KR102432567B1 - Mutant fusion protein of nipah virus and its use - Google Patents
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Abstract
본 발명은 니파 바이러스에서 유래된 퓨전 변이 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질은 발현량이 매우 저조한 것으로 알려져 있는 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현을 개선한 것으로, 니파 바이러스 감염에 대한 치료제의 개발에 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to a fusion mutant protein derived from Nipah virus and uses thereof. The Nipah virus fusion mutant protein of the present invention has improved expression of the Nipah virus fusion protein, which is known to have a very low expression level, and can be effectively used in the development of a therapeutic agent for Nipah virus infection.
Description
본 발명은 니파 바이러스에서 유래된 퓨전 변이 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질은 발현량이 매우 저조한 것으로 알려져 있는 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현을 개선한 것으로, 니파 바이러스 감염에 대한 치료제의 개발에 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to a fusion mutant protein derived from Nipah virus and uses thereof. The Nipah virus fusion mutant protein of the present invention has improved expression of the Nipah virus fusion protein, which is known to have a very low expression level, and can be effectively used in the development of a therapeutic agent for Nipah virus infection.
니파 바이러스(Nipah Virus, NiV)는 아시아 태평양 지역에서 발생한 동물원성 바이러스로, 파라믹소바이러스(paramyxoviridae)과의 헨니파 바이러스(henipavirus)속에 속하는 RNA 바이러스이다. 니파 바이러스는 18.2 kb 크기의 negative-strand RNA를 유전자로 갖고 있으며, 이 유전자는 nucleocapisd(N), phosphoprotein(P), matrix(M), fusion(F), attachment glycoprotein(G), large polymerase(L)로 구성되어 있다. 니파 바이러스는 광범위한 숙주 친화성을 나타내며, 높은 병원성 및 사망률로 인해 BSL-4 시설에서 취급해야 한다.Nipah virus (NiV) is an RNA virus belonging to the genus henipavirus of the paramyxoviridae family as a zoonotic virus originating in the Asia-Pacific region. Nipah virus has a negative-strand RNA of 18.2 kb as a gene, and these genes are nucleocapisd (N), phosphoprotein (P), matrix (M), fusion (F), attachment glycoprotein (G), large polymerase (L). ) is composed of Nipah virus exhibits a wide host affinity and must be handled in a BSL-4 facility due to its high pathogenicity and mortality.
니파 바이러스는 과일박쥐로부터 돼지로 감염되어 돼지의 비점액, 타액 등 분비물 및 배출액에 직접 접촉한 사람이나 다른 동물로 전파되어 급성, 열성 질병을 유발하는 신변종 바이러스이다. 말레이시아의 양돈장에서 1998년 말 처음 니파 바이러스 감염자 105명이 사망한 것을 시작으로, 싱가포르, 인도 남부 등에서 여러 사망 사례가 접수되었으며, 최근에는 사람 간의 감염도 보고된 바 있다. 사람에서 잠복기는 418일이며, 증상 발현 초기에는 독감과 유사한 발열, 근육통 등을 나타내지만 심각해지면 중증 폐렴과 뇌염으로 진행되어 사망에까지 이를 수 있다. 치사율은 70%로 매우 높다고 알려져 있다. 자연 숙주인 과일박쥐는 임상증상이 없지만 중간 숙주인 돼지에서는 주로 호흡기 증상 및 신경증상을 보인다. 다른 파라믹소바이러스와 같이, 니파 바이러스는 부착단백질(attachment glycoprotein, G)과 융합단백질(fusion protein, F)이 숙주 세포의 수용체(receptor)에 부착됨으로써 감염되는 것으로 알려져 있다.Nipah virus is a new strain of virus that infects pigs from fruit bats and spreads to humans or other animals that come into direct contact with secretions and discharges such as nasal mucus and saliva of pigs, causing acute and febrile diseases. Starting with the death of 105 people infected with Nipah virus in a pig farm in Malaysia in late 1998, several deaths have been reported in Singapore and southern India, and recently, human-to-human transmission has also been reported. In humans, the incubation period is 418 days, and at the beginning of the onset of symptoms, flu-like fever and muscle pain are shown, but when severe, severe pneumonia and encephalitis can lead to death. It is known that the fatality rate is very high at 70%. The natural host, fruit bat, has no clinical symptoms, but the intermediate host, pig, shows mainly respiratory and neurological symptoms. Like other paramyxoviruses, Nipah virus is known to infect by attachment of an attachment glycoprotein (G) and a fusion protein (F) to a receptor of a host cell.
