KR102394639B1 - Screening method of material for improving differentiation of keratinocyte - Google Patents

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Abstract

본 명세서에는, 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법 및 스크리닝용 키트가 개시된다. 본 발명의 스크리닝 방법은, 각질세포에 시험물질을 처리하고 리핀 유전자의 상대적 발현 정도를 확인함으로써, 간편하고 신속하며 효율적으로 각질세포 분화 촉진 물질을 스크리닝 할 수 있다.Disclosed herein are a method for screening a keratinocyte differentiation promoting substance and a kit for screening. In the screening method of the present invention, by treating keratinocytes with a test substance and checking the relative expression level of the lipin gene, it is possible to conveniently, quickly, and efficiently screen a keratinocyte differentiation promoting substance.

Description

각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법{SCREENING METHOD OF MATERIAL FOR IMPROVING DIFFERENTIATION OF KERATINOCYTE}Screening method for keratinocyte differentiation promoting substances

본 명세서에는 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법 및 스크리닝용 키트가 개시된다.Disclosed herein are a method for screening a keratinocyte differentiation promoting substance and a kit for screening.

표피(epidermis)는 일반적으로 피부(skin)나 점막의 최외각에 위치하는 상피를 의미하며, 표피 중에서도 가장 최외곽 층은 각질층이다. 각질 세포(keratinocyte)로 구성된 각질층이 정상적으로 존재할 때, 외부로부터의 다양한 자극을 방어하고, 체내에서 발산되는 수분을 보유할 수 있다. 각질 형성 세포는 피부 최하층인 기저층(basal layer)에서 증식(proliferation)하면서, 점차 유극층(spinous layer), 과립층(Granular layer)을 거쳐 분화된다. 이러한 각화 과정(keratinization)을 통하여, 각질 세포는 천연 보습인자(NMF; Natural Moisturizing factor)와 지질(세라마이드, 콜레스테롤 또는 지방산)을 형성하면서 각질층(stratum corneum)을 형성하게 된다. 이러한 각질층이 정상적으로 형성되어야, 피부 장벽(skin barrier) 기능이 제대로 수행될 수 있다.The epidermis generally refers to the epithelium located at the outermost layer of the skin or mucous membrane, and the outermost layer among the epidermis is the stratum corneum. When the stratum corneum composed of keratinocytes is normally present, it can protect against various external stimuli and retain moisture emitted from the body. While keratinocytes proliferate in the basal layer, which is the lowest layer of the skin, they are gradually differentiated through a spinous layer and a granular layer. Through this keratinization process, keratinocytes form a stratum corneum while forming a natural moisturizing factor (NMF) and a lipid (ceramide, cholesterol, or fatty acid). When such a stratum corneum is normally formed, a skin barrier function can be properly performed.

피부장벽을 회복시키는 보습제, 63차 대한 피부과학회 춘계학술대회, page 100, 최응호, 2011.Moisturizer that restores the skin barrier, the 63rd Spring Conference of the Korean Dermatological Association, page 100, Eungho Choi, 2011.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 각질 세포 분화 촉진 물질을 스크리닝하는 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to screen for substances that promote keratinocyte differentiation.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 피부 장벽 강화용 물질을 스크리닝하는 것이다.In another aspect, it is an object of the present invention to screen a substance for strengthening the skin barrier.

일 측면에서, 본 발명은, 피부 각질세포에, 시험 물질을 처리하는 단계; 및 시험 물질을 처리한 각질세포에서, 시험 물질의 처리 전후의 리핀(Lipin) 유전자의 상대적 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a method comprising the steps of: treating skin keratinocytes with a test substance; And in the keratinocytes treated with the test substance, it provides a screening method for a keratinocyte differentiation promoting substance, comprising the step of confirming the relative expression level of the lipin gene before and after the treatment with the test substance.

다른 측면에서, 본 발명은, 각질세포; 및 지시서를 포함하며, 지시서에는 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법이 기재되어 있는, 각질세포 분화 촉진 물질 스크리닝 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention, keratinocytes; and instructions, wherein the instructions describe a method for screening a keratinocyte differentiation promoting substance.

다른 측면에서, 본 발명은, 리핀-1(Lipin-1) 유전자 발현 촉진제를 포함하는 피부 각질 세포 분화, 피부 보습, 피부 장벽 기능 강화 또는 아토피 완화 또는 치료용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for skin keratinocyte differentiation, skin moisturizing, skin barrier enhancement or atopic relief or treatment comprising a Lipin-1 gene expression promoter.

