KR102368265B1 - E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 E형 간염바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 E형 간염바이러스 나노겔 백신용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.
본 발명의 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법을 이용하여 제조된 나노겔 백신은 안정적인 우수한 항원 전달 내지 담지능력 및 IL-12 또는 IFN-γ의 수준을 유의적으로 증가시키는 등 면역 부형 효과를 가지므로 E형 간염을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노겔 백신은 국내 분리주의 유전자인 Genotype 3 항원을 활용함으로써 기개발 백신에 비하여 국내 감염 분리주에 대한 높은 방어능을 유도할 수 있다.

Description

E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 {Composition for nanogel vaccine against hepatitis E virus}

본 발명은 E형 간염바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 E형 간염바이러스 나노겔 백신용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.

E형 간염은 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)로 오염된 식수에 의해서 경구로 전파되는 대변-구강 루트(fecal-oral route)를 통해 전염되며 그 유병률은 각 나라의 보건위생 및 경제적 수준과 밀접한 연관이 있다. 이러한 이유에서 인도, 네팔, 미얀마, 파키스탄, 중국 등 아시아 국가와 수단, 소말리아 등 아프리카 국가, 그리고 멕시코 등 라틴 아메리카 국가에서 주로 발병하고 있으며, 그 외 국가에서는 산발적으로 보고되고 있다. 국내뿐만 아니라 선진국에서 발병하는 E형 간염은 동물로부터 전파되거나 혹은 HEV에 오염된 식품 섭취 등을 통해서 발병하고 있다. 따라서 돼지와 같은 운반자(carrier) 동물로부터 사람에게 HEV가 전파되는 것을 차단하기 위해서는 동물과 사람에게 모두 백신을 투여하는 것이 최선의 방역대책이 될 것이다.

HEV는 헤페비리데(Hepeviridae)과에 속하며, 오르도헤페바이러스(Orthohepeveirus) 및 피시헤페바이러스(Piscihepevirus)의 두가지 속이 존재한다. 이는 약 7.2kb 길이의 단일 RNA 가닥으로 되어 있으며, 구체적으로는 (+)-센스 가닥인 RNA 유전자를 갖는다. HEV 유전자는 ORF(open reading frame) 1, 2 및 3 를 포함하는데 ORF1은 폴리단백질(polyprotein)인 비-구조적 복제효소(non-structural replicase)를 암호화한다. ORF2와 ORF3의 암호화 영역은 일부 중첩되는데, ORF2는 캡시드(capsid) 단백질을 암호화하며, ORF3은 HEV 비리온(virion)의 방출에 중요한 다기능 인산단백질(multifunctional phosphoprotein)을 암호화한다. HEV는 감염 이후 30일 내지 60일 내에 혈청에서 검출될 수 있다.

HEV는 다른 간염 바이러스와 달리 감염시 약 2주간 바이러스 혈증(血症; viremina)을 나타내며, 주증상으로 황달 이외에 혈장 빌리루빈 상승, 복통, 식욕부진, 간종대(肝腫大; hepatomegalia), 구토, 발열 등의 증상이 동반되는 것으로 알려져 있다. HEV 감염에 의한 증상은 평균적으로 40일간 지속되고, 이후 대부분은 자연 치유되나 일부는 간경변으로 만성화되기도 한다. 치사율은 일반적인 경우 3% 정도로 낮지만, 임산부나 노약자 등에서는 25 내지 30%까지 상승할 수 있다. 특히 인도 아대륙에 거주하는 임산부가 HEV에 감염되면 산모 사망, 유산, 사산 또는 자궁 내 사망 등의 심각한 합병증을 유발하게 된다. 최근 HEV에 대한 중요성이 강조되고 관심이 증가하고 있으나 현재 상용화 되고 있는 HEV 백신은 중국에서 개발된 한가지 종류에 그쳐 HEV 백신의 개발이 필요한 실정이다.

마이크로겔(microgel) 또는 나노겔(nanogel)은 폴리머 기반 전달 시스템으로서 약물전달 또는 치료 분야에서 핵심적인 연구 대상이다. 상기 마이크로겔 또는 나노겔을 제조하기 위한 가장 일반적인 방법은 역 (미니)에멀젼 중합(inverse (mini)emulsion polymerization)을 포함하여 다기능 교차 결합제(multifunctional cross-linkers)의 존재하에 친수성 수용성 단량체의 이종 중합 반응이다. 상기 마이크로겔 또는 나노겔의 고분자 네트워크 내 약물, 단백질 및 DNA의 포획 및 방출 동역학은 높은 항원 안전성 내지 면역원성으로 인해 바이오의학 응용을 위한 표적 전달체로서 연구되고 있다. 반대 (미니)에멀젼 중합의 원자 이동 라디칼 중합(atom transfer radical polymerization; ATRP)은 제어된 라디칼 중합(controlled radical polymerization; CRP) 기술이기 때문에, 단량체 및 가교 결합제가 규칙적인 방식으로 혼입된다. 따라서 동일한 길이의 중합체 사슬을 생성하여 균일한 내부 겔 네트워크를 형성한다. 이는 ATRP에 의해 제조된 나노겔과 통상적인 라디칼 중합에 의해 제조된 나노겔 사이의 결정적인 차이에 해당한다.

대한민국 등록특허 제10-1616400호는 향진균성이 향상된 폴리 N-아이소프로필아크릴아마이드(poly N-isopropylacrylamide) 기반 나노겔에 대한 것으로서, 내부에 항진균제를 함유하고 표면이 양이온성 이온으로 개질된 나노겔을 제공한다.