현재 니파 바이러스에 대해 유효한 백신이나 치료제는 없으며, 이의 진단은 바이러스성 RNA의 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 감염된 조직의 면역조직화학 분석(immunohistochemical analysis)에 의존하고 있다. 따라서 백신, 치료제 및 보다 안전하고 간단한 진단 방법의 개발이 요구되며, 국내에는 아직 니파 바이러스의 유입이 보고된 바 없으나 고위험 병원균이기에 유입에 대비할 필요가 있다.Currently, there is no effective vaccine or treatment for Nipah virus, and its diagnosis relies on reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) of viral RNA and immunohistochemical analysis of infected tissues. have. Therefore, development of vaccines, therapeutics, and safer and simpler diagnostic methods is required, and although the introduction of Nipah virus has not been reported in Korea yet, it is a high-risk pathogen, so it is necessary to prepare for the introduction.
단백질의 발현 증대와 관련하여, 메르스 바이러스 표면단백질의 HR과 central helix 사이 루프(loop)에서의 프롤린(proline) 치환으로 단백질의 발현량이 크게 개선되었다고 보고된 바 있다(비특허문헌 1). 이는 막 융합(membrane fusion)이 일어날 때 구조 변화(conformational change)가 크게 나타나는 루프에 존재하는 아미노산을 프롤린 잔기로 치환함으로써 발현량을 증가시키는 것이다.With respect to the increase in protein expression, it has been reported that the protein expression level is greatly improved by the substitution of proline in the loop between the HR and the central helix of the MERS virus surface protein (Non-Patent Document 1). This is to increase the expression level by substituting a proline residue for an amino acid present in a loop in which a conformational change occurs significantly when membrane fusion occurs.
니파 바이러스의 백신 또는 치료제를 개발하기 위해서는 니파 바이러스 퓨전(fusion) 단백질의 확보가 매우 중요하다. 그러나, 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현은 매우 저조한 것으로 알려져 있으며, 니파 바이러스 퓨전 단백질의 아미노산 잔기를 치환하여 발현량을 증가시키는 연구는 수행된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 유전자 조작을 통해 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현율을 개선하고자 하였다.In order to develop a vaccine or therapeutic agent for Nipah virus, it is very important to secure a Nipah virus fusion protein. However, it is known that the expression of the Nipah virus fusion protein is very low, and studies on increasing the expression level by substituting amino acid residues of the Nipah virus fusion protein have not been conducted. Accordingly, the present inventors tried to improve the expression rate of Nipah virus fusion protein through genetic manipulation.
본 발명은 발현량이 매우 저조한 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현율을 개선함으로써, 니파 바이러스 감염에 대한 치료제의 개발에 효과적으로 사용될 수 있는 퓨전 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a fusion protein that can be effectively used in the development of a therapeutic agent for Nipah virus infection by improving the expression rate of the Nipah virus fusion protein, which has a very low expression level.
이를 위해 본 발명에서는 유전자 조작을 통해 발현율이 개선된 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 제공한다.To this end, the present invention provides a Nipah virus fusion mutant protein having an improved expression rate through genetic manipulation.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 발현율이 개선된 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a Nipah virus fusion mutant protein having an improved expression rate.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진, 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 제공한다.Specifically, the present invention provides a Nipah virus fusion mutant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
또한 본 발명은 상기 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 형질주입된 숙주 세포를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the Nipah virus fusion mutant protein, an expression vector comprising the gene, and a host cell transfected with the expression vector.
또한 본 발명은 상기 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 형질주입하는 단계, 상기 형질주입된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 생산하는 단계, 상기 바이러스를 세포에 감염시켜 배양하여 배양물을 수득하는 단계, 및 상기 배양물로부터 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides the steps of preparing an expression vector comprising a gene encoding the Nipah virus fusion mutant protein, transfecting the expression vector into a host cell, culturing the transfected host cell to produce a virus , It provides a method for producing a mutant Nipah virus fusion protein comprising the steps of infecting and culturing the virus to obtain a culture, and isolating and purifying the protein from the culture.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 곤충 세포일 수 있으며, 바람직하게는 Sf-9(Spodoptera frugiperda 9) 곤충 세포일 수 있다.In the present invention, the host cells may be insect cells, preferably Sf-9 ( Spodoptera frugiperda 9 ) insect cells.
또한 본 발명은 상기 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 유효성분으로 포함하는 니파바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물을 제공한다.The present invention also provides a vaccine composition for the prevention or treatment of Nipah virus infection comprising the Nipah virus fusion mutant protein as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 니파바이러스 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing or treating a nipavirus infection comprising administering the vaccine composition to an animal.
본 발명에 따른 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질은 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현율 및 구조 안정성을 개선한 것으로, 니파 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 백신 및 치료제 개발에 활용될 수 있다.The Nipah virus fusion mutant protein according to the present invention has improved expression rate and structural stability of the Nipah virus fusion protein, and can be utilized to develop vaccines and therapeutic agents for prevention or treatment of Nipah virus infection.
또한 본 발명의 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질은 신속히 생산가능한 재조합 단백질 항원으로, 단백질 항원을 기반으로 하는 진단제 개발에 적용될 수 있다.In addition, the Nipah virus fusion mutant protein of the present invention is a recombinant protein antigen that can be rapidly produced, and can be applied to the development of a diagnostic agent based on a protein antigen.
