KR102378697B1 - 변형된 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 리소좀 효소를 인산화시키는 향상된 능력을 갖는 변형 UDP-GlcNAc:리소좀 효소 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

변형된 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법{COMPOSITIONS COMPRISING A MODIFIED GlcNAc-1-PHOSPHOTRANSFERASE AND METHODS OF USE THEREOF}

정부 권리

본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health: NIH)에 의해 부여된 CA 008759 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 9월 30일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/402,468호의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 개시내용은 리소좀 효소를 인산화시키는 향상된 능력을 갖는 변형된 UDP-GlcNAc:리소좀 효소 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 및 이의 사용 방법을 제공한다.

효소 대체 요법(Enzyme Replacement Therapy: ERT)은, 그의 효능이 개개 장애에 따라 다르지만, 현재 다수의 리소좀 저장 질환에 대한 치료의 주된 형태이다. 이들 유전 장애 중 대부분은 단일 리소좀 효소의 활성 결여로부터 일어나는데, 이는 효소에 의해 정상적으로 분해되는 물질의 축적을 야기한다. 리소좀 내 저장 물질의 구성은 세포 및 기관 기능장애를 초래한다. ERT의 목표는 저장 물질을 청소하고 리소좀 기능을 회복시키기 위해 결함 세포의 리소좀 내로 충분한 양의 정상 효소를 도입하는 것이다. 이런 형태의 요법은 산 β-글루코세레브로시다제 활성을 결여하고 주로 대식세포 유형의 세포에서 글리코실세라마이드를 축적하는 1형 고쉐병을 갖는 환자에서 처음 사용되었다. 말단의 만노스 잔기를 갖는 N-연결 글리칸을 함유하는 대체 효소는 정맥내로 주입되고 세포 표면 만노스 수용체를 통해 대식세포에 의해 취해진다. 이어서, 내포된(endocytosed) 효소는 엔도좀을 통해 리소좀으로 수송되는데, 이는 이 장애에서 양호한 임상 결과로 작용한다.

대부분의 세포 유형은 만노스 수용체를 결여하기 때문에, 대식세포 이외의 세포 유형을 수반하는 리소좀 저장 장애를 치료하기 위해 사용되는 대체 효소는 리소좀에 대한 후속적 전달을 위해 세포 표면에서 만노스 6-인산염(Man-6-P) 수용체에 대한 결함을 이용한다. 이들 효소는 고수준의 관심 효소를 생산하도록 조작된 포유류 세포(대부분 중국 햄스터 난소 세포)의 분비로부터 정제된다. 이 접근은 발현된 리소좀 효소의 N-글리칸의 만노스 잔기를 인산화하는 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 능력에 의존한다. 이 기법에 의해 생산된 대체 효소 중 일부는 고도로 인산화되며, Man-6-P 수용체에 잘 결합한다. 그러나, 나머지는 불량하게 인산화되어 ERT에서 그들의 유효성을 제한한다. 이는 폼페병 효소(산-α-글루코시다제, GAA) 및 알파-만노사이드축적증 효소(리소좀 산 α-만노시다제, LAMAN)를 포함한다.

따라서, 효소 대체 요법 및 개선된 효소 생산의 개선된 방법에 대한 필요가 있다.

양상에서, 본 개시내용은 서열번호 1의 전장 인간 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛에 관하여 아미노산의 내부 결실을 포함하는 변형 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 제공한다. 전장 GlcNAc-1-PT α/β는 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 C-말단으로 배열된 스페이서-1 도메인(스페이서-1), Notch 1 도메인(Notch 1), Notch 2 도메인(Notch 2), 스페이서-2 도메인(스페이서-2), DNA 메틸트랜스퍼라제-관련 단백질 상호작용 도메인(DMAP), 스페이서-3 도메인(스페이서-3), α/β 서브유닛 절단 부위, 및 스페이서-4 도메인(스페이서-4)을 포함한다. 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛에서, 스페이서-1은 내부로 결실된다. 추가로, Notch-1과 α/β 서브유닛 절단 부위 사이의 영역이 또한 결실된다.

다른 양상에서, 본 개시내용은 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하되, 스페이서-1 또는 스페이서-1 및 Notch-1과 α/β 서브유닛 절단 부위 사이의 영역은 결실된다.

양상에서, 본 개시내용은 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하되, 스페이서-1, 또는 스페이서-1 및 Notch-1과 α/β 서브유닛 절단 부위 사이의 영역은 결실된다.

양상에서, 본 개시내용은 세포 내 외인성 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛을 발현시킴으로써, 관심 단백질, 예컨대 β-글루코세브로시다제(GBA), GalA, 카텝신 D(CathD), C2형 니만-피크병(NPC2), β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA), β-만노시다제(MANBA), 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, 산 α-글루코시다제(GAA), 또는 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN) 단백질의 올리고당 인산화를 증가시키는 방법을 제공한다.

양상에서, 본 개시내용은 세포에서 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛을 발현시킴으로써, 세포 표면 만노스 6-인산염(Man-6-P) 수용체(Man-6-P)에 대한 관심 단백질을 증가시키는 방법을 제공한다.

양상에서, 본 개시내용은 세포에서 관심 리소좀 효소, 예컨대 GBA, GalA, CathD, NPC2, HEXB, GLA, MANBA, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, GAA 또는 LAMAN와 함께 변형 GlcNAc-1-PT α/β를 공동발현시킴으로써, 리소좀 효소의 인산화를 향상시키는 방법을 제공한다.

본 출원의 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 출원의 사본은 요청 시 그리고 필요한 수수료의 지불 시에 특허청으로부터 제공될 것이다.
도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d, 도 1e, 도 1f 및 도 1g는 스페이서-1 도메인이 α/β 전구체의 절단 부위를 조절한다는 것을 나타내는 개략도, 정렬, 면역블롯 및 그래프를 도시한 도면. (도 1a) GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛 모듈 배열 및 인간 스페이서-1 서열을 딕티오스텔리움 디스코이데움(D. discoideum) 스페이서-1로 대체하는 개략도. (도 1b) 항-V5 항체로 프로빙한 GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 발현된 DS1 결실 돌연변이체에 대한 WT α/β의 면역블롯 분석. (도 1c) 벡터, WT α/β 전구체 또는 다양한 돌연변이체 cDNA로 형질감염된 GNPTAB ^-/- 세포의 추출물을 이용하는 단순당 αMM에 대한 포스포트랜스퍼라제 활성. 총 단백질 농도에 대해 활성을 정규화시켰다. (도 1d) WT α/β 전구체 또는 DS1 돌연변이체 cDNA 중 하나로 형질감염시킨 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 S1P 활성의 저해. 형질감염 24시간 후에, PF-429242를 최종 농도 10μM로 세포에 첨가하고 나서, 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에 채취하였다. 세포 추출물을 제조하고 나서, 20㎍의 각각의 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 나서, 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. (도 1e) 다른 공지된 S1P 부위를 갖는 2개의 GlcNAc-1-PT α 서브유닛 S1P 기질 부위의 아미노산 정렬. 음영이 있는 박스는 보존된 공통 절단 모티프를 나타낸다. (도 1f) WT α/β 또는 DS1 결실 돌연변이체 중 하나의 맥락에서 점 돌연변이, R925A, R879A 및 R925A/R879A의 면역블롯 분석. 단백질을 GNPTAB ^-/- -Hela 세포에서 발현시킨 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분리시키고, 나이트로셀룰로스에 전달하고 나서, 항-V5 항체로 프로빙하였다. (도 1g) CI-MPR-친화도 비드에 대한 3종의 내인성 리소좀 효소의 결합에 의해 결정되는 바와 같이 효소 인산화를 결정하기 위해 WT α/β 또는 도 1f에서 나타내는 다양한 돌연변이체 중 하나를 이용하는 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 형질감염. 결합된 물질을 활성에 대해 분석하였고, WT α/β로 형질감염된 세포에 의해 얻은 값을 100%로 설정한다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 스페이서-1의 결실이 몇몇 비-리소좀 당단백질의 인산화를 향상시킨다는 것을 나타내는 그래프 및 면역블롯을 도시한 도면. (도 2a) 총 가용성 만노스 인산화는 벡터 단독, WT α/β 전구체 또는 DS1 돌연변이체 cDNA 중 하나를 이용하여 GNPTAB ^-/- Hela 세포를 형질감염시킨 다음에, [2-³H]만노스 표지에 의해 결정하였다. 나타낸 값을 포스포텅스텐산 침전물 중의 총 계수의 분율로서 CI-MPR 친화도 비드에 의해 회수된 계수의 백분율로서 계산하였다. *는 p= <0.05를 나타낸다. (도 2b) GNPTAB ^-/- Hela 세포를 WT α/β 전구체 또는 DS1 돌연변이체 cDNA와 함께 3종의 리소좀 단백질 또는 4종의 비-리소좀 단백질을 암호화하는 플라스미드와 함께 공동형질감염시켰다. 세포를 [2-³H]-만노스로 표지한 후에, 배지 내로 분비된 단백질의 면역침전 및 Man-6-P를 함유하는 N-글리칸 백분율의 결정이 이어졌다. WT에 의해 얻어진 값을 1.0으로 설정한다. WT α/β 전구체와 함께 공동발현시킨 표시된 단백질에 대한 인산화의 절대값은 GLA, 36 ± 3%; NPC2, 51 ± 6% C; CathD 25 ± 8%; DNase I, 23 ±4%; 레닌(Renin), 21 ± 4%; LIF, 24 ± 7%; PoFut2, 12.6%였다. (도 2c) 빈 벡터, WT α/β 전구체 또는 DS1 돌연변이체 cDNA와 함께 표시된 단백질에 대한 발현 플라스미드와 함께 공동형질감염된 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 웨스턴 블롯. 세포 용해물을 CI-MPR-친화도 비드와 함께 인큐베이션시키고, 다음의 항체를 이용하는 블롯을 프로빙함으로써 다양한 단백질의 결합을 결정하였다: 레닌-항-HA; 천연 단백질에 대해 생성된 항체를 이용하는 NPC2, GP, Lamp1 및 Lamp2.
도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3e, 도 3f 및 도 3g는 다수의 당단백질을 비특이적으로 인산화할 수 있는 최소 효소의 생성을 나타내는 개략도, 그래프 및 면역블롯을 도시한 도면. (도 3a) GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 발현되는 다양한 α/β 전구체 결실 작제물의 개략도. (도 3b) 총 가용성 단백질의 만노스 인산화를 WT α/β 전구체 또는 표시된 결실 돌연변이체 cDNA로 GNPTAB ^-/- Hela 세포를 형질감염시킨 후에, [2-³H]만노스 표지함으로써 결정하였다. 나타낸 값을 포스포텅스텐산 침전물 중의 총 계수의 분율로서 CI-MPR 친화도 비드에 의해 회수된 계수의 백분율로서 계산하였다. 0.8 ± 0.3%의 배경값을 차감하여 최종 도시된 값을 수득하였다. *는 p= <0.05를 나타내고, **는 p= <0.01을 나타낸다. (도 3c) WT α/β 전구체, N1-D 또는 S1-D 결실 돌연변이체 cDNA 중 하나를 이용하는 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 형질감염. 인산화 매개 WT 또는 돌연변이체 단백질의 정도를 CI-MPR-친화도 비드에 대한 3종의 내인성 리소좀 효소의 결합에 의해 결정하였다. 결합된 물질을 활성에 대해 분석하였고, WT α/β에 의해 형질감염된 세포에 의해 얻은 값을 100%로 설정한다. (도 3d) GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 발현된 WT α/β 전구체 및 결실 돌연변이체의 웨스턴 블롯. 표시된 양의 각각의 세포 추출물을 장입하고 나서, 항-V5 항체를 이용하여 α/β 전구체 및 β 서브유닛을 검출하였다. (도 3e) 동일한 양의 전체 세포 추출물을 이용하는 αMM에 대한 WT α/β 전구체 및 돌연변이체의 촉매적 활성. 대조군 및 WT 값으로서 작용하는 벡터 단독 형질감염 GNPTAB ^-/- Hela 세포 추출물을 벡터-단독 배경의 차감 후에 100%로 설정하였다. (도 3f) 빈 벡터, WT α/β 전구체 또는 표시된 결실 돌연변이체 cDNA와 함께 표시된 단백질에 대한 발현 플라스미드에 의해 공동형질감염된 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 면역블롯 분석. 세포 용해물을 CI-MPR-친화도 비드와 함께 인큐베이션시키고, 도 2c에서 기재한 바와 같은 항체를 이용하여 또는 PoFut2에 대해 항-myc 및 vWF A1A2A3 도메인에 대해 항-Strep 태그를 이용하여 블롯을 프로빙함으로써 다양한 단백질의 결합을 결정하였다. (도 3g) WT α/β 전구체, N1-S3 또는 S1-S3 결실 돌연변이체 cDNA 중 하나로 GNPTAB ^-/- HeLa 세포의 형질감염. 인산화 매개 WT 또는 돌연변이체 단백질 정도를 CI-MPR-친화도 비드에 대한 3종의 내인성 리소좀 효소의 결합에 의해 돌연변이체 단백질을 결정하였다. 결합된 물질을 활성에 대해 분석하였고, WT α/β로 형질감염된 세포에 의해 얻은 값을 100%로 설정한다.
도 4는 비-리소좀 당단백질의 인산화가 최소 α/β 전구체에 의해 매개된다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면. GNPTAB ^-/- Hela 세포를 4종의 비-리소좀 당단백질에 대한 발현 플라스미드와 함께 WT α/β 전구체 또는 S1-S3 결실 돌연변이체 cDNA를 이용하여 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에, 세포를 2시간 동안 [2-³H]-만노스로 표지한 후에, 단백질 내로 분비된 단백질의 면역침전 및 N-글리칸 함유 Man-6-P의 백분율 결정이 이어졌다. WT에 의해 얻은 값을 1로 설정한다. WT α/β 전구체와 함께 공동발현시킨 표시된 단백질에 대한 인산화의 절대값은 LIF, 26 ± 5%; 레닌, 22 ± 2%; PoFut2, 26 ± 2%, DNase I, 22 ± 3%였다.
도 5는 GlcNAc-1-PT 작용에 대한 모델을 도시한 도면. (상부) 스페이서-1 도메인(보라색)이 4개의 Stealth 도메인(핑크)에 의해 형성된 촉매적 부위를 방해하기 때문에, 기저 상태에서 GlcNAc-1-PT는 기질 분자 상에서 글리칸 쇄와 맞물릴 수 없다. 이제 스페이서-1 도메인이 대체되어, 리소좀 효소 고-만노스 글리칸의 만노스 잔기가 촉매 부위로 유입되어 인산화되는 것을 허용하도록, Notch 분자/DMAP 상호작용 도메인(오렌지)에 대한 리소좀 효소 단백질-도킹 부위의 결합은 입체배좌 변화를 유도한다. 일부 예에서, γ 서브유닛의 Man-6-P 수용체 상동성 도메인(녹색)은 촉매적 부위로 올리고당을 가이드하도록 도울 것이다. (하부) 스페이서-1 도메인 및 Notch 모듈/DMAP 상호작용 도메인이 없는 최소 효소는 인산화를 위한 기질 분자 상의 단백질-도킹 부위를 저해하지도 필요로 하지도 않는다. 이 효소는 매우 고수준으로 발현되며, 그들의 최종 목적과 상관없이 골지를 통과한 모든 가용성 당단백질을 인산화시킬 수 있다.
도 6은 인간 GlcNAc-1-PT α/β 전구체의 상이한 도메인의 모듈 조직 및 딕티오스텔리움 디스코이데움 및 네이세리아 메닌기티디스(N. meningitidis) GlcNAc-1-PT에 의한 정렬을 나타내는 개략도를 도시한 도면. 딕티오스텔리움 디스코이데움 단백질이 인간 단백질과 같은 단백질 분해 가공을 겪는지는 분명하지 않다. 함께 녹색으로 나타낸 4개의 영역은 협막다당 생합성에 수반되는 박테리아 단백질에서 처음 동정된 진화적으로 보존된 도메인인 Stealth를 포함한다.
도 7은 WT α/β 전구체 또는 표시된 돌연변이체 cDNA 중 하나로 형질감염된 HEK 293 세포의 웨스턴 블롯을 도시한 도면. 다양한 작제물이 V-에피토프에 추가로, C-말단에서 6X-His 히스티딘 태그를 갖기 때문에 α/β 전구체뿐만 아니라 β 서브유닛을 친화도 정제하기 위해 세포 용해물을 Ni-NTA-아가로스와 함께 인큐베이션시켰다. 화살촉은 WT 단백질에 의해 보이는 소량의 Q882 절단된 β 서브유닛을 나타내는 반면, *는 K928에서 절단에 기인하는 정상 β이다. R925A 돌연변이체는 또한 소량의 Q882-절단 β를 나타내는 반면, K928-절단된 β는 이 경우에 완전히 사라졌다. β 서브유닛은 둘 다 DS1/R879A/R925A 돌연변이체가 완전히 없다.
도 8a는 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛 모듈 배열 및 인간 스페이서-1 서열을 Gly 및 Ser 잔기를 포함하는 26 aa 링커 서열로 대체하는 개략도를 도시한 도면. 도 8b은 GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 발현시키고 항-V5 항체로 프로빙한 WT α/β 대 DS1 및 ΔS1 결실 돌연변이체의 면역블롯 분석을 도시한 도면. 도 8c는 WT α/β 전구체 또는 ΔS1 돌연변이체 cDNA로 형질감염시킨 GNPTAAB ^-/- 세포의 추출물을 이용하여, 단순당 αMM에 대한 포스포트랜스퍼라제 활성을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 활성을 총 단백질 농도에 대해 정규화시켰다. 도 8d는 WT α/β 전구체, DS1 또는 ΔS1 돌연변이체 cDNA 중 하나로 형질감염된 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 S1P 활성의 저해를 나타내는 면역블롯을 도시한 도면. 형질감염 24시간 후에, PF-429242를 10μM의 최종 농도로 세포에 첨가하였고, 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에 채취하였다. 세포 추출물을 준비하고 나서, 20㎍의 각각의 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
도 9는 WT α/β 전구체, DS1 또는 ΔS1 돌연변이체 cDNA 중 하나로 형질감염시키고, 각각 골지 마커 GOLPH4로 공동국소화시킨 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 공초점 면역형광 이미지를 도시한 도면(방법 참조).
도 10은 WT α/β 전구체, 또는 표시된 돌연변이체 cDNA 중 하나로 형질감염시키고, 골지 마커 GOLPH4로 각각 공동 국소화시킨 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 공초점 면역형광 이미지를 도시한 도면(방법).
도 11은 WT α/β 전구체, N1-S3 또는 S1-S3 돌연변이체 cDNA 중 하나로 형질감염시키고, 각각 골지 마커 GOLPH4로 공동국소화시킨 GNPTAB ^-/- Hela 세포의 공초점 면역형광 이미지를 도시한 도면(방법 참조).
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 최소 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 발현 및 효소 활성의 분석을 나타내는 개략도 및 그래프를 도시한 도면. (도 12a) WT GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛 모듈 배열 및 최소 효소인 S1-S3의 모듈 배열의 개략도. 최소 효소는 인간 스페이서-1 서열의 딕티오스텔리움 디스코이데움 스페이서-1로의 대체 및 아미노산 438 내지 928의 제거에 의해 생산되었다. (도 12b) Expi293F 세포 또는 마우스 D9 세포를 빈 벡터, WT α/β 전구체 또는 S1-S3 돌연변이체 cDNA와 함께 표시된 리소좀 효소에 대한 발현 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. CI-MPR-친화도 비드에 결합시킴으로써 그리고 방법 하에 기재된 바와 같은 결합된 물질의 활성을 분석함으로써 각각의 효소에 대해 WT α/β 전구체 또는 S1-S3 돌연변이체 중 하나에 의해 매개된 인산화 정도를 결정하였다. 빈 벡터에 의해 얻은 값은 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제에 의해 매개된 활성을 나타낸다. (도 12c) GNPTAB ^-/- Hela 세포를 4종의 리소좀 효소에 대한 발현 플라스미드와 함께 WT α/β 전구체 또는 S1-S3 결실 돌연변이체 cDNA 중 하나로 공동형질감염시킨 한편, 모 Hela 세포를 후자에 대해 cDNA 단독으로 형질감염시키고, 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 활성을 이용하였다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 2시간 동안 [2-³H]-만노스로 표지한 후에, 배지 내로 분비된 단백질을 면역침전시키고, Man-6-P를 함유하는 N-글리칸 백분율을 결정하였다. 인산화%의 절대값을 나타낸다.

본 발명자들은 다수의 서브유닛 요소를 결여하는 한편, 촉매적 "Stealth" 도메인을 보유하는 절단된 α/β 전구체가 매우 고수준으로 발현되어 WT 효소에 의해 생기는 것보다 20배 더 큰 촉매적 활성을 초래한다는 것을 나타낸다. 절단된 α/β 전구체는 다양한 리소좀 및 비리소좀 단백질의 내인성 수준 이상으로 만노스 인산화를 자극하였다. 추가로, 절단된 효소는 만노스-6-P 수용체에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 초래하는 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸의 형성을 증가시켰다. 리소좀 효소 인산화는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 WT 또는 절단된 α/β 전구체 중 하나로 공동형질감염에 의해 실질적으로 증가될 수 있다. 향상된 인산화는 세포에 의한 결합 및 흡수를 증가시킨다. 이 효과는 심지어 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제에 의해 잘 인산화된 리소좀 효소, 예컨대 GalA에 의해 일어난다. 더 나아가, 이 방법은 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제에 의해 불량하게 인산화되는 2종의 리소좀 효소인 LAMAN 및 GAA의 인산화 및 흡수를 향상시킨다. 본 개시내용의 다양한 양상은 이하에 더 상세하게 기재한다.

I. 조성물

양상에서, 본 개시내용은 단리된 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함한다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함한다.

양상에서, 전장 GlcNAc-1-PT 단백질은 3개의 서브유닛, α, β 및 γ 서브유닛을 포함할 수 있다. α 및 β(GlcNAc-1-PT α/β) 서브유닛은 γ 서브유닛의 부재 하에 대부분의 리소좀 효소를 인산화시킬 수 있다. GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 다양한 보존된 도메인을 포함할 수 있다. GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛의 보존된 도메인은 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 C-말단까지 배열된, 스페이서-1 도메인(스페이서-1), Notch 1 도메인(Notch 1), Notch 2 도메인(Notch 2), 스페이서-2 도메인(스페이서-2), DNA 메틸트랜스퍼라제-관련 단백질 상호작용 도메인(DMAP), 스페이서-3 도메인(스페이서-3) 및 스페이서-4 도메인(스페이서-4)을 포함할 수 있다. 서브유닛은 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 C-말단까지 배열된 스페이서-1, Notch 1, Notch 2, 스페이서-2 및 DMAP를 포함할 수 있다. 스페이서-3은 α 및 β 서브유닛을 확장시킬 수 있고, α 및 β 서브유닛이 절단되는 부위인 α/β 서브유닛 절단 부위를 포함할 수 있다. 스페이서-4는 β 서브유닛일 수 있다.

양상에서, GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 하나 이상의 보존된 도메인의 결실에 의해 변형될 수 있다. 비제한적 예로서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1, Notch 1, Notch 2, 스페이서-2, DMAP 및 스페이서-3의 부분 중 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1 및 Notch 1 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1 및 Notch 2 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1, Notch 1 및 Notch 2 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1, Notch 1, Notch 2 및 스페이서-2 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1, Notch 1, Notch 2, 스페이서-2 및 DMAP 결실을 포함할 수 있다. 양상에서, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 스페이서-1, Notch 1, Notch 2, 스페이서-2 및 DMAP 결실, 및 스페이서-3의 α/β 서브유닛 절단 부위에서 스페이서-3 부분의 결실을 포함할 수 있다.

양상에서, 본 개시내용은 단리된 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하며, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다.

(a) GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제

양상에서, 본 개시내용은 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT)를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제"는 야생형 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제, 돌연변이체 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제, GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 기능성 상동체 및 이의 단편을 포함한다. GlcNAc-1-PT는 두 유전자에 의해 암호화된 α2β2γ2 헥사머 단백질이다. 더 작은 γ 서브유닛은 GNPTG 유전자에 의해 암호화되는 반면, α 및 β 서브유닛은 GNPTAB 유전자에 의해 단일 α/β 전구체로서 암호화된다. K928에서 인간 α/β 전구체의 단백질 분해 절단은 골지에서 부위-1 프로테아제(S1P)에 의해 매개되며, 이 절단은 단백질의 촉매 적격에 필수적이다. GlcNAc-1-PT는 리소좀산 가수분해효소에 대한 입체배좌-의존적 단백질 결정소에 선택적으로 결합함으로써 그리고 가수분해효소의 고만노스-유형 N-연결 글리칸 상의 UDP-GlcNAc 로부터 만노스 잔기까지의 GlcNAc-1-P의 전달을 촉매함으로써 Man-6-P 태그의 생성에서 초기 및 대부분의 중대한 단계를 수행한다. 따라서, 기능성 상동체 또는 단편을 포함하는 본 개시내용의 GlcNAc-1-PT는 Man-6-P 태그를 생성한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함한다. 전장 인간 α/β GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 아미노산 서열에 대한 서열 정보는, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 CAJ30014.1을 이용하여 찾을 수 있다. 전장 인간 α/β GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 mRNA 서열에 대한 서열 정보는, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AM085438.1을 이용하여 찾을 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 α/β GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제는

에 제시된 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제는 서열번호 1에 대해 약 80%의 동일성을 가지며, 단, 이는 GlcNAc-1-PT와 동일한 기능적 활성을 가진다. 예를 들어, 본 개시내용의 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제는 서열번호 1에 대해 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 동일성을 가질 수 있고, 단, 이는 GlcNAc-1-PT와 동일한 기능적 활성을 가진다.

양상에서, 전장 GlcNAc-1-PT(서열번호 1)에 관하여, 스페이서-1은 거의 아미노산 86과 아미노산 322 사이에 있고, Notch 1과 Notch 2는 거의 아미노산 438과 아미노산 435 사이에 있으며, 스페이서-2는 거의 아미노산 535와 아미노산 694 사이에 있고, DMAP는 거의 아미노산 694와 아미노산 819 사이에 있으며, 스페이서-3은 거의 거의 아미노산 819와 아미노산 955 사이에 있고, α/β 서브유닛 절단 부위는 거의 아미노산 928에 있으며, 그리고 스페이서-4는 거의 아미노산 1041과 아미노산 1149 사이에 있다.

본 개시내용은 다른 유기체에서 GlcNAc-1-PT의 상동체와 관련되며, 인간 GlcNAc-1-PT로 제한되지 않는다는 것이 인식된다. 상동체는 당업계에 공지된 방법에 의해 다른 종에서 발견될 수 있다. 단백질이 상당한 상동성을 갖거나 또는 본 발명의 서열과 특정 백분율의 서열 상동성을 공유하는지의 여부를 결정함에 있어서, 서열 유사성은 최적의 적합도를 달성하기 위해 전형적으로 소수의 갭의 도입을 허용하는, 통상적인 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 특히, 두 폴리펩타이드 또는 두 핵산 서열의 "동일성 백분율"은 카를린 및 알트슐(Karlin and Altschul)의 알고리즘을 이용하여 결정한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993). 이러한 알고리즘은 알트슐 등의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램에 편입된다(J. Mal. Biol. 215:403-410, 1990). BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 서열 상동성을 얻기 위해 BLASTN 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 동일하게, BLAST 단백질 검색은 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 BLASTX 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭화된 정렬을 얻기 위하여, 알트슐 등에 기재된 바와 같이 갭 BLAST가 이용된다(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트 매개변수가 사용된다. 더 상세한 설명에 대해 www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.

GlcNAc-1-PT 상동체는 인간 GlcNAc-1-PT에 대해 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 상동성일 수 있고, 단, 이는 GlcNAc-1-PT와 동일한 기능적 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, GlcNAc-1-PT 상동체는 인간 GlcNAc-1-PT에 대해 적어도 65, 66, 67, 68, 69 또는 70% 상동성일 수 있으며, 단, 이는 GlcNAc-1-PT와 동일한 기능적 활성을 가진다. 상이한 실시형태에서, GlcNAc-1-PT 상동체는 인간 GlcNAc-1-PT에 대해 적어도 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 또는 79% 상동성일 수 있으며, 이는 GlcNAc-1-PT와 동일한 기능적 활성을 가진다. 일 실시형태에서, GlcNAc-1-PT 상동체는 인간 GlcNAc-1-PT에 대해 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 또는 89% 상동성일 수 있다. 다른 실시형태에서, GlcNAc-1-PT 상동체는 GlcNAc-1-PT에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 상동성일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, GlcNAc-1-PT 상동체는 전장 GlcNAc-1-PT와 동일한 기능적 활성을 갖는 절단 또는 변이체일 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실된다. 더 구체적으로, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함하되, 서열번호 1에 관하여 약 아미노산 86 내지 약 아미노산 322 사이의 아미노산은 결실된다. 스페이서-1의 결실은 야생형 GlcNAc-1-P에 의해 불량하게 인산화되는 다수의 비리소좀 당단백질을 인산화하는 향상된 능력을 갖는 GlcNAc-1-P가 생기게 한다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함하되, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 더 구체적으로는, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함하되, 서열번호 1에 관하여 약 아미노산 438과 약 아미노산 928 사이의 아미노산은 결실된다. 구체적 실시형태에서, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실되며, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 더 구체적으로는, 본 개시내용의 GlcNAc-1-P는 α/β 서브유닛을 포함하되, 서열번호 1에 관하여 약 아미노산 86 내지 약 아미노산 322 사이의 아미노산은 결실되고, 약 아미노산 438과 약 아미노산 928 사이의 아미노산은 결실된다. 중요하게는, 결실은 아미노산 928을 넘어 연장될 수 없다. Notch1과 α/β 절단 부위 사이의 영역과 함께 스페이서-1의 제거는 박테리아 단백질을 연상시키는 GlcNAc-1-P를 초래하며, 이 최소 GlcNAc-1-PT를 발현시키는 세포는 높은 발현 수준의 결과로서 단순당 α-메틸 D-만노사이드(αMM) 및 비리소좀 당단백질에 대해 극도로 증가된 활성을 나타낸다. 스페이서-1이 결실되고 Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실된 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 야생형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛보다 약 5배 더 큰 촉매적 활성을 가진다. 예를 들어, 스페이서-1이 결실되고 Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실된 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 야생형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛보다 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배 또는 약 30배 초과의 촉매적 활성을 가진다. 스페이서-1이 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실된 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 야생형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛에 비해 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸의 함량을 증가시킨다. 예를 들어, 스페이서-1이 결실되고 Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실된 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 야생형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛에 비해 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20% 또는 약 25%만큼 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸의 함량을 증가시킨다. 본 개시내용의 다른 변형 GlcNAc-1-Ps는 도 3a에 도시되어 있다.

(b) 효소 작제물

양상에서, 본 개시내용은 효소 작제물을 제공한다. 본 개시내용의 효소 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 서열" 및 "효소 작제물"은 상호 호환 가능하다. 본 개시내용은 또한 효소 작제물에 의해 암호화된 단리된 폴리펩타이드, 효소 작제물을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

i. 폴리뉴클레오타이드 서열

본 개시내용의 효소 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 효소 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함한다. 다른 실시형태에서, 효소 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 효소 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함하되, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 효소 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 폴리뉴클레오타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1이 결실되고 Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 상이한 실시형태에서, 효소 작제물은 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 상기 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함한다.

하나 초과의 폴리펩타이드가 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 때, 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 초과의 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 제1 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 제2 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 제1 및 제2 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편은 동일 또는 상이할 수 있다. 제1 및 제2 프로모터는 동일 또는 상이할 수 있다. 프로모터는 이하에 더 상세하게 기재된다.

대안적으로, 하나 초과의 폴리펩타이드가 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 때, 폴리뉴클레오타이드는 단일 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 당업계에서 통상적인 몇몇 전략은 하나 초과의 하나 초과의 발현 산물을 생성하는데 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, 스플라이싱 신호, 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 또는 단백질 분해 절단 부위는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 삽입될 수 있다. 비제한적 예로서, 단일프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편 및 제2 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 스플라이싱 신호, IRES 또는 제1과 제2 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 암호 영역 사이의 단백질 분해 절단 부위 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있다.

각각의 상기 실시형태에서, "GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제", "이의 단편", "GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛" 및 "GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 S1-S3"는 본 부문에 참고로 편입된 상기 부문 I(a)에 상세하게 기재된 바와 같을 수 있다.

본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 분자 생물학 방법을 이용하여 핵산 분자로부터 생산될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 단편의 증폭 및 벡터 내로 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 서열을 작제하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법 및 생체내 재조합을 포함할 수 있다(문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY] 참조).

ii. 벡터

*다른 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 효소 작제물을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 벡터는 유전자 물질을 전달하기 위해 비히클로서 사용되는 핵산 분자로서 정의된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 전위 요소, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC), 예컨대 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유래), 렌티바이러스 벡터(예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유래), 아데노바이러스(Ad) 벡터(복제 적격, 복제 결함 및 이의 무기력 형태를 포함), 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바르 바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 하비 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유선 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

벡터는 높은 복제수, 중간 복제수 또는 낮은 복제수를 가질 수 있다. 복제수는 효소 작제물에 대한 발현 수준을 제어하기 위해 그리고 발현 벡터의 안정성을 제어하기 위한 수단으로서 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, 높은 복제수 벡터가 이용될 수 있다. 높은 복제수 벡터는 박테리아 세포 당 적어도 31, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 복제물을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 높은 복제수 벡터는 숙주 세포 당 적어도 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 또는 400개의 복제물을 가질 수 있다. 대안의 실시형태에서, 낮은 복제수 벡터가 이용될 수 있다. 예를 들어, 낮은 복제수 벡터는 숙주 세포 당 1 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 복제물을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 중간 복제수 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 중간 복제수 벡터는 숙주 세포 당 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 복제물을 가질 수 있다.

본 개시내용의 벡터는 전형적으로 단백질 발현을 위해 사용된다. 당업계에 잘 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 매우 다양한 복제 기점, 다중 클로닝 서열, 프로모터, 리보솜 결합 부위/리보솜 유입 부위, 번역 개시 부위, 전사 종결자 등을 가질 수 있다. 벡터는 또한 선택 가능한 마커, 리포터 및 펩타이드 태그를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다.

효소 작제물을 암호화하는 핵산은 또한 선택 가능한 마커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 선택 가능한 마커는 외인성 핵산을 통합한 세포를 효율적으로 선택하고 동정하기 위해 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커는 외인성 핵산을 받는 세포에 선택 이점, 예컨대 특정 독소 또는 항생제에 대한 내성을 제공한다. 항생제 내성 마커의 적합한 예는 카나마이신, 스펙토마이신, 네오마이신, 겐타마이신(G418), 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 제오신 및 블라스티시딘에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 벡터는 또한 리포터 단백질을 발현시키기 위한 전사 카세트를 포함할 수 있다. 예로서, 리포터 단백질은 형광 단백질, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 겨자무과산화효소 및 이들의 변이체를 포함할 수 있다.

효소 작제물을 암호화하는 발현 벡터는 바이러스 벡터를 이용하여 또는 비바이러스 전달 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다. 세포 내로 핵산을 도입하는 데 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 랍도바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함한다. 핵산 전달의 비바이러스 방법은 네이키드 핵산, 리포좀, 및 단백질/핵산 접합체를 포함한다. 세포에 도입되는 효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물은 선형 또는 원형일 수 있고, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, DNA, RNA 또는 이들의 임의의 변형 또는 조합일 수 있다.

효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물은 형질감염에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산을 형질감염시키는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 형질감염 방법은 바이러스 형질도입, 양이온성 형질감염, 리포좀 형질감염, 덴드리머 형질감염, 전기천공법, 열 충격, 뉴클레오펙션 형질감염, 자기주입(magnetofection), 나노입자, 바이오리스틱 입자 전달(유전자총) 및 등록상표 형질감염 시약, 예컨대 리포펙타민, 도진도(Dojindo) 힐리맥스(Hilymax), 퓨젠(Fugene), jetPEI, 이펙텐(Effectene) 또는 드림펙트(DreamFect)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

세포 내로 도입 시, 효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물은 염색체 내로 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 염색체 내로 효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물의 통합은 이동성 요소에 의해 달성될 수 있다. 이동성 요소는 전위인자 또는 레트로요소일 수 있다. 다양한 전위인자는 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 사용될 수 있는 DNA 전위인자의 예는 Mu 전위인자, 초파리로부터의 P 요소 전위인자, 및 전위인자, 예컨대 어류로부터의 잠자는 미녀(sleeping beauty) 전위인자의 Tc1/마리너 슈퍼패밀리의 구성원을 포함한다. 다양한 레트로요소는 본 발명에서 사용하기에 적합하고, LTR-함유 역전위인자 및 비-LTR 역전위인자를 포함한다. 레트로전위인자의 비제한적 예는 노랑초파리로부터의 Copia 및 gypsy, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 Ty 요소, 길게 산재된 요소(long interspersed element: LINE) 및 진핵생물로부터의 짧게 산재된 요소(short interspersed element: SINE)를 포함한다. LINE의 적합한 예는 포유류로부터의 L1 및 누에로부터의 R2Bm을 포함한다.

세포 염색체 내로 외인성 핵산의 통합은 또한 바이러스에 의해 매개될 수 있다. 염색체 내로 핵산을 통합시키는 바이러스는 박테리오파지, 아데노-연관 바이러스 및 레트로바이러스를 포함한다. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 인간 또는 비인간 영장류 AAV 혈청형 및 이들의 변이체로부터 유래될 수 있다. 적합한 아데노-연관 바이러스는 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV, 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV 및 11형 AAV를 포함한다. 다양한 레트로바이러스는 주사에서 사용하기에 적합하다. 레트로바이러스 벡터는 복제-적격 또는 복제-결함일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 스푸마레트로바이러스일 수 있다. 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 인간, 시미안, 고양이, 말, 소 또는 다른 포유류종을 감염시키는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 적합한 렌티바이러스의 비제한적 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 포함한다.

효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물의 세포의 염색체 내로의 통합은 무작위일 수 있다. 대안적으로, 효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물의 통합은 염색체의 특정 서열 또는 위치로 표적화될 수 있다. 일반적으로, 통합 부위에서 일반적 환경은 효소 작제물을 암호화하는 통합된 발현 작제물이 발현되는지의 여부뿐만 아니라 그의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다.

효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물에 의해 형질감염된 세포는 일반적으로 세포를 단리시키고 확장시키기 위한 선택 하에 성장될 것이며, 이때 핵산은 염색체 내로 통합된다. 효소 작제물을 암호화하는 발현 작제물이 염색체에 통합된 세포는 상기 기재한 바와 같은 선택 가능한 마커를 이용하여 연속적 선택에 의해 유지될 수 있다. 통합된 외인성 핵산 서열의 존재 및 유지는 당업자에게 공지된 표준 기법, 예컨대 서던 블롯, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하는 특정 핵산 서열의 증폭 및/또는 뉴클레오타이드 서열분석을 이용하여 확인될 수 있다.

핵산 분자는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때 융합 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 벡터 내로 삽입된다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 및 포유류 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

iii. 조절

특정 양상에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현은 조절될 수 있다. 이러한 조절은 효소 작제물이 작용하는 때 및 작용하는 곳에 대한 제어를 허용할 수 있다.

발현 벡터는 전형적으로 다음의 요소 중 하나 이상을 함유한다: 프로모터, 종결자, 리보솜 결합 부위/리보솜 유입 부위, 및 번역 개시 부위. 이러한 요소는 본 개시내용의 효소 작제물의 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환된 숙주에서 분자가 발현되도록 본 개시내용의 핵산 분자의 발현은 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 분자의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서 요소에 의해 제어될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연-유래 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성/억제성 또는 세포 유형 특이적일 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 구성적일 수 있다. 포유류 세포에 대한 구성적 프로모터의 비제한적 예는 CMV, UBC, EF1α, SV40, PGK, CAG, CBA/CAGGS/ACTB, CBh, MeCP2, U6 및 H1을 포함한다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 테트라사이클린, 열 충격, 스테로이드 호르몬, 중금속, 포볼에스터, 아데노바이러스 E1A 요소, 인터페론 및 혈청 유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상이한 실시형태에서, 프로모터는 세포 유형 특이적일 수 있다. 예를 들어, 뉴런에 대한 세포 유형 특이적 프로모터(예를 들어, 시냅신), 성상세포(예를 들어, GFAP), 희돌기교세포(예를 들어, 수초 염기성 단백질), 미세아교세포(예를 들어, CX3CR1), 신경내분비 세포(예를 들어, 크로모그라닌 A), 근육 세포(예를 들어, 데스민, Mb) 또는 심장 근육 세포(예를 들어, 알파 미오신 중쇄 프로모터)가 사용될 수 있었다. 예시적 실시형태에서, 프로모터는 Nrl(간상 시각세포-특이적) 프로모터 또는 HBB(헤모글로빈 베타) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 발현을 추가로 향상시키기 위해 그리고/또는 핵산의 공간적 발현 및/또는 일사적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 인핸서의 비제한적 예는 CMV 인핸서 및 SP1 인핸서를 포함한다.

하나 초과의 폴리펩타이드가 개시내용의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고 폴리뉴클레오타이드가 폴리펩타이드를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 초과의 프로모터를 포함하는 실시형태에서, 프로모터는 동일 또는 상이할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 서열의 발현이 그것과 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있다는 것을 의미한다. 프로모터는 그의 제어 하에서 핵산 서열의 5'(상류)에 위치될 수 있다. 프로모터와 발현될 핵산 서열 사이의 거리는 프로모터와 그것이 제어하는 천연 핵산 서열 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변형은 프로모터 기능의 상실 없이 수용될 수 있다.

iv. 숙주 세포

다른 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 적절한 세포는 박테리아, 효모, 진균, 곤충 및 포유류 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 실질적으로 순수한 배양물(즉, 단리된 세포)에서 시험관내에서 유지된 세포이다. 본 개시내용의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 단백질 발현, 및 선택적으로 정제를 위해 사용될 수 있다. 숙주로부터 발현 단백질을 발현시키고, 선택적으로 정제하기 위한 방법은 당업계의 표준이다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 본 개시내용의 효소 작제물에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 폴리펩타이드의 생성은 효소 작제물을 포함하는 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 및 이어서, 목적으로 하는 폴리펩타이드를 전사하고 번역하도록 세포를 배양시키는 단계를 수반한다. 이어서, 단리된 숙주 세포는 후속적 정제를 위해 발현된 폴리펩타이드를 추출하기 위해 용해될 수 있다.

일부 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵세포의 비제한적 예는 이콜라이(E. coli) 및 다른 장내세균과, 에스케리키아 종(Escherichia sp.), 캄필로박터 종(Campylobacter sp.), 월린넬라 종(Wolinella sp.), 데설포비브리오 종(Desulfovibrio sp.), 비브리오 종(Vibrio sp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp), 바실러스 종(Bacillus sp.), 리스테리아 종(Listeria sp.), 스타필로코커스 종(Staphylococcus sp.), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 펩토스트렙토코커스 종(Peptostreptococcus sp.), 메가스파에라 종(Megasphaera sp.), 펙티나투스 종(Pectinatus sp.), 셀레노모나스 종(Selenomonas sp.), 자이모필루스 종(Zymophilus sp.), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 아르트로박터 종(Arthrobacter sp.), 프란키아 종(Frankia sp.), 마이크로모노스포라 종(Micromonospora sp.), 노카디아 종(Nocardia sp.), 프로피온박테리움 종(Propionibacterium sp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.), 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 락토코커스 종(Lactococcus sp.), 류코노스톡 종(Leuconostoc sp.), 페디오코커스 종(Pediococcus sp.), 아세토박테륨 종(Acetobacterium sp.), 유박테륨 종(Eubacterium sp.), 헬리오박테륨 종(Heliobacterium sp.), 헬리오스필릴륨 종(Heliospirillum sp.), 스포로무사 종(Sporomusa sp.), 스피로플라즈마 종(Spiroplasma sp.), 유레아플라즈마 종(Ureaplasma sp.), 에리시펠로트릭스 종(Erysipelothrix sp.), 코리네박테륨 종(Corynebacterium sp.), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 클로스트리듐 종(Clostridium sp.), 마이코플라즈마 종(Mycoplasma sp.), 마이코박테륨 종(Mycobacterium sp.), 악티노박테리아 종(Actinobacteria sp.), 살모넬라 종(Salmonella sp.), 쉬겔라 종(Shigella sp.), 모락셀라 종(Moraxella sp.), 헬리코박터 종(Helicobacter sp), 스테노트로포모나스 종(Stenotrophomonas sp.), 마이크로코커스 종(Micrococcus sp.), 네이세리아 종(Neisseria sp.), 브델로비브리오 종(Bdellovibrio sp.), 헤모필루스 종(Hemophilus sp.), 클레브시엘라 종(Klebsiella sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 세라티아 종(Serratia sp.), 시트로박터 종(Citrobacter sp.), 프로테우스 종(Proteus sp.), 세라티아 종(Serratia sp.), 예르시니아 종(Yersinia sp.), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.), 악티노바실러스 종(Actinobacillus sp.), 보르데텔라 종(Bordetella sp.), 브루셀라 종(Brucella sp.), 카프노사이토파가 종(Capnocytophaga sp.), 카디오박테륨 종(Cardiobacterium sp.), 에이케넬라 종(Eikenella sp.), 프란시셀라 종(Francisella sp.), 헤모필루스 종(Haemophilus sp.), 킨겔라 종(Kingella sp.), 파스퇴렐라 종(Pasteurella sp.), 플라보박테륨 종(Flavobacterium sp.), 잔토모나스 종(Xanthomonas sp.), 부르크홀데리아 종(Burkholderia sp.), 에어로모나스 종(Aeromonas sp.), 플레시오모나스 종(Plesiomonas sp.), 레지오넬라 종(Legionella sp.) 및 알파-프로테오박테리아(proteobaeteria), 예컨대 볼바키아 종(Wolbachia sp.), 사이노박테리아, 스피로헤타, 녹색유황세균 및 녹색 비유황세균, 그램 음성 구균, 까다로운 그램 음성 바실리, 장내세균과-글루코스-발효 그램 음성 바실리, 그램 음성 바실리-비-글루코스 발효기, 그램 음성 바실리-글루코스 발효, 산화효소 음성. 단백질 발현을 위한 특히 유용한 박테리아 숙주 세포는 그램 음성 박테리아, 예컨대 에스케리키아 콜라이, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 할로플란티스(Pseudomonas haloplanctis), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) AC10, 슈도모나스 슈도플라바(Pseudomonas pseudoflava), 바르토넬라 헨셀라(Bartonella henselae), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus), 및 그램 양성 박테리아, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테륨(Corynebacterium), 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 스트렙토코커스 리비단스(Streptococcus lividans) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 포함한다. 이콜라이는 가장 널리 사용되는 발현 숙주 중 하나이다. 따라서, 이콜라이의 과발현을 위한 기법은 잘 개발되어 있고, 당업자에게 용이하게 이용 가능하다. 추가로, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)는 재조합 단백질의 고수준의 생산을 위해(즉, 생체 치료제 및 백신의 개발을 위해) 통상적으로 사용된다.

일부 실시형태에서, 숙주 세포는 효모 또는 진균 세포이다. 단백질 발현을 위한 특히 유용한 진균 숙주 세포는 아스퍼질리스 오리자에(Aspergillis oryzae), 아스퍼질리스 니거(Aspergillis niger), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)을 포함한다. 단백질 발현을 위한 특히 유용한 효모 숙주 세포는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 말토스(Candida maltose), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 구일러리몬디(Pichia guillerimondii), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로이아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 단백질 발현을 위한 특히 유용한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, Hela 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), 인간 배아 신장 세포, 유럽 원우(Bos primigenius) 및 무스 무스쿨리스(Mus musculus)를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 추가적으로, 포유류 숙주 세포는 확립된, 상업적으로 입수 가능한 세포주(예를 들어, 미국 미생물 보존 센터(ATCC), 버지니아주 매너서스에 소재)일 수 있다. 숙주 세포는 불멸 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 1차 세포일 있다. "1차 세포"는 살아있는 조직(즉, 생검 물질)으로부터 직접 취한 세포이고, 시험관내 성장에 대해 확립되는데, 이는 매우 소수의 집단 배가를 겪으며, 따라서 지속적 종양형성성 또는 인공적으로 불멸인 세포주에 비해 그들이 유래된 조직의 주요 기능적 성분 및 특징을 더 나타낸다.

양상에서, 숙주 세포는 고수준의 관심 단백질을 생산하도록 조작되었다. 예를 들어, 숙주 세포는 만노스-6-인산염(Man-6-P)으로 태그가 유리한 단백질을 생산하도록 조작되었다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질은 리소좀 단백질이다. 리소좀 단백질의 비제한적 예는 β-글루코세브로시다제(GBA), GalA, 카텝신 D(CathD), C2형 니만 피크병(NPC2), β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA), β-만노시다제(MANBA), 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, 산 α-글루코시다제(GAA) 및 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)를 포함한다. 구체적으로, 리소좀 단백질은 산 α-글루코시다제(GAA) 또는 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)이다. 이들 단백질은 그들이 내인성 GlcNAc-1-PT에 의해 불량하게 인산화될 수 있기 때문에 개시된 GlcNAc-1-PT와 조합으로 특히 유용하다. 다른 실시형태에서, 관심 단백질은 비리소좀 단백질이다. 비리소좀 단백질의 비제한적 예는 DNase1, 레닌, 백혈병 저해 인자(LIF), 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 2(PoFUT2), 글리코펩시노겐(GP) 및 폰빌레브란트 인자 A1A2A3 도메인을 포함한다.

v. 폴리펩타이드 서열

다른 양상에서, 본 개시내용은 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 단리된 폴리펩타이드(들)를 제공한다. 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 서열은 부문 I(b)i에 상세하게 기재되어 있고, 본 부문에 참고로 편입된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된 폴리펩타이드"는 그것이 생산된 세포로부터 부분적으로 또는 완전히 정제된 폴리펩타이드를 지칭한다. 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 분자 생물학적 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 일반적으로 말해서, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때에 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 벡터 내로 삽입된다. 적절한 벡터 및 숙주 세포는 각각 부문 I(b)iii 및 부문 I(b)iv에 기재되어 있다. 일단 발현되면, 폴리펩타이드는 통상적인 정제 방법을 이용하여 세포로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 분비 신호를 가진다면, 발현된 폴리펩타이드는 세포 배양물 상청액으로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 분비 신호를 결여하는 폴리펩타이드는 봉입체 및/또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 개시내용의 폴리펩타이드는, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도(특히 단백질 A 이후의 특정 항원에 대한 친화도에 의해), 및 크기 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해, 예를 들어, 황산암모늄 침전에 의해 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의하는 것을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 배양 상청액, 봉입체 또는 세포 추출물로부터 단리될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)] 참조. 폴리펩타이드의 단리는 폴리펩타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 친화도 태그 또는 정제 태그를 포함할 때 크게 도움이 된다.

실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함하되, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛을 포함하되, 스페이서-1은 결실되고 Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역은 결실된다.

II. 방법

양상에서, 개시내용은 관심 단백질의 올리고당 인산화를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포에서 외인성 GlcNAc-1-PT를 발현시키는 단계를 포함한다. 외인성 GlcNAc-1-PT는 부문 I(a)에서 기재된 바와 같을 수 있다. 세포는 부문 I(b)iv에서 기재된 바와 같은 숙주 세포일 수 있다. 구체적으로는, 세포는 CHO 세포이다. 인산화의 양은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 인산화에 비해 1% 초과만큼 증가될 수 있다. 추가적으로, 인산화의 양은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 인산화에 비해 2% 초과, 3% 초과, 4% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과 또는 75% 초과만큼 증가될 수 있다. 구체적으로는, 외인성 GlcNAc-1-PT가 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛일 때, 인산화의 양은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 항의 인산화에 비해 2% 초과, 3% 초과, 4% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 또는 25% 초과만큼 증가될 수 있다. 추가로, 외인성 GlcNAc-1-PT가 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛일 때, 스페이서-1은 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실되며, 인산화의 양은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 인산화에 비해 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과 또는 75% 초과만큼 증가될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸의 함량을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 스페이서-1이 결실되고 Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실된 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛은 야생형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛에 비해 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20% 또는 약 25%만큼 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸의 함량을 증가시킨다. 관심 단백질은 만노스-6-인산염(Man-6-P)로 태그되는 것이 유리한 단백질이다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질은 리소좀 단백질이다. 리소좀 단백질의 비제한적 예는 β-글루코세브로시다제(GBA), GalA, 카텝신 D(CathD), C2형 니만 피크병(NPC2), β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA), β-만노시다제(MANBA), 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, 산 α-글루코시다제(GAA) 및 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)를 포함한다. 구체적으로는, 리소좀 단백질은 산 α-글루코시다제(GAA) 또는 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)이다. 다른 실시형태에서, 관심 단백질은 비-리소좀 단백질이다. 비-리소좀 단백질의 비제한적 예는 DNase1, 레닌, 백혈병 저해 인자(LIF), 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 2(PoFUT2), 글리코펩시노겐(GP) 및 폰빌레브란트 인자 A1A2A3 도메인을 포함한다.

다른 양상에서, 본 개시내용은 세포 표면(Man-6-P) 수용체에 관심 단백질의 결합을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포에서 외인성 GlcNAc-1-PT를 발현시키는 단계를 포함한다. 외인성 GlcNAc-1-PT는 부문 I(a)에 기재된 바와 같을 수 있다. 세포는 부문 I(b)iv에 기재된 바와 같은 숙주 세포일 수 있다. 구체적으로는, 세포는 CHO 세포이다. 세포 표면(Man-6-P) 수용체에 대한 관심 단백질의 결합의 증가는 관심 단백질의 증가를 초래할 수 있다. 결합은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 인산화에 비해 1.5배 초과만큼 증가될 수 있다. 추가적으로, 결합은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 결합에 비해 2배 초과, 3배 초과, 4배 초과, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 110배 초과, 120배 초과, 130배 초과, 140배 초과 또는 150배 초과만큼 증가될 수 있다. 구체적으로는, 외인성 GlcNAc-1-PT가 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛일 때, 결합은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 결합에 비해 1.5배 초과, 2배 초과, 3배 초과, 4배 초과, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 110배 초과, 120배 초과, 130배 초과, 140-배 초과 또는 150배 초과만큼 증가될 수 있다. 추가로, 외인성 GlcNAc-1-PT가 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 서브유닛일 때, 스페이서-1은 결실되고, Notch 1과 α/β 절단 부위 사이의 영역이 결실되며, 결합은 내인성 GlcNAc-1-PT 단독의 존재 하의 결합에 비해 2배 초과, 3배 초과, 4배 초과, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 110배 초과, 120배 초과 또는 130배 초과만큼 증가될 수 있다. 관심 단백질은 만노스-6-인산염(Man-6-P)으로 태그되는 것이 유리한 단백질이다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질은 리소좀 단백질이다. 리소좀 단백질의 비제한적 예는 β-글루코세브로시다제(GBA), GalA, 카텝신 D(CathD), C2형 니만 피크병(NPC2), β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA), β-만노시다제(MANBA), 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, 산 α-글루코시다제(GAA) 및 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)를 포함한다. 구체적으로는, 리소좀 단백질은 산 α-글루코시다제(GAA) 또는 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)이다. 다른 실시형태에서, 관심 단백질은 비-리소좀 단백질이다. 비-리소좀 단백질의 비제한적 예는 DNase1, 레닌, 백혈병 저해 인자(LIF), 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 2(PoFUT2), 글리코펩시노겐(GP) 및 폰빌레브란트 인자 A1A2A3 도메인을 포함한다.

다양한 양상에서, 상기 방법은 효소 대체 요법에서 사용하기 위한 관심 단백질을 단리시키거나 또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 단백질을 단리시키거나 또는 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 효소 대체 요법(ERT)은 리소좀 저장 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. ERT에서 사용하기 위한 효소의 비제한적 예(및 그들의 대응하는 리소좀 저장 질환)는 글루코세레브로시다제(고쉐병), α-갈락토시다제 A(파브리병), 산 α-글루코시다제(폼페병), 알파-L-이두로니다제(점액다당류증 I, 후를러 증후군, 후를러-샤이에 증후군 증후군, 샤이에 증후군), 이두로네이트 설파타제(점액다당류증 II, 헌터 증후군), 아릴설파타제 B(점액다당류증 VI, 마로토-라미증후군)를 포함한다. 효소 대체 요법은 평생 요법이다. 모든 제품은 말초 계통 또는 중추 접근 장치를 통해 정맥내로 투여된다. 주입은 전형적으로 2주마다 1회 또는 때때로 매주 일어난다. 본 개시내용의 GlcNAc-1-PT를 이용하여, 제조된 효소는 더 낮은 용량으로 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 GlcNAc-1-PT를 이용하여, 일반적으로 낮은 인산화에 기인하는 용도에 이용 가능하지 않은 리소좀 효소가 ERT에 대해 사용될 수 있다. 추가로, 고수준의 Man-6-P를 함유하는 GBA의 생산은 만노스 수용체를 결여하는 고쉐병을 갖는 환자에서의 세포 유형으로 효소 활성을 회복시키는 기회를 제공한다.

실시예

본 개시내용의 다양한 실시형태를 입증하기 위해 다음의 실시예를 포함한다. 다음의 실시예에 개시하는 기법이 본 발명의 실행에서 잘 작용하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내고, 따라서 그의 실행에 대한 바람직한 방식을 구성하도록 고려될 수 있다는 것은 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 다수의 변화가 개시된 특정 실시형태에서 이루어질 수 있고, 또한 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식하여야 한다.

실시예 1 내지 4에 대한 도입.

세포내 그리고 내포된 물질을 효율적으로 분해하는 리소좀의 능력은 이 세포소기관에 대한 60개의 또는 이렇게 가용성인 산 가수분해효소의 적절한 수송에 의존한다. 더 고등의 진핵생물에서, 분류 과정은 만노스 6-인산염(Man-6-P) 인식 시스템에 의해 매개된다. 새로 합성된 산 가수분해효소는 트랜스-골지 망상구조에서 Man-6-P 수용체(MPR)에 대한 결합 및 엔도-리소좀 시스템에 대한 후속적 수송을 위한 고친화도 리간드로서 작용하는 시스-골지에서 Man-6-P 잔기를 획득한다(1). 시스-골지 효소 UDP-GlcNAc: 리소좀 효소 N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT)는 리소좀 산 가수분해효소 상에서 입체배좌-의존적 단백질 결정소에 선택적으로 결합하고 가수분해효소의 고만노스 유형 N-연결 글리칸 상에서 UDP-GlcNAc로부터 만노스 잔기까지 GlcNAc-1-P의 수송을 촉매함으로써 Man-6-P 태그의 생성에서 개시 및 가장 중요한 단계를 수행한다(2). 동일한 N-연결 글리칸을 갖는 분비 당단백질은 그들이 분비 경로를 횡단함에 따라 Man-6-P 태그를 획득하지 않는다. 본 발명자들의 실험실로부터의 이전의 연구는 고만노스 올리고당의 인산화를 초래하는 리소좀 산 가수분해효소 상의 단백질 결정소의 특정 인식에서 GlcNAc-1-PT의 2개의 Notch 모듈 및 DNA 메틸트랜스퍼라제-관련 단백질 (DMAP) 상호작용 도메인에 대한 역할을 입증하였다(3). 비-리소좀 N-글리코실화 단백질은 이 과정이 불가능하게 되며, 리소좀에 부정확하게 표적화되는 것이 방지되는 이유는 그들의 이러한 결정소의 결여일 가능성이 있다.

GlcNAc-1-PT는 두 유전자에 의해 암호화된 α2β2γ2 헥사머 단백질이다. 더 작은 γ 서브유닛은 GNPTG 유전자에 의해 암호화되는 반면, α 및 β 서브유닛은 GNPTAB 유전자에 의해 단일 α/β 전구체로서 암호화된다(4, 5). K928에서 인간 α/β 전구체의 단백질 분해 절단은 골지에서 부위-1 프로테아제(S1P)에 의해 매개되며, 이 절단은 단백질의 촉매 적격에 필수적이다(6). Notch 및 DMAP 상호작용 도메인 이외에, α 및 β 서브유닛은 또한 단백질의 촉매적 코어를 함께 형성하는 4개의 Stealth 도메인을 보유한다(도 1a). 모든 진핵 GlcNAc-1-PT의 Stealth 도메인은 고도로 보존되며, 세포벽 다당류 생합성에 수반되는 당-인산염 트랜스퍼라제를 암호화하는 박테리아 효소 내의 서열과 유사하다(도 6)(7). 박테리아 효소는 단백질 결정소의 연루 없이 다당류 수용자에 당-인산염을 직접 전달하기 때문에, 현재 보유되는 관점은 단백질 진화 과정에서 포유류 GlcNAc-1-PT가 리소좀 산 가수분해효소 상에서 단백질 결정소의 특정 인식에서 작용하는 Notch 및 DMAP 상호작용 도메인을 획득하였다는 것이다.

추가로, GlcNAc-1-PT는 4개의 소위 "스페이서" 도메인을 갖는데, 이 중 하나인 스페이서-2만이 그들-서브유닛 결합 부위가 특성규명되었다(3, 8). Hitherto는 다른 스페이서 영역에 대한 어떤 기능도 부여하지 않았다. 본 연구에서, 본 발명자들은 GlcNAc-1-PT의 기능에서 스페이서-1의 역할을 연구하였다. 예상치 못하게, 본 발명자들은 스페이서-1의 제거가 대안의 부위(Q882) 및 촉매적으로 손상된 효소에서 절단을 초래하기 때문에 완전한 촉매적 활성을 허용하기 위해 스페이서-1이 부위-1 프로테아제(S1P)에 의해 K928에서 정확하게 α/β 전구체의 절단을 지시한다는 것을 발견하였다. 추가로, 스페이서-1의 결실은 WT 효소에 의해 불량하게 인산화되는 다수의 비-리소좀 당단백질을 인산화시키는 향상된 능력을 갖는 효소가 생기게 한다. Notch1과 α/β 절단 부위 사이의 영역과 함께 스페이서-1의 제거는 박테리아 단백질을 연상시키는 최소 효소를 초래한다. 이 최소 GlcNAc-1-PT를 발현시키는 세포는 고발현 수준의 결과로서 단순당 α-메틸 D-만노사이드(αMM) 및 비-리소좀 당단백질에 대해 극적으로 증가된 활성을 나타낸다. 종합하면, 이들 발견은 비-리소좀 단백질의 인산화를 저해함에 있어서 스페이서-1에 대한 신규하고 예상치 못한 역할을 나타내고, GlcNAc-1-PT가 리소좀 효소를 특이적으로 인산화시키도록 진화된 한편 동시에 비리소좀 단백질이 인산화되고 리소좀으로 잘못 분류되는 것으로부터 제외하는 방법에 대한 새로운 통찰을 제공한다.

실시예 1. 스페이서-1의 결실은 대안의 부위에서의 GlcNAc-1-PT α/β 절단을 초래한다.

GlcNAc-1-PT의 α/β 서브유닛의 스페이서-1 도메인의 작용을 분석하기 위해, 인간 및 딕티오스텔리움 디스코이데움 GlcNAc-1-PT 단백질 서열과 박테리아 N-아세틸글루코사민-1-인산염 트랜스퍼라제 서열간의 정렬을 초기에 수행하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 서열 데이터를 이용 가능한 모든 포유류 GlcNAc-1-PT 스페이서-1 영역에 의한 경우와 같이, 인간 스페이서-1 서열은 딕티오스텔리움 디스코이데움 및 박테리아 단백질의 서열보다 200aa 더 길다. 이는 포유류 스페이서-1 영역이 딕티오스텔리움 디스코이데움 스페이서-1 서열과 관련되지 않은 독특한 역할을 할 수 있다는 것을 시사하였다. 따라서, 236aa 인간 스페이서-1 서열을 DNA 수준에서 딕티오스텔리움 디스코이데움 서열의 29aa으로 대체하며, 얻어진 작제물(도 1a, DS1)을 CRISPR/Cas9 방법에 의해 생성된 GNPTAB ^-/- Hela 세포 내로 형질감염시켰다(3). 인간 스페이서-1의 딕티오스텔리움 디스코이데움 서열로의 대체가 돌연변이체 단백질의 효율적인 폴딩 및 소포체(ER)로부터 α/β 전구체가 α 및 β 서브유닛으로 절단되는 시스-골지까지의 그의 유출을 허용하는지의 여부를 결정하기 위해 WT 및 DS1 돌연변이체를 발현시키는 전체 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체 단백질은 정말로 잘 발현되고, ER을 나가서, 단순당 αMM에 대해 WT 촉매 활성의 60%를 나타낸다. 그러나, 단백질 분해 절단의 β 서브유닛 생성물의 벌크는 WT β 서브유닛보다 SDS-PAGE 겔 상에서 더 느리게 이동하였는데(도 1b, 화살촉), 이는 대부분의 DS1 돌연변이체가 K928에서 절단되는 WT 단백질에 비해 대안의 부위에서 절단된다는 것을 나타낸다(도 1b, *). DS1에 의해 소량의 정상 β 서브유닛이 또한 보인다(도 1b 및 도 1d, 더 긴 노출, *). 이는 스페이서-1의 제거로부터 초래되는 대안의 절단이 K928에서 WT α/β 전구체를 절단하는 동일한 프로테아제인 S1P에 기인하는지의 여부, 또는 상이한 프로테아제가 연루될 수 있는지의 여부의 문제를 일으켰다. 이 문제를 처리하기 위해, 본 발명자들은 세포를 S1P의 저해제, 즉, 아미노피롤리딘아마이드 PF-429242로 처리한다(9). 저해제의 존재는 WT GlcNAc-1-PT와 DS1 돌연변이체 둘 다에서 β 서브유닛 형성의 상실을 야기하였는데(도 1d), 이는 대안의 부위에서 절단이 S1P에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 이 경우에는 추가적인 공통 S1P 절단 부위가 본래의 절단 부위에 대해 N-말단으로 존재하여야 한다. GlcNAc-1-PT α/β 아미노산 서열의 검토는 이것이 비변이체 -4 위치에서 생기는 공통 중요 알기닌 잔기인 R879에 의해 사실이라는 것 및 Q882에서 생기는 것으로 상정된 절단이라는 것을 나타낸다(도 1e)(10). Q882에서 절단은 DS1에 의해 보이는 β 서브유닛의 분자량의 증가와 일치된다. R925의 돌연변이는 K928에서 WT GlcNAc-1-PT의 절단을 없앤다(도 1f, 레인 2). 다른 한편으로, R879의 돌연변이는 K928에서의 전장 α/β 전구체의 정상 가공에 영향을 미치지 않았지만(도 1f, 레인 3), 더 느리게 이동하는 β 서브유닛의 상실에 의해 나타내는 바와 같이 DS1 돌연변이체에 대해 Q882에서의 절단은 없었다(도 1f, 레인 6). 이 경우에 미량의 K928 절단된 β는 영향받지 않았다(도 1f, 레인 6, 더 긴 노출). R925와 R879 둘 다의 돌연변이는 β 형성의 완전한 상실을 초래하였다(도 1f, 레인 7). 이들 데이터는 스페이서-1의 부재를 제외하고 거의 이용되지 않는 GlcNAc-1-PT에서의 신규한 S1P 절단 부위로서 Q882를 분명하게 동정한다(도 7).

236 aa 인간 스페이서-1 서열은 29 aa 딕티오스텔리움 디스코이데움 서열로 대체되기 때문에, 대안의 절단 부위의 이용은 인간 스페이서-1 서열의 제거와 대조적으로 딕티오스텔리움 디스코이데움 도입의 결과라는 것이 가능하다. 이런 가능성을 제외하기 위해, 인간 스페이서-1이 작은 잔기 Gly 및 Ser을 포함하는 26aa 링커로 대체되는 다른 스페이서-1 결실 돌연변이체가 만들어졌다(도 8a, ΔS1). Δ스페이서-1(ΔS1)은 S1P에 의해 매개된 단백질 분해 가공이 새로운 부위(Q882)에서 대부분의 부분에 대한 절단을 초래하고(도 8b), ΔS1이 αMM에 대해 WT 활성의 40%를 가진다(도 8c)는 점에서 DS1과 모든 점에서 유사하게 거동하였다. 게다가, S1P 저해제인 PF-429242는 그것이 WT 및 GlcNAc-1-PT의 DS1 돌연변이체를 이용하기 때문에 ΔS1을 갖는 β 서브유닛의 형성을 차단하였다(도 8d). 또한, DS1과 ΔS1은 둘 다 WT GlcNAc-1-PT과 동일한 골지 국소화를 나타내었는데(도 9), 변경된 절단에 대한 가능한 원인으로서 이들 두 돌연변이체의 잘못된 국소화(mislocalization)를 배제한다. 이들 결과는 인간 GlcNAc-1-PT에서 236aa 스페이서-1 서열의 존재가 Q882 대신 K928에서의 절단을 보장한다는 것을 명백히 나타낸다.

실시예 2. Q882에서의 절단은 비활성 GlcNAc-1-PT를 초래한다.

잔기 K928에서의 골지에서 GlcNAc-1-PT α/β 전구체의 단백질 분해 과정은 촉매적 활성 효소에 필수적이다(5, 11). α/β에 2개의 S1P 절단 부위가 있기 때문에, 이는 K928 대신 새로운 부위에서의 절단이 활성 효소를 초래하는지의 여부에 관한 질문을 하게 만든다. 이 문제를 처리하기 위해, WT GlcNAc-1-PT α/β 전구체뿐만 아니라 DS1 돌연변이체의 맥락에서 αMM에 대해 도 1f에 나타낸 점 돌연변이의 활성(도 1c) 및 다수의 리소좀 효소(도 1g)를 시험하였다. 다양한 작제물을 GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 발현시키고, 형질감염 후 48시간에, 세포 추출물을 준비하고 나서, 각각의 분취액을 저장하여 αMM 활성 분석을 수행하였다(도 1c). 남아있는 추출물을 인산화된 리소좀 효소에 결합하는 고정된 양이온-독립적(CI)-MPR을 함유하는 비드와 함께 인큐베이션시켰다. 비드를 세척하고 나서, 방법에 기재한 바와 같은 3종의 리소좀 효소의 결합 정도를 분석하였다(도 1g). 도 1c 및 도 1g에 나타낸 바와 같이, α/β 전구체의 절단이 활성에 필수적이라는 우세한 가설과 일치되게 WT α/β 전구체의 맥락에서 R925A 돌연변이체는 αMM과 리소좀 효소 둘 다에 대해 단지 배경 활성을 가졌다. 다른 한편으로, R879A/WT는 αMM에 대해 활성의 30%를 나타내었고, WT α/β 전구체에 비해 3종의 리소좀 효소에 대해 활성의 110 내지 125%를 나타내었다. 이들 점 돌연변이를 DS1 배경에서 개개로 또는 함께 시험하였을 때, 다양한 돌연변이체는 여전히 WT αMM 활성의 20 내지 30%를 보유하였다(도 1c). 단백질 분해로 전혀 처리되지 않은 R925A/R879A/DS1 돌연변이체가 αMM에 대해 실질적인 활성을 보유하고(도 1c) 리소좀 효소에 대해 저수준의 활성을 보유한다(도 1g)는 사실은 스페이서-1의 부재 하에 비절단 α/β는 부분적으로 활성이라는 것을 나타낸다. 모든 돌연변이체는 WT와 동일한 골지 국소화를 나타내었다(도 10). 이들 결과는 DS1과 관련된 리소좀 효소에 대한 촉매 활성이 K928에서의 절단으로부터 유래된 소량의 β + α/β 전구체에 기인하는 활성의 조합에 기인한다는 것을 나타내는데, Q882에서 절단되는 β의 주요 형태가 비활성이라는 것을 나타낸다.

실시예 3. 스페이서-1의 결실은 몇몇 비-리소좀 당단백질의 인산화를 향상시킨다.

WT 또는 DS1 돌연변이체 작제물로, 또는 벡터 단독으로 형질감염시킨 GNPTAB ^-/- Hela 세포 내 가용성 당단백질의 총 만노스 인산화를 결정하였다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 2시간 동안 [2-³H]만노스로 표지하였고, 이어서, 채취하고 나서, 세척하고, 무세정제 완충제 중에서 용해시킨 후에, 초원심분리하여 가용성 분획으로부터 막 단백질을 분리시켰다. 이어서, 가용성 분획을 고정 CI-MPR과 함께 인큐베이션시켜 Man-6-P 변형된 단백질에 특이적으로 결합시키고, 이어서, 방법 하에 기재한 바와 같이 [2-³H]만노스-표지 당단백질의 그들의 함량에 대해 분석하였다. 놀랍게도, 벡터-단독 값의 차감 후에, DS1 돌연변이체는 WT 작제물에 비해 총 가용성 당단백질의 인산화 수준의 작지만, 통계적으로 유의한 증가를 일관되게 제공하였다(도 2a). WT 또는 DS1 중 하나에 의해 리소좀 단백질, GalA, 카텝신 D(CathD) 및 C2형 니만-픽병(NPC2)의 인산화 정도를 또한 방법에 기재한 바와 같이 [2-³H]만노스-표지, 면역침전 및 직접 글리칸 분석을 이용하여 측정하였다. 모든 3종의 리소좀 효소는 WT 또는 DS1 작제물을 개개 효소에 대한 발현 벡터와 함께 GNPTAB ^-/- Hela 세포로 공동형질감염되는지의 여부와 상관없이 유사한 정도의 인산화를 나타내었다(도 2b, 좌측 패널, WT 값을 1.0으로 설정). 종합하면, 이들 발견은 DS1에 의한 총 인산화의 관찰된 증가가 리소좀 단백질에 추가로 비-리소좀 당단백질의 인산화에 기인할 가능성을 상승시켰다. 이런 경우를 결정하기 위해, 비-리소좀 당단백질 DNase1, 레닌, 백혈병 저해 인자(LIF) 및 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 2(PoFUT2)에 대한 cDNA를 WTα/β 전구체 또는 DS1 돌연변이체 cDNA 중 하나와 함께 공동형질감염시키고, 인산화 정도를 [2-³H]만노스-표지로 정량화하였다. 이들 당단백질이 본래 리소좀 단백질이 아니라고 해도, 그들이 저수준의 Man-6-P 태그를 획득하는 것으로 알려져 있기 때문에, 분석을 위해 당단백질을 선택하였다(12-15). 모두 4가지 경우에, DS1에 의해 매개되는 만노스 인산화 정도는 WT 작제물에 의해 달성되는 것보다 1.5 내지 2배 더 높았다(도 2b, 우측 패널). 이와 일치되게, 레닌(그러나 NPC2는 아님)은 이들 두 단백질에 대한 cDNA를 DS1과 함께 공동 형질감염시켰을 때 WT α/β 전구체에 비해 고정된 CI-MPR에 대해 증가된 결합을 나타내었다(도 2c). 글리코펩시노겐(GP) 또는 막 당단백질(Lamp1 및 Lamp2) 중 어떤 것도 이들 조건 하에 임의의 결합을 나타내지 않았다(도 2c). 이들 결과는 스페이서-1의 부재 하에서, 비-리소좀 기질 서브세트의 변형된 α/β 서브유닛에 의해 매개된 인산화가 증가된다는 것을 나타낸다. 종합하면, 이들 데이터는 GlcNAc-1-PT α/β 전구체의 절단이 K928에서 거의 배타적으로 일어나고, 다수의 비-리소좀 당단백질의 인산화를 최소화하는 작용을 하도록 스페이서-1이 지시한다는 것을 입증한다.

실시예 4. 아미노산 438 내지 926의 결실은 활성 GlcNAc-1-PT의 고수준 발현을 초래한다.

서브유닛의 DMAP 상호작용 도메인과 함께 두 Notch 반복부가 리소좀 효소의 선택적 인식을 매개한다는 것을 이전에 나타내었다(도 3a, WT α/β). 이 영역의 결실(도 3a, N1-D)은 [2-³H]만노스-표지에 의해 결정되는 바와 같이 총 가용성 당단백질의 인산화를 극적으로 감소시켰다(도 3b). GlcNAc-1-PT에 의해 인산화된 대다수의 단백질이 사실 리소좀 단백질이라는 것을 고려하면, N1-D 영역의 부재 하에서 이 결과는 놀랍지 않다. 따라서, 고정된 CI-MPR에 결합하는 능력에 의해 측정되는 β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA) 및 β-만노시다제(MANBA)의 인산화는 거의 완전히 없어졌다(도 3c). 스페이서-1이 저해 도메인으로서 작용한다는 발견에 비추어, N1-D와 조합한 스페이서-1의 결실(도 3a, S1-D)이 두 Notch 모듈 및 DMAP 상호작용 도메인을 결여하는 GlcNAc-1-PT가 리소좀 효소를 인산화시키는 것의 불능을 부분적으로 극복할 수 있다는 가설을 세웠다. 이 예측은 N1-D에 비해 S1-D 돌연변이체에 의해 매개되는 총 가용성 단백질 인산화의 작지만 통계학적으로 유의한 증가(도 3b, N1-D와 S1-D를 비교)뿐만 아니라 HEXB, GLA 및 MANBA 인산화의 작은 증가(14%, 13% 및 5%, 각각의 WT 값)를 나타내는 결과에 의해 뒷받침된다(도 3c). 단순 당 αMM에 대한 N1-D 및 S1-D 돌연변이체의 활성이 유사하기 때문에(도 3e, N1-D 대 S1-D), S1-D 결실 돌연변이체에 의해 매개된 리소좀 효소 인산화의 이들 증가는 스페이서-1의 저해 기능의 상실에 의해 가장 잘 설명된다.

GlcNAc-1-PT α/β 전구체로부터의 추가적인 도메인이 결실되고, 여전히 촉매적 활성을 보유한다는 것을 확인하였다. 대부분의 스페이서-3을 포함한 Notch 1(C438)의 시작으로부터 K928까지의 모든 aa의 결실은 GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 WT보다 대략 10배 더 크게 발현된(도 3d, 레인 3과 6을 비교) GlcNAc-1-PT의 절단된 형태(도 3a, N1-S3)를 초래하였고, 두 Notch 반복부 및 DMAP 상호작용 도메인의 부재에도 불구하고, 이 돌연변이체는 가용성 당단백질의 총 인산화를 WT 수준으로 회복시켰다(도 3b, WT와 N1-S3을 비교). 결실된 영역이 절단 부위로 연장되기 때문에 돌연변이체는 단백질 분해 가공을 겪지 않았으며(도 3d), 또한 단순 당 αMM에 대해 극적으로 증가된 촉매적 활성을 나타내었다(도 3e). 이 결과는 α/β 전구체의 절단이 촉매적 활성 그 자체를 필요로 하지 않는다는 것을 나타낸다. K928 이후의 결실은 용인되지 않는다.

N1-S3의 맥락에서 스페이서-1 결실의 결과를 결정하였다. 이 새로운 작제물(도 3a, S1-S3)은 또한 극적으로 향상된 발현(도 3d, 레인 3과 7을 비교) 및 N1-S3과 유사한 수준으로 αMM에 대한 촉매적 활성(도 3e)을 나타낸 GlcNAc-1-PT α/β 전구체의 추가적인 절단 형태를 초래하였다. 가장 현저하게는, S1-S3에 의해 매개되는 가용성 당단백질의 총 인산화는 WT보다 3배 더 증가된 반면, N1-S3은 WT와 유사하였다(도 3b, WT를, N1-S3 및 S1-S3과 비교). S1-S3과 N1-S3 사이의 차이는 단지 스페이서-1의 부재이기 때문에, 이들 결과는 스페이서-1에 대한 저해 역할에 대해 추가적인 증거를 제공한다. 비-리소좀 단백질 레닌, PoFut2, GP 및 폰빌레브란트 인자 A1A2A3 도메인의 S1-S3에 의해 매개되는 인산화는 또한 N1-S3에 비해 증가되었는데(도 3f), 이는 리소좀 단백질 HEXB, GLA, 및 MANBA에 의한 경우와 같다(도 3g). 모두 4종의 돌연변이체(N1-D, S1-D, N1-S3 및 S1-S3)를 WT와 유사하게 골지에 대해 국소화시켰다(도 11).

S1-S3 돌연변이체에 의해 매개되는 Man-6-P 형성 정도의 더 정량적인 측정을 얻기 위해, WT GlcNAc-1-PT 또는 S1-S3 돌연변이체 α/β 전구체 cDNA 중 하나와 함께 LIF, 레닌, PoFut2 및 DNase 1 중 하나에 대해 cDNA로 공동형질감염시킨 세포의 [2-³H]만노스-표지를 수행하였다. S1-S3과 함께 각각의 이들 단백질의 공동발현은 WT에 비해 인산화의 2 내지 4배 증가를 초래하였는데(도 4), 이는 현저하게 향상된 발현 및 aMM에 대한 활성의 동시 증가와 일치된다(도 3d 및 도 3e). 이들 단백질의 인산화는 DS1 돌연변이체에 의해 달성되는 것보다 약간 더 높았다(도 4를 도 28과 비교).

실시예 1 내지 4의 논의

GlcNAc-1-PT의 Notch 모듈 및 DMAP 상호작용 도메인은 리소좀 단백질의 선택적 인식 및 그들의 N-연결 글리칸의 인산화에서 필수 역할을 한다(3, 16). 분비 경로를 횡단하는 수많은 다른 당단백질은 인산화되지 않거나 또는 저수준의 Man-6-P 태그만을 획득하는 매우 유사한 또는 동일한 N-연결 글리칸을 제시한다(17). 이 관찰에 대한 우세한 설명은 리소좀 단백질과 달리, 비-리소좀 단백질이 GlcNAc-1-PT의 Notch 모듈 및/또는 DMAP 상호작용 도메인에 의해 인식되고 결합되는 구조적 결정소를 결여한다는 것이다. 따라서, 단백질 그 자체에 대해 고만노스 올리고당의 존재는 GlcNAc-1-PT에 의한 글리칸의 생체내 인산화에 불충분하다. 시험관내에서, GlcNAc-1-PT는 단순 당인 αMM을 인산화할 수 있지만, 이 기질에 대한 효소의 Km은 리소좀 효소보다 10³배로 훨씬 더 높은데, 이는 GlcNAc-1-PT에 대한 리소좀 단백질 상의 단백질 도킹 부위의 중요한 역할을 설명한다(18). 본 연구의 중요한 발견은 리소좀 단백질을 특이적으로 인식하고 인산화는 것에 추가로, GlcNAc-1-PT가 비리소좀 단백질의 인산화를 방지하는 작용을 하는 요소(스페이서-1)를 함유한다는 것이다. 이는 스페이서-1 도메인에 부여된 첫 번째 기능이다. 인간 GlcNAc-1-PT의 스페이서-1은 236 aa 길이이며, 척추동물 종에서 고도로 보존되어 있다. 이는 정해진 구조를 갖는데(PDB ID:2N6D), 이는 단지 "스페이서"로서 작용하는 것 이외의 역할과 일치된다(19). 반면에, 하등 진핵생물인 딕티오스텔리움 디스코이데움의 스페이서-1 영역은 네이세리아 메닌기티디스 박테리아 N-아세틸글루코사민-1-인산염 트랜스퍼라제의 그것의 길이와 유사하며(도 6) 그것이 인간 서열과 동일한 방법으로 작용한다는 것은 매우 예상 밖이다. 인간과 딕티오스텔리움 디스코이데움 스페이서-1 서열 사이에서 aa 수준의 상당한 동일성은 없다. 측접하는 Stealth 1 및 2 도메인은 두 종 간에 매우 유사하기 때문에, 인간 GlcNAc-1-PT는 딕티오스텔리움 디스코이데움 서열의 인간 서열로의 치환을 용인할 수 있다. GNPTAB ^-/- Hela 세포에서 이런 키메라의 발현은, ER에서 효율적으로 폴딩되고 단지 WT 효소와 같이 시스-골지로 수송되기는 하지만, DS1가 후자의 구획에서 상이하게 단백질 분해 처리된다는 점에서 예상치 못한 결과를 얻었다. 그것이 이런 대안의 절단을 매개한 S1P라는 것은 S1P 저해제 PF-429242의 사용을 통해 확인하였다. GlcNAc-1-PT 환자 돌연변이를 분석하는 최근의 연구에서, Velho 등은 연구가 새로운 부위를 확인하지 않았다고 하더라도, 잔기 Y937 내지 M972의 프레임내 결실이 서브유닛 내의 대안의 상류에서 S1P에 의해 α/β 전구체의 절단을 초래한다는 것을 보고하였다(20). 대안의 절단 부위로서 Q882의 동정은 DS1에 의해 보이는 β-서브유닛의 더 높은 분자량과 일치된다. S1P가 스페이서-1의 부재 하에 서브유닛 내의 K928에서보다 Q882에서 절단하는 이유는 이 지점이 분명하지 않기 때문이다. 잔기 937 내지 972의 결실이 또한 새로운 부위에서의 절단을 초래한다는 발견에 비추어, 한 가지 가능성은 스페이서-1이 스페이서-3의 일부 영역과 상호작용함으로써(aa 819-955, 도 1) S1P이 절단되는 경우에 영향을 미친다는 것이다. 스페이서-1의 부재 하에서 S1P에 의한 새로운 부위의 용도에 대한 대안의 설명은 Q882에서 절단을 방지하기 위해 이 도메인에 의해 정상적으로 얻어지는 입체 장애가 더 이상 존재하지 않아서, 소량의 전구체가 또한 K928에서 절단된다고 하더라도, S1P가 이제 주로 Q882에서 절단하는 것을 허용한다는 것이다. 흥미롭게도, Q882에서 단백질 분해 과정의 결과로서 WT GlcNAc-1-PT가 미량의 촉매적 비활성 효소를 수득한다는 것을 결정하였다. 이들 결과는 척추동물 GlcNAc-1-PT가 K928에서 절단을 용이하게 하기 위해 스페이서-1을 획득하였고, 그의 촉매 효율을 최대화하는 가능성을 상승시켰다.

S1P에 의해 이용되는 절단 부위가 GlcNAc-1-PT의 정확히 가공된 형태를 생성하도록 지시하는 것에 추가로, 상기 결과는 또한 스페이서-1이 비리소좀 효소의 고만노스 글리칸의 인산화를 최소화함에 있어서 중요한 역할을 가진다는 것을 나타낸다. 이는 DNase I, 레닌, LIF 및 PoFut2를 포함하는 다수의 비-리소좀 당단백질이 그들의 올리고당 쇄 상에서 저수준의 Man-6-P 태그를 획득한다는 것을 잘 보고하였다. 이들 단백질의 저수준의 Man-6-P 변형의 생리적 유의성은 분명하지 않지만, Man-6-P변형 단백질이 엔도좀/리소좀 구획에 전달을 위한 분비 경로로부터 분리되기 때문에, GlcNAc-1-PT에 의한 이들 단백질의 광범위 인산화는 세포에 대해 역효과를 만들 수 있는 가능성이 있는 것으로 여겨진다. DNase I, 레닌, LIF 및 PoFut2의 WT 효소 이상으로 DS1에 의해 매개되는 인산화의 1.5 내지 2배의 증가를 나타내는 데이터는 비-리소좀 단백질의 인산화를 저해함에 있어서 스페이서-1에 대한 역할을 나타낸다.

2개의 Notch 모듈 및 DMAP 상호작용 도메인(N1-D)의 결실은 시험한 모든 리소좀 효소에 대해 돌연변이체 GlcNAc-1-PT의 인산화 활성을 사실상 없앴다는 것을 앞서 나타내었다(3). 이와 관련하여, Notch1-DMAP 결실(S1-D)과 조합할 때, 스페이서-1 결실이 HEXB, GLA 및 MANBA의 저수준의 인산화(14%, 13% 및 5%, 각각의 WT 값)를 회복할 수 있다는 것은 흥미롭다. N1-S3 돌연변이체는 촉매 활성에 대한 단백질 분해 과정을 필요로 하지 않기 때문에, 동일한 맥락에서 이는 스페이서-1 결실의 영향을 평가하기 위한 양호한 대조군으로서 작용한다. 박테리아의 당 인산염 트랜스퍼라제와 비슷한 이 새로운 작제물인 S1-S3(도 6)은 N1-S3에 의해 얻은 것과 유사하게 고수준에서 발현되었고, αMM에 대해 유사한 활성을 가졌다. 그러나, S1-S3 작제물은 WT보다 거의 4배 초과만큼 총 가용성 당단백질의 인산화를 증가시킨 반면, N1-S3 값은 WT와 유사하였다. 리소좀 효소 HEXB, GLA 및 MANBA의 S1-S3-매개 인산화는 또한 비-리소좀 당단백질 글리코펩티노겐 및 vWF A1A2A3 도메인의 인산화와 같이 N1-S3에 비해 증가되었다. WT 효소에 의해 작용하지 않는 비리소좀 단백질을 인산화하는 S1-S3 작제물의 능력은 그것이 박테리아 당 인산염 트랜스퍼라제와 유사하게 단백질-도킹 부위의 부재 하에서 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

종합하면, 이들 발견은 GlcNAc-1-PT α/β 전구체가 척추동물 진화과정에서 리소좀 단백질의 인산화를 용이하게 하는 작용을 하는 한편, 동시에 비리소좀 당단백질에 대한 효소의 고유한 능력을 무효화시키는 양성(Notch 모듈 및 DMAP 상호작용 도메인)과 음성(스페이서-1) 조절 도메인을 둘 다 획득하였다는 가설에 대한 근거를 제공한다. 이들 발견에 기반하여, 본 발명자들은 GlcNAc-1-PT가 작용하는 방법을 설명하기 위해 다음의 모델을 제안한다. 기저 상태에서(도 5A), 스페이서-1 도메인은 4개의 Stealth 도메인에 의해 형성된 촉매 부위의 올리고당 맞물림을 방해한다. Notch 모듈 및 DMAP 상호작용 도메인에 대한 리소좀 효소 단백질 도킹 부위의 결합 시, 스페이서-1 도메인이 대체되어, 리소좀 효소 고-만노스 글리칸의 만노스 잔기가 촉매 부위로 들어가고 인산화되도록 허용하도록 입체배좌적 변화가 일어난다. 일부 예에서, γ 서브유닛의 만노스-6-인산염 수용체 상동성 도메인은 올리고당이 촉매 부위로 향하도록 가이드할 것이다. 약하게 결합하는 비리소좀 당단백질, 예컨대 DNase I는 스페이서-1을 대신하는 데 필요한 입체배좌 변화를 유도할 수 없을 수도 있어서, 그들의 인산화 정도를 제한한다. 스페이서-1의 결실 시, 이들 단백질의 인산화는 증가된다. Notch 모듈 및 DMAP 상호작용 도메인에 결합을 위한 구조적 결정소를 전체적으로 결여하는 비-리소좀 당단백질은 전혀 인산화되지 못한다. N1-S3 효소와 함께 스페이서-1의 제거는 완전한 촉매적 활성을 갖는 고도로 발현된 효소를 초래하여,골지를 통과하는 모든 가용성 당단백질을 인산화시키도록 허용한다(도 5B).

실시예 1 내지 4의 방법.

세포주 - GNPTAB ^-/- HeLa 세포주는 다른 곳에서 상세하게 기재하였다(3). 10%(vol/vol) FBS(아틀란타 바이올로지컬스(Atlanta Biologicals)), 100,000U/ℓ 페니실린, 100㎎/ℓ 스트렙토마이신(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 및 2mM L-글루타민(라이프 테크놀로지즈)으로 보충한 0.11g/ℓ의 피루브산나트륨 및 4.5g/ℓ 글루코스를 함유하는 DMEM(라이프 테크놀로지즈)에서 세포를 유지하였다.

DNA 작제물 - pcDNA6 중의 인간 GNPTAB-V5/His을 기재하였다(11). 2 단계 중복-연장(overlap-extension: OE) PCR 공정을 이용하여 다양한 α/β 결실 작제물을 제조하되, 당해 결실을 암호화하는 PCR-생성 제한 단편을 동일한 영역 내에서 천연 cDNA와 교환하였다. DS1 작제물을 생성하기 위해, 인간 Stealth1 및 Stealth 2 서열과 함께 딕티오스텔리움 디스코이데움 스페이서-1 서열을 암호화한 0.5 kb gBlocks 유전자 단편을 합성하고 나서, OE-PCR의 제1 단계에서 이용하였다. 퀵체인지(QuikChange) 부위-지정 돌연변이유발 방법에 의해 점 돌연변이를 생성하고 나서, DNA 서열분석에 의해 모든 서열이 정확하다는 것을 확인하였다.

LIF cDNA 작제물은 Richard Steet(조지아주 애선스에 소재한 유니버시티 오브 조지아(University of Georgia))에 의해 친절하게 제공된 한편, PoFut2-myc cDNA는 Robert Haltiwanger(조지아주 애선스에 소재한 유니버시티 오브 조지아)로부터 기증받았다. DNase I, 글리코펩시노겐, CathD-myc, α-GalA 및 NPC2-myc를 기재하였다(3, 12, 21). 레닌-HA cDNA는 애드진(매사추세츠주 캠브리지에 소재)으로부터 구입한 반면, 플라스미드인 vWF-A1A2A3-Strep-pCDNA6은 J. Evan Sadler(미주리주 세인트루이스에 소재한 워싱턴 유니버시티 스쿨 오브 메디신(Washington University School of Medicine))에 의해 제공받았다.

면역형광 현미경관찰 - WT α/β 및 다양한 돌연변이체의 세포하부 국소화를 시각화하기 위해, 상이한 작제물을 제조업자의 프로토콜에 따라 리포펙타민 3000(Lipofectamine 3000)(라이프 테크놀로지즈)을 이용하여 GNPTAB ^-/- Hela 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에, 세포를 고정시키고, 마우스 항-V5 단클론성 항체(라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 α/β 서브유닛을 검출하였다. 골지 마커인 GOLPH4를 토끼 항-GOLPH4 다클론성 항체(에이빔(Abeam))를 이용하여 각각 검출하였다. 처리한 세포를 Prolong(등록상표) 골드 안티페드 장착 배지(라이프 테크놀로지즈)에서 장착하고, LSM880 공초점 현미경(칼자이스 인코포레이티드(Carl Zeiss Inc.)) 중 하나를 이용하여 영상을 획득하였다. 이미지 J 소프트웨어(Image J software)(피지(Fiji))에 의해 영상을 분석하였다.

웨스턴 블롯팅 - 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분해한 단백질을 나이트로셀룰로스 막에 옮기고 나서, 도면 범례에 나타내는 바와 같이 항체로 검출하였다.

총 가용성 당단백질에 대한 [2- ³ H]만노스 표지 실험 - 다음과 같이 형질감염 GNPTAB ^-/- Hela 세포를 이용하여 표지 실험을 수행하였다: 형질감염 48시간 후에, 6-웰 플레이트 내 세포를 10μCi의 [2-³H]만노스(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 2시간 펄스 후에, 세포를 PBS를 이용하여 2회 린스하고 나서, 채취하고, 이어서, 4℃에서 프로테아제 저해제 칵테일(라이프 테크놀로지즈)과 함께 25mM 트리스.Cl(pH 7.2) 및 150mM NaCl을 함유하는 무세정제 완충제 중에서 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고, 이어서, 100,000 x g에서 1시간 동안 초원심분리를 실시하여 가용성 분획으로부터 막 단백질을 분리시켰다. 이어서, 100㎕의 가용성 분획을 만노스-인산화된 당단백질을 펠릿화하기 위해 사이아노 브로마이드-활성화-세파로스 4B에 공유 결합된 정제된 CI-MPR과 함께 인큐베이션시킨 한편, 10㎕의 가용성 분획을 1.5% 포스포텅스텐산에 의해 침전시켜 가용성 단백질 내로의 총 [2-³H]만노스 표지 혼입을 얻었다. 이 방법은 WT 또는 돌연변이체 GlcNAc-1-PT 중 하나에 의해 인산화된 모든 만노스 표지 당단백질의 정확한 정량화를 허용하였다.

리소좀 효소에 대한 [2- ³ H[만노스 표지 실험 - 다음과 같이 형질감염된 GNPTAB ^-/- HeLa 세포를 이용하여 표지 실험을 수행하였다: 형질감염 48시간 후에, 60㎜ 조직 배양물 플레이트 내 세포를 50 내지 150μCi의 [2-³H]만노스(퍼킨 엘머)와 함께 2시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 만노스 흡수를 중단시키기 위해 5mM 글루코스, 5mM 만노스 및 10mM NH₄Cl을 함유하는 완전 배지를 첨가하고, 분비를 유도하였다. 추가 3시간 동안 세포를 인큐베이션시킨 후에, 배지를 수집하였다. 몇몇 실험에서, 세포 추출물을 준비하고 나서, β 서브유닛 함량에 대한 웨스턴 블롯팅을 실시하여 작제물이 비슷한 수준에서 발현되었는지를 확인하였다.

면역침전 및 올리고당 분석 - 배지 내로 분비된 산 가수분해효소를 면역침전시키고 나서, 올리고당을 단리시키고, 앞서 상세하게 기재한 바와 같이 본질적으로 분석하였다(23). CathD-myc, NPC2-myc, PoFut2-myc 및 레닌-HA 실험을 위해, 20㎕ 항-myc 단클론성 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)) 또는 5㎕ 항-HA 단클론성 항체(시그마-알드리치(Sigma­ Aldrich))를 100㎕ 단백질 G-아가로스-PLUS 비드(산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 사전 결합시킨 후 배지로부터 표지 리소좀 가수분해효소를 면역침전시켰다. GLA, DNase I 및 LIF의 경우에, 분비된 효소를 항-β-Gal 항체(아미쿠스 세라퓨틱스(Amicus Therapeutics))에 사전결합된 단백질 G-아가로스-PLUS 비드 및 항-DNase I 항체(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma)), 또는 항-LIF 항체(프랑스 낭트에 소재한 유니버시티 오브 낭트(University of Nantes)의 프레데릭 블랑샤드(Frederic Blanchard)에 의해 풍부하게 제공받음)에 사전 결합된 rProteinA-아가로스 비드(레플리겐(RepliGen))에 의해 면역침전시켰다. 면역침전된 물질을 Endo H(NEB)로 처리하고 나서, 울트라셀-10K(EMO 밀리포어(EMO Millipore))로 여과시켰다. 중성 및 인산화된 고 만노스 글리칸을 함유하는 여과액을 약산으로 처리하여 인산염 잔기에 여전히 부착된 임의의 N-아세틸글루코사민 잔기를 제거하고, QAE-칼럼 기질에 적용하여 0, 1 또는 2개의 Man-6-P 잔기를 보유하는 올리고당을 분리시켰다. 엔도 H-내성 복합 올리고당을 함유하는 보유액을 프로나제(Pronase)(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))로 처리하고 나서, ConA-세파로스 4B(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에서 분획화하였다. 각각의 분획의 [2-³H]-만노스 함량을 결정하고 나서, 기재한 바와 같이 인산화 백분율을 계산하였다(23). 모든 경우에, 모의 형질감염에 의해 얻은 값을 차감하였다.

실시예 5. 효소 대체 요법을 위해 고도로 인산화된 리소좀 효소를 생산하는 방법.

효소 대체 요법(ERT)은 개개 장에 중에서 그의 효능이 다름에도 불구하고 다수의 리소좀 저장 질환에 대한 현재의 주된 치료 형태이다[1]. 이들 유전 장애의 대부분은 효소에 의해 정상적으로 분해되는 물질의 축적을 야기하는 단일 리소좀 효소의 활성 결여로부터 생긴다. 리소좀 내 저장 물질의 구성은 종국적으로 세포 및 기관 기능 장애를 초래한다. ERT의 목표는 결함 세포의 리소좀 내로 충분한 양의 정상 효소를 도입하여 저장 물질을 청소하고 리소좀 기능을 회복시키는 것이다. 이런 형태의 요법은 산 β-글루코세브로시다제 활성을 결여하고 주로 대식세포 유형 세포에서 글루코실세르아마이드를 축적하는 1형 고쉐병을 갖는 환자에서 처음으로 사용하였다[2]. 말단의 만노스 잔기를 갖는 N-연결 글리칸을 함유하는 대체 효소를 정맥내로 주입하고 나서, 세포 표면 만노스 수용체를 통해 대식세포에 의해 취하였다. 이어서, 엔도솜을 통해 리소좀까지 수송되었으며, 여기서 그것은 내포된 효소를 이 장애에서 양호한 임상 결과로 작용한다[3].

대부분의 세포 유형은 만노스 수용체를 결여하기 때문에, 대식세포 이외의 세포 유형을 수반하는 리소좀 저장 장애를 치료하기 위해 사용되는 대체 효소는 리소좀에 대한 후속적 전달을 위해 세포 표면에서 만노스 6-인산염(Man-6-P) 수용체에 대한 결합을 이용한다. 이들 효소를 고수준의 관심 효소를 생성하도록 조작된 포유류 세포(대부분 중국 햄스터 난소 세포)의 분비로부터 정제하였다. 이 접근은 발현된 리소좀 효소의 N-글리칸의 만노스 잔기를 인산화하는 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 능력에 의존한다. 본 기법에 의해 생산되는 대체 효소의 일부는 고도로 인산화되며, Man-6-P 수용체에 잘 결합한다. 그러나, 나머지는 불량하게 인산화되어 ERT에서 그들의 유효성을 제한한다. 이는 폼페병 효소(산 α-글루코시다제, GAA) 및 알파-만노사이드축적증 효소(리소좀 산 α-만노시다제, LAMAN)를 포함한다[4,5].

내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 활성은 생산 세포에 의해 합성 중인 고수준의 GAA 및 LAMAN을 효과적을 인산화시키기에 불충분할 수 있다. 이 가능성을 시험하기 위해, Expi293F 또는 양이온-독립적 만노스 6-인산염 수용체(CI-MPR) 음성 마우스 D9 L 세포를 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제 α/β 전구체에 대해 cDNA와 함께 관심 리소좀 효소를 암호화하는 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제는 두 유전자(GNPTAB 및 GNPTG)에 의해 암호화된 α2β2γ2 헥사머이지만, α/β 서브유닛은 γ의 부재 하에서 대부분의 리소좀 효소를 인산화시킬 수 있다[6]. 추가로, 다수의 서브유닛 요소를 결여하는 반면, 촉매적 "Stealth" 도메인을 보유하는 절단된 α/β 전구체(S1-S3)를 또한 시험하였다(도 12a). 이 절단 효소를 매우 고수준에서 발현시켜, WT 효소에 의해 일어나는 것보다 20배 더 큰 촉매 활성을 초래하였다[7].

형질감염 세포에 의해 분비된 4종의 리소좀 효소의 CI-MPR-비드에 대한 결합을 도 12b에 나타낸다. 이 경우에 증가된 결합은 이들 효소의 더 높은 정도의 인산화를 반영한다. 모든 예에서, 효소는 세포에서 단독으로 발현된 효소에 의해 관찰된 것보다 훨씬 더 큰 정도로 CI-MPR-비드에 결합된 절단된 α/β 전구체에 의해 공동 형질감염된 세포에 의해 분비되었다. CI-MPR-비드에 대한 리소좀 효소 결합에 대한 WT α/β 전구체에 의핸 공동형질감염 효과는 가변적이었는데, 이는 GAA 결합의 최소 자극으로부터 LAMAN 경우에 12배 향상된 결합까지의 범위에 있다. 리소좀 효소 인산화에 대한 α/β 전구체 작제물의 효과를 더 직접적으로 보기 위해, CRISPR-Cas9 비활성화 GNPTAB 유전자[8]를 갖는 HeLa 세포를 다양한 플라스미드를 이용하여 형질감염시키고, 이어서, 리소좀 효소의 N-연결 글리칸을 표지하기 위해 1시간 동안 [2-³H] 만노스와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군으로서, 활성 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제를 갖는 모 HeLa 세포를 리소좀 효소를 암호화하는 플라스미드 단독으로 형질감염시켰다. 표지 효소의 분비를 자극하기 위해 NH₄Cl의 존재 하에서 4시간 추적 후에, 배지를 채취하고 나서, 관심 리소좀 효소를 면역침전시켰다. 이어서, 면역침전물을 1 또는 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 고 만노스 N-연결 글리칸의 그들의 함량에 대해 분석하였다[8, 9]. 이들 실험은 리소좀 효소에 따라서 절단된 α/β 전구체가 모 HeLa 세포 이상으로 다양한 수준에서 만노스 인산화를 자극하였다는 것을 나타내었다(도 12c). 추가로, 절단된 효소는 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸의 형성을 증가시켰다(표 2). 이는 2개의 Man-6-P 잔기를 갖는 글리칸이 1개의 Man-6-P 잔기만을 갖는 글리칸보다 CI-MPR에 대해 훨씬 더 높은 친화도로 결합하기 때문에, 중요하다[10]. WT α/β 전구체는 또한 Man-6-P 형성을 자극하였지만, 돌연변이체 α/β에 의해 관찰되는 것보다 더 적은 정도로 자극하였다.

HeLa 세포에 의한 흡수에 대한 다양한 리소좀 효소의 증가된 Man-6-P 함량의 영향을 표 1에 나타낸다. GAA를 제외하고, WT 또는 절단된 α/β 전구체 중 하나를 암호화하는 플라스미드에 의해 공동형질감염된 세포에 의해 분비된 효소는 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제만을 이용하는 세포에 의해 분비된 효소보다 몇 배 더 양호하게 내재화되었다. 배지 내 5mM Man-6P의 존재에 의해 대부분의 흡수는 차단되었는 데, 이는 흡수가 Man-6-P 수용체에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. LAMAN에 의한 결과는 특히 더 두드러졌는데, Man-6-P-저해 가능한 흡수는 130- 내지 153-배만큼 자극되었다. GAA의 경우에, 절단된 α/β 전구체에 의해 공동형질감염된 세포에 의해 분비된 효소의 Man-6-P-의존적 흡수는 WT α/β 전구체에 의해 공동 형질감염된 세포에 의해 또는 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제만을 발현시킴으로써 분비된 GAA보다 2.6배 더 컸다.

이들 발견은 리소좀 효소 인산화가 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제의 WT 또는 절단된 α/β 전구체 중 하나에 의한 공동형질감염에 의해 실질적으로 증가될 수 있다는 것을 확립한다. 향상된 인산화는 CI-MPR에 대한 결합 및 세포에 의한 흡수를 증가시킨다. 이 효과는 심지어 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제에 의해 잘 인산화되는 GalA와 같은 리소좀 효소에 의해 일어난다. 그러나 이 방법이 내인성 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제에 의해 불량하게 인산화되는 두 리소좀 효소인 LAMAN 및 GAA의 인산화 및 흡수를 향상시킨다는 발견이 가장 중요하다. 이 방법에 의해 제조된 효소는 ERT에서 그들의 유용성을 상당히 개선시키는 잠재력을 가진다. 더 양호한 세포 흡수를 제공하는 것에 추가로, 이들 제제는 환자에게 더 낮은 용량으로 투여되는 것이 허용될 수 있는데, 이는 덜 빈번할 간격이 가능성이 있다. 상기 방법은 ERT를 잘 받아들일 수 있는 다른 리소좀 저장 질환에 대한 리소좀 효소의 생산에 적용 가능하여야 한다. 추가로, 고수준의 Man-6-P를 함유하는 GBA의 생산은 만노스 수용체를 결여하는 고쉐병을 갖는 환자에서 세포 유형에 대해 효소 활성을 회복시키는 기회를 제공한다. 이는 대식세포에 특이적으로 지시된 현재의 요법에 대한 추가적인 이점을 제공하는 작용을 할 수 있다.

실시예 5에 대한 방법.

세포주 - Expi293F 세포는 라이프 테크놀로지즈로부터 유래된다. 이들 세포를 Expi293 발현 배지(라이프 테크놀로지즈) 내 현탁액 중에서 성장시켰다. GNPTAB ^-/- HeLa 세포주는 다른 곳에서 상세하게 기재하였다[8]. 모 세포 및 GNPTAB ^-/- HeLa 세포를 10%(vol/vol) FBS(아틀란타 바이올로지컬스), 100,000U/ℓ 페니실린, 100㎎/ℓ 스트렙토마이신(라이프 테크놀로지즈) 및 2mM L-글루타민(라이프 테크놀로지즈)으로 보충한 0.11g/ℓ 피루브산나트륨 및 4.5g/ℓ 글루코스를 함유하는 DMEM (라이프 테크놀로지즈)에서 단일층으로서 유지하였다. CI-MPR 음성 마우스 L-세포(D9 세포주)를 기재하였다[11]. D9 세포를 100,000U/ℓ 페니실린 및 100㎎/ℓ 스트렙토마이신(라이프 테크놀로지즈)을 함유하는 α-MEM (라이프 테크놀로지즈)에서 단일층으로서 유지하였다.

DNA 작제물 - pcDNA6 내 인간 GNPTAB-V5/His 및 S1-S3 결실 돌연변이체를 기재하였다[7]. LAMAN-myc-Flag cDNA를 오리진(Origene)으로부터 구입한 한편, GAA cDNA는 Eline van Meel(네덜란드에 소재한 레이덴 유니버시티(Leiden University))으로부터 기증받았다. GBA 및 GLA cDNA는 아미쿠스 쎄라퓨틱스(Amicus Therapeutics)에 의해 풍부하게 제공받았다.

CI-MPR 친화도 크로마토그래피 및 효소 분석 - 가용성 소 CI-MPR을 소태아 혈청으로부터 정제하였고, 기재한 바와 같이 사이아노겐 브로마이드-활성화된-세파로스 4B(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 공유 결합시켰다[12]. 2일 형질감염 Expi293F 세포 또는 마우스 D9 세포로부터의 배지를 인산화된 리소좀 효소에 결합하도록 4℃에서 1시간 동안 CI-MPR 비드와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 비드를 침전시키고 나서, 완충제(25mM 트리스-Cl, pH7.2, 150mM NaCl 및 1% 트리톤-X 100)로 세척하고, 기재한 바와 같이 리소좀 효소 활성에 대해 분석하였다[13]. 비드 상에서 회수한 출발 효소의 양을 계산하였다.

리소좀 효소의 세포 흡수 - 세포 흡수 실험 1일 전에 모 HeLa 세포를 대략 80%의 밀도로 12-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 생산 세포로부터의 각각의 효소를 함유하는 배지를 최종 용적 500㎕로 모 HeLa 세포에 첨가하였다. 경쟁 실험을 위해, Man-6-P를 5mM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 이 배지 및 세포를 별개로 수집하였다. 세포를 PBS로 2회 린스하고, 이어서, 25mM 트리스-Cl, pH 7.2, 150mM NaCl, 1% 트리톤-X100, 및 프로테아제 저해제 칵테일(라이프 테크놀로지즈) 중에 용해시켰다. 배지 및 용해 세포를 20,000 x g으로 원심분리시키고 나서, 배지 및 세포 용해물의 상청액 중의 효소 활성을 분석하였다.

리소좀 효소에 대한 [2- ³ H[만노스 표지 실험 - 다음과 같이 형질감염시킨 GNPTAB^-/- 모 HeLa 세포를 이용하여 표지 실험을 수행하였다: 형질감염 48시간 후에, 60㎜ 조직 배양물 플레이트 내 세포를 50 내지 150μCi의 [2-³H]만노스(퍼킨 엘머)와 함께 2시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 만노스 흡수를 중단시키고 분비를 유도하기 위해 5mM 글루코스, 5mM 만노스 및 10mM NH₄Cl을 함유하는 완전 배지를 첨가하였다. 세포를 추가 3시간 동안 인큐베이션시킨 후에 분석을 위해 배지를 수집하였다.

면역침전 및 올리고당 - 배지 내로 분비된 산 가수분해효소를 면역침전시키고, 올리고당을 단리시킨 후에 앞서 상세하게 기재한 바와 같이 본질적으로 분석하였다[9]. LAMAN, GAA 및 GBA cDNA에 myc-태그를 붙였기 때문에, 20㎕ 항-myc 단클론성 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 100㎕ 단백질 G-아가로스-PLUS 비드(산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 사전결합시킨 후에 표지된 리소좀 가수분해효소를 배지로부터 면역침전시켰다. GLA의 경우에, 분비 효소를 항-β-Gal 항체(아미쿠스 쎄라퓨틱스)에 사전결합된 단백질 G-아가로스-PLUS 비드를 이용하여 면역침전시켰다. 면역침전된 물질을 Endo H(NEB)로 처리하고 나서, 울트라셀(Ultracel)-1OK(EMO 밀리포어)를 이용하여 여과시켰다. 인산염 모이어티에 여전히 부착된 임의의 N-아세틸글루코사민 잔기를 제거하기 위해 중성 및 인산화된 고 만노스 글리칸을 함유하는 여과액을 약산으로 처리하였고, 0, 1 또는 2개의 Man-6-P 잔기를 보유하는 올리고당을 분리시키기 위해 QAE-칼럼 기질에 적용하였다. Endo H-내성 복합 올리고당을 함유하는 보유액을 프로나제(로슈 다이아그노스틱스)로 처리하고 나서, ConA-세파로스 4B(GE 헬스케어) 상에서 분획화하였다. 각각의 분획의 [2-³H]-만노스 함량을 결정하고 나서, 기재한 바와 같이 인산화 백분율을 계산하였다[9].

SEQUENCE LISTING <110> KORNFELD, Stuart LIU, Lin LEE, Wang-Sik DORAY, Balraj <120> COMPOSITIONS COMPRISING A MODIFIED GlcNAc-1-PHOSPHOTRANSFERASE AND METHODS OF USE THEREOF <130> 047563-580391 <150> 62/402,468 <151> 2016-09-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1256 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Phe Lys Leu Leu Gln Arg Gln Thr Tyr Thr Cys Leu Ser His 1 5 10 15 Arg Tyr Gly Leu Tyr Val Cys Phe Leu Gly Val Val Val Thr Ile Val 20 25 30 Ser Ala Phe Gln Phe Gly Glu Val Val Leu Glu Trp Ser Arg Asp Gln 35 40 45 Tyr His Val Leu Phe Asp Ser Tyr Arg Asp Asn Ile Ala Gly Lys Ser 50 55 60 Phe Gln Asn Arg Leu Cys Leu Pro Met Pro Ile Asp Val Val Tyr Thr 65 70 75 80 Trp Val Asn Gly Thr Asp Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Gln Val 85 90 95 Arg Glu Gln Met Glu Glu Glu Gln Lys Ala Met Arg Glu Ile Leu Gly 100 105 110 Lys Asn Thr Thr Glu Pro Thr Lys Lys Ser Glu Lys Gln Leu Glu Cys 115 120 125 Leu Leu Thr His Cys Ile Lys Val Pro Met Leu Val Leu Asp Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Ala Asn Ile Thr Leu Lys Asp Leu Pro Ser Leu Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Phe His Ser Ala Ser Asp Ile Phe Asn Val Ala Lys Pro Lys Asn Pro 165 170 175 Ser Thr Asn Val Ser Val Val Val Phe Asp Ser Thr Lys Asp Val Glu 180 185 190 Asp Ala His Ser Gly Leu Leu Lys Gly Asn Ser Arg Gln Thr Val Trp 195 200 205 Arg Gly Tyr Leu Thr Thr Asp Lys Glu Val Pro Gly Leu Val Leu Met 210 215 220 Gln Asp Leu Ala Phe Leu Ser Gly Phe Pro Pro Thr Phe Lys Glu Thr 225 230 235 240 Asn Gln Leu Lys Thr Lys Leu Pro Glu Asn Leu Ser Ser Lys Val Lys 245 250 255 Leu Leu Gln Leu Tyr Ser Glu Ala Ser Val Ala Leu Leu Lys Leu Asn 260 265 270 Asn Pro Lys Asp Phe Gln Glu Leu Asn Lys Gln Thr Lys Lys Asn Met 275 280 285 Thr Ile Asp Gly Lys Glu Leu Thr Ile Ser Pro Ala Tyr Leu Leu Trp 290 295 300 Asp Leu Ser Ala Ile Ser Gln Ser Lys Gln Asp Glu Asp Ile Ser Ala 305 310 315 320 Ser Arg Phe Glu Asp Asn Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Arg Ser Ile 325 330 335 Glu Arg His Ala Pro Trp Val Arg Asn Ile Phe Ile Val Thr Asn Gly 340 345 350 Gln Ile Pro Ser Trp Leu Asn Leu Asp Asn Pro Arg Val Thr Ile Val 355 360 365 Thr His Gln Asp Val Phe Arg Asn Leu Ser His Leu Pro Thr Phe Ser 370 375 380 Ser Pro Ala Ile Glu Ser His Ile His Arg Ile Glu Gly Leu Ser Gln 385 390 395 400 Lys Phe Ile Tyr Leu Asn Asp Asp Val Met Phe Gly Lys Asp Val Trp 405 410 415 Pro Asp Asp Phe Tyr Ser His Ser Lys Gly Gln Lys Val Tyr Leu Thr 420 425 430 Trp Pro Val Pro Asn Cys Ala Glu Gly Cys Pro Gly Ser Trp Ile Lys 435 440 445 Asp Gly Tyr Cys Asp Lys Ala Cys Asn Asn Ser Ala Cys Asp Trp Asp 450 455 460 Gly Gly Asp Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Ser Arg Tyr Ile Ala Gly 465 470 475 480 Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ile Gly Val Gly Gln Pro Trp Gln Phe Gly 485 490 495 Gly Gly Ile Asn Ser Val Ser Tyr Cys Asn Gln Gly Cys Ala Asn Ser 500 505 510 Trp Leu Ala Asp Lys Phe Cys Asp Gln Ala Cys Asn Val Leu Ser Cys 515 520 525 Gly Phe Asp Ala Gly Asp Cys Gly Gln Asp His Phe His Glu Leu Tyr 530 535 540 Lys Val Ile Leu Leu Pro Asn Gln Thr His Tyr Ile Ile Pro Lys Gly 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Tyr Phe Ser Phe Ala Glu Val Ala Lys Arg Gly Val 565 570 575 Glu Gly Ala Tyr Ser Asp Asn Pro Ile Ile Arg His Ala Ser Ile Ala 580 585 590 Asn Lys Trp Lys Thr Ile His Leu Ile Met His Ser Gly Met Asn Ala 595 600 605 Thr Thr Ile His Phe Asn Leu Thr Phe Gln Asn Thr Asn Asp Glu Glu 610 615 620 Phe Lys Met Gln Ile Thr Val Glu Val Asp Thr Arg Glu Gly Pro Lys 625 630 635 640 Leu Asn Ser Thr Ala Gln Lys Gly Tyr Glu Asn Leu Val Ser Pro Ile 645 650 655 Thr Leu Leu Pro Glu Ala Glu Ile Leu Phe Glu Asp Ile Pro Lys Glu 660 665 670 Lys Arg Phe Pro Lys Phe Lys Arg His Asp Val Asn Ser Thr Arg Arg 675 680 685 Ala Gln Glu Glu Val Lys Ile Pro Leu Val Asn Ile Ser Leu Leu Pro 690 695 700 Lys Asp Ala Gln Leu Ser Leu Asn Thr Leu Asp Leu Gln Leu Glu His 705 710 715 720 Gly Asp Ile Thr Leu Lys Gly Tyr Asn Leu Ser Lys Ser Ala Leu Leu 725 730 735 Arg Ser Phe Leu Met Asn Ser Gln His Ala Lys Ile Lys Asn Gln Ala 740 745 750 Ile Ile Thr Asp Glu Thr Asn Asp Ser Leu Val Ala Pro Gln Glu Lys 755 760 765 Gln Val His Lys Ser Ile Leu Pro Asn Ser Leu Gly Val Ser Glu Arg 770 775 780 Leu Gln Arg Leu Thr Phe Pro Ala Val Ser Val Lys Val Asn Gly His 785 790 795 800 Asp Gln Gly Gln Asn Pro Pro Leu Asp Leu Glu Thr Thr Ala Arg Phe 805 810 815 Arg Val Glu Thr His Thr Gln Lys Thr Ile Gly Gly Asn Val Thr Lys 820 825 830 Glu Lys Pro Pro Ser Leu Ile Val Pro Leu Glu Ser Gln Met Thr Lys 835 840 845 Glu Lys Lys Ile Thr Gly Lys Glu Lys Glu Asn Ser Arg Met Glu Glu 850 855 860 Asn Ala Glu Asn His Ile Gly Val Thr Glu Val Leu Leu Gly Arg Lys 865 870 875 880 Leu Gln His Tyr Thr Asp Ser Tyr Leu Gly Phe Leu Pro Trp Glu Lys 885 890 895 Lys Lys Tyr Phe Gln Asp Leu Leu Asp Glu Glu Glu Ser Leu Lys Thr 900 905 910 Gln Leu Ala Tyr Phe Thr Asp Ser Lys Asn Thr Gly Arg Gln Leu Lys 915 920 925 Asp Thr Phe Ala Asp Ser Leu Arg Tyr Val Asn Lys Ile Leu Asn Ser 930 935 940 Lys Phe Gly Phe Thr Ser Arg Lys Val Pro Ala His Met Pro His Met 945 950 955 960 Ile Asp Arg Ile Val Met Gln Glu Leu Gln Asp Met Phe Pro Glu Glu 965 970 975 Phe Asp Lys Thr Ser Phe His Lys Val Arg His Ser Glu Asp Met Gln 980 985 990 Phe Ala Phe Ser Tyr Phe Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Val Gln Pro Leu 995 1000 1005 Asn Ile Ser Gln Val Phe Asp Glu Val Asp Thr Asp Gln Ser Gly 1010 1015 1020 Val Leu Ser Asp Arg Glu Ile Arg Thr Leu Ala Thr Arg Ile His 1025 1030 1035 Glu Leu Pro Leu Ser Leu Gln Asp Leu Thr Gly Leu Glu His Met 1040 1045 1050 Leu Ile Asn Cys Ser Lys Met Leu Pro Ala Asp Ile Thr Gln Leu 1055 1060 1065 Asn Asn Ile Pro Pro Thr Gln Glu Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Leu 1070 1075 1080 Pro Pro Val Thr Lys Ser Leu Val Thr Asn Cys Lys Pro Val Thr 1085 1090 1095 Asp Lys Ile His Lys Ala Tyr Lys Asp Lys Asn Lys Tyr Arg Phe 1100 1105 1110 Glu Ile Met Gly Glu Glu Glu Ile Ala Phe Lys Met Ile Arg Thr 1115 1120 1125 Asn Val Ser His Val Val Gly Gln Leu Asp Asp Ile Arg Lys Asn 1130 1135 1140 Pro Arg Lys Phe Val Cys Leu Asn Asp Asn Ile Asp His Asn His 1145 1150 1155 Lys Asp Ala Gln Thr Val Lys Ala Val Leu Arg Asp Phe Tyr Glu 1160 1165 1170 Ser Met Phe Pro Ile Pro Ser Gln Phe Glu Leu Pro Arg Glu Tyr 1175 1180 1185 Arg Asn Arg Phe Leu His Met His Glu Leu Gln Glu Trp Arg Ala 1190 1195 1200 Tyr Arg Asp Lys Leu Lys Phe Trp Thr His Cys Val Leu Ala Thr 1205 1210 1215 Leu Ile Met Phe Thr Ile Phe Ser Phe Phe Ala Glu Gln Leu Ile 1220 1225 1230 Ala Leu Lys Arg Lys Ile Phe Pro Arg Arg Arg Ile His Lys Glu 1235 1240 1245 Ala Ser Pro Asn Arg Ile Arg Val 1250 1255

Claims (38)

1. 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1에 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가지는 전장 인간 GlcNAc-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNAc-1-PT) α/β 서브유닛에 관하여 아미노산의 내부 결실을 포함하는 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛으로서, 상기 내부 결실은 스페이서-1 도메인을 포함하고, 스페이서-1 도메인은 서열 번호 1에 관하여 아미노산 86 내지 아미노산 322의 아미노산을 포함하는, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, Notch 1 내지 α/β 절단 부위의 영역이 결실되고, Notch 1 내지 α/β 절단 부위의 영역은 서열번호 1에 관하여 아미노산 438 내지 아미노산 928의 아미노산을 포함하는, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제3항에 있어서, Notch 1 내지 α/β 절단 부위의 결실이 서열번호 1에 관하여 아미노산 928을 넘어 연장되지 않는, 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛.
7. 제1항의 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
8. 제7항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
9. 제8항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 단리된 숙주 세포.
10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 단리된 숙주 세포.
11. 제8항에 있어서, 상기 숙주 세포는 고수준의 관심 단백질을 생산하도록 조작된, 단리된 숙주 세포.
12. 제8항의 단리된 숙주 세포에서 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛을 발현시키는 단계를 포함하는, 관심 단백질의 올리고당 인산화를 증가시키는 방법.
13. 제8항의 단리된 숙주 세포에서 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛을 발현시키는 단계를 포함하는, 세포 표면 만노스 6-인산염(Man-6-P) 수용체에 대한 관심 단백질의 결합을 증가시키는 방법.
14. 제8항의 단리된 숙주 세포에서 변형 GlcNAc-1-PT α/β 서브유닛 및 관심 리소좀 효소를 공동발현시키는 단계를 포함하는, 리소좀 효소들의 인산화를 향상시키는 방법.
15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 관심 단백질은 리소좀 단백질인, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 관심 리소좀 단백질은 β-글루코세브로시다제(GBA), 카텝신 D(CathD), C2형 니만 피크병(NPC2), β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA), β-만노시다제(MANBA), 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, 산 α-글루코시다제(GAA) 및 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 관심 단백질은 비-리소좀 단백질인, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 비-리소좀 단백질은 DNase1, 레닌(Renin), 백혈병 저해 인자(LIF), 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 2(PoFUT2), 글리코펩시노겐(GP) 및 폰빌레브란트 인자 A1A2A3 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
19. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 관심 단백질은 폼페병 효소(산 α-글루코시다제, GAA) 및 알파-만노사이드축적증 효소(리소좀 산 α-만노시다제, LAMAN)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
20. 제14항에 있어서, 상기 관심 리소좀 단백질은 β-글루코세브로시다제(GBA), 카텝신 D(CathD), C2형 니만 피크병(NPC2), β-헥소사미니다제(HEXB), α-갈락토시다제(GLA), β-만노시다제(MANBA), 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 아릴설파타제 B, 산 α-글루코시다제(GAA) 및 리소좀 산 α-만노시다제(LAMAN)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
21. 삭제
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