그러나 HEV용 백신으로 사용하기 위하여 HEV 캡시드 단백질 항원을 내부에 포함하는 나노겔에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 사람과 동물에 모두 적용 가능하면서 높은 면역원성을 제공할 수 있는 HEV 에 대한 백신을 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과 국내 분리주 유래의 E형 간염 바이러스 항원 단백질을 포함하여 나노겔 형태로 백신을 제조하는 경우 ALT 및 AST를 낮게 유지시킬 수 있으며 HEV 항체 검출 시기가 빨라지는 등 HEV 백신용 조성물로서 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 E형 간염바이러스 유래 항원 단백질을 포함하는 E형 간염바이러스 나노겔 백신용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, i) 국내 분리주 유래의 E형 간염바이러스 항원 단백질, 단량체, 개시제 및 가교제를 용매에 녹이는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 녹인 용매에 계면활성제 및 유기용매를 투입하여 에멀젼을 형성시키는 단계;

iii) 상기 단계 ii)의 에멀젼을 초음파발생장치로 균일하게 형성한 뒤 산소를 제거하는 단계;

iv) 상기 단계 iii)의 산소가 제거된 에멀젼에 환원제를 투입하여 중합을 진행하여 단량체로 전환시키는 단계; 및

v) 상기 단계 iv)의 전환이 목표 전환률에 도달하는 경우 공기 중에 노출시켜 중합을 정지시키는 단계;

를 포함하는 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 E형 간염바이러스 항원 단백질은 E형 간염바이러스 캡시드(capsid) 단백질인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 E형 간염바이러스 캡시드(capsid) 단백질은 서열번호 1의 Genotype 3 염기서열을 포함하는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 E형 간염바이러스 항원 단백질은 20 내지 40 ㎍/㎖의 함량으로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 단량체, 개시제 및 가교제는 각각 올리고(에틸렌 글라이콜) 모노메틸 에터 메타크릴레이트(Oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate), PEO5000-Br 및 폴리(에틸렌 글라이콜)디메타크릴레이트(Poly (ethylene glycol) dimethacrylate) 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 용매는 물 또는 구아니딘 하이드로클로라이드 버퍼(guanidine hydrochloride buffer) 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 환원제는 아스코르브산(ascorbic acid)인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 나노겔의 크기는 50 내지 500 nm 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 나노겔의 분자량은 300 내지 30,000 이하인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 나노겔은 면역증강제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 E형 간염바이러스 나노겔 백신용 조성물을 제공한다.

본 발명의 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법을 이용하여 제조된 나노겔 백신은 안정적인 우수한 항원 전달 내지 담지능력 및 IL-12 또는 IFN-γ의 수준을 유의적으로 증가시키는 등 면역 부형 효과를 가지므로 E형 간염을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노겔 백신은 국내 분리주의 유전자인 Genotype 3 항원을 활용함으로써 기개발 백신에 비하여 국내 감염 분리주에 대한 높은 방어능을 유도할 수 있다.

도 1은 나노겔이 체내에서 1차 및 2차 분해되어 분자량이 30,000 이하인 친수성 폴리머가 신장을 통해 여과되는 것을 나타낸다.
도 2는 나노겔의 제조방법을 나타낸다. Bio component는 항원 단백질을 의미한다.
도 3은 HEV의 캡시드(capsid) 유전자를 M15 수용성 세포(competent cell)에 형질전환한 후 PCR을 수행하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 HEV 캡시드(capsid) 단백질을 Ni-NTA 시스템을 통하여 정제한 후 HEV에 특이적인 항체를 이용하여 단백질 성상을 확인한 결과를 나타낸다. 1번 레인은 토끼 HEV 캡시드 단백질을 포함하고 있는 백신 서브유닛을, 2번 레인은 토끼 HEV 캡시드 단백질을 나노겔로 캡슐화된 나노겔 백신을 나타낸다.
도 5는 PEO5000-Br 거대 개시제의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 역 에멀젼 중합 및 라디칼 중합 방법을 이용하는 경우 형광 단백질을 보유하고, 크기가 평균 약 110nm 인 나노겔을 제조할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 역 에멀젼 중합 및 라디칼 중합 방법을 이용하는 경우 형광 단백질을 보유하고, 약 89.99%의 효율로 담지하는 나노겔을 제조할 수 있음을 나타낸다.
도 8은 HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 백신의 직경 및 분포를 DLS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 백신의 구조 및 형상을 AFM으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 형광 표지를 부착한 HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 백신의 직경 및 분포를 DLS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 11은 형광 표지를 부착한 HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 백신의 구조 및 형상을 AFM으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 형광 표지를 부착한 HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 백신을 PL 분석한 결과를 나타낸다. 검은색 사각형은 nanogel 군, 빨간색 원은 decanted solution 군, 파란색 삼각형은 THF 세척군 및 분홍색 역삼각형은 PBS 세척군을 의미한다.
도 13은 HEV 감염 후 11주간 토끼 혈청으로부터 측정된 알라닌 아미노기전이효소(alanine aminotransferase; ALT) 또는 아스파테이트 아미노기전이효소(aspartate aminotransferase; AST)의 수치를 나타낸다.
도 14는 HEV 감염 후 토끼 혈청으로부터 측정된 항-HEV 항체의 수치를 나타낸다.
도 15는 토끼 간의 조직병리학적 병변의 이미지를 나타낸다. A는 음성 대조군 토끼(3번 토끼), B는 간엽에서 초점(화살표) 또는 산란(별표) 패턴으로 분포된 만성 염증 세포를 갖는 양성 대조군 토끼(8번 토끼); C는 간엽에서 다초점(화살표) 분포를 갖는 만성 염증 세포를 갖는 나노겔 대조군 토끼(21번 토끼); D는 간엽에 국소적으로 분포된(화살표) 패턴을 갖는 만성 염증 세포를 갖는 나노겔 백신 토끼 (10번 토끼); 및 E는 간엽에서 국소적으로 분포된(화살표) 패턴을 갖는 만성 염증 세포를 갖는 서브 유닛 백신 토끼(16번 토끼);를 나타낸다(스케일 바 = 100 mm).
도 16은 HEV 감염 토끼에 대한 음성 대조군(negative control) 및 양성 대조군(positive control) 토끼의 간을 나타낸다. 음성 대조군에는 간 병변이 나타나지 않았으나 양성 대조군에는 간 병변이 나타났음을 확인할 수 있었다.
도 17은 본 발명의 Genotype 3 항원을 포함하는 나노겔 백신을 투여한 HEV 감염 토끼의 간을 나타낸다. 특별한 간 병변이 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
도 18은 토끼의 혈청에서 IL-12 및 IFN-γ 사이토카인의 수준을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기 기재한 바와 같이, 최근 E형 간염바이러스(HEV)의 전염성 내지 위험성으로 인해 이에 대한 백신 개발이 요구되고 있는 실정이다. 본 발명의 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법에 따라 제조된 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물은 HEV 감염 토끼에 투여하는 경우 ALT 또는 AST가 낮게 유지되며 사이토카인인 IL-12, IFN-γ 내지 항-HEV 항체를 신속하게 증가시킬 수 있어 E형 간염 예방 효과가 매우 우수하다.