본 발명의 일 측면에 따른 피부 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법은, 피부각질세포에 시험물질을 처리하고 리핀 유전자의 상대적 발현 정도를 확인함으로써, 간편하고 신속하며 효율적으로 각질세포 분화 촉진 물질을 스크리닝할 수 있다.A method for screening a dermal keratinocyte differentiation promoting substance according to an aspect of the present invention, by treating a test substance in dermal keratinocytes and confirming the relative expression level of the lipin gene, simply, quickly and efficiently screening a keratinocyte differentiation promoting substance can do.

도 1은, 인간 피부 각질 세포에서 리핀-1의 발현을 억제했을 때의 각질 세포 내 다양한 유전자들의 발현 변화를 보이는 도이다(좌: 대조군, 우: 리핀-1 특이적 siRNA 처리 실험군).
도 2는, 인간 피부 각질 세포에서 리핀-1을 과발현 시켰을 때, 각질 세포 내 다양한 유전자들의 발현 변화를 보이는 도이다(좌: 대조군, 우: 리핀-1 과발현 실험군).1 is a diagram showing changes in the expression of various genes in keratinocytes when the expression of Lipin-1 is suppressed in human skin keratinocytes (left: control group, right: Lipin-1 specific siRNA treatment group).
2 is a diagram showing changes in expression of various genes in keratinocytes when Lipin-1 is overexpressed in human skin keratinocytes (left: control group, right: Lipin-1 overexpression experimental group).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 명세서에서, 리핀(Lipin)은 지질대사 및 글루코스 수치의 항상성 조절에 관여하는 것으로 알려진 단백질로서, 피부를 포함하여, 지방조직, 골격근, 간 등의 조직에 다양하게 분포한다. 리핀은 크게 리핀-1(Lipin -1), 리핀-2(Lipin-2), 리핀-3(Lipin-3)로 3종류로 나뉜다. 특히, 리핀-1을 코딩하는 유전자는 LPIN1 라고 한다. 리핀-1은 자외선에 피부가 노출되면, 그 발현이 감소할 수 있다.In the present specification, Lipin is a protein known to be involved in lipid metabolism and homeostasis regulation of glucose levels, and is variously distributed in tissues such as adipose tissue, skeletal muscle, liver, including skin. Lipin is largely divided into three types: Lipin-1, Lipin-2, and Lipin-3. In particular, the gene encoding Lipin-1 is referred to as LPIN1. Lipin-1 expression can be reduced when the skin is exposed to ultraviolet rays.

일 측면에서, 본 발명은 피부 각질세포에, 시험 물질을 처리하는 단계; 및 시험 물질을 처리한 각질세포에서, 시험 물질의 처리 전후의 리핀(Lipin) 유전자의 상대적 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법이다.In one aspect, the present invention provides a method comprising: treating skin keratinocytes with a test substance; And in the keratinocytes treated with the test substance, it is a screening method for a skin keratinocyte differentiation promoting substance comprising the step of confirming the relative expression level of the lipin gene before and after the treatment with the test substance.

본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.As used herein, the term "skin" refers to a tissue covering the body surface of an animal, and is the broadest concept including not only tissues covering the body surface such as the face or body, but also the scalp and hair.

상기와 같은 측면에서, 상기 피부 각질 세포는 사람의 정상 피부 각질 세포를 포함한다.In the above aspect, the dermal keratinocytes include normal human dermal keratinocytes.

본 명세서에서, "상대적 발현 정도"는 시험 물질을 처리한 피부 각질 세포에서의 리핀 유전자의 발현 정도를, 시험 물질을 처리하지 않은 피부 세포에서의 리핀 유전자의 발현 정도와 비교하였을 때의 발현 정도일 수 있다. 상기 발현 정도는 발현량 및 발현 질(quality)을 포함할 수 있다. 또한, 발현 정도는, 예컨대, 단백질의 발현 정도를 포함할 수 있다.In the present specification, "relative expression level" may be the expression level when comparing the expression level of the lipin gene in skin keratinocytes treated with the test substance with the expression level of the lipin gene in skin cells not treated with the test substance. there is. The expression level may include expression level and expression quality (quality). In addition, the expression level may include, for example, the expression level of the protein.

