KR102421608B1 - Novel fusion peptides for gene delivery - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 하나 이상의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 융합 펩타이드는 동물세포 내로 플라스미드 DNA 등의 핵산을 전달(transfection)하기 위한 시약, 즉 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention provides a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is fused with one or more peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The fusion peptide of the present invention can be usefully used as a reagent for transfection of nucleic acids such as plasmid DNA into animal cells, that is, a gene delivery system.
Description
본 발명은 신규의 융합 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 세포-투과 펩타이드와 특정 DNA 전달 도메인이 융합된 신규의 융합 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 융합 펩타이드는 동물세포 내로 플라스미드 DNA 등의 핵산을 전달(transfection)하기 위한 시약, 즉 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel fusion peptide, and more particularly, to a novel fusion peptide in which a specific cell-penetrating peptide and a specific DNA delivery domain are fused. The fusion peptide of the present invention can be usefully used as a reagent for transfection of nucleic acids such as plasmid DNA into animal cells, that is, a gene delivery system.
형질감염(transfection)은 DNA 혹은 RNA와 같은 핵산(nucleic acids)을 동물세포로 전달하는 것을 말하며, 통상 '유전자 전달'로도 칭해진다. 유전자 전달은 플라스미드 DNA 전달을 통한 유전자의 과발현(gene overexpression) 또는 siRNA 전달을 통한 발현억제(gene silencing) 실험을 통해 유전자의 기능 연구, 단백질 발현 억제 연구, 유전자 조작을 통한 동물모델, 유전자 치료 기법 등에 필수적으로 사용되는 연구방법으로서, 생명공학 및 의과학 분야 대부분의 연구자들이 활용하고 있다. 이러한 유전자 전달 방법은 위에서 언급한 바와 같이 크게 두가지, (1) 특정 유전자를 플라스미드 DNA 혹은 바이러스성 벡터에 담아 세포내 전달하여 유전자의 과발현이나 돌연변이체의 발현을 유도하는 실험과 (2) siRNA, miRNA 등을 세포내로 전달하여 세포내 특정 유전자의 발현(단백질 발현)을 억제하는 실험에 널리 활용되고 있다. 이러한 유전자 발현 증가 또는 억제 실험 방법으로서, 비바이러스성 벡터에 유전자를 담아 리포좀 등의 유전자 전달체를 활용하여 유전자를 전달하거나 혹은 바이러스성 벡터에 유전자를 담아 직접 세포에 감염(infection)시키는 방법이 대표적으로 사용되고 있다. Transfection refers to the transfer of nucleic acids such as DNA or RNA to animal cells, also commonly referred to as 'gene transfer'. Gene transfer is a gene overexpression through plasmid DNA transfer or gene silencing through siRNA transfer to study gene function, protein expression suppression studies, animal models through gene manipulation, gene therapy techniques, etc. As an essential research method, most researchers in the fields of biotechnology and medical science are using it. As mentioned above, there are two methods of gene delivery: (1) an experiment in which a specific gene is placed in plasmid DNA or a viral vector and delivered intracellularly to induce gene overexpression or mutant expression, and (2) siRNA, miRNA It is widely used in experiments to suppress the expression of specific genes (protein expression) in cells by delivering them into cells. As an experimental method for increasing or suppressing gene expression, a method of transferring a gene by using a gene delivery system such as liposome by placing a gene in a non-viral vector or direct infection (infection) into a cell by placing a gene in a viral vector is representative is being used
