOOK2 of the experimental group; Or, when the expression of a gene encoding it is suppressed, it may be selected as a therapeutic agent for asthma.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Duplicate content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not defined otherwise in the present specification have the meanings commonly used in the technical field to which the present invention pertains.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실험예 1. 급성 천식 마우스 모델 제작Experimental Example 1. Preparation of acute asthma mouse model

급성 천식 마우스 모델 제작 과정은 도 3A에 간략히 나타내었다. 구체적으로, BALB/c 마우스(암컷, 6주령)(Orient Bio, Seongnam, Korea)는 하이드록실 알루미늄 10 mg 및 D-PBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)에 유화된 grade V chicken egg OVA(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 50 μg를 0 일 및 14일에 복강 내 주사(intraperitoneal injection, IP)하여 감작시켰다. 21 내지 23 일에 모든 마우스는 grade III OVA(Sigma-Aldrich)(in D-PBS) 150 μg를 비강 내(intranasal, I.N) 투여하였다. 대조군 마우스는 OVA 대신 식염수(saline)를 투여하였다. 24일에, 기도 과민성(airway hyperresponsiveness, AHR)을 측정하였고, 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)을 수득하였다. 또한 마우스의 폐 조직으로부터 단백질을 수득하였다.The process of constructing an acute asthma mouse model is briefly shown in FIG. 3A . Specifically, BALB/c mice (female, 6 weeks old) (Orient Bio, Seongnam, Korea) were grade V chicken egg OVA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 50 μg was sensitized by intraperitoneal injection (IP) on days 0 and 14. On days 21-23, all mice were administered intranasal (IN) 150 μg of grade III OVA (Sigma-Aldrich) (in D-PBS). Control mice were administered saline instead of OVA. On day 24, airway hyperresponsiveness (AHR) was measured, and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was obtained. Proteins were also obtained from mouse lung tissue.

실험예 2. 만성 천식 마우스 모델 제작Experimental Example 2. Chronic asthma mouse model production

만성 천식 마우스 모델 제작 과정은 도 5A에 간략히 나타내었고, 만성 천식 마우스 모델은 희생일(33, 44, 및 80일)에 따라 세그룹으로 나누어 제작하였다.The chronic asthma mouse model production process is briefly shown in FIG. 5A, and the chronic asthma mouse model was divided into three groups according to the day of sacrifice (33, 44, and 80 days).

먼저, BALB/c 마우스(암컷, 6주령)(Orient Bio, Seongnam, Korea)는 하이드록실 알루미늄 10 mg 및 D-PBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)에 유화된 grade V chicken egg OVA(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 50 μg를 0 일 및 14일에 복강 내 주사(intraperitoneal injection, IP)하여 감작시켰다. 모든 마우스는 grade III OVA (Sigma-Aldrich)(in 50 μl D-PBS) 150 μg을 0, 14, 28, 29, 29, 30, 32일에 비강 내 투여하였다. 33일에 기도 과민성(airway hyperresponsiveness, AHR)을 측정하였고, 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)을 수득하였다. 또한 마우스의 폐 조직으로부터 단백질을 수득하였다.First, BALB/c mice (female, 6 weeks old) (Orient Bio, Seongnam, Korea) were treated with grade V chicken egg OVA (Sigma-Aldrich, St) emulsified in 10 mg of hydroxyl aluminum and D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline). Louis, MO) was sensitized by intraperitoneal injection (IP) of 50 μg on days 0 and 14. All mice were intranasally administered with 150 μg of grade III OVA (Sigma-Aldrich) (in 50 μl D-PBS) on days 0, 14, 28, 29, 29, 30, and 32. On day 33, airway hyperresponsiveness (AHR) was measured, and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was obtained. Proteins were also obtained from mouse lung tissue.