도 1 및 도 2는 니파 바이러스 퓨전 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3 내지 도 6은 니파 바이러스 퓨전 이중변이(I190P/I114N) 단백질의 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 10은 니파 바이러스 퓨전 단백질 또는 퓨전 변이 단백질의 발현을 확인한 결과이다.1 and 2 show the structure of the Nipah virus fusion protein.
3 to 6 show the purification results of the Nipah virus fusion double mutant (I190P/I114N) protein.
7 to 10 are results of confirming the expression of Nipah virus fusion protein or fusion mutant protein.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다. Hereinafter, with reference to the accompanying drawings, embodiments and examples of the present invention will be described in detail so that those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can easily carry out. However, the present application may be embodied in various forms and is not limited to the embodiments and examples described herein.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components, unless otherwise stated.
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진, 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질에 관한 것이다.The present invention relates to a Nipah virus fusion mutant protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
본원 명세서 전체에서, I190P 변이 단백질, I114N 변이 단백질 및 이중변이(I190P/I114N) 단백질은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 의미한다.Throughout this specification, I190P mutant protein, I114N mutant protein and double mutant (I190P/I114N) protein refer to Nipah virus fusion mutant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
또한 본 발명은 상기 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 형질주입된 숙주 세포에 관한 것이다.The present invention also relates to a gene encoding the Nipah virus fusion mutant protein, an expression vector comprising the gene, and a host cell transfected with the expression vector.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 적합한 숙주 세포 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된(operatively linked) 핵산 서열을 함유하는 제조물을 의미한다.As used herein, the term "expression vector" refers to a preparation containing a nucleic acid sequence operatively linked to suitable regulatory sequences capable of expressing a gene in a suitable host cell.
본원에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"이란 핵산 서열 간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다.As used herein, the term “operatively linked” means that the binding between nucleic acid sequences is functionally linked.
본원에 사용된 용어 "형질주입(transfection)"은 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하여 숙주 세포의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미한다. As used herein, the term “transfection” refers to a change in the genetic properties of a host cell by introducing a foreign gene into a host cell.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"란 세포 내 도입된 유전자가 복제 가능하도록 세포 유전자에 연결되어 세포자체의 메커니즘으로 형질전환되는 원핵 또는 진핵 생물 세포를 의미한다.As used herein, the term "host cell" refers to a prokaryotic or eukaryotic cell in which a gene introduced into the cell is linked to a cellular gene so that it can be replicated and transformed by the cell's own mechanism.
또한 본 발명은 상기 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 형질주입하는 단계, 상기 형질주입된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 생산하는 단계, 상기 바이러스를 세포에 감염시켜 배양하여 배양물을 수득하는 단계, 및 상기 배양물로부터 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention also provides the steps of preparing an expression vector comprising a gene encoding the Nipah virus fusion mutant protein, transfecting the expression vector into a host cell, culturing the transfected host cell to produce a virus , It relates to a method for producing a Nipah virus fusion mutant protein comprising the steps of infecting and culturing the virus to obtain a culture, and isolating and purifying the protein from the culture.
발명의 일 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 Sf-9(Spodoptera frugiperda 9) 곤충 세포일 수 있다.In one embodiment of the invention, the host cell may be an insect cell. Preferably, the host cell may be an Sf-9 ( Spodoptera frugiperda 9 ) insect cell.
또한 본 발명은 상기 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 유효성분으로 포함하는 니파바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 니파바이러스 감염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a vaccine composition for preventing or treating Nipah virus infection comprising the Nipah virus fusion mutant protein as an active ingredient. In addition, the present invention relates to a method for preventing or treating a nipavirus infection comprising administering the vaccine composition to an animal.
본원에 사용된 용어 "백신"은 숙주인 인간을 포함한 동물에게서 해당 병원체에 대한 면역 반응을 유도함으로써 해당 병원체의 감염 또는 재감염의 예방, 해당 병원체에 의한 증상의 중증도 감소 또는 증상의 제거, 또는 해당 병원체나 그 병원체에 의한 질환의 실질적 또는 완전한 제거를 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의 "백신 조성물"은 해당 병원체의 감염 전에 예방적으로, 또는 해당 병원체의 감염 후에 치료적으로 인간을 포함한 동물에게 투여될 수 있다.As used herein, the term “vaccine” refers to prevention of infection or re-infection of a corresponding pathogen by inducing an immune response against the pathogen in an animal, including a human, as a host, reducing the severity of symptoms or eliminating symptoms caused by the pathogen, or the pathogen. It is meant to include the substantial or complete elimination of a disease caused by the pathogen. Therefore, the "vaccine composition" of the present invention can be administered to animals, including humans, prophylactically before infection with the pathogen or therapeutically after infection with the pathogen.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응 또는 이들을 모두 포함하는 의미이다.As used herein, the term “immune response” is meant to include a humoral immune response, a cellular immune response, or both.