플라스미드 DNA 벡터로 대표되는 비바이러스성 벡터를 이용한 세포내 유전자 전달 방법은 원하는 유전자를 플라스미드 DNA 벡터에 직접 재조합 방법으로 삽입하여 제조하기가 수월하고, 여기에 리포좀 등의 유전자 전달체만 시약으로 구입해 사용하면 되므로 오래전부터 유용하게 사용되어 왔다. 여기서 필요한 유전자 전달체 연구 시약으로는, DNA를 포함한 핵산이 음이온(negative charge)을 갖기 때문에 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있는 양이온성 고분자 물질들이 이용되어 왔다. 이러한 양이온성 고분자 물질들에는 폴이에틸이민(polyethulenimine, PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(다이메틸아미노)에틸]메타크릴레이트-(PDMAE-MA) 등이 포함되며, 이들은 유전자들과의 결합 효율이 좋은 것뿐만 아니라 세포내 엔도좀(endosome)에서 탈출하는 기작인 '양성자 스폰지(proton-sponge)' 효과가 뛰어나서 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드, siRNA 전달에 널리 사용되고 있다. 최근에는 동물세포의 세포막 구조와 유사한 구조체 형식으로 양이온성 지질(cationic liposome) 또는 음이온성 지질(anionic liposome) 등의 고분자를 이용하여 플라스미드 DNA 뿐만 아니라 siRNA를 세포내 전달하는 시약이 다수 개발되고 있다. 이러한 제품으로는 리포펙타민(Lipofectamine) (Thermo Fisher Scientific 등), I-FECT (Neuromics), LipoTrust (CosmoBio) 등의 지질 전달체들이 알려져 있다. 이러한 유전자 전달체를 구입하여 비바이러스성 DNA 벡터를 전달하는 방법의 장점은 벡터에 원하는 유전자를 자유롭게 재조합 가능하며, 유전자 크기에도 비교적 제한이 없는 장점과 함께 동물모델에서 바이러스성 벡터 사용으로 나타나는 면역반응이나 안전성의 문제, 유전적 변형 등의 부작용의 우려를 줄일 수 있다는 점이다. 그러나 단점으로는 세포내 전달 효율이 낮고, 특히 1차 배양세포(primary culture cells)나 동물모델에선 유전자 전달이 거의 되지 않으며, 또한 리포좀과 같은 유전자 전달체 시약의 값이 고가인 문제가 있다. 따라서 최근에는 마이크로인젝션(microinjection), 일렉트로포레이션(electroporation) 등의 방법이 시도되고 있으나 세포수준에서만 제한적으로 사용할 수 있는 한계가 있다.The intracellular gene delivery method using a non-viral vector represented by a plasmid DNA vector is easy to manufacture by directly inserting a desired gene into a plasmid DNA vector by a recombinant method. Therefore, it has been useful for a long time. As a reagent for the study of gene delivery systems required here, cationic polymer materials capable of forming complexes through ionic bonds have been used because nucleic acids including DNA have a negative charge. Such cationic polymer materials include polyethulenimine (PEI), poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolic acid], polyamidoamine dendrimer, poly[N,N'-(dimethylamino) ) ethyl] methacrylate-(PDMAE-MA), etc., which have good binding efficiency with genes as well as 'proton-sponge', a mechanism for escaping from intracellular endosomes It is widely used for delivery of plasmid DNA, oligonucleotide, and siRNA due to its excellent effect. Recently, many reagents for intracellular delivery of siRNA as well as plasmid DNA using polymers such as cationic liposomes or anionic liposomes in a structure similar to the cell membrane structure of animal cells have been developed. Lipid carriers such as Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific, etc.), I-FECT (Neuromics), and LipoTrust (CosmoBio) are known as such products. The advantage of the method of purchasing such a gene delivery system and delivering a non-viral DNA vector is that the desired gene can be freely recombined in the vector, and there is no restriction on the size of the gene. The point is that it can reduce concerns about side effects such as safety issues and genetic modification. However, as a disadvantage, there is a problem that the intracellular delivery efficiency is low, in particular, gene delivery is hardly performed in primary culture cells or animal models, and the value of gene delivery agent reagents such as liposomes is expensive. Therefore, recently, methods such as microinjection and electroporation have been tried, but there is a limit in that it can be used limitedly only at the cellular level.