AHR이 확립된 나머지 마우스는 44일에 grade III OVA(Sigma-Aldrich) 150 μg을 비강 내 투여하였다. 45일에 AHR을 측정하였고, BALF를 수득하였다. 또한 마우스의 폐 조직으로부터 단백질을 수득하였다.The remaining mice with established AHR were intranasally administered 150 μg of grade III OVA (Sigma-Aldrich) on day 44. AHR was measured on day 45 and BALF was obtained. Proteins were also obtained from mouse lung tissue.

나머지 마우스는 52 내지 77일 기간 동안 grade III OVA(Sigma-Aldrich) 150 μg을 주 1회 간격으로 비강 내 투여하였고, 79일에 추가 투여하였다. 80일에 AHR을 측정하였고, BALF를 수득하였다. 또한 마우스의 폐 조직으로부터 단백질을 수득하였다.The remaining mice were intranasally administered with 150 μg of grade III OVA (Sigma-Aldrich) once a week for a period of 52 to 77 days, and additionally administered on day 79. AHR was measured at day 80 and BALF was obtained. Proteins were also obtained from mouse lung tissue.

실험예 3. 기도 과민성 평가Experimental Example 3. Airway hypersensitivity evaluation

기도 과민성 분석을 위해, 천식 마우스 모델을 tiletamine 및 xylazine(Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea)(2 mg/kg)를 투여하여 마취시켰고, 기도 과민성은 methacholine(Sigma-Aldrich)를 다양한 농도(0, 5, 20 또는 100 mg/ml)로 투여한 후 평가하였다.For airway hypersensitivity analysis, asthma mouse models were anesthetized by administering tiletamine and xylazine (Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea) (2 mg/kg). Concentrations (0, 5, 20 or 100 mg/ml) were administered and then evaluated.

실험예 4. 기관지폐포세척액 분석을 통한 염증 평가Experimental Example 4. Inflammation evaluation through bronchoalveolar lavage analysis

기관지폐포세척액을 원심분리한 후 상청액 취하여 -20℃에서 보관하였다. 또한 세포 펠릿은 세포 계수를 위해 재현탁하였고, 세포 분화를 위해 사이토스핀 슬라이드(cytospin slide)를 제작하였다(500 cells/mouse, Diff-Quick-staining). 포함된 전체 세포, 대식세포(macrophage), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil) 및 림프구(lymphocyte) 수를 측정하였다.After centrifugation of the bronchoalveolar lavage, the supernatant was collected and stored at -20°C. In addition, the cell pellet was resuspended for cell counting, and a cytospin slide was prepared for cell differentiation (500 cells/mouse, Diff-Quick-staining). Total cells included, macrophages, eosinophils, neutrophils and lymphocytes were counted.

실험예 5. 웨스턴 블롯팅Experimental Example 5. Western Blotting

폐 조직은 단백질 용해 버퍼(50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.5 mM EDTA 및 100mM PMSF in distilled water)에서 균질화하였고, 4℃에서 원심분리(14000 rpm, 30분)하여 단백질을 수득하였다. 마우스 폐 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, PVDF 멤브레인에 옮겼다. 마우스 폐 단백질이 트랜스퍼(transfer)된 멤브레인은 5% BSA(in 0.1% Tween 20 in TBS)로 실온에서 2시간 동안 블로킹한 후 세척하였다. 세척된 멤브레인에 1차 항체인 Rabbit anti-HOOK2 (1:1000, ABclonal, Massachusetts, USA)를 4℃에서 밤새도록 배양한 후 세척하였다. 세척된 멤브레인에 HRP-결합된 2차 항체를 처리하여 배양하였다. 배양 종료 후 단백질은 WEST-ZOL plus Western Blot Detection System(iNtRon, SungNam, Korea)을 사용하여 검출하였다. 단백질의 상대적인 양은 정량적 밀도 측정법으로 결정하였고, 베타-액틴(Sigma-Aldrich)으로 정규화하였다.Lung tissue was homogenized in protein lysis buffer (50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.5 mM EDTA and 100 mM PMSF in distilled water), and centrifuged at 4°C. (14000 rpm, 30 min) to obtain a protein. Mouse lung proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. The membrane to which the mouse lung protein was transferred was blocked with 5% BSA (in 0.1% Tween 20 in TBS) at room temperature for 2 hours and then washed. Rabbit anti-HOOK2 (1:1000, ABclonal, Massachusetts, USA), a primary antibody, was incubated overnight at 4° C. on the washed membrane, followed by washing. The washed membrane was incubated by treatment with HRP-conjugated secondary antibody. After completion of the culture, the protein was detected using WEST-ZOL plus Western Blot Detection System (iNtRon, SungNam, Korea). The relative amount of protein was determined by quantitative densitometry and normalized to beta-actin (Sigma-Aldrich).