본원에 사용된 용어 "유효성분"은 단독으로 면역 반응을 유도하거나, 그 자체로는 면역 반응을 유도할 수 없는 담체와 함께 면역 반응을 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 따라서 유효성분은 스스로가 반드시 면역원성(면역 반응을 유도할 수 있는 능력)을 가질 필요는 없다. 본 발명에서 상기 유효성분은 필수적이지는 않지만 정제된 것이 바람직하다. As used herein, the term “active ingredient” refers to a component capable of inducing an immune response by itself or in combination with a carrier that cannot induce an immune response by itself. Therefore, the active ingredient itself does not necessarily have immunogenicity (ability to induce an immune response). In the present invention, the active ingredient is not essential, but is preferably purified.
본원에 사용된 용어 "정제된"은 대상 물질이 존재하는 유기체의 세포 성분 등의 대상 물질 이외의 성분이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태를 의미하는 것으로, 순도가 50% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상인 것을 의미한다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역학적 분석 등 당업계에 공지된 방법을 통하여 평가될 수 있으며, 정제 방법 또한 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. As used herein, the term "purified" refers to a state in which components other than the target material, such as cellular components of the organism in which the target material is present, are substantially reduced or removed, and the purity is 50% or more, preferably 90%. or more, more preferably 99% or more. Purity may be evaluated through methods known in the art, such as chromatography, gel electrophoresis, immunological analysis, and the like, and purification methods may also use methods known in the art.
본 발명의 백신 조성물은 임의의 적절한, 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예컨대 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성 가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동 건조, 또는 냉동 제제 형태로 제조될 수 있다.The vaccine composition of the present invention may be prepared in any suitable, pharmaceutically acceptable formulation. For example, it may be in the form of a solution or suspension for immediate administration, a concentrated stock solution suitable for dilution prior to administration, or may be prepared in a reconstituted form such as a freeze-dried, freeze-dried, or frozen formulation.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 통상 희석제, 부형제, 안정화제, 방부제 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 희석제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나 염수, 완충 매질을 포함하는 물 등의 수성 용매 등을 들 수 있고, 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있으며, 안정화제로는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나 분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있다. 또한 방부제로는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있다.The vaccine composition of the present invention may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier usually includes a diluent, excipient, stabilizer, preservative, and the like. For example, as a diluent that may be included in the vaccine composition of the present invention, a non-aqueous solvent such as vegetable oil such as propylene glycol, polyethylene glycol, olive oil, peanut oil, or an aqueous solvent such as water including saline, buffer medium, etc. Examples of excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, anhydrous skim milk, glycerol, propylene, Glycol, water, ethanol, etc. are mentioned, and the stabilizer is carbohydrates such as sorbitol, mannitol, starch, sucrose, dextran, glutamate, and glucose; protein. Examples of the preservative include thimerosal, merthiolate, gentamicin, neomycin, nystatin, amphotericin B, tetracycline, penicillin, streptomycin, polymyxin B, and the like.
본 발명의 백신 조성물은 항원 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 항원 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 물질로, 예를 들어, 완전 프로인트(Freund), 불완전 프로인트, 사포닌, 겔 성상의 알루미늄 보조제, 표면 활성 물질(예: 리소레시틴, 플루론 글리콜, 다중 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼 등), 식물성 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유 등), 비타민 E 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The vaccine composition of the present invention may further comprise an antigen adjuvant. Antigen adjuvant is one or more substances that enhance an immune response to an antigen, for example, complete Freund, incomplete Freund, saponin, aluminum adjuvant in gel form, surface active substances (eg, lysolecithin, plurone) Glycol, polyanion, peptide, oil or hydrocarbon emulsion, etc.), vegetable oil (cottonseed oil, peanut oil, corn oil, etc.), may be at least one selected from the group consisting of vitamin E acetate, but is not limited thereto.
본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구투여 또는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 또한 상기 조성물의 예방적 또는 치료적으로 유효한 양은 투여방법, 목적부위, 환자의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 인체에 사용시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다.The vaccine composition of the present invention may be administered parenterally or orally according to a desired method, and the dosage may vary depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of disease, etc. The range varies accordingly. In addition, the prophylactically or therapeutically effective amount of the composition may vary depending on the administration method, the target site, and the condition of the patient, and when used in the human body, the dosage should be determined as an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples, but the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
[실시예 1] 니파 바이러스 퓨전 단백질의 구조 분석[Example 1] Structural analysis of Nipah virus fusion protein
니파 바이러스 퓨전(fusion) 단백질의 구조를 모델링하기 위해 호흡기 바이러스의 단백질 중 삼중체(trimer) 구조를 갖춘 외피 항원성 표면 단백질의 구조를 분석하였다.To model the structure of the Nipah virus fusion protein, the structure of the envelope antigenic surface protein with a trimer structure among respiratory virus proteins was analyzed.