바이러스성 벡터(viral vector)로서 주로 사용되고 있는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 렌티바이러스(rentivirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus or adeno-associated virus) 벡터 등은 원하는 유전자를 재조합하고 바이러스로 제작하여 세포내 전달하면 직접적인 감염이 되기 때문에 높은 유전자 전달 효율을 기대할 수 있는 장점이 있다. 그러나 동물모델 등의 시험관 내(in vivo) 실험시 바이러스성 벡터 자체가 유발하는 면역반응으로 인해 반복적으로 사용하기 어렵고, 전달하고자 하는 유전자의 크기에도 제한이 있으며, 무엇보다 개별 연구자들이 쉽게 바이러스 벡터를 제조 또는 이를 이용한 클로닝 및 바이러스 파티클을 제조하기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 세포모델에서 높은 유전자 전달 효율을 원하거나 동물모델 실험이 필요한 개별 연구자들은 외부 전문업체에 고비용으로 몇주간의 제작과정이 소요되는 바이러스성 벡터 제조를 의뢰하는 방법을 택하고 있다. 최근엔 이를 극복하기 위해, 바이러스 입자를 모방하여 만든 SNALP(stable nucleic acid-lipid particle)을 이용하여 siRNA 등을 동물 모델에서 전달시킨 사례가 보고된 바 있다.Retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus or adeno-associated virus vectors, etc., which are mainly used as viral vectors, are recombined with a desired gene and produced as a virus for intracellular delivery. Since it is a direct infection, there is an advantage that high gene transfer efficiency can be expected. However, in in vitro experiments such as animal models, it is difficult to use repeatedly due to the immune response induced by the viral vector itself, there is a limitation in the size of the gene to be delivered, and above all, individual researchers can easily develop the viral vector. There is a disadvantage in that it is difficult to manufacture or to cloning and virus particles using the same. Therefore, individual researchers who want high gene transfer efficiency in cell models or who need animal model experiments are choosing the method of requesting an external professional company to manufacture a viral vector that takes several weeks at high cost. Recently, to overcome this problem, it has been reported that siRNA and the like are delivered in an animal model using SNALP (stable nucleic acid-lipid particle) made by mimicking virus particles.
본 발명자들은 종래의 비바이러스성 벡터 사용 방법의 장점, 특히 개별 연구자들이 쉽게 사용할 수 있고 스스로 재조합 조작이 가능한 장점은 그대로 유지하면서 동시에 바이러스 벡터를 사용하지 않고도 세포내 유전자 전달 효율을 증가시킬 수 있는 유전자 전달체를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 특정 세포-투과 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP)와 특정 DNA 전달 도메인(DNA-binding domain, DBD)이 융합된 새로운 융합 펩타이드를 제작하였으며, 얻어진 융합 펩타이드가 동물세포 내로 플라스미드 DNA 등의 핵산을 높은 전달효율로 전달하기 위한 시약, 즉 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.The present inventors found a gene capable of increasing intracellular gene transfer efficiency without using a viral vector while maintaining the advantages of the conventional method of using a non-viral vector, in particular, the advantage of being easily used by individual researchers and capable of self-recombination manipulation. Various studies were conducted to develop the delivery system. The present inventors produced a new fusion peptide in which a specific cell-penetrating peptide (CPP) and a specific DNA-binding domain (DBD) are fused, and the obtained fusion peptide is introduced into animal cells such as plasmid DNA It has been found that it can be usefully used as a reagent for delivering nucleic acids with high delivery efficiency, that is, as a gene delivery vehicle.
따라서, 본 발명은 유전자 전달체로서 유용한 융합 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a fusion peptide useful as a gene delivery system.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 하나 이상의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드가 제공된다.According to one aspect of the present invention, there is provided a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is fused with one or more peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 융합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 C-말단에 하나 이상의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 1 내지 3개의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 것일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 융합 펩타이드는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.The fusion peptide of the present invention may be one in which one or more peptides composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are fused to the C-terminus of the peptide composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the fusion peptide of the present invention may be one in which one to three peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are fused to the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the fusion peptide of the present invention may consist of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 5.
본 발명의 융합 펩타이드는 특정 세포-투과 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP)와 특정 DNA 전달 도메인(DNA-binding domain, DBD)이 융합된 새로운 융합 펩타이드로서, 동물세포 내로 플라스미드 DNA 등의 핵산을 높은 전달효율로 전달하기 위한 시약, 즉 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 펩타이드는 1차 배양세포(primary culture cells)를 사용하는 연구 및 실험에서도 유용하게 사용될 수 있으며, 종래의 연구용 시약의 단점을 근본적으로 회피할 수 있다.The fusion peptide of the present invention is a new fusion peptide in which a specific cell-penetrating peptide (CPP) and a specific DNA-binding domain (DBD) are fused. It can be usefully used as a reagent for delivery with delivery efficiency, that is, a gene delivery system. Therefore, the fusion peptide of the present invention can be usefully used in research and experiments using primary culture cells, and can fundamentally avoid the disadvantages of conventional research reagents.