실험예 6. ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)Experimental Example 6. ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)

혈장 내 HOOK2는 ELISA(Mybio, Minneapolis, MN)로 특정하였다. 다른 플레이트와 결과 비교를 위해 시험 시료의 흡광도(optical density, OD)는 각 키트에 제공된 양성 및 음성 대조군 샘플로 조정하였다. 또한 중복 웰의 평균 OD를 계산하였고, 각 혈장의 index value는 다음의 식으로 계산하였다.Plasma HOOK2 was characterized by ELISA (Mybio, Minneapolis, Minn.). For comparison of results with other plates, the optical density (OD) of the test sample was adjusted with the positive and negative control samples provided in each kit. In addition, the average OD of duplicate wells was calculated, and the index value of each plasma was calculated by the following equation.

index value = (시험된 혈장의 OD - 음성 대조군의 OD) / (양성 대조군의 OD - 음성 대조군의 OD) × 100index value = (OD of plasma tested - OD of negative control) / (OD of positive control - OD of negative control) × 100

실시예 1. 천식 진단용 바이오마커 발굴Example 1. Discovering biomarkers for diagnosing asthma

천식 진단을 위한 바이오마커 발굴을 위하여, 천식 환자 및 정상인의 혈장에서 단백질 수준을 ELISA로 분석하였다. 구체적으로, 본 실험은 정상군(control subject), 조절된 천식군(stable asthma) 및 악화된 천식군(exacerbated asthma)으로 나누어 진행하였고, 실험군에 대한 구체적인 내용은 다음과 같다.In order to discover biomarkers for the diagnosis of asthma, protein levels in plasma of asthmatic patients and normal persons were analyzed by ELISA. Specifically, this experiment was divided into a normal group (control subject), stable asthma group, and exacerbated asthma group, and the specific details of the experimental group are as follows.

- 정상군 : 천식 및 폐질환 확진을 받지 않은 그룹- Normal group: group without confirmed asthma or lung disease

- 조절된 천식군 : 천식으로 확진 받고, 폐기능 감소가 일어났으나 약물로 그 증상이 조절된 천식 환자 그룹- Controlled asthma group: A group of asthma patients who were diagnosed with asthma and had reduced lung function but whose symptoms were controlled with medications.

- 악화된 천식군 : 천식으로 확진 받고, 폐기능 감소 및 염증세포수가 증가한 천식 환자 그룹- Exacerbated asthma group: Asthma patient group with confirmed asthma, decreased lung function and increased number of inflammatory cells

상기 실험군의 혈장을 채취하여, 단백질 수준을 ELISA로 분석하였다.Plasma of the experimental group was collected, and protein levels were analyzed by ELISA.

그 결과, 조절된 천식군 및 악화된 천식군에서 단백질 수준이 유의하게 증가된 HOOK2를 발굴하였다.As a result, HOOK2 with significantly increased protein levels was discovered in the controlled asthma group and the exacerbated asthma group.

ELISA를 통해 정상 대조군, 조절된 천식군 및 악화된 천식군에서 HOOK2의 발현을 확인한 결과는 도 1에 나타내었다.The results of confirming the expression of HOOK2 in the normal control group, the controlled asthma group and the exacerbated asthma group through ELISA are shown in FIG. 1 .

