KR102425508B1 - 대식세포의 거동 조절용 나노헬릭스-기판 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법 - Google Patents

대식세포의 거동 조절용 나노헬릭스-기판 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체, 이의 제조방법 및 상기 나노헬릭스-기판 복합체를 이용한 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명의 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법은 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장 인가 유무를 제어함으로써 생체 외 및 생체 내에서의 대식세포의 부착 및 표현형 분극화를 시간적 및 가역적으로 조절할 수 있다.

Description

대식세포의 거동 조절용 나노헬릭스-기판 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법{Nanohelix presenting substrates complex for controlling macrophage behaviors, preparation method thereof, and method for controlling cell adhesion and polarization of macrophage using the same}
본 발명은 대식세포의 부착 및 분극화 조절을 위한 나노헬릭스-기판 복합체, 이의 제조방법 및 상기 나노헬릭스-기판 복합체를 이용한 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로 상기 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장은 인가 유무에 따라서 대식세포의 세포 부착 및 분극화를 조절하는 방법에 관한 것이다.
대식세포는 선천 면역을 담당하는 주요한 세포이다. 온 몸에 정착성으로 있는 것이 대부분이나 일부는 혈액 내에서 단핵구의 형태로 존재한다. 이 단핵구는 수지상 세포나 대식세포로 분화할 수 있다. 대부분의 대식세포는 정착성으로 대표적으로 먼지세포, 미세교세포, 쿠퍼세포, 랑게르한스세포 등이 있으며 이들은 몸 전체에 분포하며, 이들은 항원이 침입하면 섭식하거나 독소를 분비하여 파괴, 항원을 제거하며 림프구에 항원을 전달, 면역반응을 일으킨다. 혈중에 있는 단핵구는 적이 상처로 침입하면 호중구와 같이 혈관 밖으로 나가 대식세포로 분화되어, 박테리아를 제거한다. 또한 대식세포는 체내 여러 곳을 이동하며 식작용을 하는 유리형(Free form)과 지정된 장기에 고정되어 식작용을 하는 고착형(Fixed form)으로 구분된다. 고착형 대식세포는 간의 쿠퍼세포(Kupffer cell), 폐포의 대식세포, 결합조직의 구조(Histiocyte), 뇌의 소교세포(Microglia) 등이 있다.
이와 같이 대식세포의 재생 및 항염증 효과를 효율적으로 제어하기 위한 방법으로 생체 내에서 리간드의 제시를 통한 기술이 이용되고 있다. 그러나, 기존의 마이크로 규모의 인테그린 리간드 펩티드(RGD) 탈착(uncaging)이 숙주 대식세포의 부착을 조절하지만 대식세포의 기능적 표현형 분극의 조정은 하지 않는 문제가 있다.
이에, 본 출원인은 나노바코드 리간드의 주기성 및 배열순서를 제어하여 대식세포의 부착 및 분극화를 제어하는 기술을 개발 및 출원한 바 있다.
이에 더하여, 본원출원인은 기존에 출원한 대식세포 부착 및 분극화 기술에 비해 더욱 향상되고 생체 친화적인 기술을 제공할 수 있는 기술을 이하에 제안하려고 하며, 특히 리간드를 미리 설계해서 삽입하는 방식이 아니라, 주입 후 외부 자극을 이용하여 세포의 특성을 실시간으로 변화시킬 수 있는 기술을 제안하려고 한다.
대한민국 등록특허 10-1916588호
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 리간드가 코팅된 나노헬릭스를 포함하는 기판을 제공하고, 리간드가 코팅된 나노헬릭스에 자기장을 인가하는 것을 제어하여 대식세포의 부착 및 분극화를 조절하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 기판; 기판과 화학 결합된 나노헬릭스; 및 상기 나노헬릭스와 화학 결합된 인테그린 리간드 펩티드를 포함하고,
상기 나노헬릭스는 나선형의 나노와이어로 구성되며, 하나 이상의 금속원소를 포함하고,
상기 나노헬릭스는 100 nm 내지 20 ㎛의 길이를 갖고,
상기 나노헬릭스는 자기장 인가 유무에 따라 가역적으로 길이가 하기 식 1의 범위 내에서 변화하는 것을 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체를 제공한다:
[식 1]
|L1-L0|>10 nm
식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 금속원소를 포함하는 용액을 전기증착하여 나노헬릭스를 준비하는 단계;
상기 나노헬릭스와 제1 현탁액과 혼합하여 나노헬릭스에 카르복실산염 치환기를 치환하는 단계; 및
카르복실산염이 치환된 나노헬릭스를 포함하는 용액에 표면이 활성화된 기판을 담지하여 나노헬릭스가 결합된 기판을 제조하는 단계;
나노헬릭스가 결합된 기판을 폴리에틸렌글리콜 링커를 포함하는 용액에 담지하여 나노헬릭스의 말단에 링커를 결합하는 단계; 및
인테그린 리간드 펩티드(RGD)을 포함하는 제2 현탁액과 활성화된 나노헬릭스가 결합된 기판을 혼합하여 나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계;를 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 서술한 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체에 배양액을 처리한 후 20 mT 내지 7 T의 자기장을 인가하여 대식세포의 세포 부착 및 분극화를 조절하는 단계를 포함하고,
상기 나노헬릭스는 자기장 인가 유무에 따라 가역적으로 길이가 하기 식 1의 범위 내에서 변화하는 것을 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법을 제공한다:
[식 1]
|L1-L0|>10 nm
식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
본 발명에 따른 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체는 인테그린 리간드 펩티드가 코팅된 나노헬릭스에 자기장 인가 유무를 제어함으로써 가역적인 제어가 가능하며, 생체 내 및 생체 외에서의 대식세포의 부착 및 표현형 분극화를 효율적으로 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체 및 이를 이용한 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 나노헬릭스의 주사전자현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 고각 환형 암시야 주사 투과 전자현미경(HAADF-STEM) 이미지, 에너지 분산 분광법 맵핑(EDS mapping), 주사전자현미경(SEM) 이미지 및 고해상도 주사투과전자 현미경(HR-STEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 나노헬릭스의 (a)에너지 분산 분광법(EDS) 및 (b)전자에너지 손실 분광법(EELS)으로 분석한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 나노헬릭스의 진동 샘플 자력계 측정 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 X선 회절 분석 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 고해상도 투과전자 현미경(HRTEM) 이미지이다.
도 8은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 제조하는 단계를 도식화한 이미지이다.
도 9는 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체의 푸리에 변환 적외선 분광(FT-IR) 분석한 결과이다.
도 10 및 도 11은 본 발명에 따른 나노헬릭스를 대상으로 원자간력 현미경(AFM)으로 촬영한 이미지이다.
도 12은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 배양된 대식세포(24시간 후)의 F-액틴, 핵 및 빈쿨린에 대한 공초점 면역 형광 이미지(a)이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 밀도, 세포 면적, 세포 신장 인자를 나타낸 그래프(b)이며, 스케일 바는 20㎛를 나타낸다.