본 발명의 나노겔 백신은 역 (미니)에멀젼 중합(inverse (mini)emulsion polymerization)과 원자 이동 라디칼 중합(atom transfer radical polymerization; ATRP)을 병합한 시스템을 통하여 HEV 캡시드(capsid) 단백질을 보유한 나노겔 백신으로 제조되었다. 담지하고자 하는 항원 단백질, 단량체, 개시제, 가교제 및 촉매 등을 물 또는 버퍼와 같은 용매에 녹인 후 계면 활성제와 유기용매를 투입하여 에멀젼을 형성시켰다. 그 후 초음파발생장치를 이용하여 에멀젼을 균일하게 형성한 뒤 반응기 내 질소를 투여하여 산소를 제거하였다. 산소를 제거한 환원제를 투입하고 항온 수조에서 중합을 진행하였다. 기체크로마토그래피(GC) 또는 수분함량 측정기(MA)를 이용하여 단량체의 전환율을 확인하여 목표 전환율에 도달하면 반응 혼합물을 공기중에 노출시켜 중합을 정지시켰다. 원심분리를 이용하여 잔여물 및 유기용매를 제거하고, 담지되지 않은 항원 단백질의 함량을 분석하였다. 합성된 나노겔의 구조와 크기를 DLS와 TEM, SEM, AFM(atomic force microscopy; n-Tracer SPM, Nanofocus) 등으로 분석하고 분해 후의 분자량을 GPC를 이용하여 분석하였다.

본 발명의 나노겔은 역 (미니)에멀젼 중합을 기반으로 하므로, 수용액 층이 유기용매 상에서 액적(droplet)으로 형성되고, 계면활성제 농도 및 용매 비율을 제어함으로써 액적의 크기를 조절할 수 있다. 따라서 에멀젼 형성 시 담지하고자 하는 친수성 물질을 혼합함으로써 구조체 내부에 기능성 물질의 담지가 가능하다. 본 발명의 경우 에멀젼 형성 시 담지하고자 하는 친수성의 항원 단백질을 혼합함으로써 구조체 내부에 항원을 보유하고 있는 백신을 합성할 수 있고, 나노겔의 크기를 50 내지 500 nm 범위로 제어할 수 있어 백신 입자의 크기가 면역 반응에 미치는 영향에 대한 연구가 가능하다. 또한, 본 발명의 나노겔 제조시 투여하는 항원 단백질의 함량을 조절하여 나노겔 내 항원 보유 정도를 제어할 수 있으므로, 최적화된 항원 함량을 평가할 수 있고 단백질을 함유하는 구조체로서 적합하다.

본 발명의 나노겔은 원자 이동 라디칼 중합을 기반으로 하므로, 나노겔 내에 할로젠 관능기를 부착하는 경우 복잡한 처리과정 없이 특정한 작용기를 도입할 수 있으며(개질성), 나노겔 분해 후의 분자량을 300 내지 30,000 이하로 제어할 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노겔은 2가지 이상의 물질의 담지가 가능하므로 항원 단백질과 면역 증강제를 동시에 담지 가능하며 이외에도 할로젠 기의 개질을 통해 면역 증강제의 결합이 가능하므로 나노겔 백신의 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 분자량 30,0000 이하의 친수성 고분자는 신장 여과를 통하여 안전히 몸 밖으로 배출이 가능하다(안전성).

본 발명의 나노겔은 제조시 사용되는 자극 감응형 가교제의 종류에 따라 분해 조건을 제어할 수 있으므로, 특정 환경에서 분해되는 자극 감응성 가교제를 도입함으로써, 목표 환경에 도달 이후 나노겔의 팽윤 및 분해를 제어하여 나노겔의 분해 거동에 따른 체내 잔류 시간 및 면역 효과를 관측할 수 있다(생분해능).

본 발명의 나노겔은 IL-12 및 IFN-c의 수준을 유의적으로 증가시킬 수 있다. 상기 IL-12 및 IFN-c는 세포 면역을 촉진하는 전형적인 Th1-타입 사이토카인으로, Th1-타입 매개 면역 반응은 다른 간염 바이러스의 제거에 중요한 것으로 알려져있다. 따라서, 나노겔 백신으로 백신 접종된 토끼에서 HEV의 클리어런스는 체액 성 및 세포성 면역 반응에 의해 매개될 수 있다. 대조적으로, 서브 유닛 백신은 Th1 또는 Th2-타입 사이토카인의 현저한 생성을 유도하지 않았다.

본 발명의 서브유닛 백신(subunit vaccine)은, HEV 캡시드 유전자를 대장균(E. coli)을 이용하여 발현한 후 나노겔 담지를 하지 않은 백신이며, 단백질 발현까지는 동일하나 나노겔에 담지되지 않아 면역원성 유발이 낮은 백신을 의미한다.

