KR102400270B1 - 케라틴의 산업적 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산업적 규모의 인간 모발 유래의 케라틴 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 투석백을 이용한 정제법 대신에 포름산 및 암모니아수를 이용한 신규한 정제법을 사용함으로써, 산업적인 규모로 인간 모발 유래의 케라틴을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 케라틴은 수용성의 무정형 케라틴 분말 형태로, 의약, 섬유, 화장품 원료 등 산업적 용도로 다양하게 적용할 수 있으며, 인간 유래 모발로부터 추출되어 산업적 용도로 적용시 부작용의 가능성을 최소화한 이점을 지닌다.

Description

케라틴의 산업적 제조 방법{Industrial manufacturing method of keratin}
본 발명은 산업적 규모의 인간 모발 유래의 케라틴 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 투석백을 이용한 정제법 대신에 포름산 및 암모니아수를 이용한 신규한 정제법을 사용함으로써, 산업적인 규모로 인간 모발 유래의 케라틴을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
케라틴은 동물의 조직을 구성하는 주요 단백질이며, 각질이라고도 불리며, 우리가 흔히 보는 케라틴은 머리카락과 같은 체모, 동물의 뿔, 그리고 손톱, 발톱 등 인데, 이러한 케라틴은 보통 이황화 결합에 의해 물리적으로 단단한 결합물을 만든다. 일반적으로 케라틴은 케라틴이 함유된 동물 유래 또는 인체 유래 원료를 가루로 만들어서 뜨거운 유기용매 또는 물을 넣은 후, 단백질 분해효소로 단백질을 제거하여 분리할 수 있다. 케라틴의 주요 구성 성분은 글루탐산, 알기닌, 시스틴 등의 아미노산이며, 그 중에서도 시스틴의 함유량이 높다. 케라틴은 머리카락 및 손톱 등을 구성하는 진성 케라틴과 피부 또는 신경조직에 존재하는 유사 케라틴으로 나뉜다. 진성 케라틴의 시스틴 함유량은 11∼12%이고, 유사 케라틴은 4∼8%의 시스틴을 함유하고 있어 구분할 수 있다. 케라틴은 시스틴의 함유량이 높기 때문에 이황화 결합(-S-S-)이 망상으로 이어진 선상 구조를 갖는다.
케라틴은 구조 때문에 일반적으로는 물과 중성용매에서는 녹지 않고, 펩신, 트립신 등의 단백질 분해효소의 작용을 받지 않으나, 황화나트륨(탈모제), 티오글리콜산(퍼머넌트 웨이브약), 과산화수소, 알칼리 등에 약하다. 이는 상기 시약에 의하여 이황화 결합이 끊어지기 때문이다.
케라틴은 2차 구조에 의해 α-케라틴과 β-케라틴으로 나누어진다. 머리털이나 양털을 기본 구성하는 케라틴 분자는 α-케라틴이고, 머리털의 인장력을 갖게 하는 것이 β-케라틴이다. α-케라틴은 α-나선 구조이며, β-케라틴은 접지 구조이다. 접지 구조는 α-케라틴이 갖는 분자 내의 수소결합이 끊어져 분자 사슬이 늘어나서 인접하는 분자 사슬 사이에 수소결합을 형성하기 때문에 발생한다. α-케라틴과 β-케라틴 간의 전이는 가역적이며, β-케라틴은 인장력을 제거하면 저절로 수축하여 α-케라틴으로 되돌아온다.
생체 내에서 구조적인 역할을 하는 진성 케라틴은 인성과 불용성을 가지는데, 이는 공업 재료 및 소비재의 합성 중합체로부터 발견되는 케라틴의 고유한 특징이다. 단백질로서 케라틴은 우수한 물성을 보유하는 것 외에도, 기능을 다한 후에 생체 조직에 재흡수되고, 고도의 화학적 작용기를 갖는 중합체이므로 합성 중합체에 비해 다양한 특징을 가지고 있다.
현재, 양모 케라틴은 이온 교환능과 킬레이트 형성능이 뛰어나 의류용으로써 섬유의 개질, 가공 및 화학 구조 분석에 사용되고 있으나, 기능성 고분자 재료로의 연구는 미비한 실정이며, 양모로부터 제조한 케라틴은 항혈전성 의료용 재료로 사용되는 실리콘이나 우레탄과 유사한 정도의 항혈전성을 나타내는 것으로 보고되었다.
또한, 케라틴이 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 생체적합성 매트릭스로 가공될 수 있고, 이렇게 제조된 매트릭스는 섬유아세포(fibroblast)의 배양시 부착성과 증식률이 뛰어나다는 것이 보고되고 있다.
한편, '가용화 케라틴 제조 방법'에 대해 개시하고 있는 일본등록특허 제4707154호, '케라틴 단백질 추출 방법'에 대해 개시하고 있는 미국공개특허 제2015-0080552호, 및 '케라틴과 EGCG 복합체를 함유하는 조성물 및 그 제조방법'에 대해 개시하고 있는 한국등록특허 제10-1746219호에는 의약, 섬유, 화장품 원료 등 산업적 용도로 사용될 수 있는 케라틴 제조시 투석백을 이용한 정제법에 의해 고순도 케라틴을 최종 수득함에 대해 기재하고 있다.