본 명세서에서, 리핀 유전자는, 리핀 단백질을 코딩하는 유전자를 의미할 수 있다. As used herein, the lipin gene may refer to a gene encoding a lipin protein.

상기와 같은 측면에서, 상기 리핀 유전자는 리핀-1(Lipin-1) 유전자일 수 있다. 예컨대, 리핀-1 유전자는 리핀-1 단백질을 코딩하는 유전자인, LPIN1을 의미할 수 있다.In the above aspect, the lipin gene may be a lipin-1 (Lipin-1) gene. For example, the lipin-1 gene may refer to LPIN1, which is a gene encoding a lipin-1 protein.

본 발명의 일 측면인, 피부 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 방법은, 시험 물질 처리 후의 리핀 유전자의 발현 정도가 처리 전의 정도에 비해 높은 물질을, 각질세포 분화 촉진 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 시험 물질을 처리하지 않은 각질 세포에서의 리핀-1 유전자의 발현 정도보다 시험 물질을 처리한 각질 세포에서의 리핀-1 유전자의 발현 정도가 높으면, 처리한 시험 물질이 리핀-1 유전자의 발현 정도를 증가시켰다고 판단할 수 있다. 반대로, 시험 물질을 처리하지 않은 피부 세포에서의 리핀-1 유전자의 발현 정도보다 시험 물질을 처리한 피부 세포에서의 리핀-1 유전자의 발현 정도가 낮거나 유사하면, 처리한 시험 물질이 리핀-1 유전자의 발현 정도를 증가시키지 않았다고 판단할 수 있다. 앞서 살펴본 바와 같이 처리한 시험 물질이 리핀-1 유전자의 발현 정도를 증가시키면 피부 각질 세포 분화를 촉진하는 물질이라고 판단할 수 있다.In one aspect of the present invention, in the method for screening a skin keratinocyte differentiation promoting substance, the method comprises determining that a substance having a higher lipin gene expression level after treatment with a test substance than that before treatment is a keratinocyte differentiation promoting substance It may include further steps. For example, if the expression level of the lipin-1 gene in keratinocytes treated with the test substance is higher than the expression level of the lipin-1 gene in keratinocytes that have not been treated with the test substance, the treated test substance may express the lipin-1 gene It can be judged that the degree of increase has been increased. Conversely, if the expression level of the lipin-1 gene in skin cells treated with the test substance is lower or similar to that in skin cells not treated with the test substance, the treated test substance is lipin-1. It can be determined that the expression level of the gene is not increased. As described above, if the treated test substance increases the expression level of the Lipin-1 gene, it can be determined that it is a substance that promotes skin keratinocyte differentiation.

일 구체예에서, 리핀 유전자의 발현 정도는, 공지의 기술, 예컨대, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 엘라이자(ELISA), 웨스턴블럿 또는 이뮨 블롯(immune blot)을 이용하여 확인할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment, the expression level of the lipin gene can be confirmed using a known technique, for example, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), ELISA, western blot or immune blot. , but is not limited thereto.

상기와 같은 측면에서, 상기 스크리닝 방법은, 시험 물질의 처리 전후의 AMP-활성화 단백질 키나아제(AMP-activated protein kinase, AMPK), 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1(sterol regulatory element-binding protein-1, SREBP-1), 케라틴 1(Keratine 1) 및 케라틴 10(Keratin 10)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 상대적 발현 정도를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 피부 각질 세포의 분화에 관여하는 상기 유전자 마커들의 상대적 발현 정도를 확인하여, 대상 실험 물질이 피부 각질 세포 분화 촉진 물질인지 여부를 보다 명확하게 판단할 수 있다.In the above aspect, the screening method is, before and after the treatment of the test substance, AMP-activated protein kinase (AMP-activated protein kinase, AMPK), sterol regulatory element-binding protein-1 (sterol regulatory element-binding protein-1, SREBP-1), keratin 1 (Keratine 1) and keratin 10 (Keratin 10) may further include the step of confirming the relative expression level of one or more genes selected from the group consisting of. By confirming the relative expression levels of the gene markers involved in the differentiation of keratinocytes, it is possible to more clearly determine whether the target test substance is a substance that promotes keratinocyte differentiation.