도 1은 혈관내피세포를 사용하여 본 발명의 융합 펩타이드가 세포내로 침투하는지 여부를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 플라스미드 DNA인 pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Promega)의 개열지도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 융합 펩타이드 및 리포펙타민을 각각 사용하여 혈관내피세포에 대한 플라스미드 DNA의 전달 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 융합 펩타이드의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸다.1 shows the results of measuring whether the fusion peptide of the present invention penetrates into cells using vascular endothelial cells.
2 shows a cleavage map of the plasmid DNA, pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Promega).
3 shows the results of measuring the transfer efficiency of plasmid DNA to vascular endothelial cells using the fusion peptide and lipofectamine of the present invention, respectively.
4 shows the results of measuring the cytotoxicity of the fusion peptide of the present invention.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 하나 이상의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드를 제공한다.The present invention provides a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is fused with one or more peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 융합 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 특정 DNA 전달 도메인(즉, 8-mer의 펩타이드)를 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 특정 세포-투과 펩타이드(즉, 11-mer의 펩타이드)를 융합시켜 얻어진 펩타이드로서, 전달하고자 하는 플라스미드 DNA가 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 결합하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 의해 세포내로 투과되도록 설계되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 펩타이드는 동물세포 내로 플라스미드 DNA 등의 핵산을 높은 전달효율로 전달하기 위한 시약, 즉 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있으며, 1차 배양세포(primary culture cells)를 사용하는 연구 및 실험에서도 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 융합 단백질은 종래의 유전자 전달체의 단점(특히 낮은 전달 효율)을 효과적으로 해결할 수 있다.The fusion peptide of the present invention is a specific cell-penetrating peptide composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (ie, the peptide of 11-mer) with a specific DNA transfer domain (ie, 8-mer peptide) composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 As a peptide obtained by fusion of , the plasmid DNA to be delivered binds to the peptide composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and is designed to penetrate into the cell by the peptide composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Therefore, the fusion peptide of the present invention can be usefully used as a reagent for delivering nucleic acids such as plasmid DNA into animal cells with high delivery efficiency, that is, a gene delivery system, and studies using primary culture cells and It can also be usefully used in experiments. In particular, the fusion protein of the present invention can effectively solve the disadvantages (especially low delivery efficiency) of the conventional gene delivery system.
본 발명의 융합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 형태일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 C-말단에 하나 이상의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 융합된 형태일 수 있다. The fusion peptide of the present invention may be in a form in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is fused to the N-terminus or C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. For example, the C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be in the form of a fusion of one or more peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 융합 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 1개 혹은 복수개, 바람직하게는 1개 내지 3개가 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 1개가 융합될 경우, 19-mer의 융합 펩타이드를 형성하게 되며; 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 2개가 융합될 경우, 27-mer의 융합 펩타이드를 형성하게 되며; 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 3개가 융합될 경우, 35-mer의 융합 펩타이드를 형성하게 된다. 상기 융합 펩타이드는 FMOC 고체-상 방법 등을 포함한 통상의 방법에 따라 자동화합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 융합 펩타이드는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.In the fusion peptide of the present invention, the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is one or more, preferably 1 to 3, the N-terminus or C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. can be fused to For example, when one peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is fused to the N-terminus or C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a 19-mer fusion peptide is formed; When two peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are fused to the N-terminus or C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a 27-mer fusion peptide is formed; When three peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are fused to the N-terminus or C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a 35-mer fusion peptide is formed. The fusion peptide can be synthesized using an automated synthesizer according to a conventional method including the FMOC solid-phase method and the like. In one embodiment, the fusion peptide of the present invention may consist of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 5.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrating the present invention, and the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. 융합 1. Fusion 펩타이드의of peptide 합성 synthesis
서열번호 3의 융합 펩타이드(19-mer, 'CPP-DBD-8'로 명명), 서열번호 4의 융합 펩타이드(27-mer, 'CPP-DBD-16'으로 명명), 서열번호 5의 융합 펩타이드(35-mer, 'CPP-DBD-24'로 명명)는 펩트론사(대전, 대한민국)에 의뢰하여 합성하였으며, 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.Fusion peptide of SEQ ID NO: 3 (19-mer, named 'CPP-DBD-8'), fusion peptide of SEQ ID NO: 4 (27-mer, named 'CPP-DBD-16'), fusion peptide of SEQ ID NO: 5 (35-mer, named 'CPP-DBD-24') was synthesized at the request of Peptron (Daejeon, Korea), and FMOC solid-phase using an automated synthesizer (PeptrEx-R48, Peptron, Daejeon, Korea) It was synthesized by the FMOC solid-phase method. The synthesized peptide was purified and analyzed by reverse-phase HPLC (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan) using a C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak), and mass spectrometer (HP 1100 Series) LC/MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA) was used for identification.
