KR102413226B1

KR102413226B1 - 레고라페닙을 유효성분으로 포함하는 항노화 조성물

Info

Publication number: KR102413226B1
Application number: KR1020210113135A
Authority: KR
Inventors: 김응국; 신은영; 이건우
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2022-06-23

Abstract

본 발명은 레고라페닙을 유효성분으로 포함하는 항노화 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 레고라페닙을 유효성분으로 포함하는 세포 노화 억제용 조성물, 노화 또는 노화관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 시험관 내에서 레고라페닙을 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화의 지연 또는 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 레고라페닙은 세포 노화의 지표인 SA-β-갈락토시다아제의 활성을 억제할 수 있고, p21 및 p16 단백질의 발현을 억제할 수 있으며, 노화 관련 분비 표현형(SASP: senescence-associated secretory phenotype) 억제 활성을 모두 가지고 있어 세포 노화를 효과적으로 억제 또는 지연시킬 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 레고라페닙은 항노화용 의약품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

레고라페닙을 유효성분으로 포함하는 항노화 조성물{Composition comprising regorafenib having anti-senescence activity}

본 발명은 레고라페닙의 노화 조절 활성을 규명한 것으로, 구체적으로 레고라페닙을 유효성분으로 포함하는 항노화 조성물에 관한 것이다.

세포 노화는 개체의 노화를 유발하는 주요 원인으로 활성 산소의 증가, 독극물 및 방사선 노출 등에 의한 DNA 손상, 지속적인 세포 증식에 의한 염색체 말단 텔로미어의 단축, 바이러스나 세균 감염 및 암 유전자의 활성화 등과 같은 다양한 내적 및 외적 스트레스에 의해 유발된다. 노화된 세포는 크기가 커지고, 모양이 편평해지며, 핵에 이질염색질이 증가하고, 세포질에 공포가 많아지는 형태학적 특징이 나타난다. 또한, 세포 노화를 규정하는 다양한 지표는 대표적으로 p16^Ink4a, p21^Cip1, p19^Arf 발현의 증가, 세포주기(cell cycle) 정지, SA-β-Gal(senescence associated-β-galactosidase)의 활성화, SASP(senescence-associated secretory phenotype)의 발현 등을 들 수 있다.

세포 노화(cellular senescence)는 단순히 개체나 조직의 노화에 기여할 뿐만 아니라, 여러 가지 다양한 질병의 병인에 중요한 역할을 한다. 노화 관련 질환으로는 뇌졸중, 심장질환, 암, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 관절염, 당뇨병, 대사증후군, 신부전, 실명, 만성폐쇄성 폐질환, 특발성 폐섬유화증 등이 대표적이다. 최근 질환의 치료 표적으로 노화된 세포를 제거하거나 세포 노화를 지연시킬 수 있는 약물의 개발이 주목받고 있다. 이러한 약물을 포괄적으로 항노화 약물(anti-aging drug)로 정의한다.

한편, 노화 세포가 축적되면 노화된 세포는 잘 분열하지 못하고, 손상된 조직은 적절히 복구되지 못한다. 또한 주위 조직을 분해하는 효소나 염증성 사이토카인 등의 분비를 촉진함으로 조직의 손상을 가속시켜 노화와 관련된 질환 발병에 기여한다. 따라서 세포의 노화가 개체의 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 세성 노화를 지연시킴으로 개체 노화를 조절하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

또한 세포 노화는 암화 혹은 손상된 세포의 증식을 억제하는 측면도 있는 반면 줄기세포의 소멸 및 조직의 염증반응을 촉진시켜 질병을 유발하거나 악화시키는 부정적인 측면도 있다. 그러므로 많은 연구자들은 세포 노화를 조절할 수 있는 물질의 개발에 더욱 집중하고 있으며, 세포 노화의 조절을 통해 노화와 관련된 다양한 질병을 극복할 수 있을 것으로 기대하고 있다.

그러나 아직까지 효과적으로 세포 노화를 조절할 수 있는 물질의 개발이 미비한 실정이다.