상기 투석백을 이용한 정제법을 채택하여 케라틴을 수득할 시, 모발, 손톱, 발톱, 뿔, 깃털 등으로부터 케라틴을 추출할 때 사용한 염 및 유기용매를 효율적으로 제거할 수는 있으나, 투석백 내 수용될 수 있는 시료량의 제한으로 인해 산업적인 규모로 대량 생산할 수 없는 한계가 있을 뿐 아니라, 최종 케라틴을 얻기까지 장시간이 요구된다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 산업적 규모로 케라틴을 대량 생산하고자 예의 노력한 결과, 종래기술에서 케라틴 추출 시 사용한 염 및 유기용매 제거를 위해 사용한 투석백을 이용한 정제법 대신, 포름산 및 암모니아수를 이용한 신규 정제법으로 염 및 유기용매를 효율적으로 제거할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
일본등록특허 제4707154호 미국공개특허 제2015-0080552호 한국등록특허 제10-1746219호
본 발명의 목적은 케라틴의 신규한 대량 생산 방법 및 이에 따른 무정형의 케라틴을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일측면은 a) 인모의 멜라닌 색소를 제거하는 탈색 단계; b) 상기 탈색된 인모에 에탄올 수용액을 첨가하여 모표피에 존재하는 지방 성분을 제거하는 탈지질화 단계; c) 상기 탈지질화된 인모에 과산화아세트산 수용액을 처리하여 인모를 연화시키는 산화 단계; d) 상기 연화시킨 인모에 신다이 용액(Shindai solution)을 처리하고 여과하여 케라틴 추출액을 수득하는 추출 단계; e) 상기 케라틴 추출액에 포름산 및 셀라이트(celite)를 처리하여 케라틴 추출액을 결정화시키고, 암모니아수를 첨가하고 여과하여 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 수득하는 제1 정제 단계; f) 상기 수득된 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득하는 제1 동결 건조 단계; g) 상기 동결 건조된 조케라틴 분말을 정제수로 용해한 용액을 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켜 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 수득하는 제2 정제 단계; 및 h) 상기 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 동결 건조하여 무정형(amorphous)의 케라틴 분말을 최종 수득하는 제2 동결 건조 단계;를 포함하는 케라틴의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 a) 단계의 탈색은 암모니아 및 과산화수소가 혼합된 탈색 용액에 의해 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 암모니아 및 과산화수소는 정제수 100 중량부를 기준으로 각각 0.5 내지 2 중량부로 포함되는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 b) 단계의 탈지질화는 60% 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액을 사용하여 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 c) 단계의 산화는 0.5% 내지 5%(v/v)의 과산화아세트산 수용액을 사용하여 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 과산화아세트산 수용액은 25℃ 내지 50℃의 조건하에서, 6시간 내지 24시간 동안 처리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 d) 단계의 추출은 Trizma
Figure 112019095516280-pat00001
base, HCl, 우레아(Urea), 티오우레아(Thiourea) 및 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)이 포함된 신다이 용액(Shindai solution)을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 e) 단계의 제1 정제는 포름산을 처리하여 pH 2 내지 pH 4로 조절하고, 25% 내지 30%(v/v)의 암모니아수를 처리하여 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 f) 단계의 제1 동결은 -30℃ 내지 -20℃로 12시간 내지 36시간 동안 전(pre)-동결하고, -60℃ 내지 -40℃로 60시간 내지 80시간 동안 0.05mbar 내지 5mbar 조건하에서 추가 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 g) 단계의 동결 건조된 조케라틴 분말은 정제수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부를 용해하여 음이온 교환수지 컬럼을 통과시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 h) 단계의 제2 동결은 -30℃ 내지 -20℃로 12시간 내지 36시간 동안 전(pre)-동결하고, -60℃ 내지 -40℃로 60시간 내지 80시간 동안 0.05mbar 내지 5mbar 조건하에서 추가 동결 건조하여 무정형의 케라틴 분말을 최종 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면은, 상기 케라틴의 대량 생산 방법에 따라 생산된 40 kDa 내지 100 kDa의 분자 크기를 갖는 무정형의 케라틴을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 분말 X-선 회절(XRD) 패턴 분석에서 2θ 회절각 22.0°±0.2°에서 피크를 갖는 분말 X-선 회절 패턴을 나타내는 무정형의 케라틴을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 시차주사 열량분석(DSC)에서 흡열 개시 온도 36℃ 내지 45℃, 및 흡열 온도 78℃ 내지 81℃의 흡열 피크를 나타내는 무정형의 케라틴을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 생산 방법은 종래 케라틴 생산 방법에 비해 산업적 규모로 염 및 유기용매 등을 효율적으로 제거함에 따라 독성이 없는 케라틴을 대량 생산할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일측면에 따른 생산 방법에 의해 생산된 케라틴은 수용성의 무정형 케라틴 분말 형태로, 의약, 섬유, 화장품 원료 등 산업적 용도로 다양하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
한편, 본 발명의 일측면에 따른 생산 방법에 의해 생산된 케라틴은 인간 유래 모발로부터 추출되어 산업적 용도로 적용시 부작용을 최소화한 효과가 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 모발 유래 케라틴의 산업적 대량 생산 방법을 개략적으로 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 수득된 케라틴 분말의 X-선 회절(X-ray diffraction, XRD) 패턴 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 수득된 케라틴 분말의 시차주사 열량분석(Differential scanning calorimetry, DSC) 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 수득된 케라틴의 인간 진피 모유두 세포(human dermal papilla cell)에 대한 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 현미경 사진이다. 여기서, A는 대조군(무처리)이고, B는 종래기술에 따라 투석백(dialysis bag)을 이용한 정제법을 거쳐 생산한 케라틴을 처리한 군이며, C는 본 발명의 일실시예에 따라 생산한 케라틴을 처리한 군이고, D는 본 발명의 일실시예에서 제1 정제 단계를 거치지 않고 생산한 케라틴을 처리한 군이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 수득된 케라틴의 인간 태아 섬유아세포(human fetal fibroblast)에 대한 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 현미경 사진이다. 여기서, A는 대조군(무처리)이고, B는 종래기술에 따라 투석백을 이용한 정제법을 거쳐 생산한 케라틴을 처리한 군이며, C는 본 발명의 일실시예에 따라 생산한 케라틴을 처리한 군이고, D는 본 발명의 일실시예에서 제1 정제 단계를 거치지 않고 생산한 케라틴을 처리한 군이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우 뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우 뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들 뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 산업적 규모의 인간 모발 유래의 케라틴 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 투석백을 이용한 정제법 대신에 포름산과 암모니아수를 이용한 신규한 정제법을 사용함으로써, 산업적인 규모로 인간 모발 유래의 케라틴을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일측면은 a) 인모의 멜라닌 색소를 제거하는 탈색 단계; b) 상기 탈색된 인모에 에탄올 수용액을 첨가하여 모표피에 존재하는 지방 성분을 제거하는 탈지질화 단계; c) 상기 탈지질화된 인모에 과산화아세트산 수용액을 처리하여 인모를 연화시키는 산화 단계; d) 상기 연화시킨 인모에 신다이 용액(Shindai solution)을 처리하고 여과하여 케라틴 추출액을 수득하는 추출 단계; e) 상기 케라틴 추출액에 포름산 및 셀라이트(celite)를 처리하여 케라틴 추출액을 결정화시키고, 암모니아수를 첨가하고 여과하여 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 수득하는 제1 정제 단계; f) 상기 수득된 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득하는 제1 동결 건조 단계; g) 상기 동결 건조된 조케라틴 분말을 정제수로 용해한 용액을 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켜 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 수득하는 제2 정제 단계; 및 h) 상기 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 동결 건조하여 무정형(amorphous)의 케라틴 분말을 최종 수득하는 제2 동결 건조 단계;를 포함하는 케라틴의 대량 생산 방법을 제공한다.