실시예Example 2: 융합 2: fusion 펩타이드의of peptide 세포내intracellular 침투 Penetration
혈관내피세포인 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs, Lonza)를 EGM 배지(Lonza)에서 배양한 후, 세포를 염색하기 위해 세포-표지 염색시약(cell-labeling dye) (VybrantTM DiD - red color, Thermo Fisher Scientific)를 최종 5 ul/ml의 농도로 처리하여 37℃ CO2 인큐베이터에서 30분간 방치하였다. 이후 PBS로 3회 세척하고, 4-웰 챔버(lab-tek chamber slide, Nalge Nunc)에 1 x 105 세포를 각각 EGM 배지(Lonza)와 함께 시딩하고, 24시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 서열번호 4의 융합 펩타이드(CPP-DBD-16)는 에스테르-활성화 Dylight 488 염색시약-녹색(ester-activated Dylight 488 dye - green color)(Thermo Fisher Scientific)로 다음과 같이 표지하였다. 융합 펩타이드 CPP-DBD-16 10 ug에 Dylight 488 dye를 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 스핀 탈염 컬럼(spin desalting column) (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 30초간 원심분리하여 반응하지 않은 dye를 제거하였다. VybrantTM DiD로 염색되어 4-웰 챔버에서 배양된 HUVECs에 2 ug의 Dylight 488 dye로 염색된 융합 펩타이드 CPP-DBD-16을 처리하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 방치한 후, PBS로 3회 세척하고 형광현미경으로 VybrantTM DiD (red) (Abs 644 nm/Em 665 nm), Dylight 488 NHE-ester (green) (Abs 493 nm/Em 518 nm) 파장으로 관찰하였다. 도 1의 결과로부터, 융합 펩타이드 CPP-DBD-16을 처리하지 않은 대조군에는 녹색이 나타나지 않은 반면 융합 펩타이드 CPP-DBD-16 처리군에서는 녹색이 관찰됨을 알 수 있으며, 따라서 융합 펩타이드 CPP-DBD-16은 효과적으로 세포내로 투과됨을 알 수 있다(도 1).After culturing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs, Lonza), which are vascular endothelial cells, in EGM medium (Lonza), a cell-labeling dye (Vybrant TM DiD - red color, Thermo) was used to stain the cells. Fisher Scientific) was treated at a final concentration of 5 ul/ml and left in a 37° C. CO 2 incubator for 30 minutes. After washing three times with PBS, 1 x 10 5 cells were seeded with EGM medium (Lonza) in a 4-well chamber (lab-tek chamber slide, Nalge Nunc), respectively, and cultured for 24 hours to stabilize. The fusion peptide (CPP-DBD-16) of SEQ ID NO: 4 was labeled with ester-activated Dylight 488 dye-green color (Thermo Fisher Scientific) as follows. 10 ug of the fusion peptide CPP-DBD-16 was treated with Dylight 488 dye, reacted at room temperature for 1 hour, and then centrifuged for 30 seconds using a spin desalting column (Thermo Fisher Scientific) for unreacted dye. was removed. HUVECs stained with Vybrant TM DiD and cultured in a 4-well chamber were treated with 2 ug of the fusion peptide CPP-DBD-16 stained with Dylight 488 dye, left in a 37° C. CO 2 incubator for 1 hour, and then washed with
실시예Example 3: 융합 3: fusion 펩타이드를peptides 이용한 플라스미드 DNA 전달 Plasmid DNA transfer using
혈관내피세포인 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs, Lonza)를 사용하여 본 발명의 융합 펩타이드의 핵산 전달 효율을 평가하였으며, 비교를 위하여 위하여 현재 플라스미드 DNA 전달을 위해 사용되고 있는 시약인 리포펙타민(lipofectamine)의 핵산 전달 효율을 평가하였다. DNA 전달 효율을 위해 사용한 플라스미드 DNA로서, 리포터 유전자로 루시페라아제 유전자가 삽입되어 있는 pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Promega) 사용하였고, 활성 분석을 위해 Luciferase Reporter Assay Kit (Promega)을 사용하였다. 상기 pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Promega)의 개열지도는 도 2와 같다. 6-웰 플레이트에 1 x 106의 HUVECs을 EGM 배지(Lonza)와 함께 12시간 동안 배양한 후, pGL3 vector 4 ug과 융합 펩타이드 CPP-DBD-16 1ug을 섞어 30분간 반응시킨 후 세포에 처리하였다. 이때 비교군은 pGL3 vector 4 ug을 리포펙타민 2000 (Thermo Fisher Scientific) 10 ul과 함께 제조사 지침에 따라 처리하였다. 상기 처리 후 24시간 이후, 루시페라아제 활성 분석을 수행하였다. 