따라서, 본 발명은 i) 국내 분리주 유래의 E형 간염바이러스 항원 단백질, 단량체, 개시제 및 가교제를 용매에 녹이는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 녹인 용매에 계면활성제 및 유기용매를 투입하여 에멀젼을 형성시키는 단계;

iii) 상기 단계 ii)의 에멀젼을 초음파발생장치로 균일하게 형성한 뒤 산소를 제거하는 단계;

iv) 상기 단계 iii)의 산소가 제거된 에멀젼에 환원제를 투입하여 중합을 진행하여 단량체로 전환시키는 단계; 및

v) 상기 단계 iv)의 전환이 목표 전환률에 도달하는 경우 공기 중에 노출시켜 중합을 정지시키는 단계;

를 포함하는 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 E형 간염바이러스 나노겔 백신용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 단계 i)의 E형 간염바이러스(HEV) 항원 단백질은 E형 간염바이러스 캡시드(capsid) 단백질인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 E형 간염바이러스 캡시드 단백질은 서열번호 1의 Genotype 3 염기서열을 포함하는 염기서열로 암호화되는 것이 바람직하다.

본 발명의 토끼 HEV 캡시드 단백질의 유전자는 2000 내지 2200 bp 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2050 내지 2100 bp 일 수 있다. 상기 토끼 HEV 캡시드 단백질의 분자량은 60 내지 80 kDa 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 65 내지 70 kDa일 수 있다.

본 발명의 상기 단계 i)의 E형 간염바이러스 항원 단백질은 20 내지 40 ㎍/㎖의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 25 내지 35 ㎍/㎖의 함량으로 포함되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 30 ㎍/㎖의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 i)의 단량체는 올리고(에틸렌 글라이콜) 모노메틸 에터 메타크릴레이트(Oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate)인 것이 바람직하다. 상기 단량체는 2 내지 6 mmol 로 포함되는 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 3 내지 5 mmol 로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 i)의 개시제는 PEO5000-Br 인 것이 바람직하다. 상기 개시제는 0.005 내지 0.03 mmol 로 포함되는 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.02 mmol 로 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명의 [실시예 4]에 따라 PEO5000-Br을 합성하는 반응식은 하기 [반응식 1]과 같다.

[반응식 1]

본 발명의 상기 단계 i)의 가교제는 폴리(에틸렌 글라이콜)디메타크릴레이트(Poly (ethylene glycol) dimethacrylate)인 것이 바람직하다. 상기 가교제는 0.05 내지 0.3 mmol 로 포함되는 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.2 mmol 로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 i)의 용매는 물 또는 구아니딘 하이드로클로라이드 버퍼(guanidine hydrochloride buffer)인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 iv)의 환원제는 아스코르브산(ascorbic acid)인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 나노겔의 크기는 50 내지 500 nm 인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 60 내지 300 nm인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 75 내지 150 nm인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 나노겔의 분자량은 300 내지 30,000 이하인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 500 내지 20,000 이하인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 1000 내지 10,000 이하인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 나노겔은 면역증강제를 추가적으로 포함할 수 있는데, 상기 면역증강제는 바이러스 면역에 작용하는 Type 1-IFN 또는 IL-12 등의 면역사이토카인 내지 Poly IC 등의 면역부강제일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

HEV 항원 제작

HEV 캡시드(capsid) 단백질의 유전자를 클로닝하여 HEV 항원을 제작하고자 하였다.

구체적으로, HEV Genotype 3 유전자를 코돈(codon) 최적화(optimization)하여 합성을 진행하였으며, porcine HEV G3 Capsid protein_CodonOPT(서열번호 1)을 수득하였다. 확보된 HEV 캡시드 유전자는 BglⅡ 및 HindⅢ를 이용하여 pQE40 발현 벡터(Qiagen, Germany)에 클로닝 하였다. 클로닝된 플라스미드는 정제 후 염기서열을 확인하여 M15 수용성 세포(competent cell, Qiagen) 내로 형질전환 후 제조업 자의 지시 (Qiagen)에 따라 8M 우레아 완충제로 정제 및 HEV에 특이적인 토끼 폴리 클로날 항체 (Sigma-Aldrich, USA)로 SDSPAGE 및 웨스턴 블롯을 통해 확인되었다.

그 결과, M15 수용성 세포에 형질전환된 유전자는 약 2,058 bp 임을 확인할 수 있었다(도 3).

HEV 캡시드 단백질의 발현 및 정제

상기 <실시예 1>에서 제조한 HEV 캡시드(capsid) 단백질 유전자가 형질전환된 단백질 발현용 대장균 M15 수용성 세포를 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 단백질 발현 대장균은 1L 당 20 ㎖를 새로운 배지에 접종한 후 4 내지 5 시간 동안 배양하고 분광계(spectrometer)를 이용하여 600 nm의 파장에서 배양액의 OD 값이 0.8 이상이 되도록 배양하였다. 그 후 상기 배양액에 IPTG를 첨가하여 5 내지 6 시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 발현된 HEV 캡시드 단백질이 함유된 배양액은 6,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 세균을 수거하였다. 수거된 세균 펠렛(pellet)에 고농도의 요소(urea)를 첨가하여 용해(lysis)시키고 용해된 세균 현탁액은 6,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 부유물을 침전시켰다. 원심분리된 세균 현탁액에서 상층액 만을 분리하여 리터(L)당 8 ㎖의 Ni-NTA 아가로스 비즈(agarose beads)와 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응시킨 Ni-NTA 아가로스 비즈 용액은 컬럼(column)을 이용하여 분리하고 pH 6.3의 버퍼로 워싱(washing) 하였다. 그 후, pH 5.9 버퍼 및 pH 4.5 버퍼를 이용하여 HEV 캡시드 단백질을 비즈로부터 추출하였다. 추출된 단백질은 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동 한 후 니트로셀룰로오스 페이퍼(nitrocellulose paper)에 이동(transfer)시킨 뒤 면역화학염색을 실시하여 단백질의 성상을 확인하였다.

그 결과, [도 4]에 나타나는 바와 같이 단백질은 약 67 kDa임을 확인할 수 있었다.