도 13은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 배양된 대식세포(24시간 후)의 살아있는 세포와 죽은 세포에 대한 공초점 면역 형광 이미지(a)이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 생존능력을 나타낸 그래프(b)이며, 스케일 바는 50㎛를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 비교예에 따른 나노헬릭스가 없는 기판(No nanohelix) 또는 인테그린 리간드(RGD)가 결합하지 않은 나노헬릭스-기판 복합체에서 이중 모드 스위칭(bimodal switching)에 대한 대식세포의 부착성 실험한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 12시간 간격으로 자기장 인가를 조절하여 36시간 동안 배양된 대식세포의 F-액틴, 핵 및 빈쿨린에 대한 공초점 면역 형광 이미지이고, 이때 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 16은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 자기장 인가에 의해 대식세포의 부착-의존적 표현형 분극이 조절되는지에 대한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 분극 표현형과 매칭된 자극 배지가 없을 때(즉, M2-자극 배지에서 M1 발현 또는 M1-자극 배지에서 M2 발현)의 리간드 서열에서 나노-주기성의 조절에 대한 실험 결과이다.
도 18은 36시간 동안 자기장을 인가한 신장("ON") 및 자기장을 인가하지 않은 수축("OFF")의 이중 모드 스위칭 하에 M1 또는 M2 배지에서 대식세포를 배양한 후 ROCK2 및 핵의 공초점 면역 형광 이미지(a) 및 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 ROCK2 면역형광 강도를 나타낸 그래프이며, 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 실험한 것으로, (a)는 M1 분극 배지에서 36시간 동안 배양한 후 CD68, F-액틴 및 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지와 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 면적, 세포 신장 인자 및 CD68 형광 강도를 나타낸 그래프이며, (b)는 ROCK(Y27632), 미오신Ⅱ(블레비스타틴) 또는 액틴 중합(사이토칼라신 D)에 대한 억제제의 존재 및 부재의 M2 분극 배지에서 배양한 후 Arg-1 및 F-액틴 및 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 면적, 세포 신장 인자 및 Arg-1 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 20 및 도 21은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용한 생체 내 숙주 대식세포 부착 및 표현형 조절에 대한 실험 결과이다.
도 22는 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 기판에 대한 숙주 호중구의 생체내 부착 실험한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.
본 발명은 기판; 기판과 화학 결합된 나노헬릭스; 및 상기 나노헬릭스와 화학 결합된 인테그린 리간드 펩티드를 포함하고,
상기 나노헬릭스는 나선형의 나노와이어로 구비되되, 하나 이상의 금속원소를 포함하고,
상기 나노헬릭스는 100 nm 내지 20 ㎛의 길이를 갖고,
상기 나노헬릭스는 자기장 인가 유무에 따라 가역적으로 길이가 하기 식 1의 범위 내에서 변화하는 것을 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체를 제공한다:
[식 1]
|L1-L0|>10 nm
식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
도 1은 본 발명에 따른 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체 및 이를 이용한 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절 방법을 나타낸 모식도이다.
도 1을 살펴보면, 본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체는 기판; 기판과 화학 결합된 나노헬릭스; 및 상기 나노헬릭스와 화학 결합된 인테그린 리간드 펩티드를 포함하고, 상기 나노헬릭스는 나선형의 나노와이어로 구비되되, 상기 나노와이어는 코발트(Co), 철(Fe) 및 니켈(Ni) 중 하나 이상의 금속원소를 포함하는 것을 알 수 있다.
구체적으로, 상기 나노헬릭스는 식 1을 만족하는 나선 형태의 나노와이어로 구비될 수 있다:
[식 1]
|L1-L0|>10 nm
식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
상기 식 1에서, 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이는 100 nm 내지 20 ㎛, 500 nm 내지 4 ㎛ 또는 1 ㎛ 내지 3 ㎛일 수 있다.
상기와 같이 자기장 인가시에 나노헬릭스가 신장(stretching)되어 길이가 늘어나면 생체 내에서 대식세포의 부착 및 M2 분극을 촉진시킬 수 있다. 다만, 자기장이 제거되는 경우 나노헬릭스가 수축하여 기존의 나노헬릭스 길이로 되돌아온다.
구체적으로, 상기 식 1에서 자기장 인가 유무에 따른 나노헬릭스의 길이변화는 10 nm 이상, 20 nm 이상, 10 nm 내지 500 nm 또는 10 nm 내지 100nm일 수 있다.
본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체에서 나노헬릭스의 길이변화가 상기 식 1을 만족하지 않는 경우, 상기 나노헬릭스의 길이변화가 작아서 세포부착능의 차이를 보이지 않아 문제된다.
상기 나노헬릭스의 나선형 외경의 평균길이는 50 nm 내지 200 nm 또는 100 nm 내지 200 nm 일 수 있다. 나노헬릭스의 나선형 외경이 100 nm 미만인 경우 나노헬리스가 너무 작아 인테그린 리간드 펩티드가 일정한 간격을 두고 결합하기 어렵고, 외경이 200 nm을 초과하는 경우 기판 상에 나노헬릭스가 차지하는 영역이 넓어져 기판에서 적절한 밀도로 분포하기 어려운 문제가 있다.
상기 나노헬릭스는 나노와이어로 이루어지는데, 상기 나노와이어는 코발트(Co), 철(Fe) 및 니켈(Ni) 중 하나 또는 둘 이상의 금속원소를 포함할 수 있고, 상기 나노와이어는 단면이 원형이 와이어의 형태로 구비되되, 직경은 5 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 90 nm 또는 60 nm 내지 90 nm일 수 있다. 상기와 같은 와이어의 직경을 만족하지 않는 경우 나노헬릭스의 신장 및 수축이 원활하게 나타내지 않을 수 있다.
상기 나노헬릭스 내에 결합된 인테그린 리간드 펩티드는 티올화된 인테그린 리간드 펩티드일 수 있고, 상기 인테그린 리간드 펩티드는 복수개가 상기 나노헬릭스에 서로 이격되어 결합되되, 서로 이웃하는 인테그린 리간드 사이의 평균간격은 1 nm 내지 10 nm일 수 있다. 서로 이웃하는 인테그린 리간드 펩티드 사이의 평균간격이 1 nm 미만이면 자기장을 인가한 경우에도 대식세포의 부착 및 분극화를 활성화하기 어렵고, 10 nm 초과이면 자기장을 인가하지 않은 경우에도 대식세포의 부착 및 분극화를 활성화하여 자기장을 이용한 가역적 제어를 하기 어려운 문제가 발생한다.
상기 나노헬릭스에서 자기장 인가시, 상기 나노헬릭스의 서로 이웃한 나선은 이격되고, 서로 이웃한 나선 사이의 피치(pitch)는 1 nm 내지 100 nm, 1 nm 내지 50 nm 또는 5 nm 내지 30 nm일 수 있다. 이는 자기장 인가시에 나노헬릭스가 신장(stretching)하면서 피치 간격이 늘어난 것이다. 이에 따라 인테그린 리간드 펩티드의 간격도 증가할 수 있다.