용어 "케라틴(keratin)"은 모발, 손톱, 피부 등 상피 조직의 기본을 형성하는 단백질의 일종이며, 모발, 손톱, 발톱, 뿔, 깃털 등을 구성하는 진성 케라틴과 피부 및 소수의 다른 조직에 존재하는 유사 케라틴으로 구분될 수 있다. 케라틴은 물과 모든 중성용매에 녹지 않는 불용성이며, 인성(toughness)이 강하여, 공업용 재료 및 생체 고분자 재료로서 적합하게 이용되고 있다. 특히, 인간 모발에서 추출한 케라틴 단백질의 경우 생체적합성, 세포와의 상호작용, 생분해성 등이 좋고 면역반응이 없다는 특징을 가지고 있으므로 새로운 생체재료로 응용가능성이 높은 것으로 보고되고 있다. 또한 연간 세계적으로 버려지는 30 만톤의 모발을 단백질 자원으로 활용할 수 있다는 점에서 환경친화적이며 재생 가능한 소재이다.
용어 "인모"는 인간의 모발로, 모발은 대부분 케라틴 단백질이 80~90%를 차지하며, 나머지는 멜라닌 색소 3% 이하, 수분 10~15%, 지질 1~8%, 그 외 철, 아연, 구리 등 주요 미네랄로 구성되어 있다. 모발의 주성분인 케라틴은 약 18종류의 아미노산의 집합체이며, 그 중에서 시스테인이 16.6~18%를 차지한다.
용어 "모표피(cuticle)"는 모발 횡단면의 가장 바깥층의 세포로, 물고기 비늘모양의 층이 7~10층 정도 겹쳐져 있고, 내측의 모피질(cortex)을 감싸 보호하며, 색소가 없는 투명한 세포로 구성되어 있다. 또한 1개의 세포 두께는 약 0.5∼1.0㎛ 길이가 45㎛이고, 전체 모발의 10∼15%를 차지하며, 친유성 성분으로 모발 내부의 수분 증발을 방지하고, 물이나 약제 등의 외부 물질의 내부 유입을 막아주는 역할을 한다.
본 발명의 일측면에 있어서, a) 인모의 멜라닌 색소를 제거하는 탈색 단계는 암모니아 및 과산화수소가 혼합된 탈색 용액을 사용하여 수행될 수 있다.
암모니아가 친유성인 모발의 모표피를 팽윤 및 연화시켜 머리카락 내부로 과산화수소를 쉽게 침투시킬 수 있도록 도와주는 역할을 하며, 과산화수소는 내부의 멜라닌 색소를 산화시켜 수용액 속으로 녹여냄으로서 멜라닌을 제거할 수 있다.
상기 탈색 용액 내 포함된 암모니아는 이에 제한되지는 않으나, 정제수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 2 중량부, 0.7 내지 1.5 중량부, 0.9 내지 1.2 중량부 또는 1 중량부로 포함될 수 있다.
상기 탈색 용액 내 포함된 과산화수소는 이에 제한되지는 않으나, 정제수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 2 중량부, 0.7 내지 1.5 중량부, 0.9 내지 1.2 중량부 또는 1 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 '중량부'는 탈색 용액의 총 부피를 100으로 환산하고, 이를 기준으로 과산화수소수 또는 암모니아수가 포함된 부피의 상대적 수치를 의미하는 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 1% 암모니아 및 1% 과산화수소가 포함된 탈색 용액을 인모에 25~30℃에서 18시간 동안 처리하여, 인모 내 케라틴의 분해는 막으면서 멜라닌 색소를 산화시켜 효율적으로 제거하였다 (실시예 1-1).
본 발명의 일측면에 있어서, b) 상기 탈색된 인모에 에탄올 수용액을 첨가하여 모표피에 존재하는 지방 성분을 제거하는 탈지질화 단계는 60% 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 탈지질화는 정제수에 에탄올을 총 부피 기준으로 60% 내지 80%(v/v), 65% 내지 75%(v/v), 또는 70%(v/v)가 되도록 혼합한 에탄올 수용액을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
인간 모발의 모표피는 친유성을 띄고 있으며, 수용성 케라틴을 효과적으로 추출하기 위해서는 모표피의 지질성분을 제거하여야 하는데, 일반적으로 종래 알려진 방법으로는 메탄올과 클로로포름을 사용하고 있다. 하지만 메탄올과 클로로포름은 의약품규제조화위원회 가이드라인(ICH Guideline)에 1급 독성물질로 기재된 유기용매들로서 독성이 강한 문제점이 있다.
본 발명의 일실시예에서, 최종 수득되는 케라틴 단백질에 잔류 가능한 독성 물질을 최소화하고자, 탈색된 인모를 25~30℃에서 24시간 동안 70%의 에탄올에 방치하여 탈색된 인모의 모표피에 포함된 지방성분을 효과적으로 제거하였다 (실시예 1-2).
본 발명의 일측면에 있어서, c) 상기 탈지질화된 인모에 과산화아세트산 수용액을 처리하여 인모를 연화시키는 산화 단계는 0.5% 내지 5%(v/v)의 과산화아세트산 수용액을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 b) 단계에서 탈지질화가 끝난 인모는 모표피가 응축되어 성상이 뻣뻣해지므로, 추출 효율이 매우 떨어진다. 이에, 최종 수득되는 케라틴의 품질 및 수율에 영향을 미치지 않는 보다 효과적인 방법으로 케라틴을 추출하고자, 탈지질화된 인모에 과산화아세트산(peracetic acid) 수용액을 처리하여 산화시킴에 따라 상기 인모를 연화시키며 모표피를 효율적으로 제거할 수 있다.
상기 산화는 정제수에 과산화아세트산 용액을 총 부피 기준으로 0.5% 내지 5%(v/v), 1% 내지 3%(v/v), 또는 2%(v/v)가 되도록 혼합한 과산화아세트산 수용액을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 산화 단계에서 과산화아세트산 수용액은 이에 제한되지는 않으나, 25℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 40℃, 또는 37℃의 조건하에서 처리될 수 있다.
또한, 산화 단계에서 과산화아세트산 수용액은 이에 제한되지는 않으나, 6시간 내지 24시간, 10시간 내지 20시간, 11시간 내지 15시간 또는 12시간 동안 처리될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 탈색되고 탈지질화된 인모를 37℃에서 12시간 동안 2%의 과산화아세트산 수용액을 처리하여 산화시킴에 따라, 인모를 연화시키고 모표피를 효율적으로 제거하였다 (실시예 1-3).
본 발명의 일측면에 있어서, d) 상기 연화시킨 인모에 신다이 용액(Shindai solution)을 처리하고 여과하여 케라틴 추출액을 수득하는 추출 단계는 Trizma
Figure 112019095516280-pat00002
base, HCl, 우레아(Urea), 티오우레아(Thiourea) 및 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)이 포함된 신다이 용액(Shindai solution)을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 신다이 용액은 종래 신다이 용액을 이용한 케라틴 추출법에 관해 알려진 바와 같이 인모 100g 당 하기 표 1과 같은 조성으로 신다이 용액을 제조하여 사용하였다.
인모 100 g
Trizma
Figure 112019095516280-pat00003
base(Tris(hydroxymethyl aminomethane)		 7.8 g
1M-HCl 2~5 ㎖
우레아(Urea) 600 g
티오우레아(Thiourea) 396 g
2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 100 ㎖
정제수 2000 ㎖
본 발명의 일실시예에서, 과산화아세트산 수용액을 처리하여 산화시킨 인모 산화 반응물에 신다이 용액을 50℃에서 72시간 동안 처리하여, 케라틴 단백질을 추출하였다 (실시예 1-4).
본 발명의 일측면에 있어서, e) 상기 케라틴 추출액에 포름산 및 셀라이트(celite)를 처리하여 케라틴 추출액을 결정화시키고, 암모니아수를 첨가하고 여과하여 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 수득하는 제1 정제 단계는 포름산(formic acid)을 처리하여 pH 2 내지 pH 4로 조절하고, 25% 내지 30%(v/v)의 암모니아수를 처리하여 수행될 수 있다.
상기 제1 정제는 정제수에 암모니아를 총 부피 기준으로 25% 내지 30%(w/v), 26% 내지 29%(w/v), 또는 28%(w/v)가 포함된 암모니아수를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서, 케라틴 단백질 추출 여과액에 포름산을 첨가하여 25~30℃에서 1시간 동안 반응시켜 pH 3.0~3.5로 조절하고, 셀라이트(celite)를 첨가하여 30분간 교반하여 케라틴 추출액을 결정화하고, 이를 여과하여 여과 습체(wet body)를 수득하였다. 이후, 상기 여과 습체에 28% 암모니아수를 가하여 25~30℃에서 1시간 동안 반응시키고 여과하여 염 및 유기용매 등의 불순물이 1차적으로 제거된 여과액을 수득하였다 (실시예 1-5).
상기 결정화된 케라틴 추출액의 여과 습체에는 다량의 우레아를 비롯한 염과 유기용매를 함유하고 있어 이를 제거하여야 하는데, 당업계의 해당 기술 분야에서는 일반적으로 셀루로오스 투석막(또는 투석백)을 사용하여 분자량이 작은 염과 유기용매를 정제수로 희석하는 방법을 채택한다. 그러나, 투석막(또는 투석백) 내 수용될 수 있는 시료량의 제한 및 정제의 긴 소요 시간으로 인해 산업적인 규모로 케라틴을 대량 생산할 수 없는 한계가 있다.
이에, 산업적인 규모로 케라틴을 대량 생산하고자, 본 발명에서는 종래 염 및 유기용매를 정제하고자 투석막(또는 투석백)을 이용한 정제법 대신에 포름산 및 암모니아수를 이용한 신규한 정제법으로 염 및 유기용매를 제거하였다.
본 발명의 일측면에 있어서, f) 상기 수득된 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득하는 제1 동결 건조 단계는 -30℃ 내지 -20℃로 12시간 내지 36시간 동안 전(pre)-동결하고, -60℃ 내지 -40℃로 60시간 내지 80시간 동안 0.05mbar 내지 5mbar 조건하에서 추가 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득할 수 있다.
상기 제1 동결 건조 단계는 이에 제한되지는 않으나, 전-동결 후 추가 동결 과정을 거쳐 수행될 수 있으며, 상기 전-동결은 -30℃ 내지 -20℃, -28℃ 내지 -23℃, 또는 -25℃ 조건하에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 전-동결은 12시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 22시간 내지 26시간, 또는 24시간 동안 수행될 수 있다.
한편, 추가 동결은 -60℃ 내지 -40℃, -55℃ 내지 -45℃, 또는 -50℃ 조건하에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 추가 동결은 60시간 내지 80시간, 65시간 내지 75시간, 또는 72시간 동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 추가 동결은 0.05mbar 내지 5mbar, 0.07mbar 내지 0.5mbar, 또는 0.1mbar 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 -25℃에서 24시간 동안 전동결시키고, -50℃에서 72시간 동안 0.1mbar의 조건하에서 추가 동결 건조하여 조케라틴을 얻었다 (실시예 1-6).
본 발명의 일측면에 있어서, g) 상기 동결 건조된 조케라틴 분말을 정제수로 용해한 용액을 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켜 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 수득하는 제2 정제 단계는 동결 건조된 조케라틴 분말을 정제수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부를 용해하여 음이온 교환수지 컬럼을 통과시켜 행해질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 정제 단계는 상기 제1 정제 단계 이후 수득한 조케라틴 분말에 여전히 소량의 염이 포함되어 있을 수 있으므로, 이를 완벽히 제거하고자 한 목적에서 음이온 교환수지 컬럼을 통과시킴에 따라 추가로 잔류 염을 제거할 수 있다.
상기 조케라틴 분말이 용해된 용액은 이에 제한되지는 않으나, 음이온 교환수지 컬럼 통과 시 투과 속도 및 염 제거율을 고려하여, 정제수 100 중량부를 기준으로 조케라틴 분말이 0.5 내지 5 중량부, 0.7 내지 3 중량부, 0.9 내지 2 중량부, 또는 1 중량부가 용해된 용액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 동결 건조된 조케라틴 분말 6g에 정제수 600㎖를 가하여 용해시킨 용액을 음이온 교환수지 컬럼을 통과시켜 잔류 염을 완전 제거하였다 (실시예 1-7).
본 발명의 일측면에 있어서, h) 상기 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 동결 건조하여 무정형(amorphous)의 케라틴 분말을 최종 수득하는 제2 동결 건조 단계는 -30℃ 내지 -20℃로 12시간 내지 36시간 동안 전(pre)-동결하고, -60℃ 내지 -40℃로 60시간 내지 80시간 동안 0.05mbar 내지 5mbar 조건하에서 추가 동결 건조하여 무정형의 케라틴 분말을 최종 수득할 수 있다.
상기 제2 동결 건조 단계는 이에 제한되지는 않으나, 전-동결 후 추가 동결 과정을 거쳐 수행될 수 있으며, 상기 전-동결은 -30℃ 내지 -20℃, -28℃ 내지 -23℃, 또는 -25℃ 조건하에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 전-동결은 12시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 22시간 내지 26시간, 또는 24시간 동안 수행될 수 있다.
한편, 추가 동결은 -60℃ 내지 -40℃, -55℃ 내지 -45℃, 또는 -50℃ 조건하에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 추가 동결은 60시간 내지 80시간, 65시간 내지 75시간, 또는 72시간 동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 추가 동결은 0.05mbar 내지 5mbar, 0.07mbar 내지 0.5mbar, 또는 0.1mbar 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 상기 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 -25℃에서 24시간 동안 전동결시키고, -50℃에서 72시간 동안 0.1mbar의 조건하에서 추가 동결 건조하여 무정형(amorphous)의 수용성 케라틴을 최종 수득하였다 (실시예 1-8).
상기 최종 수득된 무정형의 케라틴은 이에 제한되지는 않으나, 40 kDa 내지 100 kDa 또는 40 kDa 내지 60kDa의 분자 크기를 가질 수 있다.
상기 분자 크기의 케라틴은 이에 제한되지는 않으나, 알파-케라틴(α-keratin)일 수 있다.
상기 최종 수득된 무정형의 케라틴은 분말 X-선 회절(XRD) 패턴 분석에서 2θ 회절각 22.0°±0.2°에서 특징적인 피크를 갖는 분말 X-선 회절 패턴을 나타낼 수 있다.
상기 X-선 회절(X-ray diffraction, XRD) 패턴 분석은 물질의 내부 미세구조를 밝히는데 매우 유용한 수단으로 사용되는 것으로, 당업자에게 명백히 자명한 바와 같이, 임의의 X-선 회절 패턴의 결과는 다양할 수 있다. 이 편차는 샘플 제제, 이용된 X-선 회절분석기의 구체적 모델, 조작자의 기술 등에 기인할 수 있다. 또한, 당업자는 실험 XRD 패턴에 존재하는 피크의 상대적 강도가 구체적인 결정의 바람직한 배향 때문에 달라질 수 있고, 이 효과를 최소화하는 기술을 이용하여 XRD를 수행할 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 X-선 회절 패턴 분석을 통해 본 발명의 최종 수득된 케라틴은 무정형의 수용성 케라틴 분말 형태임을 알 수 있었다(도 2 참조).
또한, 상기 최종 수득된 무정형의 케라틴은 시차주사 열량분석(DSC)에서 흡열 개시 온도 36℃ 내지 45℃, 및 흡열 온도 78℃ 내지 81℃의 흡열 피크를 나타낼 수 있다.
상기 시차주사 열량분석(Differential scanning calorimetry, DSC)은 특정 물질의 물리적 성질 또는 반응 생성물을 온도 또는 시간의 함수로 측정하여 특정 물질의 열 안정성, 결정성 또는 비결정성의 구조 상태 등의 변화를 정량적으로 파악할 수 있는 분석법이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시차주사 열량분석(DSC)을 통해 본 발명의 최종 수득된 케라틴은 흡열 개시 온도 36℃ 내지 45℃, 및 흡열 온도 78℃ 내지 81℃의 흡열 피크를 나타내는 무정형의 수용성 케라틴 분말 형태임을 알 수 있었다(도 3 참조).
따라서, 본 발명의 케라틴 대량 생산 방법에 따르면, 종래 케라틴 추출 시 사용한 염 및 유기용매 제거를 위해 사용한 투석백 또는 투석막을 이용한 정제법 대신, 포름산 및 암모니아수를 이용하여 염 및 유기용매를 효율적으로 제거하는 신규 정제법을 채택함에 따라 케라틴 대량 생산의 한계를 극복하고, 무정형의 수용성 케라틴 분말을 최종 수득함에 의해 산업적으로 용이하게 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 모발 유래 케라틴의 제조
실시예 1-1: 인모 탈색
인모(人毛) 20g을 증류수 400㎖씩 사용하여 3회 세척하였다. 세척된 인모를 비이커에 담고, 탈색 용액 400㎖를 가하고 인모가 탈색 용액에 잠기도록 하였다. 그 상태에서 18시간 동안 25~30℃에서 탈색을 진행시켰다. 탈색된 인모를 5㎛ 기공 크기의 메쉬(mesh)로 여과하여 탈색 용액을 제거하고 정제수 400㎖씩 5회 가하여 여과된 인모를 세척하였다.
이때, 상기 탈색 용액은 10% 암모니아수 40㎖와 10% 과산화수소 40㎖를 혼합한 후 정제수를 가하여 총 용액의 부피를 400㎖가 되도록 제조한 것을 사용하였으며, 탈색 용액 내 암모니아수 및 과산화수소의 최종 함유량은 각각 1%이다.
실시예 1-2: 인모 탈지질화
상기 실시예 1-1에서 얻은 탈색된 인모의 모표피에 포함된 지질 성분을 제거하고자, 탈색된 인모를 2ℓ 유리 반응기에 넣고, 70% 에탄올(v/v; 정제수 중 70% 에탄올) 600㎖를 가하여 탈색된 인모가 잠기도록 하였다. 이를 25~30℃에서 24시간 동안 방치하고, 이후 5㎛ 기공 크기의 메쉬(mesh)를 이용하여 여과하였다. 상기 에탄올에 의해 탈지질화된 여과된 인모는 정제수 600㎖씩 사용하여 3회 세척하였다.
실시예 1-3: 인모 유래 케라틴 단백질의 산화
상기 실시예 1-2에서 얻은 탈지질화된 인모를 반응기에 가하고 2% 과산화아세트산(peracetic acid) 용액 800㎖를 가하여 인모가 잠기도록 하여 37℃에서 12시간 동안 산화(oxidation) 시켰다. 12시간 후 상기 산화 반응물을 5㎛ 기공 크기의 메쉬로 여과하고 여과된 반응물을 정제수 800㎖씩 사용하여 3회 세척하였다. 이때, 상기 여과된 반응물은 탈지질화된 인모로서, 케라틴 제조에 최초 사용한 인모 무게의 80%(약 16g) 이었다.
실시예 1-4: 인모 유래 케라틴 단백질의 추출
상기 실시예 1-3에서 얻은 산화 반응물과 신다이 용액(Shindai solution) 400㎖를 가한 후 50℃에서 72시간 동안 인모 유래의 케라틴 단백질을 추출(extraction) 하였다. 불용성 물질은 5㎛ 기공 크기의 메쉬를 이용한 여과를 통하여 제거하고 여과액을 취하였다.
이때, 상기 신다이 용액은 증류수 400㎖에 Trizma
Figure 112019095516280-pat00004
base 1.6g, 1N-HCl(pH8.5), 우레아(Urea) 120g, 티오우레아(Thiourea) 79g, 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 20㎖를 순차적으로 가하여 완전 용해시켜 제조한 용액을 사용하였다.
실시예 1-5: 포름산 및 암모니아수를 이용한 인모 유래 케라틴 단백질 추출액의 제1 정제
상기 실시예 1-4에서 얻은 인모 유래 케라틴 단백질 추출 여과액에 정제수 500㎖를 가하고 포름산(formic acid) 25㎖로 pH 3.0~3.5까지 조절하였다. 상기 반응액을 25~30℃에서 1시간 동안 교반하고, 셀라이트(celite) 40g을 가한 후 30분간 교반하였다. 상기 용액을 5㎛ 기공 크기의 메쉬로 여과하여 결정화된 여과 습체(wet body)를 수득하였으며, 여과시 정제수 1500㎖를 세척액으로 사용하였다.
상기 수득한 결정화된 여과 습체를 2ℓ 유리 반응기에 가하고, 상기 반응기에 증류수 500㎖를 넣고 25~30℃에서 1시간 동안 교반하며 추가 세척하였다. 교반이 완료된 후 5㎛ 기공 크기의 메쉬를 이용하여 재여과하고 여과물을 정제수 500㎖씩 사용하여 3회 세척하였다. 상기 재여과한 여과 습체를 다시 반응기에 가하고 증류수 500㎖를 추가한 뒤, 상기 결정화된 여과 습체가 포함된 용액에 암모니아수(ammonium hydroxide solution; 정제수 중 28% 암모니아(w/v)) 25㎖를 가하여 pH 9~10으로 조절하였다. pH 조절 후, 25~30℃에서 1시간 동안 교반하여 용해시키고, 상기 교반된 용액을 5㎛ 기공 크기의 메쉬로 여과하였다. 여과 후 여과액 내 포함된 녹지 않은 셀라이트를 제거하고, 여과액에 95% 에탄올 200㎖를 가한 후 외부 온도 40℃에서 농축 직전의 총 부피 대비 최종 부피가 1/10 부피가 될 때까지, 즉, 농축 직전 총 부피 700㎖를 70㎖가 될 때까지 농축하였다. 상기 농축액을 최종 부피가 500㎖가 되도록 정제수를 가하고 30분간 교반한 후 여과하여 여과액을 수득하였다.
이때, 인모 유래 케라틴 단백질 추출액에 적용한 포름산 및 암모니아수는 종래 투석 백을 이용한 정제법 대신 인모 유래 케라틴 단백질 추출액 내 포함된 염 및 유기용매 등의 불순물을 제거하기 위한 정제 용도로서 사용되었다.
실시예 1-6: 제1 정제된 인모 유래 케라틴 단백질의 동결 건조
상기 실시예 1-5에서 수득한 여과액을 -25℃ 냉동실에서 24시간 동안 전(pre)-동결시킨 후, 냉각 온도 -50℃, 0.1 mbar 이하 감압 조건하에서 72시간 동안 동결 건조하여 조(crude) 케라틴을 6g을 수득하였다.
실시예 1-7: 이온교환수지를 이용한 동결 건조된 조 케라틴의 제2 정제
상기 실시예 1-6에서 수득한 조케라틴에 함유되어 있는 잔류 염을 제거하고자, 상기 실시예 1-6에서 얻은 조케라틴 6g에 정제수 600㎖를 가하여 완전 용해시키고, 음이온 교환수지 20g으로 충진된 컬럼을 3회 통과시켰다. 이후 상기 컬럼에 정제수 100㎖를 천천히 가하여 세척하였다.
실시예 1-8: 제2 정제 후 최종 수득된 케라틴의 동결 건조
상기 실시예 1-7에서 음이온 교환수지를 이용한 이온교환크로마토그래피를 통해 얻은 제2 정제된 케라틴 용액과, 세척액으로서 정제수를 동량으로 합한 용액을 -25℃ 냉동실에서 24시간 동안 전-동결 시켰다. 전-동결 후 냉각 온도 -50℃, 0.1mbar 이하 감압 조건하에서 72시간 동안 동결 건조하여 무정형(amorphous)의 케라틴 3.3g을 최종 수득하였다.
실시예 2: 인간 모발 유래 케라틴의 결정성 분석 및 물리적 특성 평가
실시예 2-1: 케라틴 분말의 X-선 회절(XRD) 패턴 분석
PXRD 분석(도 2 참조)을 Cu Kα 방사선을 사용하여 (D8 Advance) X-선 분말 회절계 상에서 수행하였다. 기구에는 관 동력이 장치되어 있고, 전류량은 45 kV 및 40 mA 로 설정하였다. 발산 및 산란 슬릿은 1°로 설정하였고, 수광 슬릿은 0.2 ㎜로 설정하였다. 5 에서 35°2θ까지 3°분 (0.4 초/0.02°간격) 의 θ-2θ 연속 스캔을 사용하였다.
실시예 2-2: 케라틴 분말의 시차주사 열량분석(DSC)
TA사 로 부터 입수한 DSC Q20을 사용하여, 질소 정화 하에 10℃ 에서 150℃까지 10℃/min의 스캔속도로, 밀폐팬에서 DSC 측정(도 3 참조)을 수행하였다.
실시예 3: 인간 모발 유래 케라틴의 독성 시험
실시예 3-1: 인간 진피 모유두 세포에 대한 케라틴의 독성
인간 진피 모유두 세포를 8.8×105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩(seeding)한 후 밤새 배양하였다. 이후, 상기 세포에 종래기술에 따라 투석 백(dialysis bag)을 이용한 정제법에 의해 수득한 케라틴(도 4의 B 참조), 상기 실시예 1의 방법에 따라 수득한 케라틴(도 4의 C 참조), 및 상기 실시예 1-6의 제1 정제 단계를 거지치 않고 수득한 케라틴(도 4의 D 참조)을 각각 20㎍/㎖의 농도로 각 웰에 48시간 동안 처리하고, 독성 여부를 현미경 하에서 확인하였다. 이때, 케라틴 무처리군을 대조군으로 사용하였다(도 4의 A 참조).
그 결과, 상기 실시예 1의 방법에 따라 제조된 케라틴, 즉, 암모니아수를 이용한 제1 정제 단계를 거쳐 최종 제조된 케라틴 및 종래기술에 따라 투석백을 이용하여 정제하여 얻은 케라틴은 무처리군인 대조군과 마찬가지로 진피 모유두 세포에 대한 세포 이상 변형 및 세포 사멸을 유발하지 않음을 확인하였다(도 4의 A 내지 C 참조).
즉, 종래기술에서 투석백을 이용한 정제법에 의해 최종 제조된 케라틴과 상기 실시예 1의 방법에 따라 암모니아수를 이용한 신규한 정제법에 의해 최종 제조된 케라틴 모두 진피 모유두 세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
이에 반해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 케라틴을 제조하되, 암모니아수를 이용한 제1 정제 단계를 거치지 않고 제조된 케라틴을 처리한 실험군의 경우, 세포 이상 변형 및 세포 사멸을 유발함을 확인하였다 (도 4의 D 참조).
실시예 3-2: 인간 태아 섬유아세포에 대한 케라틴의 독성
인간 태아 섬유아세포를 1.2×105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩(seeding)한 후 밤새 배양하였다. 이후, 상기 세포에 종래기술에 따라 투석 백(dialysis bag)을 이용한 정제법에 의해 수득한 케라틴(도 5의 B 참조), 상기 실시예 1의 방법에 따라 수득한 케라틴(도 5의 C 참조), 및 상기 실시예 1-6의 제1 정제 단계를 거지치 않고 수득한 케라틴(도 5의 D 참조)을 각각 20㎍/㎖의 농도로 각 웰에 48시간 동안 처리하고, 독성 여부를 현미경 하에서 확인하였다. 이때, 케라틴 무처리군을 대조군으로 사용하였다(도 5의 A 참조).
그 결과, 상기 실시예 1의 방법에 따라 제조된 케라틴, 즉, 암모니아수를 이용한 제1 정제 단계를 거쳐 최종 제조된 케라틴 및 종래기술에 따라 투석백을 이용하여 정제하여 얻은 케라틴은 무처리군인 대조군과 마찬가지로 인간 태아 섬유아세포에 대한 세포 이상 변형 및 세포 사멸을 유발하지 않음을 확인하였다(도 5의 A 내지 C 참조).
즉, 종래기술에서 투석백을 이용한 정제법에 의해 최종 제조된 케라틴과 상기 실시예 1의 방법에 따라 암모니아수를 이용한 신규한 정제법에 의해 최종 제조된 케라틴 모두 인간 태아 섬유아세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
이에 반해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 케라틴을 제조하되, 암모니아수를 이용한 제1 정제 단계를 거치지 않고 제조된 케라틴을 처리한 실험군의 경우, 세포 이상 변형 및 세포 사멸을 유발함을 확인하였다 (도 5의 D 참조).
실시예 4: 산업적 규모의 인간 모발 유래 케라틴의 대량 생산
상기 실시예 1에 따른 인모로부터 파일럿 스케일(pilot scale)의 케라틴 제조 공정을 기반으로 하여 산업적 규모로 인간 모발 유래의 케라틴의 생산량을 도출해 본 결과, 하기 표 2와 같았다.
투석막 실시예 1
(실시예 1-1 내지 1-8) 		제1 정제 단계
(실시예 1-5) 생략
최대 배취(batch) 당 생산량 25 ~ 30 g 25 ~ 45 ㎏ 25 ~ 50 ㎏
수율
(인모 100g 당 기준) 		22% 25% 31%
종래 투석백을 이용한 정제법을 거쳐 제조된 케라틴의 경우, 투석백에 적용 가능한 시료량의 한계로 인하여, 최대 배취 당 생산량이 25~30g 수준에 그쳤으나, 상기 실시예 1에서 수행한 암모니아수를 이용한 신규한 정제법을 적용하여 케라틴을 생산할 경우, 최대 배치 당 25~45 ㎏ 수준으로 생산 가능함을 확인하였다.
한편, 제1 정제 단계를 거치지 않은 경우에도 최대 배치 당 25~50 ㎏ 수준으로 대량 생산이 가능하나, 상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이 세포 독성의 문제로 인하여 실질적으로 산업적 적용이 불가능함을 알 수 있다.
상기 일련의 결과를 통해, 상기 실시예 1에서 수행한 암모니아수를 이용한 신규한 정제법은 종래기술에서 투석백을 이용한 정제법과 마찬가지로 세포 생존에 영향을 미치는 염 및 유기용매를 효율적으로 제거할 수 있음을 알 수 있었으며, 뿐만 아니라, 최대 수용할 수 있는 시료의 양이 제한되어 있는 투석백을 이용한 정제법과 달리, 케라틴 수득시 최종 수득할 수 있는 케라틴의 생산량이 최대 배취 당 25~45 ㎏ 수준으로 산업적 규모로 대량 생산이 가능함을 알 수 있었다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

  1. a) 인모의 멜라닌 색소를 제거하는 탈색 단계;
    b) 상기 탈색된 인모에 에탄올 수용액을 첨가하여 모표피에 존재하는 지방 성분을 제거하는 탈지질화 단계;
    c) 상기 탈지질화된 인모에 과산화아세트산 수용액을 처리하여 인모를 연화시키는 산화 단계;
    d) 상기 연화시킨 인모에 신다이 용액(Shindai solution)을 처리하고 여과하여 케라틴 추출액을 수득하는 추출 단계;
    e) 상기 케라틴 추출액에 포름산 및 셀라이트(celite)를 처리하여 케라틴 추출액을 결정화시키고, 암모니아수를 첨가하고 여과하여 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 수득하는 제1 정제 단계;
    f) 상기 수득된 염 및 유기용매가 제거된 여과액을 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득하는 제1 동결 건조 단계;
    g) 상기 동결 건조된 조케라틴 분말을 정제수로 용해한 용액을 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켜 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 수득하는 제2 정제 단계; 및
    h) 상기 잔류 염이 추가로 제거된 케라틴 용액을 동결 건조하여 무정형(amorphous)의 케라틴 분말을 최종 수득하는 제2 동결 건조 단계;를 포함하며,
    상기 e) 단계의 제1 정제는 포름산을 처리하여 pH 2 내지 pH 4로 조절하고, 25% 내지 30%(v/v)의 암모니아수를 처리하여 수행되는, 케라틴의 대량 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, a) 단계의 탈색은 암모니아 및 과산화수소가 혼합된 탈색 용액에 의해 수행되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 암모니아 및 과산화수소는 정제수 100 중량부를 기준으로 각각 0.5 내지 2 중량부로 포함되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, b) 단계의 탈지질화는 60% 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액을 사용하여 수행되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, c) 단계의 산화는 0.5% 내지 5%(v/v)의 과산화아세트산 수용액을 사용하여 수행되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 과산화아세트산 수용액은 25℃ 내지 50℃의 조건하에서, 6시간 내지 24시간 동안 처리하는, 방법.
  7. 제1항에서 있어서, d) 단계의 추출은 Trizma
    Figure 112019095516280-pat00005
    base, HCl, 우레아(Urea), 티오우레아(Thiourea) 및 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)이 포함된 신다이 용액(Shindai solution)을 사용하는, 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, f) 단계의 제1 동결은 -30℃ 내지 -20℃로 12시간 내지 36시간 동안 전(pre)-동결하고, -60℃ 내지 -40℃로 60시간 내지 80시간 동안 0.05mbar 내지 5mbar 조건하에서 추가 동결 건조하여 조(crude) 케라틴 분말을 수득하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, g) 단계의 동결 건조된 조케라틴 분말은 정제수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부를 용해하여 음이온 교환수지 컬럼을 통과시키는, 방법
  11. 제1항에 있어서, h) 단계의 제2 동결은 -30℃ 내지 -20℃로 12시간 내지 36시간 동안 전(pre)-동결하고, -60℃ 내지 -40℃로 60시간 내지 80시간 동안 0.05mbar 내지 5mbar 조건하에서 추가 동결 건조하여 무정형의 케라틴 분말을 최종 수득하는, 방법.
  12. 삭제
  13. 제1항 내지 제 7항 및 제 9 항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 케라틴에 있어서,
    상기 케라틴은 분말 X-선 회절(XRD) 패턴 분석에서 2θ 회절각 22.0°±0.2°에서 피크를 갖는 분말 X-선 회절 패턴을 나타내는 무정형의 케라틴.
  14. 제1항 내지 제 7항 및 제 9 항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 케라틴에 있어서,
    상기 케라틴은 시차주사 열량분석(DSC)에서 흡열 개시 온도 36℃ 내지 45℃, 및 흡열 온도 78℃ 내지 81℃의 흡열 피크를 나타내는 무정형의 케라틴.
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