형광 단백질 보유 나노겔 합성 및 분석을 통한 HEV 단백질 담지 가능 여부 평가

<3-1> 개시제 합성

2-브로모아이소부티릴 브로마이드(2-bromoisobutyryl bromide; 0.25 g, 2.0 mmol; Sigma-Aldrich, USA)를 폴리(에틸렌 글라이콜)모노메틸에터(poly (ethylene glycol) monomethyl ether; PEO5000-OH; 5g, 1.0mmol; Sigma-Aldrich) 및 트리메틸아민(trimethylamine; 0.25g, 2.0 mmol; Sigma-Aldrich)와 함께 디클로로메텐(dichloromethane; Sigma-Aldrich) 150㎖에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 부드럽게 교반하였다. 교반 후 휘발성 용매를 진공으로 제거한 후 PEO5000-Br 침전을 위해 헥센(Sigma-Aldrich)을 첨가하였으며, PEO5000-Br 침전물은 25℃의 진공 컨테이너에서 24시간 동안 건조하였다. 1H-NMR (CDCl3): 1.93 [s, 6H, -C(CH3)2Br], 3.34 [s, 3H, -OCH3], 3.4 -3.8 [m, EO protons], 4.3 [m, 2H, -CH2-O(O)C].

그 결과, [도 5]에서 나타나는 바와 같은 1H-NMR 분석 결과를 나타내는 개시제 PEO5000-Br 을 수득할 수 있었다.

<3-2> 형광 단백질을 함유한 나노겔 합성

단백질 모델 물질로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 단량체인 올리고(에틸렌 글라이콜) 모노메틸 에터 메타크릴레이트(Oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate; OEOMA300; 1.2g, 4.0 mmol; Sigma-Aldrich), 개시제인 PEO5000-Br(68.65mg, 0.013 mmol), 트리스-[(2-피리딜)메틸]아민(tris-[(2-pyridyl)methyl]amine; TPMA; 1.93 mg, 0.0067 mmol; Sigma-Aldrich), CuBr₂(1.48 mg, 0.0067 mmol; Sigma-Aldrich) 및 가교제인 폴리(에틸렌 글라이콜)디메타크릴레이트(Poly (ethylene glycol) dimethacrylate, PEGDMA; 90 mg, 0.12 mmol; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 구아니딘 하이드로클로라이드 버퍼(guanidine hydrochloride buffer; 1.2㎖, 2M)에 혼합하여 혼합물을 제작하였다. 상기 각각의 혼합물에 유기용매 사이클로헥산(Cyclohexane; 17.14g; Sigma-Aldrich) 및 계면활성제 857mg Span^® 80(Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 한 후 균일하고 안정한 역에멀젼을 형성하기 위하여 0℃에서 2분동안 초음파 처리를 하였다. 그 후 30℃의 오일 배스(oil bath)에 설치된 플라스크에서 질소 가스의 존재 하에 환원제인 아스코르브산(ascorbic acid; 0.004 mmol, 0.028mmol/㎖, 143 ㎕)를 첨가하여 반응을 개시하고 24시간 후에 혼합물을 공기에 노출하여 반응을 종료시켰다. 그 후 사이클로헥산, 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF; Sigma-Aldrich) 및 PBS를 용매로하여 4℃에서 30분 동안 15,000×g 원심분리를 반복하여 형성된 나노겔 및 나머지 잔여 반응물을 분리하였다. 최종적으로 수득한 나노겔은 PBS 용액(pH 7.54, 10mM)에 분산시켜 수득하였다.

수득한 GFP 보유 나노겔을 Dynamic Light Scattering(DLS) 분석(90 Plus 입자 크기 분석기, Brookhaven Instruments Corporation)을 통하여 그 크기를 측정하고, 형광 분석을 통하여 정제 후 나노겔이 녹색 형광 단백질을 보유하고 있는지 여부를 확인하였으며, 담지 되지 않고 정제 과정에서 제거된 단백질 잔여물을 회수하여 측정함으로써 담지 효율을 계산하였다.

그 결과, 나노겔은 중합반응 중 발생한 가교로 인해 다양한 용매에 녹여도 그 구조가 와해되지 않고 구조 형상을 유지하였다. 나노겔의 크기는 균일하게 약 80 내지 120 nm 범위(평균 110±20 nm)에서 가장 높은 밀도로 좁은 분포를 가지며 성공적으로 형성되었다(도 6). 또한, 나노겔이 녹색 형광 단백질을 보유하면서도 약 89.99%의 높은 효율로 담지된 것을 확인할 수 있었다(도 7).

HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 단가 백신 합성 및 확인

상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 HEV 캡시드 단백질을 담지한 나노겔 백신을 제조 및 분석하였다. 형광 단백질 대신 Genotype 3의 토끼 HEV 캡시드 단백질 30 ㎍/㎖(OEOMA300의 0.1 wt%)을 포함하도록 하였으며, 면역증강제를 추가적으로 포함하는 혼합물도 제작하였다.

그 결과, 나노겔의 크기는 균일하게 약 70 내지 120 nm 범위에서 가장 높은 밀도로 좁은 분포를 가지며 성공적으로 형성되었다(도 8). 또한, 나노겔은 중합반응 중 발생한 가교로 인해 다양한 용매에 녹여도 그 구조가 와해되지 않고 구조 형상을 유지하는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

형광 표지 부착 HEV 캡시드 단백질 나노겔 제조를 통한 담지 효율 분석

<5-1> 형광 표지 부착 HEV 캡시드 단백질 나노겔 제조

Alexa647 형광 표지를 부착한 HEV 캡시드 단백질을 각각 담지 한 두 종류의 나노젤을 AGET atom-transfer radical polymerization (ATRP)과 역에멀젼 중합법을 기반으로 하여 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 합성 및 분석하였다.

그 결과, 나노겔의 크기는 균일하게 약 70 내지 120 nm 범위에서 가장 높은 밀도로 좁은 분포를 가지며 성공적으로 형성되었다(도 10). 또한, 나노겔은 중합반응 중 발생한 가교로 인해 다양한 용매에 녹여도 그 구조가 와해되지 않고 구형 구조 형상을 유지하는 것을 확인할 수 있었다(도 11).

<5-2> HEV 캡시드 단백질 담지 효율 및 함량 분석

상기 실시예 <5-1>에서 나노겔을 제조 후 원심분리를 통해 나노겔과 잔여 반응물을 분리하였으며, 이를 PL로 측정하여 담지된 단백질과 담지 되지 않고 분리된 단백질의 비율을 계산하였다. 나노겔을 사이클로헥산, THF 그리고 PBS 버퍼 세 가지 용액을 통해 정제하였으며, 각 과정에서 얻어진 각각의 잔여 반응물 용액과 최종적으로 얻어진 나노겔 용액의 부피 함량을 일치시켰다. 그 후, PL을 통해 형광(여기파장: 647 nm, 방출파장: 670 nm)을 측정하고, 670 nm 영역의 형광 세기를 상대적으로 비교하였다. decanted solution 군은 나노겔 형성 반응액에서 나노겔을 수득 한 후 남은 여액 군을 의미한다.

그 결과, [도 12]에서 나타나는 바와 같이 Genotype3 HEV 캡시드 단백질이 48.53% 의 효율로 담지 되었음을 확인할 수 있었다.

HEV 나노겔 단가 백신 유효성 평가

<6-1> HEV 감염 토끼 제조

상기 <실시예 4>에서 제조된 HEV 나노겔 단가 백신의 유효성 평가하고자 하였다.

구체적으로, 토끼 HEV(GenBank 수탁 번호 KY496200)를 토끼 대변 샘플로부터 수득 하였다. 분변 상청액에서 토끼 HEV의 역가를 4 % 소 혈청 알부민 용액으로 희석하여 바이러스의 게놈 카피 수는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정하여 10⁶ 게놈 카피 수/㎖로 조정하였다. 본 실험은 건국 대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회(IACUC No. KU16128)에 의해 동물 실험이 승인되었다. 모든 토끼는 생물 안전 수준 2의 건국 실험실 동물 연구 센터의 동물 시설에 보관되었다. 총 23마리의 특정 병원체가 없는(Specific Pathogen Free, SPF) 6 주령 토끼(Orient Bio, Korea)를 5 개의 그룹으로 나누었다(4, 음성 대조군; 4, 양성 대조군; 5, 나노겔 대조군; 5, 나노겔 백신; 및 5, 서브 유닛 백신 그룹). 음성 및 나노겔 대조군 그룹의 토끼에게 0 주 및 1 주에 각각 1 ㎖ PBS 또는 나노겔 용액을 근육 내 주사하였다. 두 백신 그룹의 토끼에게 보조제 없이 각각 30 ㎍/㎖의 서브 유닛 백신 또는 나노겔 백신을 0 주 및 1 주에 2 회 근육 내 주사하였다. 음성 대조군을 제외한 4 개의 그룹의 토끼는 토끼 HEV의 10⁶ 게놈 카피로 4 주차에 혈관 내 투여하였다. 모든 토끼를 11주차에 조레틸(Zoletil, 50 mg/kg) 및 자일라진(Xylazine, 5 mg/kg)의 혼합물을 투여하여 안락사시키고, 간 샘플을 4 % 포름 알데히드 용액에 수집 하였다. 포름 알데히드-고정 된 간 샘플을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하여 관찰하였다.

<6-2> 감염된 토끼의 분변 및 혈액으로부터 HEV 확인

상기 실시예 <6-1>에서 제조한 HEV 감염 토끼로부터 11주 동안 매주 수집한 분변 및/또는 혈청 샘플에서 바이러스 RNA를 제조사의 지시에 따라 Patho Gene-spin DNA/RNA 추출 키트(Intron, Korea)로 추출한 후 Nested RT-PCR 기법을 통해 혈증(viremia) 및 분변을 통한 HEV shedding을 확인하였다. 추출된 바이러스 RNA를 사용할 때까지 70 ℃에서 보관 하였다.

그 결과, 하기 [표 1]과 같이 음성 대조군 토끼에서는 바이러스 RNA를 검출 할 수 없었다. 바이러스성 RNA는 1주 내지 5주차에서 각각 모두 검출되지 않은 반면, 6주 내지 10 주 동안 양성 및 나노겔 대조군 토끼에서 검출되었다. 그러나 바이러스 감염 후 서브 유닛 또는 나노겔 백신을 투여한 토끼에서는 바이러스 RNA를 검출할 수 없었다. 이는 서브 유닛 및 나노겔 백신 모두 토끼 HEV 감염에 대해 완전한 보호 면역을 유도했음을 나타낸다.

그룹	주	1 ~ 5	6	7	8	9	10	11	조직병리학적 스코어	평균 스코어
	번호	분변/혈청
음성 대조군	1	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	0	0.5
	2	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	1
	3	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	0
	4	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	1
양성 대조군	5	-/-	+/+	+/-	-/-	-/-	-/-	-/-	2	2.0
	6	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-	-/-	-/-	2
	7	-/-	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-	-/-	1
	8	-/-	-/-	+/+	+/-	-/-	-/-	-/-	3
나노겔 백신	9	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	1	0.8
	10	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	2
	11	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	1
	12	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	0
	13	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	0
서브유닛 백신	14	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	0	1.0
	15	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	1
	16	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	2
	17	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	0
	18	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	2
나노겔 대조군	19	-/-	+/-	+/-	-/-	-/-	-/-	-/-	2	1.6
	20	-/-	-/-	+/-	+/-	-/-	+/-	-/-	1
	21	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-	-/-	-/-	3
	22	-/-	-/-	-/-	+/-	-/-	-/-	-/-	1
	23	-/-	-/-	-/-	-/-	+/-	-/-	-/-	1

<6-3> 혈액화학검사

상기 실시예 <6-1>에서 제조한 HEV 감염 토끼 또는 각 백신 접종 전 매주 11 주 동안 토끼 귀 정맥으로부터 채취한 혈액 샘플을 밀도 기울기 원심분리(density gradient centrifuge)를 이용하여 3,000×g 에서 5분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. HEV-특이적 항체 역가는 상업적 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 키트(Wantai, China)를 사용하여 측정되었다. 혈청 HEV 역가는 제조사의 지시에 따라 항-HEV 역가가 cut-off 값(O. D. 0.12)보다 높을 때 결정되었다. IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ 및 TNF-α의 혈청 농도는 제조사의 지침에 따라 상업용 ELISA 키트를 통해 결정 하였다 : 토끼 IL-2 듀오 세트 ELISA 키트(R&D System, USA), 토끼 IL-4 DuoSet ELISA 키트(R&D System, USA), 토끼 IL-10 ELISA 키트(Cusabio, China), 토끼 IL-12 ELISA 키트(FineTest, China), 토끼 TNF-α ELISA 키트(Cusabio) ) 및 토끼 IFN-c ELISA 키트(Raybio, USA)를 2 회 반복하여 사용 하였다. 간 손상 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, AST)의 혈청 농도는 피리독스 포스페이트 활성화 없이 국제 임상 화학 및 실험실 의약 프로토콜에 따라 네오딘 수의 과학 연구소(서울, 한국)에서 UV-검정에 의해 결정되었다.

그 결과, [도 13]에서 나타나는 바와 같이, 5 개의 실험군에서 모든 토끼의 ALT 및 AST 수준은 실험 전반에 걸쳐 유의한 차이없이 정상 범위 내로 유지되었다. 이러한 결과는 나노겔 백신이 바이러스 공격 후 백신 접종된 토끼의 간 조직에서 덜 심각한 염증 반응에 확실히 기여했음을 암시한다.

<6-4> 항 HEV 항체 검사

상기 실시예 <6-1>의 5 개의 실험 그룹에서 모든 토끼로부터 수집된 혈청 샘플에서의 혈청 전환(항 HEV 항체가)은 11주 동안 ELISA를 사용하여 결정되었다.

그 결과, [도 14]에서 나타나는 바와 같이, 음성 대조군의 토끼는 예상대로 실험 기간 동안 혈청 전환을 나타내지 않았다. 항-HEV 항체 역가가 2 주차에 측정되었을 때, 두 백신 그룹의 모든 토끼들은 cut-off 값(O.D. 0.12)보다 더 높은 역가를 생성하였다. 4 주차 바이러스 공격 후, 서브유닛 백신 토끼의 항체 역가는 5-7 주 동안 급격히 증가하였으나, 그 후 11 주까지 천천히 감소하였다. 그러나, 백신 접종된 토끼의 항-HEV 항체 역가는 5 내지 11 주 동안 지속적으로 증가 하였다. 나노겔 및 양성 대조군 토끼는 바이러스성 도전 후 항-HEV 항체를 생성하였다. 이러한 결과는 나노겔 백신이 서브 유닛 백신보다 더 내구성 있는 면역원성을 가질 수 있음을 나타낸다.

<6-5> 간 조직변화 확인

상기 실시예 <6-1>에서 제조한 HEV 감염 토끼의 간엽세포에서 염증세포가 생성되었는지 여부 및 육안으로 간 조직에서 병변을 관찰할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

우선, [도 15]에서 나타나는 바와 같이 양성 및 나노겔 대조군에서 모든 토끼의 간엽에서 국소 및/또는 산란된 만성 염증 세포가 발견되었다(도 15의 B 및 C). 그러나, 국소적으로 분포된 염증 세포는 때때로 음성 대조군, 서브 유닛 백신 및 나노겔 백신 군에서 관찰되었다(도 15의 A, D 및 E). 또한, 상기 [표 1]에서 기재하고 있는 바와 같이 음성 대조군, 나노겔 백신 및 서브 유닛 백신군의 평균 조직 병리학적 점수는 각각 0.5, 0.8 및 1.0 이었으며, 나노겔 백신 및 서브 유닛 백신군의 조직 병리학적 점수는 양성(2.0) 및 나노겔(1.6) 대조군보다 훨씬 낮았다.

또한, 음성 대조군(Negative control) 토끼에서는 육안으로 간 조직의 병변이 관찰되지 않은 반면, 양성 대조군(Positive control) 토끼의 경우, 진한 적색으로 관찰되는 병변이 관찰되었다(검은색 화살표, 도 16). Genotype 3 백신(나노겔 백신) 접종군에서는 명확히 보이는 병변이 관찰되지 않았다(도 17).

<6-6> 혈청 사이토카인 측정

상기 실시예 <6-1>의 5 개의 실험군 토끼로부터 10 주 동안 수집한 혈청 샘플의 IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ 및 TNF-α 농도를 측정 하였다.

그 결과, 모든 실험군의 토끼들에서 IL-2, IL-4, IL-10 및 TNF-α의 혈청 농도의 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, [도 18]에서 나타나는 바와 같이 IL-12의 혈청 농도는 나노겔 백신 접종 후 1 주 및 2 주에 대조군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 바이러스 공격 후에는 나노겔 백신 접종 후 8 주차에 유의하게 증가하였다. IFN-γ의 혈청 농도는 또한 나노겔 백신을 접종하고 토끼 HEV로 공격받은 토끼에서 8 주 및 10 주에 유의하게 증가하였다(P <0.05). 서브 유닛 백신으로 백신 접종된 토끼는 백신 접종 및 바이러스 공격 후 혈청 샘플에서 IL-12 및 IFN-γ를 생성하지 않았다. 이러한 결과는 나노겔 백신이 서브 유닛 백신보다 더 강한 Th1 유형 면역 반응을 유도했음을 나타낸다. 관련된 보충 데이터는 온라인 버전(https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.08)에서 찾을 수 있다.

[통계 분석]

데이터는 평균 ± SEM으로 표현되었다. 실험 결과는 GraphPad Prism ver. 5.00(미국 그래프 패드 소프트웨어)으로 분석되었다. Bonferroni 다중 비교 테스트는 사후 테스트로 수행되었다. 통계적 유의 수준은 P <0.05로 설정되었다.

SEQUENCE LISTING <110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Composition for nanogel vaccine against hepatitis E virus <130> 1065918 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2010 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> porcine HEV G3 Capsid protein_CodonOPT <400> 1 tgcccgcgtg ctgttctgct gctgctgttc gttctgctgc cgatgctgcc ggctccgccg 60 gctggtcagc cgtctggtcg tcgtcgtggt cgtcgttctt ctggtgctgg tggtggtttc 120 tggggtgacc gtgttgactc tcagccgttc gctctgccgt acatccaccc gaccaacccg 180 ttcgctgctg acgttgtttc tcagtctggt gctggtgctc gtccgcgtca gccgccgcgt 240 ccgctgggtt ctgcttggcg tgaccagtct cagcgtccgt ctgctgctcc gcgtcgtcgt 300 tctgctccgg ctggtgctgc tccgctgacc gctacctctc cggctccgga caccgctccg 360 gttccggacg ttgactctcg tggtgctatc ctgcgtcgtc agtacaacct gtctacctct 420 ccgctgacct cttctgttgc ttctggtacc aacctggttc tgtacgctgc tccgctgaac 480 ccgctgctgc cgctgcagga cggtaccaac acccacatca tggctaccga agcttctaac 540 tacgctcagt accgtgttgt tcgtgctacc atccgttacc gtccgctggt tccgaacgct 600 gttggtggtt acgctatctc tatctctttc tggccgcaga ccaccaccac cccgacctct 660 gttgacatga actctatcac ctctaccgac gttcgtatcc tggttcagcc gggtatcgct 720 tctgaactgg ttatcccgtc tgaacgtctg cactaccgta accagggttg gcgttctgtt 780 gaaaccaccg gtgttgctga agaagaagct acctctggtc tggttatgct gtgcatccac 840 ggttctccgg ttaactctta caccaacacc ccgtacaccg gtgctctggg tctgctggac 900 ttcgctctgg aactggaatt ccgtaacctg accccgggta acaccaatac tcgtgtaagc 960 cgttacacct ctaccgctcg tcaccgtctg cgtcgtggtg ctgacggtac cgctgaactg 1020 accaccaccg ctgctacccg tttcatgaaa gacctgcact tcaccggtac caacggtgtt 1080 ggtgaagttg gtcgtggtac cgctctgacc ctgttcaacc tggctgacac cctgctgggt 1140 ggtctgccga ccgaactgat ctcttctgct ggtggtcagc tgttctactc tcgtccggtt 1200 gtttctgcta acggtgaacc gaccgttaaa ctgtacacct ctgttgaaaa cgctcagcag 1260 gacaaaggta tcaccatccc gcacgacatc gacctgggtg actctcgtgt tgttatccag 1320 gactacgaca accagcacga acaggaccgt ccgaccccgt ctccggctcc gtctcgtccg 1380 ttctctgttc tgcgtgctaa cgacgttctg tggctgtctc tgaccgctgc tgaatacgac 1440 cagaccacct acggttcttc taccaacccg atgtacgttt ctgacaccgt taccctggct 1500 aacgttgcta ccggtgctca ggctgttgct cgttctctgg actggtctaa agttgctctg 1560 gacggtcgtc cgctgaccac catccagctg tactctaaaa ccttctacgt tctgccgctg 1620 cgtggtaaac tgtctttctg ggaagctggt accaccaaag ctggttaccc gtacaactac 1680 aacaccaccg cttctgacca gatcctgatc gaaaacgctg ctggtcaccg tgttgctatc 1740 tctacctaca ccacctctct gggtgctggt ccgacctcta tctctgctgt tggtgttctg 1800 gctccgcact ctgctctggc tgttctggaa gacaccgttg acttcccggc tcgtgctcac 1860 accttcgacg acttctgccc ggaatgccgt accctgggtc tgcagggttg cgctttccag 1920 tctaccatcg ctgaactgca gcgtctgaaa atgaaagttg gtaaaacccg tgaatctggt 1980 ggcggtagtc atcaccatca ccatcactaa 2010

Claims (11)

1. i) 국내 분리주 유래의 E형 간염바이러스 캡시드(capsid) 단백질, 단량체, 개시제 및 가교제를 구아니딘 하이드로클로라이드 버퍼(guanidine hydrochloride buffer) 용매에 녹이는 단계;
   ii) 상기 단계 i)의 녹인 용매에 계면활성제 및 유기용매를 투입하여 에멀젼을 형성시키는 단계;
   iii) 상기 단계 ii)의 에멀젼을 초음파발생장치로 균일하게 형성한 뒤 산소를 제거하는 단계;
   iv) 상기 단계 iii)의 산소가 제거된 에멀젼에 질소가스 존재하에 아스코르브산(ascorbic acid)을 투입하여 중합을 진행하여 단량체로 전환시키는 단계; 및
   v) 상기 단계 iv)의 전환이 목표 전환률에 도달하는 경우 공기 중에 노출시켜 중합을 정지시키는 단계;
   를 포함하는 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법으로서,
   상기 E형 간염바이러스 캡시드(capsid) 단백질은 서열번호 1의 Genotype 3 염기서열을 포함하는 염기서열로 암호화되는 것이고,
   상기 단량체, 개시제 및 가교제는 각각 올리고(에틸렌 글라이콜) 모노메틸 에터 메타크릴레이트(Oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate), PEO5000-Br 및 폴리(에틸렌 글라이콜)디메타크릴레이트(Poly (ethylene glycol) dimethacrylate) 이며,
   상기 계면활성제 및 유기용매는 각각 Span80 및 사이클로헥산이며,
   상기 나노겔의 크기는 75 내지 150 nm 인 것을 특징으로 하는 E형 간염바이러스에 대한 나노겔 백신용 조성물 제조방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 E형 간염바이러스 항원 단백질은 20 내지 40 ㎍/㎖의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 나노겔의 분자량은 300 내지 30,000 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 나노겔은 면역증강제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    
11. 제1항의 제조방법으로 제조된 E형 간염바이러스 나노겔 백신용 조성물.

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