도 1에 나타낸 바와 같이, HOOK2는 조절된 천식군 및 악화된 천식군에서 정상 대조군에 비해 유의하게 발현이 증가된 것을 확인하였다. As shown in FIG. 1 , it was confirmed that the expression of HOOK2 was significantly increased in the controlled asthma group and the exacerbated asthma group compared to the normal control group.

상기 ELISA 결과에 기초하여, 조절된 천식군 및 악화된 천식군을 대상으로 HOOK2의 발현 수준 및 흡연량의 연관성을 분석하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.Based on the ELISA results, the association between the expression level of HOOK2 and the amount of smoking was analyzed in the controlled asthma group and the exacerbated asthma group, and the results are shown in FIG. 2 .

도 2에 나타낸 바와 같이, HOOK2의 발현 수준 및 흡연량은 연관성이 있으며, 이는 양의 상관관계를 보이는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 2 , it was confirmed that the expression level of HOOK2 and the amount of smoking were correlated, which showed a positive correlation.

실시예 2. 급성 천식 마우스 모델에서 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 발현Example 2. Expression of biomarker HOOK2 for diagnosing asthma in mouse model of acute asthma

2-1. 기도 과민성 평가2-1. Airway hypersensitivity assessment

급성 천식 마우스 모델에서 methacholine의 농도에 따른 기도 과민성을 평가하였다. 본 실험의 대조군(shame)은 모델 제작 시 식염수를 투여한 마우스이다. 기도 과민성 평가 결과는 도 3B에 나타내었다.Airway hypersensitivity according to the concentration of methacholine was evaluated in a mouse model of acute asthma. A control group (shame) in this experiment is a mouse administered with saline during model production. The results of airway hypersensitivity evaluation are shown in FIG. 3B .

도 3B에 나타낸 바와 같이, 급성 천식 마우스 모델은 대조군에 비해 기도 과민성이 높으며, 이는 methacholine의 농도에 의존적인 것을 확인하였다.As shown in FIG. 3B , the acute asthma mouse model had higher airway hypersensitivity than the control group, which was confirmed to be dependent on the concentration of methacholine.

2-2. 염증 평가2-2. Inflammation Assessment

기관지폐포세척액 내 세포 분석을 통해 급성 천식 마우스 모델의 염증 정도를 평가하였다. 본 실험의 대조군(shame)은 모델 제작 시 식염수를 투여한 마우스이다. 염증 평가 결과는 도 3C에 나타내었다.The degree of inflammation in the acute asthma mouse model was evaluated through cell analysis in bronchoalveolar lavage fluid. A control group (shame) in this experiment is a mouse administered with saline during model production. The inflammation evaluation results are shown in FIG. 3C .

도 3C에 나타낸 바와 같이, 급성 천식 마우스 모델은 기관지폐포세척액 내 세포가 대조군에 비해 많은 것을 확인하였다. 특히, 대식세포 및 호중구의 수가 많은 것을 확인하였다. 이는 급성 천식 마우스 모델에서 염증 정도가 대조군에 비해 현저히 증가되었음을 의미한다.As shown in FIG. 3C , it was confirmed that the acute asthma mouse model had more cells in the bronchoalveolar lavage fluid than the control group. In particular, it was confirmed that the number of macrophages and neutrophils was large. This means that the level of inflammation in the acute asthma mouse model was significantly increased compared to the control group.

2-3. HOOK2의 발현량 측정2-3. Measurement of expression level of HOOK2

급성 천식 마우스 모델에서 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 단백질 발현량을 측정하였다. 상기 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯팅으로 수행하였다. HOOK2 발현량 측정 결과는 도 4에 나타내었다.The protein expression level of the asthma diagnostic biomarker HOOK2 was measured in the acute asthma mouse model. The protein expression level was measured by Western blotting. HOOK2 expression level measurement results are shown in FIG. 4 .

도 4에 나타낸 바와 같이, 급성 천식 마우스 모델은 대조군에 비해 HOOK2가 2배 이상 고발현되는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 4 , it was confirmed that HOOK2 was expressed more than twice as high in the acute asthma mouse model as compared to the control group.