상기와 같은 측면에서, 상기 스크리닝 방법은, 시험 물질 처리 후의 AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 유전자의 발현 정도가 처리 전의 정도에 비해 낮은 물질, 또는 시험 물질 처리 후의 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1(SREBP-1), 케라틴 1 및 케라틴 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도가 처리 전의 정도에 비하여 높은 물질을 각질세포 분화 촉진 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 실험 물질을 처리하지 않은 피부 세포에서의 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1(SREBP-1), 케라틴 1 및 케라틴 10로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도보다 시험 물질을 처리한 피부 세포에서의 상기 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도가 높으면 처리한 시험 물질이 상기 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도를 증가시켰다고 판단할 수 있다. 앞서 살펴본 바와 같이 상기 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도를 증가시키면 처리한 시험 물질이 피부 각질 세포 분화를 촉진하는 물질이라 고 판단할 수 있다. 또한, 실험 물질을 처리하지 않은 피부 세포에서의 AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK) 유전자의 발현 정도보다 시험 물질을 처리한 피부 세포에서의 발현 정도가 낮으면, 처리한 시험 물질이 AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK) 유전자의 발현 정도를 증가시켰다고 판단할 수 있다. 나아가, AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK) 유전자의 발현을 감소시키면, 처리한 시험 물질이 피부 각질 세포 분화를 촉진하는 물질이라고 판단할 수 있다.In the above aspect, in the screening method, the expression level of the gene of AMP-activated protein kinase (AMPK) after treatment with the test material is lower than that before treatment, or sterol regulatory element after treatment with the test material-binding protein-1 (SREBP-1), keratin 1, and keratin 10 may further include determining a material having a higher expression level than that before treatment as a keratinocyte differentiation promoting material. Specifically, the test substance-treated skin than the expression level of one or more genes selected from the group consisting of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1), keratin 1 and keratin 10 in skin cells not treated with the test substance When the expression level of the selected one or more genes in the cell is high, it can be determined that the treated test substance increases the expression level of the selected one or more genes. As described above, if the expression level of the selected one or more genes is increased, it can be determined that the treated test substance is a substance that promotes skin keratinocyte differentiation. In addition, if the expression level of the AMP-activated protein kinase (AMPK) gene in skin cells treated with the test substance is lower than the expression level of the AMP-activated protein kinase (AMPK) gene in skin cells not treated with the test substance, the treated test substance is AMP-activated protein kinase It can be determined that the expression level of the (AMPK) gene is increased. Furthermore, when the expression of the AMP-activated protein kinase (AMPK) gene is reduced, it can be determined that the treated test substance is a substance that promotes skin keratinocyte differentiation.

본 명세서에서, AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK)는, 5'AMP-활성화 단백질 키나아제(5'AMP-activated protein kinase) 또는 5'아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 키나아제(5'adenosine monophosphate-activated protein kinase)라고도 불리는 것으로서, 세포 에너지 항상성에 관여하는 효소로서, α, β 및 γ의 세가지 서브유닛으로 구성된다. 또한, 스테롤 조절 요소-결합 단백질(sterol regulatory element-binding protein)은, 스테롤 조절 요소(sterol regulatory element) DNA 시퀀스에 결합하는 전사 인자이며, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1과 스테롤 조절 요소-결합 단백질-2를 포함하며, 특히, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1은 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1a와 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1c를 포함한다. 스테롤 조절 요소-결합 단백질은 유전자 SREBF1 또는 SREBF2에 의해 인코딩된다. In the present specification, AMP-activated protein kinase (AMPK) is, 5'AMP-activated protein kinase (5'AMP-activated protein kinase) or 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (5'adenosine monophosphate-activated protein kinase) As an enzyme involved in cellular energy homeostasis, it is composed of three subunits: α, β, and γ. In addition, sterol regulatory element-binding protein is a transcription factor that binds to a sterol regulatory element DNA sequence, sterol regulatory element-binding protein-1 and sterol regulatory element-binding protein -2, in particular, sterol regulatory element-binding protein-1 includes sterol regulatory element-binding protein-1a and sterol regulatory element-binding protein-1c. The sterol regulatory element-binding protein is encoded by the gene SREBF1 or SREBF2.

상기 AMP-활성화 단백질 키나아제는 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1(SREBP-1)의 상위 조절자이다. 예컨대, AMP-활성화 단백질 키나아제의 발현양이 증가하면, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1의 발현양은 감소한다. 반대로, AMP-활성화 단백질 키나아제의 발현양이 감소하면, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1의 발현양은 증가한다. 또한, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1은 리핀-1 단백질의 상위 조절자이다. 예컨대, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1의 발현양이 증가하면, 리핀-1 단백질의 발현양도 증가하게 되고 반대로, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1의 발현양이 감소하면, 리핀-1 단백질의 발현양도 감소하게 된다. 이러한 내용은 논문 "Regulation of Hepatic Lipin-1 by Ethanol"(Role of AMPK-SREBP-1 Signaling, Hepatology, February 1, 2013, Ming Hu 외 9인)과 "Sterol-mediated Regulation of Human Lipin 1 Gene Expression in Hepatoblastoma Cells"(The Journal of Biological chemistry Vol. 284, No.33, pp.22195022205, August 14, 2009, Kenji Ishimoto 외 10인)에 설명되어 있다. The AMP-activated protein kinase is an upstream regulator of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). For example, when the expression level of AMP-activated protein kinase increases, the expression level of sterol regulatory element-binding protein-1 decreases. Conversely, when the expression level of AMP-activated protein kinase decreases, the expression level of sterol regulatory element-binding protein-1 increases. In addition, sterol regulatory element-binding protein-1 is an upstream regulator of the lipin-1 protein. For example, when the expression level of sterol regulatory element-binding protein-1 increases, the expression level of lipin-1 protein also increases. Conversely, when the expression level of sterol regulatory element-binding protein-1 decreases, the expression of lipin-1 protein quantity will decrease. These are the papers "Regulation of Hepatic Lipin-1 by Ethanol" (Role of AMPK-SREBP-1 Signaling, Hepatology, February 1, 2013, Ming Hu et al. 9) and "Sterol-mediated Regulation of Human Lipin 1 Gene Expression in Hepatoblastoma Cells" (The Journal of Biological chemistry Vol. 284, No. 33, pp. 22195022205, August 14, 2009, Kenji Ishimoto et al., 10).

일 구현예에서, 리핀-1 유전자의 발현이 증가하면, 케라틴 1과 케라틴 10의 발현양도 증가하고, 리핀-1 유전자의 발현이 감소하면, 케라틴1과 케라틴 10의 발현양도 감소한다. 따라서, 리핀-1은 케라틴 1과 케라틴 10의 상위 조절자라고 할 수 있다. 그러므로, 예컨대, AMP-활성화 단백질 키나아제의 발현양이 증가하면, 스테롤 조절 요소-결합 단백질-1, 리핀-1 단백질, 케라틴 1 및 케라틴 10의 발현양은 감소하게 된다. In one embodiment, when the expression of the lipin-1 gene increases, the expression levels of keratin 1 and keratin 10 also increase, and when the expression of the lipin-1 gene decreases, the expression levels of keratin 1 and keratin 10 also decrease. Therefore, it can be said that Lipin-1 is a high-level regulator of keratin 1 and keratin 10. Therefore, for example, when the expression level of AMP-activated protein kinase is increased, the expression level of sterol regulatory element-binding protein-1, lipin-1 protein, keratin 1 and keratin 10 is decreased.

상기 케라틴 1과 케라틴 10은, 피부 각질 세포의 분화, 피부 장벽 기능 및/또는 피부의 수분 보유력과 연관된 인자이다. 즉, 각질세포 내 케라틴 1과 케라틴10의 발현양이 증가하면, 각질 세포 분화, 피부의 장벽 기능, 피부의 수분 보유력 등이 향상될 수 있다. 이러한 내용은 논문 "Keratin 1 maintains skin integrity and participates in an inflammatory network in skin through interleukin-18"(Journal of Cell Science, November 6, 2012, Wera Roth 외 15인)과 "Impaired Cutaneous Permeability Barrier Function, Skin Hydration, and Sphingomyelinase Activity in Keratin 10 Deficient Mice" (The Journal of Investigative Dermatology, Vol.15, No.4, October, 2000, Jens-Michael Jensen 외 3인)에 설명되어 있다. 결국, 리핀-1의 발현 정도가 증가하면, 각질 세포 분화, 피부의 장벽 기능, 피부의 수분 보유력이 향상될 수 있다.The keratin 1 and keratin 10 are factors associated with the differentiation of skin keratinocytes, the skin barrier function and/or the water retention capacity of the skin. That is, when the expression levels of keratin 1 and keratin 10 in keratinocytes are increased, keratinocyte differentiation, skin barrier function, skin moisture retention ability, etc. may be improved. These are the articles "Keratin 1 maintains skin integrity and participates in an inflammatory network in skin through interleukin-18" (Journal of Cell Science, November 6, 2012, Wera Roth et al. 15) and "Impaired Cutaneous Permeability Barrier Function, Skin Hydration" , and Sphingomyelinase Activity in Keratin 10 Deficient Mice" (The Journal of Investigative Dermatology, Vol.15, No.4, October, 2000, Jens-Michael Jensen et al. 3). As a result, when the expression level of Lipin-1 is increased, keratinocyte differentiation, skin barrier function, and skin water retention capacity can be improved.

한편, 피부 각질 세포 분화가 잘 이루어지지 않으면 피부 각질층이 정상적인 기능을 할 수 없으므로, 피부의 수분 보유력이 떨어지고, 피부 장벽 기능이 저하된다. 또한 아토피와 같은 피부 질환의 경우, 여러 요인들에 의하여 정상적인 피부 각질층의 기능을 유지되지 않아 발생하는 질환으로, 피부 염증 및 피부 건조가 주된 증상으로 나타난다. 따라서 피부 세포 분화를 촉진하는 물질은 피부 보습, 피부 장벽 기능 강화 및 아토피를 완화시키거나 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 피부 각질 세포 분화 촉진 물질 스크리닝 방법을 이용하여 피부 보습용 물질, 피부 장벽 기능 강화용 물질 및 아토피 완화 또는 치료용 물질을 스크리닝 할 수 있다.On the other hand, if the skin keratinocytes are not properly differentiated, the stratum corneum of the skin cannot function normally, so the moisture retention of the skin is lowered and the skin barrier function is lowered. In addition, in the case of skin diseases such as atopic dermatitis, it is a disease that occurs because the function of the normal stratum corneum is not maintained due to various factors, and skin inflammation and dry skin appear as the main symptoms. Therefore, a substance that promotes skin cell differentiation may exhibit effects of moisturizing the skin, strengthening the skin barrier function, and alleviating or treating atopy. That is, a substance for skin moisturizing, a substance for enhancing skin barrier function, and a substance for alleviating or treating atopic dermatitis can be screened using the skin keratinocyte differentiation promoting substance screening method according to an aspect of the present invention.

본 발명은 다른 측면에서, 리핀-1(Lipin-1) 유전자 발현 촉진제를 포함하는 피부 각질 세포 분화 촉진, 피부 보습, 피부 장벽 기능 강화 또는 아토피 완화 또는 치료용 조성물이다.In another aspect, the present invention is a composition for promoting skin keratinocyte differentiation, skin moisturizing, enhancing skin barrier function, or alleviating or treating atopy comprising a Lipin-1 gene expression promoter.

상기와 같은 측면에서, 상기 조성물은 화장품 조성물, 약학적 조성물, 또는 건강 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the above aspect, the composition may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, or a health food composition, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 통하여, 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are provided for illustrative purposes only to aid understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.

[실시예 1] 리핀-1(Lipin-1) 넉다운에 의한 피부 각질 세포의 분화 억제 확인[Example 1] Confirmation of inhibition of differentiation of skin keratinocytes by lipin-1 knockdown

인간 정상 피부각질세포 (human neonatal keratinocyte)는 론자사(Lonza)에서 분양 받아 사용하였다. 상기 세포는 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500 ml의 KGM-2 (Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2 ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5 ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5ml, 및 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다. Human neonatal keratinocytes were purchased from Lonza and used. The cells were subcultured and then incubated in a CO 2 incubator at 37° C. and 5% CO 2 conditions . Cell cultures were cultured according to Lonza's guidelines. In 500 ml of KGM-2 (Clonetics CC-3103) medium, KGM-2 bullet kit (Bullet kit: BPE (Bovine pituitary extract) 2 ml, hEGF (human epidermal growth factor) 0.5 ml, Insulin 0.5 ml, Hydro Cortisone (Hydrocortisone) 0.5 ml, transferrin (Transferrin) 0.5 ml, epinephrine (Epinephrine) 0.5 ml, and gentamicin sulfate + amphofericin-B (Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml was added and used. .

인간 피부각질세포를 60 mm 배양접시에 70-80% 차게 분주한 후 24시간 배양하였다. Human skin keratinocytes were aliquoted to 70-80% cold in a 60 mm culture dish and cultured for 24 hours.

리핀-1(Lipin-1)이 피부 각질세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 25nM의 리핀-1 특이적 siRNA(small interfering RNA), 대조군 특이적 siRNA 각각을 lipofectamine®RNAiMAX™(Invitrogen)과 함께 OPTI-MEM배지(Invitrogen)에서 6시간 처리하여 트랜스펙션시켰다. 이후, 배지를 KGM-Gold 배지로 교체하고 24시간 경과 후에 세포에 용해버퍼(lysis buffer)를 처리하여 세포추출물을 준비하였다. 동량의 단백질의 세로추출물을 4-12% SDS PAGE에 로딩한 후 분리하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 리핀-1 특이적 siRNA에 의한 각질 세포내 다양한 단백질들(케라틴5, 케라틴14, 케라틴1, 케라틴10, 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin))의 발현을 대조군과 비교하였다. 리핀-1 특이적 siRNA를 처리한 결과, 각질세포 분화 마커인 케라틴 1, 케라틴 10의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 1). In order to confirm the effect of Lipin-1 on the differentiation of keratinocytes in the skin, 25nM of Lipin-1 specific siRNA (small interfering RNA) and control specific siRNA, respectively, were used together with lipofectamine® RNAiMAX™ (Invitrogen). Transfection was carried out for 6 hours in OPTI-MEM medium (Invitrogen). Thereafter, the medium was replaced with KGM-Gold medium, and after 24 hours, the cells were treated with a lysis buffer to prepare a cell extract. The vertical extract of the same amount of protein was loaded on 4-12% SDS PAGE, separated, and analyzed by Western blot. Expression of various proteins (keratin 5, keratin 14, keratin 1, keratin 10, involucrin, loricrin) in keratinocytes by Lipin-1 specific siRNA was compared with the control group. As a result of treatment with Lipin-1 specific siRNA, it was confirmed that the expression of keratin 1 and keratin 10, which are markers of keratinocyte differentiation, were reduced ( FIG. 1 ).

[실시예 2] 리핀-1의 과발현에 의한 피부 각질 세포의 분화 촉진 확인[Example 2] Confirmation of promotion of differentiation of skin keratinocytes by overexpression of Lipin-1

60 mm 배양 접시에 70-80% 분주된 인간 피부각질 세포에, 1㎍의 리핀-1을 인코딩하는 GFP 플라스미드, 대조군 GFP 플라스미드 각각을 X-treme GENE HP DNA 트랜스펙션 시약과 함께 하룻밤 처리하였다. 이후, 배지를 KGM-Gold™로 교체하여 3일 동안 배양하여 분화를 유도 시킨 후, 세포에 용해 버퍼를 처리하여 세포추출물을 준비하였다. 동량의 단백질의 세로추출물을 4-12% SDS PAGE에 로딩한 후 분리하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 리핀-1을 과발현 시킨 실험군에서의 단백질들(keratin5, keratin14, keratin1, keratin10, involucrin, loricrin)의 발현을 대조군에서의 발현과 비교하였다. 그 결과, 리핀-1을 과발현 시킨 군(Lipin-1를 인코드하는 GFP 플라스미드를 처리한 군)에서, 대조군에 비해 각질 세포 분화 마커인 케라틴 1과, 케라틴 10의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).In a 60 mm culture dish, 70-80% of human keratinocytes were treated with 1 μg of Lipin-1 encoding GFP plasmid and control GFP plasmid, respectively, overnight together with X-treme GENE HP DNA transfection reagent. Thereafter, the medium was replaced with KGM-Gold™ and cultured for 3 days to induce differentiation, and then the cells were treated with a lysis buffer to prepare a cell extract. The vertical extract of the same amount of protein was loaded on 4-12% SDS PAGE, separated, and analyzed by Western blot. The expression of proteins (keratin5, keratin14, keratin1, keratin10, involucrin, loricrin) in the experimental group overexpressing Lipin-1 was compared with the expression in the control group. As a result, it was confirmed that the expression of keratin 1 and keratin 10, keratinocyte differentiation markers, were increased in the group overexpressing Lipin-1 (group treated with the GFP plasmid encoding Lipin-1) compared to the control group. (Fig. 2).

Claims (11)

피부 각질세포에, 시험 물질을 처리하는 단계; 및
시험 물질을 처리한 각질세포에서,
시험 물질의 처리 전후의 리핀-1(Lipin-1) 유전자의 상대적 발현 정도를 확인하는 단계; 및
시험 물질의 처리 전후의 케라틴 1 (Keratin 1) 및 케라틴 10 (Keratin 10)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 상대적 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는,
피부 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법.treating the skin keratinocytes with a test substance; and
In the keratinocytes treated with the test substance,
Checking the relative expression level of the lipin-1 (Lipin-1) gene before and after the treatment of the test substance; and
Including the step of confirming the relative expression level of one or more genes selected from the group consisting of keratin 1 (Keratin 1) and keratin 10 (Keratin 10) before and after the treatment of the test substance,
A method for screening skin keratinocyte differentiation promoting substances. 삭제delete 제1항에 있어서,
시험 물질 처리 후의 리핀-1 유전자의 발현 정도가 처리 전의 정도에 비해 높은 물질을, 각질세포 분화 촉진 물질로 판단하는 단계; 및
시험 물질 처리 후의 케라틴 1 및 케라틴 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도가 처리 전의 정도에 비하여 높은 물질을 각질세포 분화 촉진 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는,
피부 각질세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법.The method of claim 1,
determining, as a keratinocyte differentiation promoting substance, a substance having a higher level of expression of the Lipin-1 gene after treatment with the test substance compared to that before treatment; and
Further comprising the step of judging a substance having a higher expression level of one or more genes selected from the group consisting of keratin 1 and keratin 10 after treatment with the test substance as a keratinocyte differentiation promoting material compared to the level before treatment,
A method for screening skin keratinocyte differentiation promoting substances. 삭제delete 삭제delete 제1항 또는 제3항에 있어서,
스크리닝 방법은 각질세포 분화 촉진에 의한 피부 장벽 강화용 물질 스크리닝 방법인, 스크리닝 방법.4. The method of claim 1 or 3,
The screening method is a screening method, which is a screening method for a substance for strengthening the skin barrier by promoting differentiation of keratinocytes. 제1항 또는 제3항에 있어서,
스크리닝 방법은 각질세포 분화 촉진에 의한 피부 보습용 물질 스크리닝 방법인, 스크리닝 방법.4. The method of claim 1 or 3,
The screening method is a screening method, which is a method for screening a substance for skin moisturizing by promoting differentiation of keratinocytes. 제1항 또는 제3항에 있어서,
스크리닝 방법은 각질세포 분화 촉진에 의한 아토피 완화 또는 치료용 물질 스크리닝 방법인, 스크리닝 방법.4. The method of claim 1 or 3,
The screening method is a screening method of a substance for alleviating or treating atopic dermatitis by promoting keratinocyte differentiation. 각질세포; 및
지시서를 포함하며,
상기 지시서에는 제1항 또는 제3항의 방법이 기재되어 있는, 피부 각질세포 분화 촉진 물질 스크리닝 키트.keratinocytes; and
including instructions;
The method of claim 1 or claim 3 is described in the instructions, a skin keratinocyte differentiation promoting substance screening kit. 유효성분으로서 리핀-1(Lipin-1) 유전자 발현 촉진제; 및
케라틴 1 및 케라틴 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현 촉진제를 포함하는, 피부 각질 세포 분화 촉진용 조성물.Lipin-1 gene expression promoter as an active ingredient; and
A composition for promoting skin keratinocyte differentiation, comprising at least one gene expression promoter selected from the group consisting of keratin 1 and keratin 10. 유효성분으로서 리핀-1(Lipin-1) 유전자 발현 촉진제; 및
케라틴 1 및 케라틴 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현 촉진제를 포함하는, 피부 장벽 기능 강화용, 피부 보습용 또는 아토피 완화 또는 치료용 조성물.Lipin-1 gene expression promoter as an active ingredient; and
A composition for enhancing skin barrier function, moisturizing the skin, or alleviating or treating atopic dermatitis, comprising one or more gene expression promoters selected from the group consisting of keratin 1 and keratin 10.
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