MUSCLE 및 Clustal omega, Geneious 프로그램을 이용하여 서열 정렬(sequence alignment)을 수행하였다. 또한 PDB(protein databank)에 기탁된 PDB ID 5EVM 구조를 분석하고, PyMOL 프로그램을 이용하여 니파 바이러스 퓨전 단백질의 구조를 삼중체 형태로 모델링하여, 도 1 및 도 2에 나타내었다.Sequence alignment was performed using MUSCLE and Clustal omega, Geneious programs. In addition, the PDB ID 5EVM structure deposited in the PDB (protein databank) was analyzed, and the structure of the Nipah virus fusion protein was modeled in a triplex form using the PyMOL program, and is shown in FIGS. 1 and 2 .
도 1은 니파 바이러스 퓨전 단백질의 1차 구조 구성도이다(FP, fusion peptide; HR1, heptad repeat 1; HR2, heptad repeat 2; F1 및 F2는 숙주의 프로테아제에 의해 절단되는 2개의 서브 유닛). 도 2는 PDB로부터 얻은 니파 바이러스 퓨전 단백질의 구조(PDB ID: 5EVM)로서, 190번 잔기의 위치를 확대하여 나타내었다.1 is a schematic diagram of the primary structure of a Nipah virus fusion protein (FP, fusion peptide; HR1,
[실시예 2] 구조 분석 기반의 유전자 조작[Example 2] Gene manipulation based on structural analysis
상기 실시예 1의 단백질의 proteolytic 부위를 삭제하고, trimeric motif(foldon)를 삽입하여 단백질의 안정성을 증진시켰으며, 단백질의 발현을 확인하기 위해 Avi-Tag를 삽입하였다. The proteolytic region of the protein of Example 1 was deleted, and a trimeric motif (foldon) was inserted to enhance protein stability, and Avi-Tag was inserted to confirm protein expression.
또한 HR1 루프(loop)의 190번 아미노산 잔기 아이소류신(isoleucine)을 프롤린(proline)으로 치환한 변이 단백질(I190P), 114번 아미노산 잔기 아이소류신을 아스파라긴(asparagine)으로 치환한 변이 단백질(I114N), 및 상기 190번과 114번 잔기의 이중 변이 단백질(I190P/I114N)을 제작하였다. 유전자 변이는 부위-지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 이루어졌다.Also, a mutant protein (I190P) in which amino acid residue 190 of the HR1 loop is substituted with proline (I190P), a mutant protein in which amino acid residue 114 is substituted with asparagine (I114N), and a double mutant protein of residues 190 and 114 (I190P/I114N) was prepared. Gene mutations were made by site-directed mutagenesis.
[실시예 3] 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 대량 생산 및 정제 [Example 3] Mass production and purification of Nipah virus fusion mutant protein
곤충 세포에서 Bac-to-Bac 발현 시스템을 이용하여 니파 바이러스 퓨전 단백질(F0), I190P 변이 단백질, I114N 변이 단백질 및 이중변이(I190P/I114N) 단백질을 각각 생산 및 정제하였다.Nipah virus fusion protein (F0), I190P mutant protein, I114N mutant protein and double mutant (I190P/I114N) protein were respectively produced and purified in insect cells using the Bac-to-Bac expression system.
세포cell
Sf-9(Spodoptera frugiperda 9) 곤충 세포를 열-불활성화된 5 % FBS와 함께 무혈청 Sf-900™ II SFM(Gibco BRL, Karlsruhe, Germany)에서 성장시키고, 27 ℃에서 CO2 교환없이 유지시켰다. 그 후, 26~28 ℃의 비가습 인큐베이터에서 진탕기(shaker)를 이용하여 130rpm으로 현탁 배양하였다.Sf-9 ( Spodoptera frugiperda 9 ) insect cells were grown in serum-free Sf-900™ II SFM (Gibco BRL, Karlsruhe, Germany) with heat-inactivated 5% FBS and maintained at 27° C. without CO 2 exchange. . Thereafter, suspension culture was performed at 130 rpm using a shaker in a non-humidified incubator at 26-28 ° C.
High Five(Hi5) 세포는 무혈청 Sf-900™ II SFM에서 성장시키고, 30회 이하로 계대 배양하였다.High Five (Hi5) cells were grown in serum-free Sf-900™ II SFM and subcultured up to 30 times.
배큘로바이러스(baculovirus) 제작 및 단백질 생산Baculovirus production and protein production
니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 대량 생산을 위해 배큘로바이러스를 제작하고, 이를 통해 생산된 단백질을 다음과 같이 수득하였다.A baculovirus was prepared for mass production of Nipah virus fusion mutant protein, and the produced protein was obtained as follows.