도 3의 결과로부터, 리포펙타민 2000을 처리한 대조군에 비해 융합 펩타이드 CPP-DBD-16를 처리한 시험군의 루시페라아제 활성이 약 3배 정도 높음을 알 수 있다(도 3).The nucleic acid delivery efficiency of the fusion peptide of the present invention was evaluated using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs, Lonza), which are vascular endothelial cells. For comparison, lipofectamine, a reagent currently used for plasmid DNA delivery, was used. The efficiency of nucleic acid transfer was evaluated. As plasmid DNA used for DNA transfer efficiency, pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Promega) in which a luciferase gene is inserted as a reporter gene was used, and Luciferase Reporter Assay Kit (Promega) was used for activity analysis. The cleavage map of the pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Promega) is shown in FIG. 2 . After incubating 1 x 10 6 HUVECs in a 6-well plate with EGM medium (Lonza) for 12 hours, 4 ug of pGL3 vector and 1 ug of the fusion peptide CPP-DBD-16 were mixed and reacted for 30 minutes, and then the cells were treated. . In this case, the control group was treated with 4 ug of pGL3 vector along with 10 ul of Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions. 24 hours after the treatment, luciferase activity assay was performed. From the results of FIG. 3 , it can be seen that the luciferase activity of the test group treated with the fusion peptide CPP-DBD-16 was about 3 times higher than that of the control group treated with Lipofectamine 2000 ( FIG. 3 ).
실시예Example 4: 융합 4: fusion 펩타이드의of peptide 세포 독성 cytotoxicity
기존의 사용중인 일부 유전자 전달체는 세포독성이 발견되는 것으로 보고되고 있어, 본 발명의 융합 펩타이드의 세포 독성을 평가하였다. 24-웰 플레이트에 1 x 105의 HUVECs을 EGM 배지(Lonza)와 함께 배양하고 융합 펩타이드 CPP-DBD-16를 농도별로 처리한 후 48시간 후에 MTT 분석을 실시하여 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다. 도 4의 결과로부터, 처리 농도에 관계없이 본 발명의 융합 펩타이드는 유의성 있는 세포 사멸을 초래하지 않음을 알 수 있다(도 4).It has been reported that some gene delivery systems in use have cytotoxicity, so the cytotoxicity of the fusion peptide of the present invention was evaluated. In a 24-well plate, 1 x 10 5 HUVECs were cultured with EGM medium (Lonza), treated with the fusion peptide CPP-DBD-16 by concentration, and MTT analysis was performed 48 hours later to measure cell viability. did. From the results of FIG. 4 , it can be seen that the fusion peptide of the present invention does not cause significant cell death regardless of the treatment concentration ( FIG. 4 ).
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel fusion peptides for gene delivery <130> PN0763 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-binding domain <400> 2 Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys 20 25 <210> 5 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys 20 25 30 Ala Lys Lys 35 <110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel fusion peptides for gene delivery <130> PN0763 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell-penetrating peptide <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-binding domain <400> 2 Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys 20 25 <210> 5 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys 20 25 30 Ala Lys Lys 35
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| Faranak Sadeghian et al., ‘Design, engineering and preparation of a multi-domain fusion vector for gene delivery’, International Journal of Pharmaceutics, Vol. 427, pp. 393-399, 2012.* |
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| Date | Code | Title | Description |
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| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |