JP7037827B2 - 修飾されたGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼを含む組成物及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、National Institutes of Health(NIH)により付与されたCA008759に基づく政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本出願は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、2016年9月30日に出願された米国特許仮出願第62/402,468号に基づく利益を主張するものである。
[項1]
配列番号1の配列を有する全長ヒトGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを基準にしてアミノ酸の内部欠失を含む、修飾されたGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)α/βサブユニットであって、配列番号1が、N末端からC末端の順に、スペーサー1ドメイン(スペーサー1)、Notch1ドメイン(Notch1)、Notch2ドメイン(Notch2)、スペーサー2ドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質相互作用ドメイン(DMAP)、スペーサー3ドメイン(スペーサー3)、α/βサブユニット切断部位、及びスペーサー4ドメイン(スペーサー4)を含み、前記スペーサー1が内部欠失している、前記修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項2]
配列番号1を基準にしてアミノ酸86とアミノ酸322との間のアミノ酸が欠失している、上記項1に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項3]
Notch1と前記α/β切断部位との間の領域が欠失している、上記項1に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項4]
配列番号1を基準にしてアミノ酸438とアミノ酸928との間のアミノ酸が欠失している、上記項1に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項5]
スペーサー1が欠失しており、Notch1と前記α/β切断部位との間の領域が欠失している、上記項1に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項6]
配列番号1を基準にしてアミノ酸86とアミノ酸322との間のアミノ酸が欠失しており、アミノ酸438とアミノ酸928との間のアミノ酸が欠失している、上記項1に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項7]
Notch1と前記α/β切断部位との間の前記欠失が、配列番号1を基準にしてアミノ酸928を超えて伸長しない、上記項4~6に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
[項8]
上記項1~7のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項9]
上記項8に記載のベクターを含む宿主細胞。
[項10]
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、上記項9に記載の宿主細胞。
[項11]
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、上記項9に記載の宿主細胞。
[項12]
前記宿主細胞が、目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている、上記項9~11のいずれかに記載の宿主細胞。
[項13]
前記目的のタンパク質がリソソームタンパク質である、上記項12に記載の宿主細胞。
[項14]
前記リソソームタンパク質が、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)からなる群から選択される、上記項13に記載の宿主細胞。
[項15]
前記目的のタンパク質が非リソソームタンパク質である、上記項12に記載の宿主細胞。
[項16]
前記非リソソームタンパク質が、DNase1、レニン、白血病抑制因子(LIF)、タンパク質O-フコシルトランスフェラーゼ2(PoFUT2)、グリコペプシノゲン(GP)、及びフォンウィルブランド因子A1A2A3ドメインからなる群から選択される、上記項15に記載の宿主細胞。
[項17]
前記目的のタンパク質が、ポンペ病酵素(酸性α-グルコシダーゼ、GAA)及びアルファマンノシドーシス酵素(リソソーム酸性α-マンノシダーゼ、LAMAN)からなる群から選択される、上記項13に記載の宿主細胞。
[項18]
細胞において、外来性の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを発現させることを含む、目的のタンパク質のオリゴ糖リン酸化を増加させる方法。
[項19]
細胞において、修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを発現させることを含む、細胞表面マンノース6-リン酸受容体(Man-6-P)に対する目的のタンパク質の結合を増加させる方法。
[項20]
前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、上記項18または19に記載の方法。
[項21]
前記細胞が、前記目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている、上記項18~20のいずれかに記載の方法。
[項22]
前記目的のタンパク質がリソソームタンパク質である、上記項21に記載の方法。
[項23]
前記リソソームタンパク質が、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)からなる群から選択される、上記項22に記載の方法。
[項24]
前記目的のタンパク質が非リソソームタンパク質である、上記項21に記載の方法。
[項25]
前記非リソソームタンパク質が、DNase1、レニン、白血病抑制因子(LIF)、タンパク質O-フコシルトランスフェラーゼ2(PoFUT2)、グリコペプシノゲン(GP)、及びフォンウィルブランド因子A1A2A3ドメインからなる群から選択される、上記項24に記載の方法。
[項26]
前記目的のタンパク質が、ポンペ病酵素(酸性α-グルコシダーゼ、GAA)及びアルファマンノシドーシス酵素(リソソーム酸性α-マンノシダーゼ、LAMAN)からなる群から選択される、上記項21に記載の方法。
[項27]
前記GlcNAc-1-PTα/βサブユニットがマンノース-6-リン酸(Man-6-P)タグを糖タンパク質上に生成することを条件として、前記ポリペプチドが配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を含む、上記項19~26のいずれかに記載の方法。
[項28]
前記GlcNAc-1-PTα/βサブユニットが配列番号1を含み、配列番号1が、N末端からC末端の順に、スペーサー1ドメイン(スペーサー1)、Notch1ドメイン(Notch1)、Notch2ドメイン(Notch2)、スペーサー2ドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質相互作用ドメイン(DMAP)、スペーサー3ドメイン(スペーサー3)、α/βサブユニット切断部位、及びスペーサー4ドメイン(スペーサー4)を含む、上記項19~26のいずれかに記載の方法。
[項29]
前記スペーサー1が内部欠失している、上記項28に記載の方法。
[項30]
配列番号1を基準にしてアミノ酸86とアミノ酸322との間のアミノ酸が欠失している、上記項28に記載の方法。
[項31]
Notch1と前記α/β切断部位との間の領域が欠失している、上記項28に記載の方法。
[項32]
配列番号1を基準にしてアミノ酸438とアミノ酸928との間のアミノ酸が欠失している、上記項28に記載の方法。
[項33]
スペーサー1が欠失しており、Notch1と前記α/β切断部位との間の領域が欠失している、上記項28に記載の方法。
[項34]
配列番号1を基準にしてアミノ酸86とアミノ酸322との間のアミノ酸が欠失しており、アミノ酸438とアミノ酸928との間のアミノ酸が欠失している、上記項28に記載の方法。
[項35]
Notch1と前記α/β切断部位との間の前記欠失が、配列番号1を基準にしてアミノ酸928を超えて伸長しない、上記項31~34のいずれかに記載の方法。
[項36]
2つのMan-6-P残基を含むグリカンの量が、GlcNAc-1-PTα/βサブユニットと比べて増加する、上記項28~35のいずれかに記載の方法。
[項37]
上記項1~7のいずれかに記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βを目的のリソソーム酵素と共発現させることを含む、リソソーム酵素のリン酸化を増強させる方法。
[項38]
前記目的のリソソーム酵素が、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)からなる群から選択される、上記項37に記載の方法。
本出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも1つ含む。カラー図面(複数可)を含む本特許出願公報のコピーは、要請及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁より提供される。
ある態様において、本開示は、GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)α/βサブユニットを含む単離されたポリペプチドを提供する。別の態様では、本開示は、少なくとも1つのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)α/βサブユニットを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。更に別の態様では、本開示は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)α/βサブユニットを含む、ベクターを提供する。なおも更に別の態様では、本開示は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)α/βサブユニットを含む、宿主細胞を提供する。
ある態様において、本開示は、GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)を提供する。本明細書で使用される場合、「GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ」という用語には、野生型GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ、変異体GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ、GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼの機能的ホモログ、及びそれらの断片が含まれる。GlcNAc-1-PTは、2つの遺伝子によってコードされるα2β2γ2六量体タンパク質である。より小さなγサブユニットは、GNPTG遺伝子によってコードされ、一方でαサブユニット及びβサブユニットは、GNPTAB遺伝子によって単一のα/β前駆体としてコードされる。ゴルジ内のサイト1プロテアーゼ(S1P)により、ヒトα/β前駆体のK928におけるタンパク質分解切断が媒介され、この切断は、このタンパク質の触媒能力に必須である。GlcNAc-1-PTは、リソソーム酸性ヒドロラーゼのコンフォメーション依存性タンパク質決定基に特異的に結合し、このヒドロラーゼの高マンノース型N-結合型グリカン上のマンノース残基に対するUDP-GlcNAcからのGlcNAc-1-Pの輸送を触媒することにより、Man-6-Pタグの生成において最初で最も重要なステップを行う。したがって、本開示のGlcNAc-1-PTは、機能的ホモログまたは断片を含め、Man-6-Pタグを生成する。ある特定の実施形態では、本開示のGlcNAc-1-Pは、α/βサブユニットを含む。全長ヒトα/βGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼアミノ酸配列の配列情報は、例えば、GenBank受入番号CAJ30014.1を使用して入手することができる。全長ヒトα/βGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼmRNA配列の配列情報は、例えば、GenBank受入番号AM085438.1を使用して入手することができる。ある特定の実施形態では、本開示のα/βGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼは、配列番号1(MLFKLLQRQT YTCLSHRYGL YVCFLGVVVT IVSAFQFGEV VLEWSRDQYH VLFDSYRDNI AGKSFQNRLC LPMPIDVVYT WVNGTDLELL KELQQVREQM EEEQKAMREI LGKNTTEPTK KSEKQLECLL THCIKVPMLV LDPALPANIT LKDLPSLYPS FHSASDIFNV AKPKNPSTNV SVVVFDSTKD VEDAHSGLLK GNSRQTVWRG YLTTDKEVPG LVLMQDLAFL SGFPPTFKET NQLKTKLPEN LSSKVKLLQL YSEASVALLK LNNPKDFQEL NKQTKKNMTI DGKELTISPA YLLWDLSAIS QSKQDEDISA SRFEDNEELR YSLRSIERHA PWVRNIFIVT NGQIPSWLNL DNPRVTIVTH QDVFRNLSHL PTFSSPAIES HIHRIEGLSQ KFIYLNDDVM FGKDVWPDDF YSHSKGQKVY LTWPVPNCAE GCPGSWIKDG YCDKACNNSA CDWDGGDCSG NSGGSRYIAG GGGTGSIGVG QPWQFGGGIN SVSYCNQGCA NSWLADKFCD QACNVLSCGF DAGDCGQDHF HELYKVILLP NQTHYIIPKG ECLPYFSFAE VAKRGVEGAY SDNPIIRHAS IANKWKTIHL IMHSGMNATT IHFNLTFQNT NDEEFKMQIT VEVDTREGPK LNSTAQKGYE NLVSPITLLP EAEILFEDIP KEKRFPKFKR HDVNSTRRAQ EEVKIPLVNI SLLPKDAQLS LNTLDLQLEH GDITLKGYNL SKSALLRSFL MNSQHAKIKN QAIITDETND SLVAPQEKQV HKSILPNSLG VSERLQRLTF PAVSVKVNGH DQGQNPPLDL ETTARFRVET HTQKTIGGNV TKEKPPSLIV PLESQMTKEK KITGKEKENS RMEENAENHI GVTEVLLGRK LQHYTDSYLG FLPWEKKKYF QDLLDEEESL KTQLAYFTDS KNTGRQLKDT FADSLRYVNK ILNSKFGFTS RKVPAHMPHM IDRIVMQELQ DMFPEEFDKT SFHKVRHSED MQFAFSYFYY LMSAVQPLNI SQVFDEVDTD QSGVLSDREI RTLATRIHEL PLSLQDLTGL EHMLINCSKM LPADITQLNN IPPTQESYYD PNLPPVTKSL VTNCKPVTDK IHKAYKDKNK YRFEIMGEEE IAFKMIRTNV SHVVGQLDDI RKNPRKFVCL NDNIDHNHKD AQTVKAVLRD FYESMFPIPS QFELPREYRN RFLHMHELQE WRAYRDKLKF WTHCVLATLI MFTIFSFFAE QLIALKRKIF PRRRIHKEAS PNRIRV)に記載の配列を含む。他の実施形態では、本開示のGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼは、GlcNAc-1-PTと同じ機能活性を有することを条件として、配列番号1に対して約80%の同一性を有し得る。例えば、本開示のGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼは、GlcNAc-1-PTと同じ機能活性を有することを条件として、配列番号1に対して約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%の同一性を有し得る。
ある態様において、本開示は、酵素構築物を提供する。本開示のある酵素構築物は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列である。本明細書で使用される場合、「本開示のポリヌクレオチド配列」及び「酵素構築物」という用語は交換可能である。本開示は、酵素構築物によってコードされる単離されたポリペプチド、酵素構築物を含むベクター、及び該ベクターを含む単離細胞も提供する。
本開示のある酵素構築物は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットを含む、ポリヌクレオチド配列である。別の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットを含み、スペーサー1が欠失している、ポリヌクレオチド配列である。更に別の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットを含み、Notch1とα/β切断部位との間の領域が欠失している、ポリヌクレオチド配列である。なおも更に別の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットを含み、スペーサー1が欠失しており、Notch1とα/β切断部位との間の領域が欠失している、ポリヌクレオチド配列である。異なる実施形態では、酵素構築物は、少なくとも2つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列である。
別の態様では、本開示は、本開示の酵素構築物を含むベクターを提供する。本明細書で使用される場合、ベクターは、遺伝子材料を輸送するためのビヒクルとして使用される核酸分子と定義される。ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、転位因子、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス)、及び人工染色体(例えば、YAC)、例えばレトロウイルスベクター(例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNVなどに由来するもの)、レンチウイルスベクター(例えば、HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIVなどに由来するもの)、アデノウイルス(Ad)ベクター(その複製可能形態、複製欠損形態、及びガットレス(gutless)形態を含む)、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、サルウイルス40(SV-40)ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の態様において、本開示のポリヌクレオチド配列の発現は調節され得る。かかる調節により、酵素構築物がいつどこで機能するかの制御が可能になり得る。
別の態様では、本開示は、本開示のベクターを含む宿主細胞を提供する。この細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。適切な細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本開示による宿主細胞は、実質的に純粋な培養物においてインビトロで維持される細胞(すなわち単離された細胞)である。本開示のベクターを含む宿主細胞は、タンパク質発現、また場合により精製のために使用され得る。タンパク質を発現させ、場合により、宿主から発現されたタンパク質を精製するための方法は、当技術分野において標準的である。
別の態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチド配列によってコードされる1つ以上の単離されたポリペプチド(複数可)を提供する。本開示のポリヌクレオチド配列は、セクションI(b)iに詳細に記述されており、参照により本セクションに組み込まれている。本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを産生した細胞から部分的または完全に精製されたポリペプチドを指す。本開示の単離されたポリペプチドは、当技術分野で公知の分子生物学的方法を使用して産生され得る。大まかに言うと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞に導入された場合にポリペプチドを発現することのできるベクターに挿入される。適切なベクター及び宿主細胞については、それぞれセクションI(b)iii及びセクションI(b)ivに記述されている。ポリペプチドが発現されたら、一般的な精製方法を使用してこれを細胞から得ることができる。例えば、ポリペプチドが分泌シグナルを有する場合、発現されたポリペプチドを細胞培養上清から単離することができる。あるいは、分泌シグナルを欠いているポリペプチドは、封入体及び/または細胞抽出物から精製することができる。本開示のポリペプチドは、例えば、クロマトグラフィ(例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインA後の特定の抗原に対する親和性によるもの、及びサイズカラムクロマトグラフィ)、遠心分離、溶解度差、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術(例えば、Scopes,“Protein Purification”,Springer Verlag,N.Y.(1982)を参照されたい)を含む、当業者に公知の任意の方法を使用して、培養上清、封入体、または細胞抽出物から単離することができる。ポリペプチドの単離は、ポリペプチドが本明細書に記述されている親和性タグまたは精製タグを含む場合、大いに促進される。
ある態様において、本開示は、細胞において、外来性GlcNAc-1-PTを発現させることを含む、目的のタンパク質のオリゴ糖リン酸化を増加させる方法を提供する。外来性GlcNAc-1-PTは、セクションI(a)に記述した通りであり得る。細胞は、セクションI(b)ivに記述した通りの宿主細胞であり得る。特定すると、細胞はCHO細胞である。リン酸化の量は、内在性GlcNAc-1-PTのみの存在下におけるリン酸化と比べて1%超増加し得る。更に、リン酸化の量は、内在性GlcNAc-1-PTのみの存在下におけるリン酸化と比べて2%超、3%超、4%超、5%超、10%超、15%超、20%超、25%超、30%超、35%超、40%超、45%超、50%超、55%超、60%超、65%超、70%超、または75%超増加し得る。特定すると、外来性GlcNAc-1-PTがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットである場合、リン酸化の量は、内在性GlcNAc-1-PTのみの存在下におけるリン酸化と比べて2%超、3%超、4%超、5%超、10%超、15%超、20%超、または25%超増加し得る。更に、外来性GlcNAc-1-PTがGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットであり、スペーサー1が欠失しており、Notch1とα/β切断部位との間の領域が欠失している場合、リン酸化の量は、内在性GlcNAc-1-PTのみの存在下におけるリン酸化と比べて5%超、10%超、15%超、20%超、25%超、30%超、35%超、40%超、45%超、50%超、55%超、60%超、65%超、70%超、または75%超増加し得る。更に、本方法は、2つのMan-6-P残基を含むグリカンの含有量を増加させ得る。例えば、スペーサー1が欠失しており、Notch1とα/β切断部位との間の領域が欠失しているGlcNAc-1-PTα/βサブユニットは、2つのMan-6-P残基を含むグリカンの含有量を、野生型GlcNAc-1-PTα/βサブユニットと比べて約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、または約25%増加させる。目的のタンパク質は、マンノース-6-リン酸(Man-6-P)でタグ付けすることにより役立つタンパク質である。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質はリソソームタンパク質である。リソソームタンパク質の非限定的な例としては、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)が挙げられる。特定すると、リソソームタンパク質は、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)またはリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)である。他の実施形態では、目的のタンパク質は非リソソームタンパク質である。非リソソームタンパク質の非限定的な例としては、DNase1、レニン、白血病抑制因子(LIF)、タンパク質O-フコシルトランスフェラーゼ2(PoFUT2)、グリコペプシノゲン(GP)、及びフォンウィルブランド因子A1A2A3ドメインが挙げられる。
細胞内の飲食された物質を効率的に分解するリソソームの能力は、60種程度の可溶性酸性ヒドロラーゼがこの小器官に適切に輸送されることに依存する。高等真核生物において、この選別プロセスは、マンノース6-リン酸(Man-6-P)認識系によって媒介される。新しく合成された酸性ヒドロラーゼは、シスゴルジにおいてMan-6-P残基を獲得し、この残基が、トランスゴルジ網におけるMan-6-P受容体(MPR)への結合、及びその後のエンドリソソーム系への輸送のための高親和性リガンドとしての役割を果たす(1)。シスゴルジ酵素UDP-GlcNAc:リソソーム酵素N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)は、リソソーム酸性ヒドロラーゼのコンフォメーション依存性タンパク質決定基に特異的に結合し、このヒドロラーゼの高マンノース型N-結合型グリカン上のマンノース残基に対するUDP-GlcNAcからのGlcNAc-1-Pの輸送を触媒することにより、Man-6-Pタグの生成において最初で最も重要なステップを行う(2)。同一のN-結合型グリカンを有する分泌性糖タンパク質は、分泌経路を通過する際にMan-6-Pタグを獲得しない。我々の研究室による過去の研究は、GlcNAc-1-PTの2つのNotchモジュール及びDNAメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質(DMAP)相互作用ドメインが、リソソーム酸性ヒドロラーゼにあるタンパク質決定基を特異的に認識し、結果としてそれらの高マンノースオリゴ糖をリン酸化させる役割を示した(3)。非リソソームN-グリコシル化タンパク質がこのプロセスから除外され、誤ってリソソームを標的とすることが防止される理由はおそらく、かかる決定基の欠如である。
GlcNAc-1-PTのα/βサブユニットのスペーサー1ドメインの機能を解析するため、まず、ヒト及びD.discoideumのGlcNAc-1-PTタンパク質配列、ならびに細菌のN-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼ配列の間でアライメントを行った。図6に示したように、ヒトのスペーサー1配列は、配列データが入手可能である全ての哺乳動物GlcNAc-1-PTスペーサー1領域と同様に、D.discoideum及び細菌タンパク質のものよりも200aa長い。このことは、哺乳動物のスペーサー1領域が、D.discoideumのスペーサー1配列には関連付けられない特有の役割を果たし得ることを示唆した。よって、236aaのヒトスペーサー1配列をDNAレベルにおいてD.discoideum配列の29aaに置き換え、結果として得られた構築物(図1A、DS1)を、CRISPR/Cas9法(3)により生成されたGNPTAB-/-HeLa細胞にトランスフェクトした。WT及びDS1変異体を発現する全細胞抽出物のウェスタンブロット解析を行うことで、ヒトスペーサー1のD.discoideum配列への置き換えにより変異体タンパク質の効率的なフォールディングが起こり、それが小胞体(ER)から出て、α/β前駆体がα及びβのサブユニットに切断されるシスゴルジに至ったかどうかを判定した。図1B及び図1Cに示したように、変異体タンパク質は実際に良好に発現され、ERを出て、単糖αMMに対するWT触媒活性の60%を呈する。しかしながら、タンパク質分解切断のβサブユニット産物の大部分は、WTのβサブユニットよりもゆっくりとSDS-PAGEゲル上を泳動し(図1B、矢印)、K928で切断されるWTタンパク質に対して、DS1変異体のほとんどが代替的部位で切断されていることが示された(図1B、*)。DS1では、小量の正常なβサブユニットも見られた(図1B及び図1D、長時間曝露、*)。このことから、スペーサー1の除去から生じる代替的な切断が、WTα/β前駆体をK928で切断するS1Pと同じプロテアーゼに起因するのか、または異なるプロテアーゼが関与し得るのかに関する疑問が生じた。我々はこの問題に対処するため、S1Pの阻害剤であるアミノピロリジンアミドPF-429242(9)で細胞を処置した。この阻害剤の存在は、WTのGlcNAc-1-PT及びDS1変異体の両方においてβサブユニット形成の喪失をもたらし(図1D)、代替的部位における切断がS1Pによって媒介されていることを示した。これが事実であれば、元の切断部位のN末端側に更なるコンセンサスS1P切断部位が存在するはずである。GlcNAc-1-PTα/βアミノ酸配列の調査により、コンセンサスの主要なアルギニン残基R879がインバリアントな-4位に存在することから、これが真実であることが明らかになり、切断はQ882で起こると仮定された(図1E)(10)。Q882における切断は、DS1で見られるβサブユニットの分子質量の増加と一致している。R925の変異は、K928におけるWTのGlcNAc-1-PTの切断を消失させる(図1F、レーン2)。その一方で、R879の変異は、K928における全長α/β前駆体の正常なプロセシングには影響を与えなかったが(図1F、レーン3)、よりゆっくりと泳動するβサブユニットの喪失(図1F、レーン6)によって示されるように、DS1変異体のQ882における切断を消失させた。この場合、微量のK928切断βは影響を受けなかった(図1F、レーン6、長時間曝露)。R925及びR879両方の変異は、β形成の完全な喪失をもたらした(図1F、レーン7)。これらのデータは、スペーサー1の非存在下を除いては稀にしか利用されないGlcNAc-1-PTにおける新規のS1P切断部位としてQ882を明らかに特定するものである(図7)。
ゴルジ内の残基K928におけるGlcNAc-1-PTα/β前駆体のタンパク質分解プロセシングは、触媒活性酵素に不可欠である(5、11)。α/βには2つのS1P切断部位があるため、K928ではなく新たな部位における切断も活性酵素をもたらすかどうかという疑問が提起される。この疑問に対処するため、図1Fに示した点変異体のαMMに対する活性(図1C)及びいくつかのリソソーム酵素に対する活性(図1G)を、WTのGlcNAc-1-PTα/β前駆体及びDS1変異体の両方との関連において試験した。種々の構築物をGNPTAB-/-HeLa細胞において発現させ、トランスフェクションの48時間後、細胞抽出物を調製し、それぞれのアリコートを取ってαMM活性アッセイを行った(図1C)。固定化されたカチオン非依存性(CI)-MPRを含むビーズとともに残りの抽出物をインキュベートし、リン酸化されたリソソーム酵素に結合させた。ビーズを洗浄し、3種のリソソーム酵素の結合度について「方法」に記述したようにアッセイした(図1G)。図1C及び図1Gに示したように、WTα/β前駆体との関連におけるR925A変異体は、α/β前駆体の切断が活性に不可欠であるという有力な仮説と一致して、αMM及びリソソーム酵素のいずれに対してもバックグラウンド活性しか有しなかった。その一方でR879A/WTは、WTα/β前駆体と比較して、αMMに対する活性の30%、及び3種のリソソーム酵素に対する活性の110~125%を呈した。これらの点変異を個別にまたはDS1バックグラウンドと併せて試験したとき、種々の変異体は依然としてWTのαMM活性の20~30%を保持していた(図1C)。タンパク質分解プロセシングを一切受けないR925A/R879A/DS1変異体が、αMMに対する相当な活性(図1C)及びリソソーム酵素に対する低レベルの活性(図1G)を保持したという事実は、スペーサー1の非存在下において切断されていないα/βが部分的に活性であることを示す。全ての変異体がWTと同一のゴルジ局在化を提示した(図10)。これらの結果は、DS1に関連するリソソーム酵素に対する触媒活性が、K928における切断から生じる小量のβと、α/β前駆体が寄与する活性の組み合わせに起因し、Q882において切断される主な形態のβが不活性であることを示す。
WTもしくはDS1変異体の構築物、またはベクター単独をトランスフェクトしたGNPTAB-/-HeLa細胞における、可溶性糖タンパク質の全マンノースリン酸化を定量した。トランスフェクションの48時間後、[2-3H]マンノースで細胞を2時間標識してから採取し、界面活性剤不含バッファー中で洗浄し溶解させた後、超遠心分離により膜タンパク質を可溶性画分から分離させた。次に、「方法」において記述したように、固定化されたCI-MPRとともに可溶性画分をインキュベートしてMan-6-P修飾タンパク質を特異的に結合させてから、[2-3H]マンノース標識糖タンパク質の含有量についてそれらを解析した。驚くべきことに、ベクター単独の値を差し引いた後、DS1変異体は、WT構築物と比較して、全可溶性糖タンパク質のリン酸化レベルのわずかだが統計的に有意な上昇を一貫してもたらした(図2A)。WTまたはDS1のいずれかによるリソソームタンパク質GalA、カテプシンD(CathD)、及びニーマン・ピック病C2型(NPC2)のリン酸化の度合いも、「方法」に記述した[2-3H]マンノース標識、免疫沈降、及び直接的なグリカンの解析を使用して測定した。個々の酵素の発現ベクターと併せてWTまたはDS1構築物のいずれがGNPTAB-/-HeLa細胞にコトランスフェクトされたかにかかわらず、3種全てのリソソーム酵素が同様のリン酸化度を示した(図2B、左パネル、WT値が1.0に設定されている)。これらの所見をまとめると、DS1による全リン酸化において観察された増加が、リソソームタンパク質に加えて非リソソーム糖タンパク質のリン酸化に起因したという可能性が高まった。これが事実であるかどうかを判定するために、非リソソーム糖タンパク質のDNase1、レニン、白血病抑制因子(LIF)、及びタンパク質O-フコシルトランスフェラーゼ2(PoFUT2)の各cDNAをWTα/β前駆体またはDS1変異体cDNAのいずれかと併せてコトランスフェクトし、リン酸化度を[2-3H]マンノース標識によって定量化した。これらの糖タンパク質は本質的にリソソームタンパク質ではないが、低レベルのMan-6-Pタグを獲得することが知られているため(12~15)、これらを解析のために選択した。4つの場合全てにおいて、DS1によって媒介されるマンノースリン酸化の程度は、WT構築物を用いて達成されたものよりも1.5~2倍高かった(図2B、右パネル)。これと一致して、レニン及びNPC2のcDNAをDS1とコトランスフェクトしたとき、レニンは、WTα/β前駆体と比べて固定化されたCI-MPRに対する結合の増加を提示したが、NPC2はこの結合の増加を提示しなかった(図2C)。グリコペプシノゲン(GP)も、膜糖タンパク質のLamp1及びLamp2のいずれも、これらの条件下では結合を一切示さなかった(図2C)。これらの結果は、スペーサー1の非存在下では、非リソソーム基質のサブセットのうちの修飾されたα/βサブユニットによって媒介されるリン酸化が増加することを示す。これらのデータをまとめると、スペーサー1は、GlcNAc-1-PTα/β前駆体の切断がほぼK928でのみ起こることを決定付け、かついくつかの非リソソーム糖タンパク質のリン酸化を最小限に抑えるように機能することが示される。
αサブユニットのDMAP相互作用ドメインと併せて2つのNotchリピートがリソソーム酵素の選択的認識を媒介することは、これまでに示された(図3A、WTα/β)。この領域の欠失(図3A、N1-D)は、[2-3H]マンノース標識によって定量される全可溶性糖タンパク質のリン酸化を劇的に低減させた(図3B)。GlcNAc-1-PTによってリン酸化されるタンパク質の大部分が事実上リソソームタンパク質であることを考えると、N1-D領域の非存在下におけるこの結果は驚くべきものではない。したがって、固定化されたCI-MPRに結合する能力によって測定される、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、及びβ-マンノシダーゼ(MANBA)のリン酸化は、ほぼ完全に抑止された(図3C)。スペーサー1が阻害性ドメインとして機能するという所見を踏まえ、N1-Dと組み合わせてスペーサー1を欠失させれば(図3A、S1-D)、2つのNotchモジュール及びDMAP相互作用ドメインを欠いているGlcNAc-1-PTがリソソーム酵素をリン酸化できないことが部分的に克服され得ると仮定した。この予想は、N1-Dと比べてS1-D変異体により媒介される全可溶性タンパク質のリン酸化のわずかだが統計的に有意な増加(図3B、N1-D対S1-Dの比較)、ならびにHEXB、GLA、及びMANBAのリン酸化のわずかな増加(それぞれWT値の14%、13%、及び5%)(図3C)を示す結果によって証明された。単糖αMMに対するN1-D及びS1-D変異体の活性は同様であるため(図3E、N1-D対S1-D)、S1-D欠失変異体によって媒介されるリソソーム酵素リン酸化のこうした増加は、スペーサー1の阻害機能の喪失によって最もよく説明される。
GlcNAc-1-PTのNotchモジュール及びDMAP相互作用ドメインは、リソソームタンパク質の選択的認識及びそれらのN-結合型グリカンのリン酸化において必須の役割を有する(3、16)。分泌経路を通過する数多くの他の糖タンパク質は、リン酸化されないか、または低レベルのMan-6-Pタグしか獲得しないかのいずれかである、極めて類似または同一のN-結合型グリカンを提示する(17)。この観察に関する有力な説明は、非リソソームタンパク質は、リソソームタンパク質とは異なり、GlcNAc-1-PTのNotchモジュール及び/またはDMAP相互作用ドメインによって認識され結合される構造決定基を欠いているというものである。よって、タンパク質に高マンノースオリゴ糖が存在するというだけでは、GlcNAc-1-PTがグリカンをインビボでリン酸化させるには不十分である。インビトロでは、GlcNAc-1-PTは単糖αMMをリン酸化させることができるが、この基質に対するこの酵素のKmはリソソーム酵素のそれを優に3桁上回り、リソソームタンパク質にあるGlcNAc-1-PTに対するタンパク質ドッキング部位の主要な役割を示している(18)。この研究の主要な所見は、GlcNAc-1-PTは、リソソームタンパク質を特異的に認識しリン酸化することに加えて、非リソソームタンパク質のリン酸化を防止する役割を果たすエレメント(スペーサー1)を含むというものである。これは、スペーサー1ドメインに割り当てられた第1の機能である。ヒトGlcNAc-1-PTのスペーサー1は236aa長であり、脊椎動物種間で高度に保存されている。これは、単に「スペーサー」として機能する以外の役割と一致して(19)、明確な構造(PDB ID:2N6D)を有する。その一方で、下等真核生物であるD.discoideumのスペーサー1領域は、N.meningitidisの細菌性N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼのそれと長さが同様であり(図6)、ヒト配列と同じように機能する可能性は極めて低い。ヒトとD.discoideumとのスペーサー1配列間にアミノ酸レベルで有意な同一性は存在しない。隣接するステルス1&2ドメインはこれら2つの種の間で酷似しているため、ヒトGlcNAc-1-PTは、ヒト配列のD.discoideum配列との置換を許容する可能性がある。GNPTAB-/-HeLa細胞においてこのキメラを発現させると、DS1はちょうどWT酵素のようにERにおいて効率的にフォールディングされシスゴルジに輸送されたものの、後者の区画では差次的にタンパク質分解プロセシングされたという、予想外の結果がもたらされた。この代替的な切断を媒介したのはS1Pであったということが、S1P阻害剤PF-429242の使用によって確認された。GlcNAc-1-PT患者変異を解析する近年の研究においてVelhoらは、残基Y937~M972のインフレーム欠失が、αサブユニット内の代替的な上流部位におけるS1Pによるα/β前駆体の切断をもたらしたことを報告したが、この研究ではこの新たな部位は特定されなかった(20)。代替的切断部位としてのQ882の特定は、DS1で見られるβ-サブユニットのより高い分子質量と一致している。S1Pがスペーサー1の非存在下でαサブユニット内のK928ではなくQ882で切断する理由は、現時点では不明である。残基937~972の欠失も新たな部位における切断をもたらしたという所見を踏まえると、1つの可能性は、スペーサー1がスペーサー3の一部の領域(aa819~955、図1)と相互作用することにより、S1Pが切断される場所に影響が及ぶというものである。スペーサー1の非存在下でのS1Pによる新たな部位の使用についての代替的な説明は、通常はこのドメインによってもたらされるQ882での切断を妨げる立体障害がもはや存在しないことから、小量の前駆体はK928でも切断されるものの、S1Pが主にQ882で切断できるようになるというものである。興味深いことに、WTのGlcNAc-1-PTは、Q882におけるタンパク質分解プロセシングの結果として、微量の触媒不活性酵素をもたらすことが分かった。これらの結果により、脊椎動物のGlcNAc-1-PTが、K928における切断を促進し、その触媒効率を最大にするためにスペーサー1を獲得したという可能性が高まる。
細胞株 - GNPTAB-/-HeLa細胞株については、他所で詳細に記述されている(3)。0.11g/Lのピルビン酸ナトリウム及び4.5g/Lのグルコースを含み、10%(vol/vol)のFBS(Atlanta Biologicals)、100,000U/Lのペニシリン、100mg/Lのストレプトマイシン(Life Technologies)、及び2mMのL-グルタミン(Life Technologies)を補充したDMEM(Life Technologies)において、細胞を維持した。
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酵素補充療法(ERT)は現在、いくつかのリソソーム蓄積症のための主要な処置形態であるが、その効力は個々の障害において異なる[1]。これらの遺伝性障害のほとんどは、単一のリソソーム酵素の活性不足により、この酵素によって通常分解される物質が蓄積することに起因する。リソソーム内の蓄積物質が増えると、やがて細胞及び臓器の機能不全が生じる。ERTの目的は、欠損細胞のリソソームに十分な量の正常な酵素を導入して蓄積物質を排出し、リソソーム機能を回復させることである。この形態の療法が初めて使用されたのは、酸性β-グルコセレブロシダーゼ活性が欠如しており、主にマクロファージ系細胞にグルコシルセラミドが蓄積する、1型ゴーシェ病患者においてであった[2]。末端マンノース残基を含むN-結合型グリカンを含有する補充酵素が静脈内に注入され、細胞表面マンノース受容体を介してマクロファージに取り込まれる。飲食された酵素は次にエンドソームによってリソソームに輸送され、ここで酵素が機能することでこの障害の良好な臨床結果が得られる[3]。
細胞株 - Expi293F細胞は、Life Technologiesによるものである。これらの細胞は、Expi293発現培地(Life Technologies)に懸濁して増殖させた。GNPTAB-/-HeLa細胞株については、他所で詳細に記述されている[8]。0.11g/Lのピルビン酸ナトリウム及び4.5g/Lのグルコースを含み、10%(vol/vol)のFBS(Atlanta Biologicals)、100,000U/Lのペニシリン、100mg/Lのストレプトマイシン(Life Technologies)、及び2mMのL-グルタミン(Life Technologies)を補充したDMEM(Life Technologies)において、親細胞及びGNPTAB-/-HeLa細胞を単層として維持した。CI-MPR陰性マウスL-細胞(D9細胞株)については記述されている[11]。100,000U/Lのペニシリン及び100mg/Lのストレプトマイシン(Life Technologies)を含むα-MEM(Life Technologies)において、D9細胞を単層として維持した。
表1。内在性GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ、または過剰発現したWT酵素、またはS1-S3変異体でリン酸化された、リソソーム酵素の細胞取り込み。取り込み実験は、リン酸化された酵素の取り込みを競合的に阻害するように、Man-6-Pの非存在下で、または5mM Man-6-Pを用いて行った。
表2。リソソーム酵素に存在する1つまたは2つのMan-6-P残基を含む高マンノースグリカンの分布。内在性GlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ、または過剰発現したWTα/β前駆体、またはS1-S3欠失変異体の作用を受けたリソソーム酵素間の、1つまたは2つのMan-6-P残基を含むグリカンの含有量を示すため、図12Cに提示されるデータを更に分析している。
実施例5に関する参考文献。
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Claims (25)
- 配列番号1の配列を有する全長ヒトGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを基準にしてアミノ酸の欠失を含む、修飾されたGlcNAc-1-ホスホトランスフェラーゼ(GlcNAc-1-PT)α/βサブユニットであって、スペーサー1ドメインが欠失しており、前記スペーサー1ドメインが配列番号1のアミノ酸86からアミノ酸322までのアミノ酸を含む、前記修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
- Notch1からα/β切断部位までの領域が欠失しており、前記Notch1からα/β切断部位までの領域が配列番号1のアミノ酸438からアミノ酸928までのアミノ酸を含む、請求項1に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニット。
- 請求項1または2に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項4に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項4に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている、請求項4~6のいずれかに記載の宿主細胞。
- 前記目的のタンパク質がリソソームタンパク質である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記リソソームタンパク質が、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)からなる群から選択される、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記目的のタンパク質が非リソソームタンパク質である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記非リソソームタンパク質が、DNase1、レニン、白血病抑制因子(LIF)、タンパク質O-フコシルトランスフェラーゼ2(PoFUT2)、グリコペプシノゲン(GP)、及びフォンウィルブランド因子A1A2A3ドメインからなる群から選択される、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記目的のタンパク質が、ポンペ病酵素(酸性α-グルコシダーゼ、GAA)及びアルファマンノシドーシス酵素(リソソーム酸性α-マンノシダーゼ、LAMAN)からなる群から選択される、請求項8に記載の宿主細胞。
- 細胞により産生される目的のタンパク質のオリゴ糖リン酸化を増加させる方法であって、目的のタンパク質を産生する細胞において請求項1または2に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを発現させることを含む、方法。
- 細胞により産生される目的のタンパク質の、細胞表面マンノース6-リン酸受容体(Man-6-P)に対する結合能を高める方法であって、目的のタンパク質を産生する細胞において請求項1または2に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを発現させることを含む、方法。
- 前記目的のタンパク質を産生する細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項13または14に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質を産生する細胞が、前記目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている、請求項13~15のいずれかに記載の方法。
- 前記目的のタンパク質がリソソームタンパク質である、請求項13~16のいずれかに記載の方法。
- 前記リソソームタンパク質が、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が非リソソームタンパク質である、請求項13~16のいずれかに記載の方法。
- 前記非リソソームタンパク質が、DNase1、レニン、白血病抑制因子(LIF)、タンパク質O-フコシルトランスフェラーゼ2(PoFUT2)、グリコペプシノゲン(GP)、及びフォンウィルブランド因子A1A2A3ドメインからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、ポンペ病酵素(酸性α-グルコシダーゼ、GAA)及びアルファマンノシドーシス酵素(リソソーム酸性α-マンノシダーゼ、LAMAN)からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質上にマンノース-6-リン酸(Man-6-P)タグが生成される、請求項13~21のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットが、野生型GlcNAc-1-PTα/βサブユニットと比べて、前記目的のタンパク質において2つのMan-6-P残基を含むグリカンの量を増加させる、請求項13~22のいずれかに記載の方法。
- 請求項1または2に記載の修飾されたGlcNAc-1-PTα/βサブユニットを目的のリソソーム酵素と共発現させることを含む、リソソーム酵素のリン酸化を増強させる方法。
- 前記目的のリソソーム酵素が、β-グルコセレブロシダーゼ(GBA)、GalA、カテプシンD(CathD)、ニーマン・ピック病C2型(NPC2)、β-ヘキソサミニダーゼ(HEXB)、α-ガラクトシダーゼ(GLA)、β-マンノシダーゼ(MANBA)、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)、及びリソソーム酸性α-マンノシダーゼ(LAMAN)からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
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