니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 cDNA를 합성하고 PCR을 이용하여 증폭시킨 후, 이를 전달 벡터 pAcGP67A(BD Biosciences, Woburn, MA, USA)의 GP67 분비 신호 서열 하에 존재하는 pFastBac™ HT A(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 벡터에 클로닝하였다. 그 후, DH10Bac에서 Bac-to-Bac 발현 시스템을 통해 재조합 bacmid DNA를 생산하였다. 생산된 재조합 bacmid DNA를 Cellfectin II를 이용하여 Sf-9 세포에 형질주입(transfection)하고, 2-3일 동안 배양한 후 바이러스를 생산하였다. 생산된 바이러스를 Sf-9 세포에서 단계적으로 증폭시킨 후, Hi5 세포에 MOI 5 수준으로 감염시켜 3일 동안 배양하였다. 그 후, 3,000 rpm에서 30분, 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 제거하고 단백질이 분비(secretion)된 상등액을 수득하였다. After synthesizing the cDNA of the Nipah virus fusion mutant protein and amplifying it using PCR, it is present under the GP67 secretion signal sequence of the transfer vector pAcGP67A (BD Biosciences, Woburn, MA, USA) pFastBac™ HT A (Invitrogen, Carlsbad, CA). , USA) was cloned into a vector. Then, recombinant bacmid DNA was produced in DH10Bac through a Bac-to-Bac expression system. The produced recombinant bacmid DNA was transfected into Sf-9 cells using Cellfectin II, and the virus was produced after culturing for 2-3 days. After the produced virus was stepwise amplified in Sf-9 cells, Hi5 cells were infected at an MOI of 5 and cultured for 3 days. Thereafter, the cell pellet was removed by centrifugation at 3,000 rpm for 30 minutes and at 10,000 rpm for 20 minutes to obtain a supernatant from which the protein was secreted.
단백질 정제protein purification
상기 수득한 상등액으로부터 AKTA BASIC 크로마토그래피 시스템을 이용하여 다음과 같이 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질을 분리 및 정제하였다.Nipah virus fusion mutant protein was isolated and purified from the obtained supernatant using the AKTA BASIC chromatography system as follows.
상등액을 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl(pH 8.0)로 평형화된 니켈-니트릴로트리아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA) 친화성 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 적용하였다. 컬럼을 30 mM 이미다졸(imidazole)을 함유하는 완충액으로 세척하고, 단백질을 이미다졸 구배(30-400 mM)에서 용출시켜, 이를 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 20-150 mM NaCl에서 투석하였다. 이어서 단백질을 KTA 정제 시스템(GE HealthCare, Piscataway, NJ, USA)에 연결된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 100 mM NaCl 중 Superdex 200 10/300 GL 컬럼, 또는 20 mM Tris(pH 8.0), 200 mM NaCl 및 10 % 글리세롤 중 Superose 6 증가 컬럼을 사용하여 Size exclusion chromatography (SEC)에 의해 정제하였다. 특성화(characterization)를 위해 Amicon 10,000 MWCO 농축기(Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 바이러스 항원 단백질 삼중체를 1-2 mg/ml의 고순도 단백질로 농축시켰다.The supernatant was applied to a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column (Qiagen, Hilden, Germany) equilibrated with 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8.0. The column is washed with a buffer containing 30 mM imidazole and the protein is eluted in an imidazole gradient (30-400 mM), which is dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 20-150 mM NaCl. did. Then the
도 3 및 도 4는 니파 바이러스 퓨전 이중변이(I190P/I114N) 단백질의 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래피 정제 프로파일을 나타낸 것이다. 도 5 및 도 6은 단백질의 정제를 확인하기 위하여 수행한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏(Western-blot) 결과를 나타낸 것이다.3 and 4 show the Ni-NTA affinity chromatography and size exclusion chromatography purification profiles of the Nipah virus fusion double mutant (I190P/I114N) protein. 5 and 6 show the results of SDS-PAGE and Western-blot performed to confirm protein purification.
[실시예 4] 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 발현 증가 확인[Example 4] Confirmation of increased expression of Nipah virus fusion mutant protein
유전자 조작을 통해 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현이 증가하였는지 확인하기 위해 변이되지 않은 니파 바이러스 퓨전 단백질, I190P 변이 단백질, I114N 변이 단백질 및 이중변이(I190P/I114N) 단백질 각각의 세포 용해물(cell lysate) 및 상등액(supertanat)에서의 단백질 발현을 분석하였다.Cell lysates of each of the unmutated Nipah virus fusion protein, I190P mutant protein, I114N mutant protein, and double mutant (I190P/I114N) protein were used to determine whether the expression of Nipah virus fusion protein was increased through genetic manipulation. Protein expression in the supernatant was analyzed.
세포 용해물cell lysate
형질주입된 세포를 샘플 완충액(0.1 M Tris, pH 6.8, 4 % SDS, 4 mM EDTA, 286 mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 3.2 M 글리세롤 및 0.05 % 브로모 페놀 블루)에 용해시켜 세포 용해물을 준비하였다.The transfected cells were lysed in sample buffer (0.1 M Tris, pH 6.8, 4% SDS, 4 mM EDTA, 286 mM 2-mercaptoethanol, 3.2 M glycerol and 0.05% bromophenol blue). Cell lysates were prepared.