미국공개특허 US2015/0328145

이에 본 발명자들은 세포 노화를 조절할 수 있는 약물을 개발하기 위해 연구하던 중, 세포노화를 유도시킨 세포주를 대상으로 1000여종의 FDA 약물을 대상으로 항노화 활성이 있는 약물을 스크리닝한 결과, 항암제로 알려져 있는 레고라페닙(regorafenib)이 세포노화를 지연시킬 수 있는 우수한 항노화 활성이 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 레고라페닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 레고라페닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 분리된 노화세포에 레고라페닙을 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화의 지연 또는 억제 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 레고라페닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 노화는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도되는 세포 노화일 수 있다.

또한 본 발명은 레고라페닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노화 또는 노화 관련 질환은, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도되는 질환일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 레고라페닙은, SA-β-갈락토시다아제 활성 억제; p21 및 p16 단백질의 발현 억제; 및 노화 관련 분비 표현형(SASP: senescence-associated secretory phenotype) 억제 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 뇌졸중, 심장질환, 암, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 관절염, 당뇨병, 대사증후군, 신부전, 조로증, 인지 질환, 동맥경화, 탈모, 만성폐쇄성 폐질환 및 폐섬유화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 시험관 내에서 노화세포에 레고라페닙을 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화의 지연 또는 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노화세포는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도된 노화세포일 수 있다.

본 발명의 레고라페닙은 세포 노화의 지표인 SA-β-갈락토시다아제의 활성을 억제할 수 있고, p21 및 p16 단백질의 발현을 억제할 수 있으며, 노화 관련 분비 표현형(SASP: senescence-associated secretory phenotype) 억제 활성을 모두 가지고 있어 세포 노화를 효과적으로 억제 또는 지연시킬 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 레고라페닙은 항노화용 의약품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta) 발현 저해로 유도된 세포 노화에서 레고라페닙에 의한 세포 노화 억제를 확인한 것으로, A는 어린 폐 섬유아세포 IMR-90에 βPIX에 대한 siRNA를 처리하여 세포 노화를 유도한 후, 레고라페닙을 처리한 다음 세포 노화 정도를 분석하는 실험 스케줄을 나타낸 것이고, B 및 C는 레고라페닙 처리유무에 따른 SA-β-갈락토시다아제의 활성정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, D 및 E는 p21 및 p16 단백질의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이고, F는 SASP 발현량 분석으로 IL-6(빨간색) 및 IL-8(파란색)의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 독소루비신으로 유도된 세포 노화에서 레고라페닙에 의한 세포 노화 억제를 확인한 것으로, A는 어린 폐 섬유아세포 IMR-90에 독소루비신을 처리하여 세포 노화를 유도한 후, 레고라페닙을 처리한 다음 세포 노화 정도를 분석한 실험 스케줄을 나타낸 것이고, B는 독소루비신 처리에 따른 p21의 발현 증가로 세포 노화를 확인한 것을 나타낸 것이며, C 및 D는 레고라페닙 처리유무에 따른 SA-β-갈락토시다아제의 활성정도를 분석한 결과를 나타낸 것이고, E 및 F는 p21 및 p16 단백질의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 복제성 노화에서 레고라페닙에 의한 세포 노화 억제를 확인한 것으로, A 및 B는 어린 폐 섬유아세포(10회 계대배양한 세포) 및 노화된 폐 섬유아세포(42회 계대배양한 세포)에서 레고라페닙 처리 유무에 따른 SA-β-갈락토시다아제의 활성정도를 분석한 것이고, C는 p21 및 p16 단백질의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 레고라페닙이 세포 노화를 조절할 수 있는 활성이 있음을 규명한 점에 특징이 있다.

본 발명자들은 신규한 노화 조절 약물을 발굴하기 위해 연구하던 중, 종래 항암제로 알려진 레고라페닙이 세포 노화를 지연 또는 억제하는 활성이 있음을 처음으로 규명하였다.

따라서 본 발명은 레고라페닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

이와 관련하여 본원의 일실시예에서는, 세포 노화를 유도시킨 폐 섬유아세포를 대상으로 레고라페닙을 처리한 군과 처리하지 않은 군에서의 세포 노화 정도를 분석하였는데, 그 결과, 레고라페닙을 처리한 군에서는 세포 노화 지표들의 발현 및 활성이 억제되는 것으로 나타났다.

구체적으로, βPIX의 발현이 억제되면 세포 노화가 유도되는 것으로 알려진 사실을 토대로, βPIX에 대해 특이적인 siRNA를 처리하여 βPIX 발현 억제를 통해 세포 노화를 유도시킨 후, 레고라페닙을 처리한 결과, SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase)의 활성이 감소되는 것으로 나타났고, 노화 지표인자들로 알려진 p16^Ink4a과 p21^Cip1의 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 세포 노화에서 증가되는 것으로 알려진 노화 관련 분비 표현형(SASP: senescence-associated secretory phenotype)도 억제되는 것으로 나타났다(도 1 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, βPIX 발현 억제로 유도되는 세포 노화 이외에도 본 발명의 레고라페닙이 독소루비신과 같은 노화 유도 약물에 의한 세포 노화도 억제할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 즉, 세포 노화를 유도하는 활성이 있는 약물로 알려진 독소루비신을 어린 폐 섬유아세포에 처리하여 세포 노화를 유도시킨 후, 레고라페닙 처리 유무에 따른 노화 지표들의 변화를 분석하였는데, 레고라페닙을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 SA-β-gal의 활성 및 p16^Ink4a과 p21^Cip1의 발현이 모두 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 이러한 실험 결과를 통해 본 발명의 레고라페닙이 세포 노화를 억제 또는 지연시키는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 정상적인 인간 체세포가 무한정 세포분열을 지속하는 것이 아니고 일정한 횟수만큼만 증식한 후 비가역적으로 세포 분열이 정지되는 것이 복제성 노화 (replicative senescence)이다. 복제성 노화는 주로 염색체 말단의 텔로미어 길이가 분열을 거듭하면서 단축되고 이를 세포가 인식하게 됨으로서 세포 노화가 유도되는 것이며, 세포는 대수 성장기 (logarithmic growth period)를 거쳐 세포성장률이 점진적으로 느려지면서 여러 기능적, 형태적 변화들을 수반하게 된다. 이러한 변화들 중 대표적인 것으로는 i) 크고 평평하게 세포 형태가 변화되고, ii) 특정 pH (pH 6.0) 에서의 노화-연관 베타 갈락토시다아제(SA-β-gal)가 활성화가 되며, iii) lipofuscin (자가형광 리소솜 색소) 축척, iv) 노화-연관 이질염색질 부위 (senescence-associated heterochromatin foci) 형성, v) 성장인자에 대한 조기발현유전자 (immediate early gene)의 비반응성, vi) 유전자발현의 변화 (전사과정이 일어나지 않음), vii) p53, p21, p16과 다른 종류의 cyclin-의존성 인산화효소 억제제 (즉, p27 과 p15)의 발현증가, viii) Rb의 저인산화, viiii) 세포사멸 저항성 획득 (모든 세포타입에 대한 것은 아님) 등을 들 수 있다.

이에 본 발명자들은 레고라페닙이 복제성 노화도 억제할 수 있는지를 확인하였는데, 어린 폐 섬유아세포 및 어린 폐 섬유아세포를 42회 계대배양하여 복제성 노화를 유도시킨 세포를 대상으로 레고라페닙 처리 유무에 따른 세포노화 정도를 비교하였다.

그 결과, 복제성 노화가 유도된 폐 섬유아세포 특이적으로 레고라페닙의 처리에 의해 SA-β-gal의 활성 및 p16^Ink4a과 p21^Cip1의 발현이 모두 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 어린 폐 섬유아세포에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 레고라페닙이 노화된 세포 특이적으로 세포의 노화를 억제 또는 지연시킨다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 레고라페닙 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 노화 또는 노화 관련 질환은, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도되는 질환을 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 노화 관련 질환은 이에 제한되지는 않으나, 뇌졸중, 심장질환, 암, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 관절염, 당뇨병, 대사증후군, 신부전, 조로증, 인지 질환, 동맥경화, 탈모, 만성폐쇄성 폐질환 및 폐섬유화증으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한 상기 만성폐쇄성 폐질환은 이에 제한되지는 않으나, 폐기종 또는 만성 기관지염을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 레고라페닙의 노화 억제는 SA-β-갈락토시다아제 활성 억제; p21 및 p16 단백질의 발현 억제; 및 노화 관련 분비 표현형(SASP: senescence-associated secretory phenotype) 억제 활성을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 치료란 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

나아가 본 발명은 시험관 내에서 노화 세포에 레고라페닙을 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화의 지연 또는 억제 방법을 제공할 수 있다.

여기서 상기 노화 세포는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도된 노화 세포일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예>

시약준비

Lipofectamine RNAiMAX, MEM(Minimum essential medium), FBS(Fetal Bovine Serum) 및 siPIX는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)에서 구입하여 사용하였다. 면역블롯팅을 위한 p16(sc-2826), p21(sc-6246), GAPDH에 대한 항체들은 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX)로부터 구입하여 사용하였다. Anti-βPIX 항체는 βPIX의 C-terminal 부위(439~648 aa)에 대한 항체를 사용하였다. SA-β-gal 염색용액 및 다른 시약들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입하여 사용하였다. 인간 염증 항체 어레이는 Abcam(Cambridge, UK)에서 구입하여 사용하였다. 또한 레고라페닙(Regorafenib)은 Selleckchem사의 제품을 사용하였다.

세포배양

사람의 폐 섬유아세포인 IMR-90 세포는 MEM(Minimum essential medium) 배지에 10% FBS 및 1 x 항생제(antibiotics)가 함유된 배양액에서 배양하였다. 세포는 습도가 포화된 37℃의 온도 및 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 세포노화를 유도하는 모든 어린 IMR-90 세포는 passage #9 ~ #12를 사용하였고, 복제 노화를 위한 늙은 세포는 passage #40 ~ #43의 세포들을 사용하였다.

β-galactosidase (SA-β-gal) 어세이

노화 관련 β-갈락토시다제 (SA-β-Gal) 활성 측정은 pH 6.0의 조건에서 Proc Natl Acad Sci USA 92, 9363-9367 (1995)에 기재된 방법을 조금 변형하여 수행하였다. 구체적으로, 세포를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 5분 동안 3% 포름알데히드로 고정시킨 다음, PBS로 세척하였다. 이후 세포를 37 ℃에서 13-14 시간 동안 SA-β-gal 염색용액(Sigma-Aldrich)에서 배양한 후, 30분 동안 Hoechst 33258로 염색하여 세포수를 세었다. 세포 노화는 총 세포수에 대한 SA-β-gal 양성 세포(청색 염색)의 비율로 계산하였다.

일시적 형질감염(Transient transfection)

siRNA를 이용한 형질감염은 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine RNAiMAX 형질감염 시약을 사용하여 수행하였다. 세포를 세포 배양접시에 분주한 후, βPIX에 대해 특이적인 siRNA 20nM을 형질 감염 시킨 후 3-4 일 동안 배양하면서 실험을 수행하였다. 본 실험에서 사용한 βPIX에 대해 특이적인 siRNA 서열은 다음과 같다.

siPIX: 5′-UCAACUGGUAGUAAGAGCAAAGUUU-3'

면역블롯팅(Immunoblotting)

세포를 차가운 용해 완충액(50mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100, 500μM EDTA, 200μM 피루브산 나트륨, 50mM β- 글리세로 포스페이트)으로 용해시키고, 상층액을 1차 항체로 4 ℃에서 18 시간 반응시켜 면역침강을 수행하였다. 면역 침전물들을 8-10 % SDS-PAGE로 전기영동하고, 트리스-글리신-메탄올 완충액(25 mM Tris base, 200 mM glycine and 20% methanol)상에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 이후 막은 3 % BSA가 함유된 Tris-완충 식염수 (TBS-T; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween-20)를 이용하여 30분 동안 블록킹 시켰고, 1 차 항체로 상온에서 1 시간 반응시킨 다음, TBS-T로 3회 세척하였다. 이후 막을 2차 horseradish peroxidase접합된 항체를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T로 3 회 세척한 후, 강화 화학 발광 시약을 사용하여 신호를 검출하였다.

SASP 어세이

IMR-90 세포는 βPIX에 대해 특이적인 siRNA 20nM을 트랜스펙션시킨 후, 48시간 동안 배양하였다. 48 시간 후 1 μM 레고라페닙을 첨가하고 24 시간을 더 배양한 세포 용출액을 확보한 다음, 인간 염증성 항체 어레이용 블럿과 함께 반응시킨 후, 분비된 사이토카인을 제조사의 지시(Abcam)에 따라 분석하였다.

<실시예 1>

βPIX 발현저해로 유도된 세포노화에서 레고라페닙 처리에 따른 세포노화 억제활성 분석

본 발명자들은 레고라페닙이 세포노화를 억제 또는 지연할 수 있는지를 확인하기 위해, 노화된 세포에 레고라페닙을 처리한 후, 세포의 노화지표들의 발현변화를 분석하였다. 이를 위해 노화된 세포는 세포 노화를 유발하는 것으로 알려진 βPIX에 대한 특이적 siRNA (siPIX)를 처리하여 βPIX 발현을 감소시킨 후 세포노화를 유발하였다. 구체적으로, 사람의 폐 섬유아세포인 IMR-90 세포에 βPIX에 대해 특이적인 siRNA 20nM을 트랜스펙션한 후, 48 시간을 배양하였다. 48 시간 후, 1 μM 레고라페닙을 처리한 다음, 24 시간을 더 배양한 후 SA-β-Gal 염색과 SASP(senescence-associated secretory particles) 발현변화를 분석하였다. 또한, 세포노화의 바이오마커인 p16과 p21 단백질의 발현 변화도 분석하였는데, 상기 같은 조건으로 βPIX siRNA를 처리하고, 0, 0.25, 0.5, 1.0 μM의 레고라페닙을 24시간 처리한 후, 세포로부터 단백질을 용출하여 면역블롯팅을 수행하였다.

그 결과, 어린 폐섬유아세포 IMR-90 세포에 siPIX를 3일간 처리하여 세포 노화를 유도시켰고(도 1A), 노화된 세포에 레고라페닙(REG)을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 세포 노화정도를 분석한 결과, 세포노화 지표인 SA-β-Gal의 발현과 활성이 siPIX가 처리된 노화세포에서는 siPIX가 처리되지 않은 세포에 비해 현저하게 증가된 것으로 나타난 반면, 노화세포에 레고라페닙을 처리한 군에서는 증가된 SA-β-Gal의 발현과 활성이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 1B 및 1C).

또한, p16^Ink4a과 p21^Cip1의 발현 변화 분석 결과, 세포 노화 시 증가된 p16^Ink4a과 p21^Cip1의 발현량이 레고라페닙의 처리 시, 농도 의존적으로 이들의 발현량이 감소되는 것으로 나타났고(도 1D 및 1E), 세포 노화에서 증가하는 것으로 알려진 SASP(senescence-associated secretory phenotype)의 발현량 분석에서도 노화된 세포에 레고라페닙을 처리한 경우, IL6와 IL-8의 발현이 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 1F).

이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 레고라페닙이 βPIX 발현 저해에 의해 유도되는 세포 노화를 억제 또는 지연시키는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2>

독소루비신 처리에 의해 유도된 세포노화에서 레고라페닙 처리에 따른 세포노화 억제활성 분석

독소루비신(Doxorubicin)은 항암제로 DNA cross-linking을 통해 암세포를 사멸시키는 활성을 가지고 있기도 하지만 세포 노화를 유도하는 약물로도 사용되고 있다. 이에 본 발명자들은 βPIX 발현 저해 이외에도 이러한 약물에 의한 세포노화에서도 레고라페닙이 세포노화를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

이를 위해, IMR-90 세포에 200 nM 독소루비신을 24시간 처리 한 후, 1 μM의 레고라페닙을 포함하는 새로운 배양액으로 교체하였고, 48시간 후 SA-β-Gal 염색을 통해 세포 노화 정도를 분석하였다.

또한, 세포노화의 바이오마커로 알려진 p16 및 p21 단백질의 발현량 검증을 위해 상기 세포배양 조건과 동일하게 독소루비신을 처리하고, 0, 0.25, 0.5, 1.0 μM 레고라페닙을 처리한 후, 세포로부터 단백질을 용출하여 면역블롯팅을 수행하였다.

그 결과, IMR-90 세포를 대상으로 독소루비신(DOX) 처리로 세포노화가 유도되고, 노화된 세포에 레고라페닙을 처리한 결과, 노화지표인 SA-β-Gal의 활성이 레고라페닙을 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 감소하였다(도 2B와 2C). 뿐만 아니라, 세포노화의 바이오마커인 p16 및 p21의 단백질 발현수준도 레고라페닙의 처리 농도에 비례하여 유의적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 2D와 2E).

이러한 결과 역시, 레고라페닙이 세포의 노화를 억제 또는 지연시킬 수 있음을 나타낸 것이다.

<실시예 3>

복제성 노화(Replicative senescence)에서 레고라페닙의 항노화 활성분석

나아가 본 발명자들은 레고라페닙이 복제성 노화에서도 세포 노화를 억제 또는 지연시킬 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

일반적으로 정상세포는 어느 정도 세포가 증식하게 되면 세포주기가 정지되면서 더 이상 DNA를 복제할 수 없는 시점에 이르게 된다. 이러한 현상은 1961년 Hayfilick과 Moorehead에 최초로 보고되었으며, 그 후 Hayfilick’s limit으로 명명되었다. 이러한 세포 상태를 세포 노화(cellular senescence)로 정의하고 있다. 사람의 폐 섬유아세포인 IMR-90 세포도 정상 세포이므로 세포 증식이 어느 정도 진행되면 세포가 노화 상태에 이르게 된다. 노화된 세포는 세포 증식이 멈추고 노화된 세포의 특성인 SA-β-Gal 활성 증가와 p16 및 p21 단백질의 발현이 증가한다. 어린 IMR-90 세포 역시 지속적으로 계대배양하면 세포 성장이 느려지고, 세포 모양이 변화되는 시기인 노화된 세포로 복제노화가 유도된다. 어린 폐 섬유아세포인 IMR-90 세포를 약 passage #40 이상 계대배양하면 복제노화가 유도되는 현상을 관찰할 수 있다. 복제노화 세포에 대한 증거로는 세포노화에 대한 바이오마커 단백질인 p16과 p21 단백질의 발현 증가로 확인한다. 이에 본 발명자들은 젊은 세포와 노화된 세포(passage #42)를 대상으로, 레고라페닙을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 세포노화 정도를 분석하였다. 이때 노화된 IMR-90 세포는 1 μM 레고라페닙을 포함하는 배양액 조건에서 24시간 배양한 후, SA-β-Gal 염색을 통해 세포노화 조절 효능을 검증하였고, 세포노화의 바이오마커인 p16과 p21 단백질의 발현량 검증을 위해 노화된 세포에 0, 0.25, 0.5, 1.0 μM 레고라페닙을 24시간 처리한 후, 세포로부터 단백질을 용출하여 면역블롯팅을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 노화된 세포에서만 레고라페닙에 의한 SA-β-Gal 활성 감소를 확인할 수 있었고(도 3A 및 3B), p16 및 p21 단백질의 발현도 노화된 세포에서만 레고라페닙 처리에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 3C).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 레고라페닙이 노화되지 않은 젊은 세포에 대해서는 세포노화 지연 효과가 미비하지만, 복제성 노화에 따른 노화된 세포에 대해서는 효과적으로 노화를 억제 또는 지연시키는 활성이 있음을 알 수 있었다.

이상의 결과를 통해 본 발명자들은 레고라페닙이 세포노화를 조절하는 활성이 있으며, 특히 세포노화의 진행을 억제 또는 지연시키는 항노화 활성이 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명의 레고라페닙은 노화로 유도되는 다양한 질환에 대한 새로운 치료제로서 사용 가능함을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

레고라페닙을 유효성분으로 포함하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도되는 폐 섬유아세포의 세포 노화 억제용 조성물.
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시험관 내(in vitro)에서 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현감소, 독소루비신(Doxorubicin) 또는 복제성 노화(Replicative senescence)로 유도되는 노화된 폐 섬유아세포에 레고라페닙을 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화의 지연 또는 억제 방법.
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