상기 인테그린 리간드 펩티드는 티올화된 인테그린 리간드 펩티드로서, 인테그린 리간드 펩티드의 티올기와 나선형의 나노헬릭스의 폴리에틸렌글리콜 링커로 인해 결합될 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜 링커는 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-NHS 에스터(Mal-PEG-NHS ester)일 수 있다. 상기와 같은 링커를 포함하여 나노헬릭스와 인테그린 리간드 펩티드 사이의 결합력을 높여 내구성을 향상시킬 수 있다.
상기 나노헬릭스는 카르복실산염이 치환된 구조일 수 있다. 상기 카르복실산염 치환기는 아미노산 유도체, 구체적으로 아미노카프론산일 수 있다. 상기와 같이 나노헬릭스가 카르복실산염이 치환된 구조를 가짐으로써 기판 및 인테그린 리간드 펩티드와의 결합력을 높일 수 있다.
상기 기판은 표면이 아민화된 기판으로, 아미노실란 용액에 담지되어 표면이 활성화된 기판일 수 있고, 상기 기판 표면에 있는 아미노기와 나노헬릭스의 카르복실기가 EDC/NHS 반응을 통해 결합된 구조일 수 있다.
또한, 상기 기판은 나노헬릭스가 결합되지 않은 기판의 표면이 비활성화된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 금속원소를 포함하는 용액을 전기증착하여 나노헬릭스를 준비하는 단계;
상기 나노헬릭스와 제1 현탁액과 혼합하여 나노헬릭스에 카르복실산염 치환기를 치환하는 단계; 및
카르복실산염기가 치환된 나노헬릭스를 포함하는 용액에 표면이 활성화된 기판을 담지하여 나노헬릭스가 결합된 기판을 제조하는 단계;
나노헬릭스가 결합된 기판을 폴리에틸렌글리콜 링커를 포함하는 용액에 담지하여 나노헬릭스의 말단에 링커를 결합하는 단계; 및
인테그린 리간드 펩티드(RGD)을 포함하는 제2 현탁액과 활성화된 나노헬릭스가 결합된 기판을 혼합하여 나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계;를 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 나노헬릭스를 준비하는 단계에서 금속원소를 포함하는 용액은 코발트(Co), 철(Fe) 및 니켈(Ni) 중 하나 또는 둘 이상의 금속원소를 포함할 수 있다.
상기 나노헬릭스를 준비하는 단계는 나노기공을 가지며, 일면에 작업 전극을 가지는 나노템플릿(nano template)을 준비하는 단계; 아스코르브산 (Ascorbic acid; C6H8O6), 바나듐(IV) 옥사이드 설페이트(VOSO4·xH2O) 및 증착하고자 하는 금속을 포함하는 금속 전구체 용액을 포함하는 제1 금속 전구체 혼합액을 준비하는 단계; 상기 제1 금속 전구체 혼합액에 질산(Nitric acid; HNO3)을 혼합하여 제2 금속 전구체 혼합액을 준비하는 단계; 상기 제2 금속 전구체 혼합액에 상기 나노템플릿을 침지하고, 상기 제2 금속 전구체 혼합액에 삽입된 상대 전극(counter electrode)과 상기 작업 전극 사이에 전류를 인가하여 전기도금 방식으로 상기 나노기공에 금속 나노헬릭스를 증착시키는 단계; 및 상기 금속 나노헬릭스가 증착된 나노템플릿에서 상기 작업 전극 및 상기 나노템플릿을 선택적으로 제거하는 단계;를 포함한다.
상기 나노템플릿으로는 양극산화 알루미늄(Anodic Aluminum Oxide, AAO) 나노틀, 무기재료(Inorganic) 나노틀 또는 고분자 나노틀을 사용한다. 여기에서는 양극산화 알루미늄 나노틀을 사용하는 경우를 도시한다. 양극산화 알루미늄을 나노틀 세공(Pore)의 지름에 따라 나노선의 크기가 정해지며, 나노선의 형성 시간 및 속도에 따라 나노선 길이가 결정된다.
상기 나노기공의 평균 직경이 5 내지 500 nm, 50 nm 내지 200 nm 또는 100 nm 내지 200 nm 일 수 있다
상기 금속 전구체 용액은 황산코발트(II) 7수화물(CoSO4·7H2O) 및 황산철(II) 7수화물(FeSO4·7H2O) 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있다.
황산코발트(II) 7수화물(CoSO4·7H2O)의 농도는 30 mM 내지 100 mM 이고, 바나듐(IV) 옥사이드 설페이트(VOSO4·xH2O)의 농도는 30 mM 내지 100 mM이고, 철 황산철(II) 7수화물(FeSO4·7H2O)의 농도는 30 mM 내지 100mM 이고, 아스코르브산 (Ascorbic acid; C6H8O6)의 농도는 20 mM 내지 50 mM 일 수 있다.
상기 제2 금속 전구체 혼합액의 pH는 1.5 내지 2.5 일 수 있다.
상기 나노템플릿을 상기 제2 금속 전구체 혼합액에 침지하고 상기 제2 금속 전구체 혼합액을 수납하는 도금조(plating bath)를 감압하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 도금조의 압력은 100 Torr 내지 700 Torr일 수 있다.
전기도금 시 상기 작업 전극에 흐르는 전류 밀도는 0.1 내지 300 mA/cm2 이고, 전기도금 시간은 1 분 내지 48 시간일 수 있다.
전자빔 증착법(Electron Beam Evaporation)으로 양극산화 알루미늄 나노틀의 밑면에 250 nm 두께의 은(Ag) 전극층을 형성한다. 이 전극층은 전기증착 시 음극 전극 역할을 한다. 여기서 전극층으로 다른 금속 또는 다른 전도성 물질층을 사용할 수 있다.
상기 카르복실산염 치환기를 치환하는 단계는 상기 나노헬릭스와 제1 현탁액을 혼합하여 8 내지 20시간 또는 10 내지 15시간 동안 반응시켜 수행할 수 있다. 상기 제1 현탁액은 카르복실산염 치환기를 포함하는 아미노산 유도체를 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 아미노산 유도체는 아미노카프론산일 수 있다. 상기와 같은 제1 현탁액과 반응시켜 상기 아미노산 유도체가 나노헬릭스의 표면에 결합할 수 있다.
상기 나노헬릭스가 결합된 기판을 제조하는 단계는 카르복실산염이 치환된 나노헬릭스를 포함하는 용액에 표면이 활성화된 기판을 담지하여 수행할 수 있다.
상기 표면이 활성화된 기판은 염산 및 황산 중 어느 하나 이상을 포함하는 산성 용액에 30분 내지 2시간 또는 30분 내지 1시간 동안 침지시켜 제조할 수 있다. 이를 통해, 상기 기판의 표면에 수산화기를 결합시켜 아미노기와의 결합을 용이하게 하게 기판의 표면 활성화를 효과적으로 수행할 수 있다.
상기 나노헬릭스가 결합된 기판을 제조하는 단계는 상기 표면이 활성화된 기판을 암 조건 하에서 아미노-실란 용액에 기판을 담지하여 기판의 표면을 아민화시킬 수 있다. 상기 아미노-실란 용액은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)을 포함할 수 있다. 이때, 기판의 표면을 아민화시킨다는 것은 기판의 상에 아민기를 결합시켰다는 의미이다. 상기와 같이 아미노-실란 용액에 침지하여 기판의 표면을 아민화시킴으로써 상기 나노헬릭스와 EDC/NHS 반응을 통해 결합할 수 있다.
상기 나노헬릭스의 말단에 링커를 결합하는 단계는 나노헬릭스가 결합된 기판을 폴리에틸렌글리콜 링커를 포함하는 용액에 담지하여 수행할 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜 링커는 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-NHS 에스터(Mal-PEG-NHS ester)일 수 있다. 상기와 같은 링커를 포함하여 나노헬릭스와 인테그린 리간드 펩티드 사이의 결합력을 높여 내구성을 향상시킬 수 있다.
상기 나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계는 인테그린 리간드 펩티드(RGD)을 포함하는 제2 현탁액과 활성화된 나노헬릭스가 결합된 기판을 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 제2 현탁액은 티올화된 인테그린 리간드 펩티드를 포함할 수 있다.
상기 나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계 이후에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 포함하는 용액에 나노헬릭스가 결합된 기판을 담지하여 나노헬릭스가 결합되지 않은 기판의 표면을 비활성화시키는 안계를 더 포함할 수 있다. 상기 플리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)-숙신이미딜카르복시메틸에스터일 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 서술한 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체에 처리한 후 20 mT 내지 7 T의 자기장을 인가하여 대식세포의 세포 부착 및 분극화를 조절하는 단계를 포함하고,
상기 나노헬릭스는 자기장 인가 유무에 따라 가역적으로 길이가 변화하되, 하기 식 1을 만족하는 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법을 제공한다:
[식 1]
|L1-L0|>10 nm
식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
상기 대식세포의 세포 부착 및 분극화를 조절하는 단계는 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가 유무에 따라 가역적으로 나노헬릭스의 길이를 변화시켜 생체 내 및 생체 외의 대식세포의 부착 및 분극화를 조절할 수 있다.
구체적으로, 대식세포의 부착 및 분극화를 조절하는 단계는 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가하지 않는 경우 나노헬릭스가 수축하고, 나노헬릭스의 피치의 간격이 감소하여 염증성(M1) 표현형을 촉진할 수 있다.
또한, 대식세포의 부착 및 분극화를 조절하는 단계는 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가하는 경우 나노헬릭스가 신장하고, 나노헬릭스의 피치의 간격이 증가하여 재생성 및 항염증성(M2) 표현형을 촉진할 수 있다.
예를 들어, 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가했다가 자기장을 제거하는 경우, 나노헬릭스의 길이가 신장 및 수축이 가역적으로 일어난다. 구체적으로, 자기장을 인가했다가 제거한 후 다시 자기장을 인가하는 경우, 나노헬릭스의 길이가 신장한 후 수축했다가 다시 신장할 수 있다.
이를 통해, 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용한 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절은 시간적 및 가역적으로 조절할 수 있다.
구체적으로, 상기 식 1에서 자기장 인가 유무에 따른 나노헬릭스의 길이변화는 10 nm 이상, 20 nm 이상, 10 nm 내지 500 nm 또는 10 nm 내지 100nm일 수 있다.
본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체에서 나노헬릭스의 길이변화가 상기 식 1을 만족하지 않는 경우, 상기 나노헬릭스의 길이변화가 작아서 세포부착능의 차이를 보이지 않아 문제된다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예들에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예
나노헬릭스의 제조
기공 직경이 200nm인 양극산화 알루미늄(AAO)의 다공성 템플릿을 사용하여 전기증착하여 제조하였다. 먼저 양극산화 알루미늄 다공성 템플릿의 한면에 전자빔 증발기를 사용하여 은(Ag)을 증착하였다. 금속 이온 전구체 용액으로 황산코발트 7수화물(CoSO4 · 7H2O, 0.08M)과 황산철 7수화물(FeSO4 · 7H2O, 0.08M)을 탈이온수에 혼합하여 준비하였다. CoFe 나노헬릭스를 생산하기 위해 바나듐(IV) 옥사이드 설페이트(VOSO4·xH2O)와 L-아스코르부산(0.06M)을 상기 금속 이온 전구체 용액에 첨가하였다. 그런 다음 질산을 전구체 용액에 첨가하여 pH 2.5로 조정한 후 양극산화 알루미늄 템플릿의 기공에 주입하고 20mA/cm2의 일정한 전류밀도를 1분 동안 인가하여 CoFe 나노헬릭스를 증착하였다. CoFe 나노헬릭스가 증착된 나노템플릿을 1M의 NaOH로 45℃에서 30분 동안 반응시켜 나노템플릿을 제거한 후 탈이온수로 세척하여 CoFe 나노헬릭스를 제조하였다. 세척된 CoFe 나노헬릭스는 기판 결합 전에 1mL의 탈이온수에 현탁시켰다.
비교제조예
음으로 하전된 티올화된 RGD 펩티드(CDDRGD, GL Biochem)을 첨가하지 않은 것을 제외하고 제조예 1과 동일한 방법으로 나노헬릭스를 제조하였다.
[실시예]
실시예
나노헬릭스-기판 복합체 제조
아미노카프론산(aminocaproic acid)은 제조예에서 제조한 나노헬릭스의 천연 산화물층과 반응하는 것으로 알려진 아민 그룹을 기반으로 자기 CoFe 나노헬릭스의 표면에 커플링하는데 사용되었다. 1mL의 나노헬릭스와 1mL의 6mM 아미노카프론산 용액의 혼합용액을 12시간 동안 실온에서 교반한 후, 원심분리하고 탈 이온수로 세척하였다. 22mm×22mm의 평면의 세포 배양 등급 유리 기판을 아민화시켜서 나노헬릭스의 표면에 카르복실레이트기가 기판 상의 아민기에 결합되도록 한다. 기판을 먼저 30분 동안 염산 및 메탄올을 1:1로 혼합한 혼합물로 세정하고 탈이온수로 세척하였다. 세척된 기판을 황산에서 1시간 동안 활성화시키고 탈이온수로 세척하였다. 기판을 암실에서 3-아미노프로필 트리에톡시 실란(APTES) 및 에탄올(1:1)에서 1시간 동안 아민화하고 에탄올로 세척한 후, 100℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 1mL의 탈이온수에서 아미노카프론산이 결합된 나노헬릭스를 0.5mL의 20mM N-에틸-N'-(3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드)(EDC) 및 0.5mL의 20mM N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)을 포함하는 탈이온수 1mL에서 3시간 동안 EDC/NHS 반응을 통해 활성화시키고, 그런 다음 탈이온수로 세척하였다.
아민화된 기판을 활성화된 나노헬릭스에 1시간 동안 암근 후 탈이온수로 세척하였다. 인테그린 리간드는 먼저 0.04mM의 말레이미드-폴리(에틸렌글리콜)-NHS에스터 링커와 2μl의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA, 2 μL)를 포함하는 1mL의 탈이온수에서 암조건하에서 16시간 동안 흔들면서 배양하여아미드 결랍 형성을 중재하여 기판의 표면에 그라프팅된 다음 탈이온수로 세척하였다. 티올-엔 반응을 매개하기 위해 상기 기판을 티올화된 RGD 펩티드 리간드(GCGYCFCDSPG, GLBiochem, 0.04M), 2μL의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 및 10Mm 트리스(2-카르복시에틸)포스핀히드로클로라이드(TCEP)를 포함하는 탈이온수 1mL에서 암조건하에서 2시간 동안 배양한 후 탈이온수로 세척하였다. 세포 배양 전에 비-RGD 리간드 특이적 대식세포 부착을 최소화하기 위해, 나노헬릭스가 결합되지 않은 영역을 어둠 속에서 2시간 동안 2μL의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 및 100μΜ 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)-숙신이미딜카르복시메틸에스터(methoxy-poly(ethylene glycol)-succinimidyl carboxymethyl ester)을 포함하는 탈이온수 1mL로 반응시킨 후 세척하여 기판의 비-나노헬릭스-코팅된 영역을 차단하였다.
비교예 1
상기 비교제조예 1에서 제조한 나노헬릭스를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 나노헬릭스-기판 복합체를 제조하였다.
[실험예]
실험예 1
본 발명에 따른 나노헬릭스의 형태와 화학적 특성을 확인하기 위해서, 제조된 나노헬릭스를 대상으로 주사전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM), 고각 환형 암시야 주사전자 현미경(HAADF-STEM), 고분해능 투과형전자현미경(HR-TEM) 및 고분해능 주사투과전자현미경(HR-STEM)으로 촬영하였고, 에너지분산형 분광법(Energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS), 전자에너지 손실 분광법(Electron energy loss spectroscopy, EELS), 진동 시편 자력계 측정(Vibrating-sample magnetometry, VSM) 및 X선 회절분석(X-ray diffraction, XRD)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 도 2 및 도 7에 나타내었다.
도 2는 본 발명에 따른 나노헬릭스의 주사전자현미경 이미지이다. 구체적으로, (a)는 전기증착 템플릿의 기공 직경을 조절하여 제조한 CoFe 나노헬릭스의 주사전자 현미경 이미지이고, (b)는 코발트 나노헬릭스와 CoFe 나노헬릭스의 주사전자 현미경 이미지이고, (c)는 전기증착 시간에 따른 CoFe 나노헬릭스의 길이를 측정한 주사전자 현미경 이미지이고, 이때 스케일바는 (a) 500 nm, (b) 200 nm, and (c) 1 μm이다.
도 2를 살펴보면, 본 발명에 따른 나노헬릭스는 전기증착 템플릿의 기공 직경에 따라 CoFe 나노헬릭스의 직경을 조절할 수 있고, 금속 이온 전구체를 조절함에 따라 나노헬릭스의 구성원소를 조절할 수 있으며, 전기 증착 시간에 따라 CoFe 나노헬릭스의 길이를 조절할 수 있는 것을 알 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 고각 환형 암시야 주사 투과 전자현미경(HAADF-STEM) 이미지 에너지 분산 분광법 맵핑(EDS mapping) 및 고해상도 주사투과전자 현미경(HR-STEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 나노헬릭스의 (a)에너지 분산 분광법(EDS) 및 (b)전자에너지 손실 분광법(EELS)으로 분석한 결과 그래프이다.
도 3 및 도 4를 살펴보면, HAADF-STEM 이미지에서 나노헬릭스의 코발트(Co) 및 철(Fe)로 이루어지고, 각각 약 50 원자%의 분포로 균일하게 분포된 것을 확인할 수 있다. 교대되는 Fe 및 Au 세그먼트는 각각 어둡고 밝은 음영 영역으로 식별되었으며, Fe 및 Au 요소 별 EDS 맵핑 이미지로 합금 형성이 없는 날카로운 인터페이스를 갖는 것을 확인하였다.
도 5는 본 발명에 따른 나노헬릭스의 진동 샘플 자력계 측정 결과 그래프이다. 구체적으로, 코발트 및 철로 인한 나노헬릭스의 자기 특성을 확인하였고, 이를 통해 나노헬릭스의 나노 신장("ON") 및 나노 수축("OFF")의 가역적인 이중 모드(bimodal) 전환이 가능한 것을 알 수 있다.
도 6은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 X선 회절 분석 그래프이고, 도 7은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 고해상도 투과전자 현미경(HRTEM) 이미지이다.
도 6 및 도 7을 살펴보면, 나노헬릭스는 체심 입방 구조의 (110) 결정면을 갖는 것을 알 수 있고, 평균 격자 간격은 약 2.02±0.02Å인 것을 알 수 있다. 또한, 등방성 인테그린 리간드와 결합을 촉진하기 위해 나노헬릭스를 이루는 나노와이어의 직경은 인테그린 분자 크기인 약 10nm와 거의 비슷한 것을 알 수 있다.
실험예 2
본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체의 특성을 확인하기 위해, 나노헬릭스-기판 복합체를 대상으로 전계방출 주사전자 현미경으로 촬영하였고, 푸리에 변환 적외선 분광분석(Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR)을 수행하였으며, 원자간력 현미경(Atomic force microscope, AFM)으로 촬영하였으며, 그 결과는 도 8 내지 도 11에 나타내었다.
푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)은 나노헬릭스의 화학적 결합 특성을 확인하기 위해, FTIR은 GX1(Perkin Elmer Spectrum, USA)을 사용하여 수행되었다. 화학적 결합 특성의 변화에 대한 분석을 거친 샘플을 분석 전에 동결 건조시키고 KBr 펠렛으로 조밀하게 패킹하였다.
도 8은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 제조하는 단계를 도식화한 이미지이다. 도 8을 살펴보면, 나노헬릭스에 아미노카프론산을 결합시켰다. 그런 다음, EDC/NHS 반응을 이용하여 EDC 및 NHS가 포함된 물에 아미노카프론산이 결합된 나노헬릭스를 넣어 활성화시킨 후 표면이 아민화된 기판과 결합시켰다. 기판이 결합되지 않은 나노헬릭스에 결합된 아미노카프로산에 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 후 티올화된 인테그린 리간드(RGD)와 반응시켜 인테그린 리간드를 나노헬릭스에 결합시켰다.
도 9는 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체의 푸리에 변환 적외선 분광(FT-IR) 분석한 결과이다. 도 9를 살펴보면, 아미노카프론산이 코팅된 나노헬릭스의 화학적 결합 특성을 알 수 있다. 구체적으로, 1560 - 1565 cm-1 및 1387 - 1389 cm-1에서 COO- 결합을 확인하였다. 이를 통해, 나노헬릭스에 아미노카프론산이 성공적으로 결합되었음을 알 수 있다.
더불어, 비리간드 특이적인(non-ligand-specific) 대식세포의 접착을 최소화하기 위해, 나노리간드가 결합되지 않은 기판은 메톡시-PEG-NHS 에스터 그룹과 결합하여 비활성화시켰고, 도 3을 살펴보면 노헬릭스의 균일한 분포는 주사전자현미경을 통해 확인할 수 있고, 밀도는 약 62802±2385나노헬릭스/mm2인 것을 알 수 있다.
도 10은 본 발명에 따른 나노헬릭스의 신장(strecting, "ON") 및 수축(compression, "OFF")에 의한 탄성 운동의 자기 이중 모드 스위칭(magnetic bimodal switching)을 확인하기 위해 원자간력 현미경(AFM)으로 촬영한 결과이다. 도 11은 본 발명에 따른 나노헬릭스에 자기장을 인가하지 않은 경우를 원자간력 현미경(AFM)으로 촬영한 결과이다.
도 10 및 도 11을 살펴보면, 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체는 자기장은 인가하면 나노헬릭스의 신장이 발생하여 나노헬릭스의 길이가 길어지고, 다시 자기장을 인가하지 않는 경우 나노헬릭스의 수축이 발생하여 나노헬릭스의 길이가 원래 상태로 돌아오는 것을 알 수 있다. 그러나, 나노헬릭스의 길이만 길어졌다가 다시 짧아질 뿐 나노헬릭스의 외경이나 나노헬릭스를 이루는 나노와이어의 직경은 크게 차이나지 않는 것을 확인할 수 있다.
구체적으로, 자기장 인가하기 전의 나노헬릭스의 길이는 1060±9nm이고, 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이는 1243±25nm이며, 다시 자기장을 인가하지 않으면, 나노헬릭스의 길이는 1052±9nm로 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 이때, 나노헬릭스의 외경은 174nm 내지 181nm로 유지되고, 나노헬릭스를 이루는 나노와이어의 직경은 83 내지 86nm로 유지되어 순환 스위칭(OFF→ON→OFF)되는 동안 큰 차이가 나지 않는 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체는 이중 모드 스위칭하는 동안 거시적인 리간드 밀도가 일정하게 유지되는 것을 알 수 있다.
실험예 3
본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장 인가에 따라 대식세포의 부착에 미치는 영향을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 12 내지 도 15에 나타내었다.
나노헬릭스의 이중 모드 전환하에서 대식세포의 부착성 및 표현형 분극화를 조절하는 효과를 평가하였다. 배양 전에 기판을 자외선 하에서 2시간 동안 멸균시켰다. RAW 264.7(ATCC)의 계대 5(passage 5)로부터 대식세포를 약 9X104 cell/cm2의 밀도로 멸균된 기판에 씨딩(seeding)하였고, 대식세포를 높은 글루코스 DMEM(high glucose DMEM), 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 및 50IU/ml 페니실린/스트렙토 마이신을 함유하는 기초 배지에서 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 대식세포의 이중 모드 스위칭 제어된 부착력은 "ON" 상태(기판 가장자리 근처에 270mT 영구자석 배치, 리간드 함유 나노헬릭스가 기판 가장자리쪽으로 신장함) 또는 "OFF" 상태(자석을 제거하여 원래의 나노헬릭스 구조로 수축함) 사이의 주기적 전환을 통해 평가하였다. 대식세포 부착을 평가하기 위한 대조 실험은 이중 모드 스위칭 하에서 수행되었지만 나노헬릭스 또는 인테그린 리간드가 없는 상태에서 수행되었다.
대식세포의 표현형 분극의 평가에 사용되는 M1 배지는 각각 10ng/mL의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 및 재조합 인터페론-감마(recombinant interferon-gamma, IFN-γ)를 갖는 기초 배지를 사용하여 제조하였다. 인터류킨-4(IL-4) 및 인터류킨-13(IL-13) 각각 20ng/Ml을 갖는 기초 배지를 사용하여 M2 배지를 제조하였다. 대식세포의 부착-보조 M2 표현형 분극은 ROCK(50μM Y2763), 미오신Ⅱ(10 μM 블레비스타틴) 또는 액틴 중합(2μg/mL의 사이토칼라신D) 억제제로 평가하였다.
도 12은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 배양된 대식세포(24시간 후)의 F-액틴, 핵 및 빈쿨린에 대한 공초점 면역 형광 이미지(a)이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 밀도, 세포 면적, 세포 신장 인자를 나타낸 그래프(b)이며, 스케일 바는 20㎛를 나타낸다.
도 12를 살펴보면, 공초점 면역 형광 이미지는 대식세포가 이중 모드 스위칭에서 자기장을 인가하는 "ON" 모드에서 자기장을 인가하지 않은 "OFF"와 비교하여 훨씬 더 높은 세포 부착 밀도와 빈쿨린 및 F-액틴 확산 영역을 가지므로 자기장 인가시에 대식세포의 부착을 촉진했음을 보여준다.
이를 통해, 거시적인 스트레칭 매개 대식세포 부착은 대식세포 접착을 촉진하기 위해 나노규모 스트레칭을 발휘할 수 있음을 확인하였다.
도 13은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 배양된 대식세포(24시간 후)의 살아있는 세포와 죽은 세포에 대한 공초점 면역 형광 이미지(a)이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 생존능력을 나타낸 그래프(b)이며, 스케일 바는 50㎛를 나타낸다.
도 13을 살펴보면, 자기장 인가하는 이중 모드 스위칭에도 세포 생존능력이 95%로 우수하여 대식세포에 대해 세포 적합성이 우수함을 알 수 있다.
도 14는 본 발명의 비교예에 따른 나노헬릭스가 없는 기판(No nanohelix) 또는 인테그린 리간드(RGD)가 결합하지 않은 나노헬릭스-기판 복합체에서 이중 모드 스위칭(bimodal switching)에 대한 대식세포의 부착성 실험한 것으로, 배양된 대식세포(24시간 후)의 F-액틴, 핵 및 빈쿨린에 대한 공초점 면역 형광 이미지(a)이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 밀도, 세포 면적, 세포 신장 인자를 나타낸 그래프(b)이며, 이때 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 14를 살펴보면, 비교예는 나노헬릭스가 없거나 인테그린 리간드(RGD)가 결합되지 않은 기판을 사용한 상태에서 이중 모드 스위칭 "ON" 및 "OFF"에서 유의미한 차이 없으므로, 대식세포의 부착을 촉진하지 않는 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체의 경우 인테그린 리간드가 나노헬릭스에 결합되어야 이중 모드 스위칭이 효과를 나타냄을 알 수 있다.
도 15는 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 12시간 간격으로 자기장 인가를 조절하여 36시간 동안 배양된 대식세포의 F-액틴, 핵 및 빈쿨린에 대한 공초점 면역 형광 이미지이고, 이때 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 15를 살펴보면, 자기장을 인가하지 않은 경우는 세포 부착에 변화가 없고, 자기장을 인가하는 경우 세포 부착이 촉진되며, 다시 자기장을 인가하지 않으면 가역적으로 세포 부착이 감소하는 것을 알 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체는 나노헬릭스의 신장 및 수축을 시간적 및 가역적 방식으로 대식세포의 부착을 촉진하고 억제하는 것을 알 수 있다.