웨스턴 블랏(Western-blot)Western-blot
니파 바이러스 퓨전 단백질, I190P 변이 단백질, I114N 변이 단백질 각각의 세포 용해물 및 상등액을 SDS-PAGE로 분리하고, Avi-tag 항체(Genscript, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 단백질을 검출하였다.Cell lysates and supernatants of Nipah virus fusion protein, I190P mutant protein, and I114N mutant protein were separated by SDS-PAGE, and the protein was detected using an Avi-tag antibody (Genscript, Piscataway, NJ, USA).
Native-PAGE (Native polyacrylamide gel electrophoresis)Native-PAGE (Native polyacrylamide gel electrophoresis)
정제된 이중변이(I190P/I114N) 단백질을 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 sodium dodecyl sulphate(SDS)없이 5x로딩 완충액(loading buffer), 312.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 50 % 글리세롤 및 0.05 % 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 혼합된 native 조건 하에서 준비하였다. 200V, 80mA로 1시간 동안 192mM 글리신(glycine)과 함께 25mM Tris-HCl 완충액(pH 8.8)에서 전기영동을 수행하였다. Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 겔을 염색하였다.Purified double mutant (I190P/I114N) protein was prepared without β-mercaptoethanol and sodium dodecyl sulphate (SDS) in 5x loading buffer, 312.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 50% glycerol. And 0.05% bromophenol blue (bromophenol blue) was prepared under the mixed native conditions. Electrophoresis was performed in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.8) with 192 mM glycine at 200 V, 80 mA for 1 hour. The gel was stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma-Aldrich).
전기영동(SDS-PAGE) 결과, 니파 바이러스 퓨전 단백질은 세포 용해물 및 상등액 모두에서 발현이 확인되지 않았다(도 7). 반면, I190P 변이 단백질은 세포 용해물에서 응집(aggregation)된 형태로 확인되었으며(도 8), I114N 변이 단백질은 상등액에서 발현되었다(도 9). 또한 도 10에 나타낸 바와 같이, 니파 바이러스 퓨전 이중변이(I190P/I114N) 단백질은 삼중체 구조가 두 개 연결된 육합체(hexamer) 형태인 것을 Native-PAGE를 통해 확인하였다.As a result of electrophoresis (SDS-PAGE), expression of the Nipah virus fusion protein was not confirmed in both the cell lysate and the supernatant ( FIG. 7 ). On the other hand, the I190P mutant protein was identified as an aggregated form in the cell lysate (FIG. 8), and the I114N mutant protein was expressed in the supernatant (FIG. 9). Also, as shown in FIG. 10 , it was confirmed through Native-PAGE that the Nipah virus fusion double mutant (I190P/I114N) protein was in the form of a hexamer in which two triplex structures were connected.
이를 통해 니파 바이러스 퓨전 단백질의 발현이 유전자 변이로 인해 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 니파바이러스 퓨전 변이 단백질은 니파 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 백신 및 치료제 개발에 사용될 수 있고, 또한 단백질 항원을 기반으로 하는 진단제 개발에 효과적으로 활용될 수 있다.Through this, it can be seen that the expression of the Nipah virus fusion protein is significantly increased due to the genetic mutation. Therefore, the Nipah virus fusion mutant protein according to the present invention can be used for the development of vaccines and therapeutic agents for preventing or treating Nipah virus infection, and can also be effectively utilized for the development of diagnostic agents based on protein antigens.
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention Korea University Research and Business Foundation, Sejong Campus <120> MUTANT FUSION PROTEIN OF NIPAH VIRUS AND ITS USE <130> KCD19P-0007-KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I190P <400> 1 Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Ile 1 5 10 15 Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val 20 25 30 Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser 35 40 45 Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile 50 55 60 Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly 65 70 75 80 Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile 85 90 95 Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met 100 105 110 Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr 115 120 125 Asn Glu Ala Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Ala Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr 145 150 155 160 Ile Asp Lys Pro Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala 165 170 175 Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu 180 185 190 Gln Asp Pro Val Ser Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala 195 200 205 Phe Gly Gly Asn Tyr Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr 210 215 220 Glu Asp Phe Asp Asp Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile 225 230 235 240 Ile Tyr Val Asp Leu Ser Gly Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe 245 250 255 Pro Ile Leu Thr Glu Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro 260 265 270 Val Ser Phe Asn Asn Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn 275 280 285 Phe Ile Leu Val Arg Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe 290 295 300 Cys Leu Ile Thr Lys Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr 305 310 315 320 Pro Met Thr Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys 325 330 335 Cys Pro Arg Glu Leu Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu 340 345 350 Ser Asn Gly Val Leu Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys 355 360 365 Gln Thr Thr Gly Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu 370 375 380 Met Ile Asp Asn Thr Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile 385 390 395 400 Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly 405 410 415 Ile Ala Ile Gly Pro Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser 420 425 430 Gln Ile Ser Ser Met Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile 435 440 445 Lys Glu Ala Gln Arg Leu Leu Gly Ile His Gly Leu Asn Asp Ile Phe 450 455 460 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 465 470 475 480 Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr 485 490 495 Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His 500 505 510 His His His His His 515 <210> 2 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I114N <400> 2 Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Ile 1 5 10 15 Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val 20 25 30 Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser 35 40 45 Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile 50 55 60 Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly 65 70 75 80 Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Asn Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile 85 90 95 Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met 100 105 110 Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr 115 120 125 Asn Glu Ala Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Ala Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr 145 150 155 160 Ile Asp Lys Ile Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala 165 170 175 Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu 180 185 190 Gln Asp Pro Val Ser Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala 195 200 205 Phe Gly Gly Asn Tyr Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr 210 215 220 Glu Asp Phe Asp Asp Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile 225 230 235 240 Ile Tyr Val Asp Leu Ser Gly Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe 245 250 255 Pro Ile Leu Thr Glu Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro 260 265 270 Val Ser Phe Asn Asn Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn 275 280 285 Phe Ile Leu Val Arg Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe 290 295 300 Cys Leu Ile Thr Lys Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr 305 310 315 320 Pro Met Thr Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys 325 330 335 Cys Pro Arg Glu Leu Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu 340 345 350 Ser Asn Gly Val Leu Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys 355 360 365 Gln Thr Thr Gly Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu 370 375 380 Met Ile Asp Asn Thr Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile 385 390 395 400 Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly 405 410 415 Ile Ala Ile Gly Pro Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser 420 425 430 Gln Ile Ser Ser Met Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile 435 440 445 Lys Glu Ala Gln Arg Leu Leu Gly Ile His Gly Leu Asn Asp Ile Phe 450 455 460 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 465 470 475 480 Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr 485 490 495 Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His 500 505 510 His His His His His 515 <210> 3 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I190P/I114N <400> 3 Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Ile 1 5 10 15 Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val 20 25 30 Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser 35 40 45 Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile 50 55 60 Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly 65 70 75 80 Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Asn Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile 85 90 95 Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met 100 105 110 Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr 115 120 125 Asn Glu 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PROTEIN OF NIPAH VIRUS AND ITS USE <130> KCD19P-0007-KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I190P <400> 1 Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Ile 1 5 10 15 Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val 20 25 30 Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser 35 40 45 Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile 50 55 60 Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly 65 70 75 80 Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile 85 90 95 Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met 100 105 110 Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr 115 120 125 Asn Glu Ala Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Ala Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr 145 150 155 160 Ile Asp Lys Pro Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala 165 170 175 Leu Ser 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Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly 65 70 75 80 Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Asn Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile 85 90 95 Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met 100 105 110 Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr 115 120 125 Asn Glu Ala Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr 130 135 140 Val Leu Thr Ala Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr 145 150 155 160 Ile Asp Lys Ile Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala 165 170 175 Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu 180 185 190 Gln Asp Pro Val Ser Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala 195 200 205 Phe Gly Gly Asn Tyr Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr 210 215 220 Glu Asp Phe Asp Asp Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile 225 230 235 240 Ile Tyr Val Asp Leu Ser Gly Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe 245 250 255 Pro Ile Leu Thr Glu Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro 260 265 270 Val Ser Phe 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Claims (15)
Consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Nipah virus fusion mutant protein.
Consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, Nipah virus fusion mutant protein.
Consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, Nipah virus fusion mutant protein.
A gene encoding the protein of any one of claims 1 to 3.
An expression vector comprising a gene encoding the protein of any one of claims 1 to 3.
A host cell transfected with the expression vector of claim 5 .
7. The host cell of claim 6, wherein the host cell is an insect cell.
7. The host cell of claim 6, wherein the host cell is an Sf-9 ( Spodoptera frugiperda 9 ) cell.
상기 발현 벡터를 숙주 세포에 형질주입하는 단계;
상기 형질주입된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 생산하는 단계;
상기 바이러스를 세포에 감염시켜 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
상기 배양물로부터 단백질을 분리 및 정제하는 단계
를 포함하는 니파 바이러스 퓨전 변이 단백질의 제조 방법.
preparing an expression vector comprising a gene encoding a Nipah virus fusion mutant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3;
transfecting the expression vector into a host cell;
culturing the transfected host cell to produce a virus;
obtaining a culture by infecting the cells with the virus and culturing; and
Isolating and purifying the protein from the culture
A method for producing a Nipah virus fusion mutant protein comprising a.
The method according to claim 9, wherein the host cell is an insect cell.
The method of claim 9, wherein the host cell is a Sf-9 ( Spodoptera frugiperda 9 ) cell.
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KR1020200032391A KR102432567B1 (en) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Mutant fusion protein of nipah virus and its use |
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WO2009117035A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-09-24 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Soluble forms of hendra and nipah virus f glycoprotein and uses thereof |
WO2020028902A1 (en) * | 2018-08-03 | 2020-02-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Nipah virus immunogens and their use |
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2020
- 2020-03-17 KR KR1020200032391A patent/KR102432567B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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