실시예 3. 만성 천식 마우스 모델에서 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 발현Example 3. Expression of HOOK2, a biomarker for diagnosing asthma in a mouse model of chronic asthma

3-1. 기도 과민성 평가3-1. Airway hypersensitivity assessment

만성 천식 마우스 모델에서 methacholine의 농도에 따른 기도 과민성을 평가하였다. 본 실험의 대조군(shame)은 모델 제작 시 식염수를 투여한 마우스이다. 기도 과민성 평가 결과는 도 5B에 나타내었다.Airway hypersensitivity according to the concentration of methacholine was evaluated in a mouse model of chronic asthma. A control group (shame) in this experiment is a mouse administered with saline during model production. The results of airway hypersensitivity evaluation are shown in FIG. 5B.

도 5B에 나타낸 바와 같이, 만성 천식 마우스 모델은 대조군에 비해 기도 과민성이 높으며, 이는 methacholine의 농도에 의존적인 것을 확인하였다. 또한 만성 천식 마우스 모델은 희생일이 빠를수록 기도 과민성이 높은 것을 확인하였다.As shown in FIG. 5B , the chronic asthma mouse model had higher airway hypersensitivity than the control group, which was confirmed to be dependent on the concentration of methacholine. In addition, the chronic asthma mouse model confirmed that the earlier the sacrifice date, the higher the airway hypersensitivity.

또한 만성 80일에 희생된 천식 마우스 모델은 33일에 희생된 것에 비해 기도 과민성이 낮은 것을 알 수 있다. 이는 알러젠에 장기간 노출 시 기도개형으로 인해 민감도가 떨어져 기도 과민성이 상대적으로 낮은 것으로 보인다.In addition, it can be seen that the asthma mouse model sacrificed on the 80th day had lower airway hypersensitivity compared to that sacrificed on the 33rd day. It seems that airway hypersensitivity is relatively low due to low sensitivity due to airway remodeling when exposed to allergens for a long time.

3-2. 염증 평가3-2. Inflammation Assessment

기관지폐포세척액 내 세포 분석을 통해 만성 천식 마우스 모델의 염증 정도를 평가하였다. 본 실험의 대조군(shame)은 모델 제작 시 식염수를 투여한 마우스이다. 염증 평가 결과는 도 5C에 나타내었다.The degree of inflammation in a mouse model of chronic asthma was evaluated through analysis of cells in bronchoalveolar lavage fluid. A control group (shame) in this experiment is a mouse administered with saline during model production. The inflammation evaluation result is shown in FIG. 5C.

도 5C에 나타낸 바와 같이, 만성 천식 마우스 모델은 기관지폐포세척액 내 세포가 대조군에 비해 많은 것을 확인하였다. 특히, 대식세포 및 호중구의 수가 많은 것을 확인하였다. 이는 만성 천식 마우스 모델에서 염증 정도가 대조군에 비해 현저히 증가되었음을 의미한다. 또한 만성 천식 마우스 모델은 희생일이 빠를수록 전체 세포, 대식세포 및 호산구의 수가 많은 것(즉, 염증 정도가 높은 것)을 확인하였다.As shown in FIG. 5C , it was confirmed that the chronic asthma mouse model had more cells in the bronchoalveolar lavage fluid than the control group. In particular, it was confirmed that the number of macrophages and neutrophils was large. This means that the level of inflammation in the chronic asthma mouse model was significantly increased compared to the control group. In addition, the chronic asthma mouse model confirmed that the earlier the sacrifice day, the greater the number of total cells, macrophages and eosinophils (that is, the higher the degree of inflammation).

또한 80일에 희생된 만성 천식 마우스 모델은 33일에 희생된 것에 비해 염증 정도가 낮은 것을 알 수 있다. 이는 알러젠에 장기간 노출 시 기도개형으로 인해 민감도가 떨어져 염증 정도가 상대적으로 낮은 것으로 보인다.In addition, it can be seen that the chronic asthma mouse model sacrificed on day 80 had a lower level of inflammation compared to that sacrificed on day 33. It seems that the degree of inflammation is relatively low due to decreased sensitivity due to airway remodeling when exposed to allergens for a long period of time.