실험예 4
본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 리간드 서열의 나노-주기성 조절이 대식세포의 표현형 분극 매개 부착을 제어하는지에 대한 실험을 다음과 같이 수행하였으며, 그 결과는 도 16 내지 22에 나타내었다.
대식세포의 부착 구조는 M1 또는 M2 분극 자극제의 존재하에 이들의 표현형 분극을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히, 길쭉한 형태의 일반적인 F-액틴 및 빈쿨린의 어셈블리를 포함하여 강력한 부착 구조를 나타내는 대식세포는 이들의 표현형 분극을 재생성/항염증성 M2 상태로 활성화시키는 경향이 있다. 반대로, 낮은 F-액틴 및 둥근 형태를 나타내는 대식세포는 M1 상태를 활성화시키는 경향이 있다.
도 16은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 자기장 인가에 의해 대식세포의 부착-의존적 표현형 분극이 조절되는지에 대한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 16을 살펴보면, 공초점 면역 형광 이미지는 대식세포가 점진적으로 M1-유도 배지에서 자기장을 인가할수록 약한 iNOS 형광 신호를 나타내었지만, M2-유도 배지에서는 자기장을 인가할수록 더 강한 Arg-1 형광 신호를 나타냈다. 또한, 유전자 발현 프로파일은 면역 형광에서 관찰된 경향을 확인할 수 있다. 대식세포는 M1-유도 배지에서 자기장을 인가할수록 상당히 낮은 iNOS 및 TNF-α 발현을 보였으나, M2-유도 배지에서 자기장을 인가할수록 높은 Arg-1 및 Ym1 발현을 보였다.
이를 통해, 대식세포 부착을 조절하는 나노헬릭스의 자기장 인가에 따른 이중 모드 스위칭이 대식세포의 부착성에 의존하는 분극을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
도 17은 본 발명의 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 분극 표현형과 매칭된 자극 배지가 없을 때(즉, M2-자극 배지에서 M1 발현 또는 M1-자극 배지에서 M2 발현)의 리간드 서열에서 나노-주기성의 조절에 대한 실험 결과이다.
도 17을 살펴보면, 분극 표현형과 매칭된 자극 배지 부재 하에(즉, M2-자극 배지에서 M1 발현 또는 M1-자극 배지에서 M2 발현) 자기장 인가 유무를 조절하는 것은 면역 형광에서 무시할만한 iNOS 및 Arg-1 발현을 최소로 나타내었고, iNOS, TNF-α, Arg-1 및 Ym1 발현에서 유의미한 차이를 나타내지 않음을 발견했다.
이를 통해, M1 및 M2 자극이 각각 적절한 자극없이 M1 또는 M2 발현의 변화에 영향을 미치지 않는 다는 것을 알 수 있다.
도 18은 36시간 동안 자기장을 인가한 신장("ON") 및 자기장을 인가하지 않은 수축("OFF")의 이중 모드 스위칭 하에 M1 또는 M2 배지에서 대식세포를 배양한 후 ROCK2 및 핵의 공초점 면역 형광 이미지(a) 및 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 ROCK2 면역형광 강도를 나타낸 그래프이며, 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.
도 18을 살펴보면, 자기장을 인가하는 것이 M2 배지 배양하에서 자기장을 인가하지 않는 것에 비해 ROCK2 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 자기장을 인가한 신장("ON") 조건에 의해 대식세포의 부착 의존성 M2 분극화를 매개하는 것을 알 수 있다.
도 19의 (a)는 M1 분극 배지에서 36시간 동안 배양한 후 CD68, F-액틴 및 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지와 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 면적, 세포 신장 인자 및 CD68 형광 강도를 나타낸 그래프이며, 도 19의 (b)는 ROCK(Y27632), 미오신Ⅱ(블레비스타틴) 또는 액틴 중합(사이토칼라신 D)에 대한 억제제의 존재 및 부재의 M2 분극 배지에서 배양한 후 Arg-1 및 F-액틴 및 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지이고, 공초점 면역 형광 실험 결과를 토대로 계산한 세포 면적, 세포 신장 인자 및 Arg-1 형광 강도를 나타낸 그래프이며, 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 19를 살펴보면, ROCK, 미오신Ⅱ 또는 액틴 중합을 억제하는 약리학적 저해제(각각 Y27632, 블레비스타틴 또는 사이토칼라신 D)를 사용하여 M1 배지 배양 하에서 이중 모드 스위칭 "ON" 하에서 대식세포의 M1 분극화 억제가 지속적으로 방해된 것을 확인할 수 있다. 또한, M2 배지 배양하에서는 상기 저해제를 처리할 때 강력한 부착(더 높은 세포 면적 및 신장 인자)와 M2 분극의 발현(Arg-1 발현)의 자극이 방해된 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, ROCK, 미오신Ⅱ 및 F-액틴이 인테그린 리간드 함유 나노헬릭스의 자기 이중 모드 스위칭(자기장 인가 유무)과 함께 M1 대 M2 분극의 조절에서 분자 스위치로 작동함을 알 수 있다.
실험예 5
본 발명에 따른 나헬릭스 제시 기판을 이용하여 자기장 인가에 따른 나노헬릭스의 신장 및 수축에 대해서 생체 내 숙주 대식세포의 부착 및 표현형을 공간적으로 조절한다는 것을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 20 내지 도 22에 나타내었다.
도 20은 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용한 생체 내 숙주 대식세포 부착 및 표현형 조절에 대한 실험 결과이다:(a)는 생체 내의 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장 인가를 나타낸 대략적인 모식도로, 인터루킨-4 및 인터루킨 -13(M2 유도제) 모두를 생체 내 피하 이식된 기판 상에 주사하였다. (b)는 나노헬릭스의 신장("ON") 및 수축("OFF")의 이중 모드 스위칭하에서 24시간 후 기판에 부착된 iNOS, F-액틴 및 숙주 대식세포의 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지 및 이를 정량화한 그래프이며, 스케일바는 20㎛를 나타낸다. (c)는 나노헬릭스의 신장("ON") 및 수축("OFF")의 이중 모드 스위칭하에서 24시간 후 기판에 부착된 M1 표현형 마커(iNOS 및 TNF-α)의 생체 내 부착성 숙주세포의 정량분석 결과 그래프이다.
도 21의 (a)는 나노헬릭스의 신장("ON") 및 수축("OFF")의 이중 모드 스위칭하에서 24시간 후 기판에 부착된 Arg-1, F-액틴 및 숙주 대식세포의 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지이며, 스케일바는 20㎛를 나타낸다. (b)는 나노헬릭스의 신장("ON") 및 수축("OFF")의 이중 모드 스위칭하에서 24시간 후 기판에 부착된 M2 표현형 마커(Arg-1 및 Ym1)의 생체 내 부착성 숙주세포의 정량분석 결과 그래프이다.
도 22는 본 발명에 따른 나노헬릭스-기판 복합체를 이용하여 기판에 대한 숙주 호중구의 생체내 부착 실험한 결과이다. (a)는 24시간 후에 기판에 부착된 NIMP-R14, F-액틴 및 숙주 세포의 핵에 대한 공초점 면역 형광 이미지이고, 스케일바는 20㎛이다. (b)는 생체내 부착성 NIMP-R14-양성 숙주 호중구의 정략 데이터로 인터루킨-4 및 인터루킨-13 모두 리간드 서열의 조정가능한 나노-주기성을 나타내는 피하 이식된 기판 상에 주입되었다.
도 20 내지 도 22를 살펴보면, 이중 모드 스위칭에서 자기장을 인가하는 신장("ON")은 자기장을 인가하지 않는 수축("OFF")에 비해 훨씬 더 높은 부착성 세포 밀도, F-액틴 확산 영역, 보다 뚜렷한 신장, 낮은 iNOS 및 TNF-α 발현으로 숙주 대식세포의 M1 분극을 억제하는 시간 조절 부착을 촉진하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 이중 모드 스위칭에서 자기장을 인가하는 신장("ON")은 견고한 부착 구조와 자기장을 인가하지 않는 수축("OFF")에 비해 부착성 NIMP-R14 양성 호중구과 관련된 상당히 높은 Arg-1 및 Ym1 발현을 갖는 숙주 대식세포의 부착 매개 M2 분극을 일시적으로 자극하는 것을 확인할 수 있다.

Claims (19)

  1. 기판; 기판과 화학 결합된 나노헬릭스; 및 상기 나노헬릭스와 화학 결합된 인테그린 리간드 펩티드를 포함하고,
    상기 나노헬릭스는 나선형의 나노와이어로 구성되며, 하나 이상의 금속원소를 포함하고,
    상기 나노헬릭스는 100 nm 내지 20 ㎛의 길이를 갖고,
    상기 나노헬릭스는 자기장 인가 유무에 따라 가역적으로 길이가 하기 식 1의 범위 내에서 변화하고,
    상기 자기장의 인가시에 상기 나노헬릭스의 길이가 신장하고,
    상기 자기장의 비인가시에 상기 나노헬릭스의 길이가 수축하는 것을 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체:
    [식 1]
    |L1-L0|>10 nm
    식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
    L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금속원소는 코발트(Co), 철(Fe) 및 니켈(Ni) 중 하나 이상의 원소를 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노와이어는 단면이 원형이 와이어의 형태로 구비되되, 직경은 5nm 내지 100nm이고,
    상기 나노헬릭스의 나선형 외경의 평균길이는 50nm 내지 200nm인 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인가되는 자기장은 100 mT 내지 7 T 크기인 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인테그린 리간드 펩티드는 복수개가 상기 나노헬릭스에 서로 이격되어 결합되되, 서로 이웃하는 인테그린 리간드 사이의 평균간격은 1 내지 10nm인 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    자기장 인가시, 상기 나노헬릭스의 서로 이웃한 나선은 이격되고, 서로 이웃한 나선 사이의 피치(pitch)는 1 nm 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인테그린 리간드 펩티드는 티올화된 인테그린 리간드 펩티드를 포함하고,
    상기 인테그린 리간드 펩티드의 티올기와 나선형의 나노헬릭스의 폴리에틸렌글리콜 링커로 인해 결합된 구조인 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 나노헬릭스는 카르복실산염이 치환되어 기판과 결합된 구조인 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 기판은 나노헬릭스가 결합되지 않은 기판의 표면이 비활성화된 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체.
  10. 하나 이상의 금속원소를 포함하는 용액을 전기증착하여 나노헬릭스를 준비하는 단계;
    상기 나노헬릭스와 제1 현탁액과 혼합하여 나노헬릭스에 카르복실산염 치환기를 치환하는 단계; 및
    카르복실산염이 치환된 나노헬릭스를 포함하는 용액에 표면이 활성화된 기판을 담지하여 나노헬릭스가 결합된 기판을 제조하는 단계;
    나노헬릭스가 결합된 기판을 폴리에틸렌글리콜 링커를 포함하는 용액에 담지하여 나노헬릭스의 말단에 링커를 결합하는 단계; 및
    인테그린 리간드 RGD 펩티드(Arg-Gly-Ast 펩티드)을 포함하는 제2 현탁액과 활성화된 나노헬릭스가 결합된 기판을 혼합하여 나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계;를 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    나노헬릭스를 준비하는 단계에서 금속원소를 포함하는 용액은 코발트(Co), 철(Fe) 및 니켈(Ni) 중 하나 이상의 금속원소를 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    카르복실산염 치환기를 치환하는 단계에서, 상기 제1 현탁액은 카르복실산염 치환기를 포함하는 아미노산 유도체를 포함하고,
    상기 아미노산 유도체가 나노헬릭스의 표면에 결합하는 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계에서, 상기 제2 현탁액은 티올화된 인테그린 리간드 펩티드를 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법.
  14. 제10항에 있어서,
    나노헬릭스가 결합된 기판을 제조하는 단계는, 기판을 산성용액 중에 침지시켜 기판의 표면을 활성화시킨 후 표면이 활성화된 기판을 아미노실란 용액 중에 담지하여 표면을 아민화시킨 기판을 사용하는 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법.
  15. 제10항에 있어서,
    나노헬릭스에 인테그린 리간드 펩티드를 결합하는 단계 이후에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 포함하는 용액에 나노헬릭스가 결합된 기판을 담지하여 나노헬릭스가 결합되지 않은 기판의 표면을 비활성화시키는 단계를 더 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체의 제조방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 대식세포의 세포 부착 및 분극화 조절용 나노헬릭스-기판 복합체에 배양액을 처리한 후 20 mT 내지 7 T의 자기장을 인가하여 대식세포의 세포 부착 및 분극화를 조절하는 단계를 포함하고,
    상기 나노헬릭스는 자기장 인가 유무에 따라 가역적으로 길이가 하기 식 1의 범위 내에서 변화하는 것을 포함하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법:
    [식 1]
    |L1-L0|>10 nm
    식 1에서, L1은 자기장 인가시의 나노헬릭스의 길이이고,
    L0은 자기장 인가되지 않은 나노헬릭스의 길이이다.
  17. 제16항에 있어서,
    대식세포의 부착 및 분극화를 조절하는 단계는 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가 유무에 따라 가역적으로 나노헬릭스의 길이를 변화시켜 생체 내 및 생체 외의 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    대식세포의 부착 및 분극화를 조절하는 단계는 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가하지 않는 경우 염증성 표현형을 촉진하는 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    대식세포의 부착 및 분극화를 조절하는 단계는 나노헬릭스-기판 복합체에 자기장을 인가하는 경우 재생성 및 항염증성 표현형을 촉진하는 것을 특징으로 하는 대식세포의 부착 및 분극화 조절 방법.
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