3-3. HOOK2의 발현량 측정3-3. Measurement of expression level of HOOK2

만성 천식 마우스 모델(33일 및 80일)에서 천식 진단용 바이오마커 HOOK2의 단백질 발현량을 측정하였다. 상기 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯팅으로 수행하였다. HOOK2 발현량 측정 결과는 도 6에 나타내었다.The protein expression level of the asthma diagnostic biomarker HOOK2 was measured in the chronic asthma mouse model (33 days and 80 days). The protein expression level was measured by Western blotting. HOOK2 expression level measurement results are shown in FIG. 6 .

도 6에 나타낸 바와 같이, 만성 천식 마우스 모델은 대조군에 비해 HOOK2가 고발현되는 것을 확인하였다. 80일에 희생된 만성 천식 마우스 모델은 33일에 희생된 모델에 비해 HOOK2의 발현이 더 높은 것을 확인하였다.As shown in FIG. 6 , it was confirmed that HOOK2 was highly expressed in the chronic asthma mouse model compared to the control group. It was confirmed that the chronic asthma mouse model sacrificed on day 80 had a higher expression of HOOK2 compared to the model sacrificed on day 33.

종합적으로 본 발명자들은 천식 진단용 바이오마커로써 HOOK2를 발굴하고, 상기 바이오마커가 흡연량, 기도 과민성 및 염증과 깊은 연관성이 있음을 확인하였다. 이는 본 발명의 천식 진단용 바이오마커 HOOK2는 천식의 진단 및 병리학적 상태를 예측할 수 있음을 의미하는바, 천식의 진단 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.Overall, the present inventors discovered HOOK2 as a biomarker for diagnosing asthma, and confirmed that the biomarker is closely related to smoking amount, airway hypersensitivity and inflammation. This means that the biomarker HOOK2 for diagnosing asthma of the present invention can predict the diagnosis and pathological state of asthma, and thus can be variously used in the field of diagnosis and treatment of asthma.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. Above, specific parts of the present invention have been described in detail, for those of ordinary skill in the art, it is clear that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, it is intended that the substantial scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (10)

혈액 내 HOOK2(hook microtubule-tethering protein 2)의 발현을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물.A composition for diagnosing asthma, comprising an agent for measuring the expression of HOOK2 (hook microtubule-tethering protein 2) in blood. 제1항에 있어서,
상기 천식은 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식인, 천식 진단용 조성물.The method of claim 1,
The asthma is allergic asthma or non-allergic asthma, asthma diagnosis composition. 제1항에 있어서,
상기 HOOK2는 혈액에서 과발현되는 것인, 천식 진단용 조성물.The method of claim 1,
The HOOK2 is overexpressed in blood, asthma diagnosis composition. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 발현을 측정하는 제제는 상기 HOOK2에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인, 천식 진단용 조성물.The method of claim 1,
The agent for measuring the expression is an oligopeptide, monoclonal antibody, polyclonal antibody, chimeric antibody, ligand, PNA (Peptide nucleic acid) or aptamer that specifically binds to the HOOK2. , A composition for diagnosing asthma. 삭제delete 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 천식 진단용 키트.A kit for diagnosing asthma comprising the composition of any one of claims 1 to 3 and 5. 제7항에 있어서,
상기 천식 진단용 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 천식 진단용 키트.8. The method of claim 7,
The asthma diagnosis kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit or a protein chip kit. 혈액에서 HOOK2의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 천식 진단에 대한 정보 제공 방법.A method for providing information on the diagnosis of asthma, comprising the step of measuring the expression of HOOK2 in blood. 삭제delete
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Rachel L. Clifford et al., ‘TWIST1 DNA methylation is a cell marker of airway and parenchymal lung fibroblasts that are differentially methylated in asthma’, Clinical Epigenetics, (2020.10.), Vol. 12,*

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